Os antifúngicos nas infecções por Candida sp

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1 Artigo Os antifúngicos nas infecções por Candida sp Vanessa Zardo 1, Adelina Mezzari Farmacêutica - aluna da disciplina de estágio curricular em Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) 2 - Professora da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) e da Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas Porto Alegre (FFFCMPA) Resumo As infecções por Candida sp têm aumentado nos últimos anos. A produção de fosfolipase é um fator importante no processo de infecção (19), atuando na hidrólise de fosfolipídeos com conseqüente dano à célula epitelial. A resistência aos antifúngicos, clínica ou in vitro, pode ocorrer quando células de fungos suscetíveis passam a ser resistentes devido ao contato prévio com a droga ou é inerente ao próprio microrganismo. Esta resistência ocorre quando as alterações na rota da biossíntese dos esteróis e da expressão do gene ERG 11 envolvidos na síntese da enzima 14 DM reduzem o acúmulo intracelular da droga e a inativação da mesma (31). Os testes de suscetibilidade em isolados fúngicos têm importância clínica na escolha da terapêutica adequada, sendo importante considerar o patógeno e as características intrínsecas do paciente. A padronização de metodologias simples e baratas para os testes de suscetibilidade contribuirá para essa terapêutica. As infecções por Candida glabrata e Candida krusei têm aumentado e por C. albicans têm diminuído proporcionalmente. A C. krusei tem apresentado resistência ao fluconazol e a C. glabrata um perfil variável. O objetivo do presente trabalho é revisar a resistência do gênero Candida aos antifúngicos. Palavras-chaves: Candida spp, suscetibilidade, Fluconazol Summary The infections for Candida sp have increased in the last years. The production of phospholypases is an important factor in the infection process (19), acting in hydrolysis of phospholypides with consequent damage to the epithelial cell. The resistance to the antifungicals drugs, clinical or in vitro, can occur when cells of susceptible pass resistant to have to the previous contact with the drug or is inherent to the proper microorganism. This resistance occurs when the alterations in the route of biosynthesis of the esthers and the expression of the involved gene ERG 11 in the synthesis of the enzyme 14 DM reduce the intracellular accumulation of the drug and the inativation of the same one (31). The susceptibility tests in isolated fungicals have clinical importance in therapeutical choice of the adequate one, being important to consider the pathogen and the intrinsic characteristics of the patient. The standardization of simple and cheap methodologies for the susceptibility tests will contribute for this therapeutical one. The infections for Candida glabrata and Candida krusei have increased and C. albicans has diminished proportionally. The C. krusei has presented resistance to fluconazole and the C. glabrata a changeable profile. The objective of the present work is to revise the resistance of the Candida species to the antifungicals drugs. Keywords: Candida spp, suscetibility, Fluconazole 136

2 Introdução A freqüência de infecções por espécies de Candida tem aumentado nas últimas décadas, tornando a candidemia uma infecção presente nos hospitais. Nos EUA, a taxa de fungemia entre 1980 e 1990 aumentou em torno de quatro vezes. Em 1990, cerca de 10% de todas as infecções sangüíneas foram por Candida sp. (2). Atualmente, essas infecções representam o quarto lugar entre as adquiridas no ambiente hospitalar (16). O aumento das infecções por Candida sp. se deve a fatores como tratamentos com antimicrobianos de amplo espectro, uso de nutrição parenteral, cateteres intravenosos, entubação endotraqueal e outros. A maior freqüência ocorre em pacientes com predisposição de base como neonatos, patologia oncológica, quimioterapia, terapia imunossupressora e pacientes submetidos a cirurgias de grande porte. A espécie albicans é a mais freqüente, responsável por 50 a 70% de todas as infecções invasivas pelo gênero Candida. As espécies não-albicans, como a Candida glabrata, recentemente tem sido um patógeno presente em pacientes nas unidades de terapia intensiva. A fungemia por C. glabrata tem sido observada com mais freqüência em pacientes não leucêmicos e a C. albicans nos leucêmicos, naqueles com tumores sólidos ou que apresentem desordens hematológicas malignas (33). A genotipagem tem demonstrado que a maioria das infecções por Candida sp é proveniente de fontes endógenas. Eventualmente, as mãos dos trabalhadores da área da saúde podem também ser veículo de transmissão do agente (16). Métodos moleculares de genotipagem das espécies de Candida têm sido usados, baseados na análise molecular do DNA desses patógenos. Os resultados têm apresentado baixa sensibilidade e são incapazes de reproduzirem os resultados obtidos através de metodologias fenotípicas devido, principalmente, à falta de padronização dos procedimentos fenotípicos (17). O método de Southern blot tem sido utilizado pela sua alta reprodutibilidade e poder discriminatório. Neste método, quando os pacientes estão colonizados por cepas diferentes de Candida sp ao mesmo tempo, as mesmas podem ser identificadas. Na candidemia, a disseminação pode ocorrer aos múltiplos órgãos resultando na formação de microabscessos, lesões cutâneas embólicas, abscessos renais e hepatoesplênicos, endocardite, meningite, artrite, osteomielite e outros (3). O objetivo do presente trabalho é revisar o perfil de resistência dos antifúngicos pelo gênero Candida e os testes de suscetibilidade disponíveis para esta avaliação. Fatores de virulência das espécies de Candida Estes microrganismos sobrevivem como comensais em sítios anatômicos, de acordo com o ambiente em que se encontram e a pressão ambiental exercida sobre eles. Em superfícies de mucosas, a limitação dos nutrientes e a competição entre as bactérias e fungos, pertencentes à microbiota normal, exercem uma pressão seletiva, o que resulta na eliminação dos microrganismos menos adaptados (32). Na Candida albicans observase a aderência da levedura à superfície celular. A formação do tubo germinativo com conseqüente desenvolvimento da forma filamentosa, a variabilidade fenotípica (switching), a produção de toxinas e enzimas extracelulares, constituem os fatores mais importantes para o desencadeamento da infecção por esse patógeno. A produção de fosfolipase é também um fator importante no processo da infecção, variando conforme a amostra (19). Essa enzima, localizada na superfície da levedura e na extremidade do tubo germinativo, atua na hidrólise de fosfolipídeos, dando origem a lisofosfolipídeos que causam dano à célula epitelial. Entre as espécies de 137

3 Candida, apenas a albicans é capaz de produzir fosfolipase. (20). A espécie albicans também possui adesinas, biomoléculas que promovem a aderência do fungo às células do hospedeiro ou à células ligantes. Outros componentes, também importantes no reconhecimento e disseminação hematogênica da micose, são as proteínas Als1p e Als5p e o gene HWP-1. Estudos mostraram que mutantes de Candida albicans, deficientes em HWP-1, causaram mortalidade reduzida em camundongos bem como menor dano endotelial às células. Esses dados confirmam o papel de HWP-1 na aderência e virulência (20, 21). As outras espécies do gênero Candida também expressam fatores de virulência, embora menos estudados. Possuem enzimas proteolíticas extracelulares capazes de degradar substratos, como a queratina, colágeno, albumina, fibronectina, hemoglobina, cadeia pesada de imunoglobulinas e proteínas da matriz extracelular. Essas enzimas proteolíticas foram encontradas em amostras clínicas com os agentes C. albicans, C. tropicalis e C. parapsilosis. A transição da forma de células leveduriformes para a filamentosa (pseudo-hifas) desses fungos, também pode facilitar a invasão (21). A resposta imune celular também é importante na defesa contra as micoses, por exemplo na candidíase orofaríngea, doença comum entre pacientes infectados pelo HIV. Nestas infecções, Calderone e Fanji (2001) pesquisaram anticorpos anti-candida dirigidos diretamente contra epítopos chaves, o que resultou em um efeito protetor nos modelos animais, sugerindo que a imunidade humoral pode fazer parte de um sistema de defesa, juntamente com a imunidade inata (32). A resistência nas micoses sistêmicas está associada com a atuação dos macrófagos nestas patologias. Nos pacientes com SIDA, uma redução da contagem de células CD4+ está associada com a progressão da doença. Resistência aos antifúngicos Os novos triazólicos, fluconazol e itraconazol, de administração oral ou intravenosa, são comumente utilizados no tratamento das micoses. Esses fármacos são utilizados na profilaxia de pacientes com risco de desenvolverem infecções fúngicas, pois são menos tóxicos do que os poliênicos. A anfotericina B, uma droga poliênica, tem sido considerada o padrão "ouro" para o tratamento de infecções fúngicas, mas sua toxicidade limita seu uso (27). Com a introdução dos antifúngicos azólicos, especialmente o fluconazol e itraconazol, que possuem boa biodisponibilidade via oral e baixa incidência de efeitos adversos, uma nova era no tratamento das infecções fúngicas se iniciou. Seu espectro de ação inclui leveduras e fungos dimórficos. O itraconazol pode ser utilizado, também, no tratamento das dermatofitoses e aspergilose. O fluconazol, azol com maior penetração no sistema nervoso central, tem se mostrado também efetivo em outras situações clínicas, como na candidíase oral e esofagiana de pacientes com SIDA, infecções na medula óssea e em pacientes transplantados renais (4). Nos pacientes com SIDA, apesar do sucesso na terapêutica ser alta, pode ocorrer falha quando o uso desse antifúngico for por longos períodos (5). Tem sido observado, com maior freqüência, o isolamento de cepas de leveduras com suscetibilidade diminuída ou resistentes aos antifúngicos. Esta resistência pode ser clínica ou in vitro. A primeira pode ser conseqüência do baixo nível do fármaco no tecido e no sangue, devido à interação entre os fármacos ou à imunodepressão do paciente. A resistência in vitro pode ser do tipo secundária, onde cepas suscetíveis se transformam em resistentes devido ao prévio contato com o antifúngico. É consenso que a resistência ao fármaco depende da interação entre o hospedeiro, o fármaco e o fungo, porém os fatores do paciente são os mais importantes para o surgimento da resistência (1). 138

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5 A análise de isolados de C. albicans, provenientes de pacientes com infecções recorrentes, tem mostrado que a resistência ao fluconazol ocorre nas mesmas cepas que anteriormente eram suscetíveis. Isso confirma os dados de estudos anteriores de que as cepas são modificadas ao longo da exposição do paciente à droga (31). A genética no desenvolvimento da resistência ao fluconazol Os agentes azólicos interferem na biossíntese do esgosterol, o esterol presente em maior quantidade na membrana plasmática dos fungos. A ação desses fármacos ocorre através da inibição da enzima 14α-demetilase (14 DM), uma enzima da citocromo P 450 importante na rota de biossíntese do esgosterol, a qual catalisa a remoção oxidativa do grupo 14α-metil do lanosterol. Os azóis, ligados ao sítio ativo da 14 DM, competem com o substrato pela ligação (30). As alterações na rota de biossíntese dos esteróis e a expressão aumentada do gene ERG 11, envolvido na síntese da enzima 14 DM, podem interferir no desenvolvimento de resistência na Candida sp. As mutações no gene ERG 11 resultam numa afinidade diminuída da 14 DM ao fluconazol, reduzindo o acúmulo intracelular da droga e a inativação da mesma, desenvolvendo a resistência do microrganismo (31). A inibição da 14 DM pelo fluconazol resulta na depleção do ergosterol e no acúmulo de um esterol metilado, o 14α-metilergoste-8,24(28) dien-3β, 6α-diol, o qual inibe o crescimento celular. As alterações na biossíntese do esterol podem evitar o acúmulo desse inibidor do crescimento e determinar a resistência ao fluconazol (31). É necessário conhecer o mecanismo de resistência das espécies de Candida ao fluconazol para auxiliar no desenvolvimento de estratégias em novas ações terapêuticas (31). Testes de suscetibilidade in vitro A resistência às drogas entre as espécies de Candida spp. tem sido um problema crescente, tornando-se necessário o uso de testes de suscetibilidade nos isolados clínicos. A identificação prévia da espécie de Candida e a determinação da suscetibilidade in vitro tem sido recomendada em alguns casos, como na candidíase de orofaringe de pacientes infectados com HIV, micoses sistêmicas e vaginites recorrentes. Na rotina do laboratório de micologia é importante adequar métodos que possibilitem avaliar a suscetibilidade antifúngica devido ao aumento da resistência dessas leveduras e, uma conseqüente diminuição do arsenal terapêutico disponível (29). O conhecimento da sensibilidade às drogas torna possível otimizar o tratamento (13). O método de determinação precisa ser reprodutível, econômico, fácil, rápido, com boa correlação clínica, utilizando tecnologia que possa ser executada na rotina laboratorial. Em 1982, o Comitê Nacional de padronização dos laboratórios clínicos (NCCLS - National Comitee for clinical Laboratory Standards) estabeleceu um subcomitê para padronizar uma metodologia capaz de avaliar a suscetibilidade in vitro das leveduras, sendo aprovada após uma década de trabalho. Conseqüentemente, a atividade dos antifúngicos pôde ser comparada; a correlação entre atividade in vitro e in vivo realizada; a resistência monitorada e a farmacodinâmica in vitro avaliada. Posteriormente, outros métodos foram desenvolvidos, incluindo os de difusão de disco, E- teste, métodos colorimétricos e o de macro e microdiluição em caldo (5). Para o NCCLS, o método de diluição em caldo é o de referência, com uma reprodutibilidade intra e interlaboratorial acima de 90% (6). A limitação do uso dos testes de suscetibilidade na prática clínica são os dados limitados de correlação da CIM (concentração inibitória mínima) com casos de candidíase 140

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7 invasiva, especialmente em pacientes neutropênicos. O método padrão do NCCLS, apesar da boa reprodutibilidade, é um método extremamente trabalhoso e demorado, necessitando de melhorias. O teste de difusão em disco e o E- test têm se mostrado eficazes nos casos de isolados suscetíveis, mas não nos resistentes, intermediários ou dose-dependentes. Uma alternativa seria o uso desses testes para rastreamento e o preconizado pelo NCCLS, para a confirmação da resistência do isolado. O método de discodifusão em agar ainda não foi padronizado pelo NCCLS, portanto, as correlações entre essa metodologia e a do NCCLS ainda não foram reportadas. Conseqüentemente, o teste de difusão com antifúngicos não pode ser um guia para o monitoramento da terapia antifúngica (22). Essa metodologia tem sido utilizada na identificação do perfil das amostras quanto à suscetibilidade ao fluconazol. O teste utiliza 25 µg de fluconazol em placas de ágar MH (Mueller Hinton) contendo 2% de glicose e 5 mg de azul de metileno/ml. Esse teste tem se mostrado reprodutível e acurado como screening (23) e tem sido usado por pesquisadores em programas de vigilância da suscetibilidade ao fluconazol (24, 25). Resistência antifúngica na clínica Os primeiros dados de resistência aos antifúngicos ocorreu em pacientes com candidíase muco-cutânea tratados com cetoconazol. Desde o início da epidemia de SIDA, esse problema se tornou evidente. O desenvolvimento de resistência aos azóis precede o uso prolongado e repetido do fluconazol na terapêutica de pacientes com candidíase oral e esofágica, apresentando baixas contagens de células CD4+ (7). Os pacientes inicialmente infectados com amostras suscetíveis de Candida albicans, desenvolveram infecção pelo mesmo genótipo do fungo, porém com CIM mais elevado após o uso do fluconazol. Os isolados resistentes ao fluconazol têm se tornado mais freqüentes em virtude do aumento do uso dos azóis na terapêutica. É importante lembrar que a introdução da terapia antiretroviral alterou a história natural dos pacientes infectados com HIV, diminuindo a incidência de infecções oportunistas (5). A C. krusei é resistente ao fluconazol. Os valores de CIM para os isolados de C. glabrata são variáveis, porém freqüentemente maiores do que para C. albicans. (8). Estudos epidemiológicos realizados em pacientes com câncer e fungemia mostraram diminuição do número de casos por Candida albicans, Candida glabrata e Candida krusei (11). Em um estudo prospectivo, realizado em instituições européias, foi observado que a profilaxia com antifúngicos foi um preditor para candidemia (9). Safdar et al (2001) analisaram 349 cepas de Candida obtidas de colonização e infecções sistêmicas. Os autores observaram resistência ao fluconazol em 3,4% de C. albicans e 30,7% de C. glabrata. Somente uma amostra de C. glabrata e C. krusei foram resistentes a anfotericina B (CIM= 1 µg/ml). Nesse estudo, a prévia exposição aos azóis foi associada com a resistência da C. albicans (12). A influência do fluconazol no desenvolvimento da resistência aos azóis foi avaliada por Marr et al (2000) em 585 espécimes de Candida sp p isoladas de pacientes pós-transplante de medula óssea. Os autores observaram que todas as amostras foram resistentes ao fluconazol (10). Na Candida albicans, a resistência ao fluconazol pode chegar a 45% entre os indivíduos que receberam terapêutica prévia. Dos isolados resistentes, 93% apresentaram resistência cruzada ao itraconazol (30). O prognóstico na candidemia por Candida albicans é melhor do que por Candida glabrata, porque os pacientes em sua maioria são neutropênicos, apresentando uma 142

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9 menor capacidade de resposta ao patógeno agressor (33). O aumento da fungemia por Candida glabrata tem ocorrido em instituições com um maior número de pacientes leucêmicos e póstransplantados de medula que receberam profilaxia com o fluconazol, Sendo assim, a profilaxia com fluconazol deve ser reservada para pacientes com risco de desenvolverem fungemia. Os médicos têm sido relutantes quanto à utilização do fluconazol como terapêutica inicial, antes da identificação da espécie de Candida responsável pela infecção (33). Por isso, é importante a identificação correta da espécie responsável pela candidemia para estabelecer a terapêutica adequada ao paciente. No Brasil, Colombo et al (1999) realizaram testes de suscetibilidade em 200 amostras de Candida isoladas de hemoculturas utilizando o método preconizado pelo NCCLS. A doença de base mais comum nestes pacientes foi o câncer (33% dos casos) e, desses, aproximadamente 50% eram pacientes neutropênicos. A resistência ao fluconazol foi de 2,5%, limitada aos isolados de C. krusei e C. glabrata. Um estudo epidemiológico realizado pelos mesmos autores mostrou que a incidência de resistência nessas espécies foi baixa, podendo ser atribuída ao uso menor de fluconazol em hospitais brasileiros (13). Nos EUA e Europa, a C. glabrata tem sido a segunda ou terceira espécie mais isolada de pacientes com infecções sistêmicas, no entanto, no Brasil, a C. glabrata e C. krusei representam apenas 9% de todas as leveduras isoladas (26). Discussão e Conclusão O fluconazol tem sido o tratamento de escolha em pacientes neutropênicos. Acredita-se que, por isso, tem ocorrido um declínio no número de casos de candidíase invasiva, principalmente em pacientes que receberam transplante de medula óssea. Com a diminuição das infecções houve um aumento de espécies de Candida com suscetibilidade diminuída aos antifúngicos, como resultado de uma seleção das cepas resistentes. A Candida glabrata tem emergido como um importante patógeno, causando fungemia em muitos países. Existe também uma limitação no uso dos testes de suscetibilidade in vitro. O método de diluição em caldo, método padrão preconizado pelo NC- CLS, tem se mostrado extremamente trabalhoso para ser utilizado rotineiramente no laboratório clínico, sendo de suma importância o desenvolvimento de metodologias mais simples, que possam ser utilizadas na rotina e que apresentem uma boa reprodutibilidade em relação ao método padrão. A falha na terapêutica antifúngica ocorre quando o estado de imunodeficiência dos pacientes e a profilaxia com os azóis se somatizam, determinando a resistência do agente fúngico (15). A presença de isolados com suscetibilidade reduzida ao fluconazol pode ser um indicativo de exposição prévia do paciente ao antifúngico. Os pacientes com infecções fúngicas que receberam terapêutica prévia são mais suscetíveis em apresentar candidemia resistente ao fluconazol no futuro. A resistência ao fluconazol (CIM > 64 µg/ml) é rara, sendo limitada aos portadores de doenças malignas severas que receberam azóis de forma profilática ou terapêutica. É importante destacar que, na decisão da terapêutica adequada para cada paciente, se considere não somente o patógeno, mas também as características intrínsecas desse paciente. Nesse contexto, a farmacogenética representará um instrumento para o sucesso da terapêutica (14). É necessária uma vigilância periódica da suscetibilidade das espécies de Candida ao fluconazol, já que seu uso tem aumentado em nosso país (26). Mais estudos epidemiológicos em pacientes infectados com espécies do gênero Candida devem ser realizados, tendo como foco o estado do paciente e sua história clínica. Pesquisas sobre os mecanismos envolvidos no aparecimento da resistência também

10 são necessárias para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. É necessária a padronização de metodologias mais simples e baratas para permitir o conhecimento da suscetibilidade dos isolados clínicos. As metodologias padronizadas até o momento são difíceis de serem executadas no laboratório clínico de rotina, devido a sua complexidade de realização ou, quando comerciais, apresentam custo elevado. Havendo essa padronização, o perfil de suscetibilidade poderá ser obtido na rotina laboratorial, contribuindo para o sucesso da terapêutica. Correspondência para: Adelina Mezzari Departamento de Análises da Faculdade de Farmácia - UFRGS Av. Ipiranga, CEP: Porto Alegre. RS mezzari@fffcmpa.tche.br Referências Bibliográficas 1. Silva VV, Díaz MC, Febré N. Vigilancia de la resistencia de leveduras a antifúngicos. Rev Chil infect, 19 :56-65, Mac Donald L, Baker C. Risk factors for candidemia in a Children Hospital. Clin Infect Dis, 26: , Swanson H, Hughes PA, Messer AS et al. Candida albicans arthritis one year after sucessful treatment of fungemia in a healthy infant. J Pediatr, 129: , Marr KA et al. Prolonged fluconazole prophylaxis in associated with persistent protection against candidiasis-related death in allogeneic marrow transplant recipients: long-term follow-up of a randomized, placebo-contolled trial. Blood, 96: , Nucci M, Colombo AL. Emergence of resistant Candida in neutropenic patients. Brazil J Infect Dis, 6(3): , Espinel-Ingroff A et al. Comparison study of broth macrodiluition and microdilution antifungal susceptibility tests. J Clin Microbiol, 29: , Ruhnke M et al. Emergence of fluconazol- resistant strains of Candida albicans in patients with recurrent oropharyngeal candidosis and human immunodeficiency virus infection. J Clin Microbiol, 32: , Wingard JR, Merz WG, Rinaldi MG. Increase in Candida krusei infection among patients eith bone marrow transplantation and neutropenia treated prophylactically with fluconazole. N Engl J Med, 325: , Viscoli C et al. Candidemia in cancer patients: a prospective, multicenter surveillance study by Invasive Fungal Infection Group (IFIG) of the European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC). Clin Infec Dis, 28: , Marr KA et al. Candidemia in allogeneic blood and marrow transplant recipients: evolution of risk factors after the adoption of prophylactic fluconazole. J Infec Dis, 181: , Wingard JR et al. Increase in Candida krusei infections among patients with bone marrow transplantation and neutropenia treated prophylactically with fluconazole. N Engl J Med, 325: , Safdar A et al. Prospective study of Candida sp ecies in patients at a comprehensive cancer center. Antimicrob Agents Chemoter, 45: ,

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