AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO E DO CRESCIMENTO DE BACTÉRIAS LÁCTICAS DURANTE DESENVOLVIMENTO DE IOGURTE
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- Márcia Tavares Lameira
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1 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO E DO CRESCIMENTO DE BACTÉRIAS LÁCTICAS DURANTE DESENVOLVIMENTO DE IOGURTE YAMAGUCHI, S. K. F. 1, CANAL, T. R. 1, SOUZA, C. K. 1, BERTOLI, S. L., CARVALHO, L. F. 1 1-Departamento de Engenharia Química, Centro de Ciências Tecnológicas Universidade Regional de Blumenau - CEP: Blumenau SC Brasil, Telefone: 55 (47) (shanakimi@hotmail.com) RESUMO O iogurte é um produto lácteo no qual as bactérias lácticas utilizam a lactose do leite como substrato para seu crescimento, diminuindo seu ph devido a produção de ácido láctico durante o processo de fermentação. Este trabalho teve por objetivo avaliar a produção de ácido láctico e o crescimento de bactérias lácticas durante o desenvolvimento de iogurte. O ph foi mensurado através de phmetro digital, a acidez por titulação com NaOH (0,01 N) e a contagem de bactérias lácticas pelo método de plaqueamento em profundidade e sobrecamada em meio MRS. Ao final do processo de fermentação, o iogurte apresentou concentração de ácido láctico e contagem de bactérias lácticas desejáveis. As curvas das velocidades de produção de ácido láctico e crescimento celular indicaram a necessidade de pelo menos 2,5 h para que o produto obtenha características de iogurte. ABSTRACT Yogurt is a milk product that lactic acid bacteria uses lactose milk like substrate for its growth, lowering the ph due to lactic acid production during the fermentation process. This study aimed evaluate the lactic acid prodution and the growth of lactic acid bacteria during development of yogurt. The ph was measured through digital phmeter, the acidity by titration with NaOH (0.01 N) and the count of lactic acid bacteria by method of plating in depth and overlying on MRS medium. At the end of the fermentation process, the yougurt presented concentration of lactic acid and lactic bacteria desirable. The curves of the acid prodution and cell growth speeds showed the need for at least 2.5 h to get features of yogurt. PALAVRAS-CHAVE: iogurte, fermentação, bactérias lácticas, estudo cinético. KEYWORDS: yogurt, fermentation, lactic acid bacteria, kinetic study. 1. INTRODUÇÃO O crescimento da utilização de culturas lácticas no setor alimentício e farmacêutico é uma tendência mundial, tanto para enriquecer alimentos quanto para torná-los benéficos aos seres humanos, combatendo microrganismos patogênicos (Ostlie et al, 2004). Para Dave e Shah (1997), vários benefícios à saúde têm sido associados ao consumo de produtos fermentados à base de leite, seja pelo uso da microflora tradicional do iogurte (Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus) ou pela adição de organismos probióticos (Lactobacillus acidophillus e bifidobactérias). No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) define probióticos como microrganismos vivos capazes de melhorar o equilíbrio microbiano intestinal, produzindo efeitos benéficos à saúde (Brasil, 2002).
2 As vendas de produtos alimentícios com cultura probiótica vêm aumentando ao longo dos anos. Seu maior uso ocorre em produtos como iogurtes, leites fermentados, sorvetes e produtos farmacêuticos. Os probióticos são utilizados tanto como agentes biotecnológicos, os quais melhoram as características do produto tradicional por reduzir a pós-acidificação do iogurte e leites fermentados, quanto como agentes terapêuticos, promovendo efeitos benéficos nos indivíduos que os ingerem (Thamer; Penna, 2005). Segundo Oliveira e Damin (2003), para a obtenção dos efeitos desejados, as bactérias probióticas devem estar presentes em quantidades adequadas nos produtos. Em geral, dependendo da cepa empregada é recomendado um consumo de bactérias probióticas entre 10 7 e UFC/dia. A principal função das bactérias lácticas nos alimentos é a acidificação do produto por meio da fermentação até ph próximo de 4,0, impedindo o desenvolvimento de bactérias indesejáveis. Além disso, as bactérias lácticas conferem características sensoriais específicas ao alimento, modificando sabor, textura e aroma, teor proteico, assumindo importante significado comercial (Dias, 2008; Piard et al., 2011). A base utilizada para a produção de bebidas lácteas é composta por microrganismos como Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricos e Streptococcus salivarius ssp. thermophilus, pois existe uma relação simbiótica entre estas bactérias. Na fermentação, o Lactobacillus bulgaricus libera aminoácidos e peptídeos provenientes da proteína do leite, estes compostos estimulam o crescimento do Streptococcus thermophilus que ao crescer libera ácido fórmico e gás carbônico, proporcionando melhor desenvolvimento do Lactobacillus bulgaricus (Martin, 2002; Damin, 2003). A fermentação tem seu fim quando o ph atinge 4,6 (ponto isoelétrico da caseína) ou até que a acidez atinja de 85 a 90 D (Aquarone et al, 1983). A formação do ácido láctico em produtos lácteos fermentados é desejável, pois este é um conservante natural que torna o produto biologicamente seguro, além de favorecer a digestibilidade dos componentes do leite. O ácido láctico, produzido através da via metabólica dos microrganismos envolvidos auxilia na desestabilização das micelas de caseína promovendo a coagulação da caseína em ph 4,6 4,7 formando o gel característico do iogurte (Brown, 2001). Com base no exposto acima, este trabalho teve por objetivo avaliar a produção de ácido láctico e o crescimento das bactérias lácticas durante o desenvolvimento de iogurte. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Desenvolvimento do Iogurte O iogurte foi desenvolvido no Laboratório de Processamento de Alimentos da Universidade Regional de Blumenau (FURB) apresentando a seguinte formulação: leite integral (Tirol), leite em pó integral (Nestlé)), sacarose (União), cultura láctica (Lactobacillus acidophilus LA-5, Bifidobacterium BB-12 e Streptoccocus thermophilus) (Bio Rich) e aroma de uva verde (Duas Rodas). O leite foi aquecido até 90 ºC por 5 min, com o objetivo de criar as condições de microaerofilia favoráveis ao crescimento do cultivo iniciador e desnaturação parcial das proteínas do leite, a fim de contribuir para uma melhor coagulação do leite e diminuição da sinérese após o término da fermentação (Özer e Robinson, 1999). Posteriormente, o leite foi resfriado até 45 ºC para ser adicionado o restante dos ingredientes sólidos, juntamente com a cultura láctica. A mistura foi incubada a 45 ºC durante 4 h. A seguir, resfriada a 4 ºC e armazenada em refrigerador convencional. 2.2 Análises físico-químicas A determinação de ph foi realizada em phmetro digital (Tec-3MP), calibrando-se o equipamento com soluções tampão (ph 4,0 e ph 7,0), segundo indicado na AOAC (1995). A acidez foi determinada através do método de titulação com solução de NaOH 0,01 N, usando como indicador
3 a solução de fenolftaleína 1%, conforme metodologia descrita pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) (Brasil, 1986). A acidez titulável e o ph foram mensurados a cada 30 min, durante 4 h do processo fermentativo do iogurte, a fim de se determinar a curva de produção de ácido láctico durante este período. 2.3 Contagem de Bactérias Lácticas A contagem das bactérias lácticas totais foi realizada a cada 30 min durante o período fermentativo (4 h) pelo método de plaqueamento em profundidade e sobrecamada em meio MRS, com temperatura de incubação de 32 ºC por 48 h conforme metodologia descrita por Silva et al. (2010). 2.4 Estudo cinético A partir dos resultados obtidos referente à acidez titulável e à contagem de bactérias lácticas foi possível determinar as velocidades específicas de produção de ácido láctico ( ) (Equação 1) e de crescimento celular (µ X ) (Equação 2), conforme Borzani (2001). Eq. 1 Onde: X: concentração microbiana; dp/dt: velocidade instantânea de produção de ácido láctico; dx/dt: velocidade instantânea de crescimento celular. Eq RESULTADOS E DISCUSSÕES A contagem de bactérias lácticas obtida ao final da fermentação foi de UFC/L e sua curva de crescimento pode ser visualizada na Figura 1. Este resultado é satisfatório visto que a mínima quantidade de colônias para que o produto seja considerado probiótico é de 10 7 UFC/L (Cook et al., 2012). Observa-se na Figura 1 que houve crescimento na primeira meia hora de processo e após o desenvolvimento das bactérias se manteve estável até a contagem final. Martin (2002) relatou que o desenvolvimento dos microrganismos possui relação com o ph, e que o microrganismo probiótico Streptococcus sp. resiste a um ph de no máximo 4,3 enquanto que o Lactobacillus sp. tolera valores entre 3,5 3,8. Sendo assim, levando em consideração o ph final encontrado de 4,9, poderia ter ocorrido maior crescimento dos microrganismos probióticos até atingir seus respectivos ph s de inibição caso o processo tivesse sido prolongado.
4 Figura 1: Curva de crescimento de bactérias lácticas Fonte: Autor (2016). De acordo com a Figura 2(a), observa-se que a maior concentração de ácido láctico obtida se deu em 3,5 h de fermentação, atingindo 9,88 g/l. Dias (2008) obteve valor semelhante de 9,40 g/l em 4 h de fermentação para iogurte com adição de soja. Os resultados mostram a necessidade de pelo menos 3 h de fermentação para que o produto obtivesse características de iogurte. Verificou-se uma queda do ph de 5,9 para 4,9 após 4 h de fermentação, conforme Figura 2(b). De acordo com este valor, nota-se a necessidade de prolongar o tempo de fermentação a fim de atingir ph definido na legislação que é de 3,6 4,5. Porém como a acidez atingiu valor de 9,27 g/l (Figura 2) ao final do processo, teor este acima da faixa prevista pela legislação que é de 8 a 9 g/l (Brasil, 2005), optou-se por cessar o processo neste tempo, evitando-se assim a descaracterização do produto. Figura 2: Acidez titulável (a) e ph (b) durante a fermentação. (a) Fonte: Autor (2016). (b) Em relação às velocidades específicas de produção de ácido láctico (Figura 3a) e crescimento de bactérias lácticas (Figura 3b), ambas tiveram maior velocidade específica na primeira meia hora de fermentação de 0,0634 g ácido láctico /UFC.h e 0,3012 h -1 para produção de ácido láctico e crescimento celular, respectivamente. Houve um decréscimo nas velocidades específicas até 2,5 h de processo fermentativo,voltando a aumentar posteriormente, atingindo no final do processo 0,0285 g ácido láctico/ufc.h para a produção de ácido láctico e 0,1674 h -1 para o crescimento das bactérias ácido lácticas.
5 Figura 3: Velocidades específicas de produção de ácido láctico (a) e de crescimento de bactérias lácticas (b) ao longo do processo de fermentação. (a) Fonte: Autor (2016). (b) 4. CONCLUSÕES O processo fermentativo ocorreu conforme o esperado, obtendo-se concentração de ácido láctico e contagem de bactérias lácticas desejáveis. Em relação às velocidades específicas de produção de ácido láctico e crescimento das bactérias lácticas, verificou-se que estas apresentaram comportamento semelhante, no qual os resultados compravam a necessidade de no mínimo 2,5 h para que o produto obtenha características de iogurte. 5. AGRADECIMENTOS À FURB Universidade Regional de Blumenau pela estrutura utilizada e a CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior pela bolsa de pesquisa. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Aquarone, E., Lima, U. A., Borzani, W. (1983). Alimentos e bebidas produzidos por fermentação. São Paulo: Edgard Blücher. Borzani, W; Aquarone, E.; Schmidell, W.; Lima, U.A. (2001) Biotecnologia industrial. Engenharia Bioquimica. v.2, ed. Edgard Blücher. São Paulo. Brasil, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. (2002). Regulamento Técnico de Substâncias Bioativas e Probióticos Isolados com Alegação de Propriedades Funcional e ou de Saúde (RDC n 2 de janeiro de 2002). Diário oficial da União. Brasil. Ministério da Agricultura. Portaria nº 76 de 26 de novembro de Dispõe sobre os métodos analíticos de bebidas e vinagre. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, 28 nov Seção 1, pt. 2. Brasil, Ministério da Agricultura. (2005) Regulamento técnico de identidade e qualidade de bebidas lácteas. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, 24 ago Seção I, p. 07.a. Brown, R.B. (2001). Estudo da produção de iogurte batido por fermentação continua (Tese de Doutorado). Escola Politécnica, Universidade de São Paulo São Paulo. Cerqueira, D. A.; Teshima, E. (2011). Avaliação do crescimento de bactérias lácticas com substrato prebiótico. Universidade Federal de Feira de Santana. Feira de Santana-BA. Cook, M.T. Tzortzis, G.; Charalampopoulos, D.; Khutoryanskiy V. V. Microencapsulation of probiotics for gastrointestinal delivery. Journal of Controlled Release, v.162, p.56-67, In
6 ETCHEPARE, M. A. Microencapsulation of probiotics using sodium alginate. Revista Ciência Rural, Santa Maria, v.45, n.7, p , jul, Dave, R.I., Shah, N.P. (1997). Viability of yogurt and probiotic bacteria in yogurts made from commercial starter cultures. International Dairy Journal. Hauly, M. C. de O. Fuchs, R. H. B. Prudencio-Ferreira, S. H. (2005). Suplementação de iogurte de soja com frutooligossacarídeos: características probióticas e aceitabilidade. Revista de nutrição, Campinas, v. 18, n. 5, p Martin, A. F. (2002). Armazenamento do iogurte comercial e o efeito na proporção das bactérias láctias. (Dissertação de Mestrado). Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, Piracicaba. Oliveira, M. N., Damin, M. R. (2003). Efeito do teor de sólidos e da concentração de sacarose na acidificação, firmeza e viabilidade de bactérias do iogurte e probióticas em leite fermentado. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Ostlie, H.M.; Treimo, J.; Narvhus, J.A. (2005). Effect of temperature on grown and metabolism of probiotic bacteria in milk. International Dairy Journal: 15: Piard, J.C.; Le Loir, Y.; Poquet, I.; Langella, P. (2011). Bactérias láticas: as bactérias lácteas no centro de novos desafios tecnológicos. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento. Encarte Especial. Silva, N., et al Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos. Editora Varela. 4ed. São Paulo. Sinclair, C. G.; Cantero, D. (1990). Fermentation modeling. In: Mcneil, B.; Harvey, L. M.; (Ed.) Fermentation a Practical Approach. New York: IRL PRESS; Oxford University Press. p Thamer, K. G., Penna, A. L. B. (2005). Efeito do teor de soro, açúcar, e de frutooligossacarídeos sobre a população de bactérias lácticas probióticas em bebidas fermentadas. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. V.41, n.3,
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