UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA CAROLINA RODRIGUES COSTA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA CAROLINA RODRIGUES COSTA Identificação e suscetibilidade in vitro de espécies de Candida isoladas de pacientes HIV positivos. Orientador: Prof a Dr a Maria do Rosário Rodrigues Silva Dissertação de Mestrado Goiânia-GO, 2005

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA CAROLINA RODRIGUES COSTA Identificação e suscetibilidade in vitro de espécies de Candida isoladas de pacientes HIV positivos. Orientador: Prof a Dr a Maria do Rosário Rodrigues Silva Dissertação apresentada ao curso de Mestrado em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás,como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Medicina Tropical, na área de concentração de Microbiologia. Goiânia-GO,

3 Se nós pudéssemos ver como os outros nos vêem, compreenderíamos até que ponto as aparências são enganosas. Franklin Jones 3

4 Aos meus pais Theobaldo Silva Costa e Maria do Rosário Rodrigues Silva, e aos meus irmãos Márcio e Théo pelo estímulo, carinho, amizade e ainda pelo incentivo e apoio dados nesse momento. AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por me fazer tão perseverante mesmo diante de seus desígnios. 4

5 A minha orientadora, prof a. Dr a. Maria do Rosário Rodrigues Silva, minha maior amiga que me deu apoio e dedicou se a mim nesse período que convivi no laboratório. Obrigada pelo incentivo e palavras de carinho que recebi. A professora Orionalda de Fátima Lisboa Fernandes pelo carinho e amor com que sempre me tratou fazendo-me enxergar mais longe Aos amigos do laboratório de Micologia nas pessoas de Karla Carvalho Miranda, Crystiane Rodrigues Araújo, Claudine Hassan Abbas Krais, Xisto Sena Passos, Lúcia Kioko Hasimoto e Souza, Janine de Aquino Lemos pelo auxilio técnico, solidariedade e constantes colaborações..ao professor Evandro Leão Ribeiro e funcionários do laboratório de Micologia do IPTSP UFG, Hildene Menezes e Cícero Júnior, pelo auxílio prestado durante o processamento experimental da pesquisa. Ao professor Gercino Monteiro Filho, pela forma eficiente com que realizou a análise estatística deste trabalho. Aos integrantes do serviço de ambulatório do Hospital de Doenças Tropicais de Goiânia-GO, em especial à Dr a. Ana Joaquina Cohen, que se dispôs a examinar os pacientes e coletar o material biológico. Aos pacientes que mesmo na dor provocadas por suas enfermidades, contribuíram em prol da ciência. A todos que direta ou indiretamente contribuíram para realização deste trabalho, minha sincera gratidão. 5

6 Resumo A candidíase está entre as doenças cuja incidência tem aumentado nos últimos 20 anos, principalmente nos pacientes HIV (+). Candida albicans encontrada na mucosa bucal como comensal é uma das espécies mais comuns isoladas desta cavidade. Há vários fatores que podem contribuir para que a levedura seja patogênica, incluindo alterações do hospedeiro ou virulência do microrganismo. Entre os fatores que contribuem para alta patogenicidade do microrganismo estão: o dimorfismo, o aumento da adesão, a produção de proteinase aspartil secretora e resistência aos fármacos disponíveis para o tratamento. Além disso vários outros fatores relacionados ao hospedeiro tais como alteração da barreira epitelial, microbiota e imunidade celular contribuem para a proliferação da levedura bucal. A grande maioria dos pacientes infectados pelo HIV desenvolverão lesões de candidíase esofageana como progresso de doença viral. A carga viral e contagem de célula T CD4 são marcadores para a progressão da AIDS. Para tratamento das infecções causadas por Candida tem sido usado fluconazol, itraconazol, voriconazol e anfotericina B. O desenvolvimento de resistência aos antifúngicos, observados em isolados de leveduras sensíveis e em candidíase de orofaringe recorrente seguindo tratamento com diferentes antifúngicos, são fatores importantes nos quais devem ser usado teste de suscetibilidade in vitro. Este trabalho teve o objetivo de investigar a etiologia de carreadores de Candida bucal nos pacientes infectados pelo HIV e verificar se houve associação entre contagem de célula T CD4 e carga viral nos pacientes carreadores de Candida e determinar o padrão de suscetibilidade dos isolados frente ao fluconazol, itraconazol, voriconazol e anfotericina B. Amostras da cavidade bucal foram coletadas em 99 pacientes infectados pelo HIV tratados no Hospital de Doenças Tropicais de Goiânia, Goiás, Brasil. Em todos os pacientes foram feitos 6

7 contagem de célula T CD4 usando citometria de fluxo e medida de carga viral usando Versant HIV-1 RNA 3.0 branched DNA. Os isolados de Candida foram identificados por tubo germinativo, produção de clamidoconídio em ágar Corn Meal suplementado com 1% de tween 80 e por testes de assimilação de açúcar e de nitrogênio. Para diferenciar C. albicans e C. dubliniensis foi usado teste de formação de clamidoconídeo em agar Staib, crescimento à 45 o C, caldo Sabouraud hipertônico. Teste de suscetibilidade foi feito usando microdiluição em caldo de acordo com a metodologia recomendada pelo Comitê Nacional para normas de Laboratório Clínico (NCCLS) documento M-27 A 2. Dos 99 pacientes HIV positivos, 62 (62,6%) tinham cultura positiva para Candida. O agente etiológico mais comum foi C. albicans (50,0%) e C. tropicalis (21,0%). Não identificamos C. dubliniensis pelos métodos fenotípicos usados. Dos 62 pacientes carreadores a média de CD4 foi de 402,2 células mm 3, enquanto a média de carga viral foi de cópias/ml, para os não carreadores a média de CD4 foi de 341,1 células mm 3, enquanto a média de carga viral foi de 9956 cópias/ml. O teste de Mann-Whitney foi usado para determinar se havia associação de contagen de célula T CD4 + e carga viral entre os pacientes carreadores de Candida. Um valor de P < 0,05 foi considerado estatisticamente significante. Nossos resultados mostraram que não houve diferença significativa das variáveis: contagem de célula T CD4 e carga viral entre os pacientes carreadores e não carreadores de Candida. O teste de suscetibilidade in vitro mostrou que alguns isolados de Candida foram resistentes aos derivados azólicos, sendo 8,1%, 12,9% e 3,2% resistentes respectivamente ao itraconazol, fluconazol, e voriconazol. Nenhum isolado foi resistente a anfotericina B. Em conclusão, colonização de espécies de Candida na cavidade bucal, principalmente C. albicans foi detectada com alta freqüência em pacientes infectados pelo HIV. Os nossos resultados permitiram também verificar que carreadores de Candida não estão associados com número de células T CD4 + ou carga viral. O desenvolvimento de resistência aos agentes antifúngicos, observados nos isolados, 7

8 é um fator importante para determinar o uso de teste de suscetibilidade in vitro em rotina de laboratório. Palavras chave: AIDS; carreadores de Candida bucal; suscetibilidade; carga viral; célula T CD4 +. 8

9 Abstract Candidiasis is among those diseases whose incidence has increased over the past 20 years, particularly in AIDS patients. Candida albicans frequently, recovered from oral mucosa as comensal is by far the most common species isolated from oral candidiasis. There are several factors that may contribute for the yeast to be pathogen, including changes in the host or the virulence of the organism. Among the factors that contribute to higher pathogenicity of the microrganism include dimorphism, increased adhesion, production of secretory aspartyl proteases, and drug resistance. Besides other several factors relationship to host such as changes of epithelial barrier, normal flora and cell immunity contributed for oral yeast proliferation. So, a majority of HIV-positive patients could develop clinical lesions of oropharyngeal or esophageal candidosis as the viral disease progresses, according to quantitative HIV-1 RNA in plasma and CD4 + cells count. For treating the infection caused by Candida has been used fluconazole, voriconazole, itraconazole and amphotericin B. The increased use of fluconazole has given rise to the development of resistance among Candida spp, mainly C. glabrata, C. krusei and C. dubliniensis isolates. The development of resistance to antifungal agents, observed in previously susceptible yeast isolates, as well as recurrence of oropharyngeal candidiasis following treatment with different antifungal drugs, are highly relevant factors which should be taken into account to determine the use of in vitro susceptibility tests. Thus the present study had the aim of 9

10 investigating the etiology of oral Candidal carriage in HIV-infected patients, of verifying whether there was association of CD4 + cell count, of HIV-1 RNA measurement in plasma with oral candida carriage patients and to determine the in vitro susceptibility pattern of the isolates against fluconazole, voriconazole, itraconazole and amphotericin B. Samples from the oral mucosa were collected of 99 HIV-infected patients treated at the Hospital de Doenças Tropicais, Goiânia, Goiás State, Brazil. CD4 + cells count by using flow cytometer and HIV-1 RNA measument in plasma by using Versant HIV-1 RNA 3.0 branched DNA assay were determined for all patients at the moment of collect. The yeast isolates were identified by germ tube test, chlamydoconidia production on cornmeal agar supplemented with 1% tween 80, and by sugar and nitrogen assimilation tests. For differentiation between C. albicans and C. dubliniensis we used chlamydospore formation on Staib agar, growth at 45 o C and at hypertonic Sabouraud broth. Antifungal susceptibility tests were performed by using the broth microdilution assay, according to the methodology recommended by the National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), document M-27 A2. Out of 99 HIV-positive patients studied, 62 (62.6 %) had positive culture for Candida (oral carriage). The etiologic agents most common were C. albicans (50,0%) and C. tropicalis (21.0%). We did not identify C. dubliniensis by the phenotypic characteristics used. Of the 62 oral carriage patients, the mean of CD4 + was cells/mm 3, while the mean of viral load was copies/ml; for no carriage the mean of CD4 + was cells/mm 3, while the mean of viral load was 9956 copies/ml. Our results showed that there was no significant difference of the variables CD4 + cell count and viral load between oral candida carriage and no oral candida carriage patients. The in vitro susceptibility test showed that some Candida isolates were resistant to azoles derivative 8.1% were resistant to itraconazole, 12.9% were resistant to fluconazole and 3.2% were resistant to voriconazole. None isolate was resistant to amphotericin B. In conclusion, oral colonization of Candida spp. especially C. albicans was detected with high 10

11 frequency in HIV infected patients. Early detection of oral carriage of Candida spp is seen to be important for identification of patients with the propensity for rapid progression of HIV infection since oral carriage may influence the development of clinically significant candidiasis in these immunocompromised patients. We have also shown that the status of oral Candida carrier is not associated with the number of CD4 cells or the viral load. The development of resistance to antifungal agents, observed in our isolates, is a highly relevant factor, which should be taken into account to determine the use of in vitro susceptibility tests in rotine laboratory. Key words: AIDS; oral Candida carriage; susceptibility, CD4 + cell; viral load 11

12 Lista de abreviaturas ATCC America Type Culture Collection CIM Concentração Inibitória Mínima CFM Concentração Fungicida Mínima HAART Highly Active Antiretroviral Therapy HDT Hospital de Doenças Tropicais HIV Human Immunodeficience Vírus IgA Imunoglobulina A kda Quilodaltons MIC Minimal Inhibithory Concentration MOPS Morpholonepropanesulfonic acid NCCLS National Committee for Clinical laboratory Standars OPC Oropharyngeal Candidiasis PCR Polymerase Chain Reaction RAPD Randomly Amplified Polymorphic DNA SAP Secretory Aspartyl Proteinase SPSS Statistical Programme for Social Sciences 12

13 Índice GOIÂNIA-GO, CAROLINA RODRIGUES COSTA... 2 GOIÂNIA-GO, Lista de abreviaturas Aspectos Gerais Mecanismo de Patogenicidade Fatores relacionados ao microrganismo Aderência Dimorfismo Exoenzimas secretadas por leveduras Resistência aos agentes antifúngicos Fatores relacionados ao hospedeiro

14 1.3 - Infecção em pacientes com AIDS Candidíase bucal como marcador para linfócitos T CD4+ e carga viral na era dos antiretrovirais Distinção entre C. dubliniensis e C. albicans Teste de suscetibilidade in vitro para leveduras do gênero Candida OBJETIVOS Geral: Específicos: REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS O. ARTIGO: ASYMPTOMATIC ORAL CARRIAGE OF CANDIDA SPECIES IN HIV- INFECTED PATIENTS IN THE HIGHLY ACTIVE ANTIRETROVIRAL THERAPY ERA O. ARTIGO: SPECIES DISTRIBUTION AND ANTIFUNGAL SUSCEPTIBILITY PROFILE OF ORAL CANDIDA ISOLATES FROM HIV-INFECTED PATIENTS IN THE ANTIRETROVIRAL THERAPY ERA CONCLUSÕES ANEXOS INTRODUÇÃO Aspectos Gerais A candidíase bucal, micose superficial, cuja incidência tem aumentado nos últimos 20 anos é causada por fungos do gênero Candida, sendo que Candida albicans é a espécie mais freqüentemente isolada nos diferentes processos infecciosos (Ghannoum 2001). Outras espécies de Candida como C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis e 14

15 C. guilliermondii são reconhecidamente agentes responsáveis por lesões na mucosa bucal (Merz 1990, Lewis et al. 1991, Delgado & Aguirre 1997). As leveduras do gênero Candida apresentam-se normalmente como microrganismos oportunistas. Na maioria dos pacientes HIV positivos, a infecção por espécies de Candida é decorrente principalmente de reservatório endógeno, tais como a mucosa bucal e o trato gastrointestinal (Delgado & Aguirre 1997). Vários fatores interferem para que estas leveduras tornem-se patogênicas. Estes fatores estão ligados à virulência do microrganismo e ao próprio hospedeiro Mecanismo de Patogenicidade Fatores relacionados ao microrganismo Os principais fatores de virulência ligados ao microrganismo que contribuem para aumento da patogenicidade incluem: aumento de sua aderência ao tecido do hospedeiro, capacidade de se apresentar de duas formas (dimorfismo), secreção de enzimas como as proteases e resistência a agentes antifúngicos (Cutler 1991) Aderência A aderência é a primeira etapa do processo de colonização e infecção. A interação microrganismo-superfície celular é decorrente de proteínas denominadas adesinas presentes na superfície da levedura e de receptores proteicos tais como laminina, fibronectina e fibrina, presentes nas superfícies celulares do hospedeiro (Klotz & Smith 1991, Greenfield 1992). Alguns trabalhos têm mostrado que a capacidade de aderência das várias espécies de Candida ao tecido do hospedeiro está altamente correlacionada com o desenvolvimento de infecção (Sweet et al., Biasoli et al. 2002). Sweet et al. (1995) verificaram, que em indivíduos infectados pelo HIV, as leveduras associadas à infecção bucal apresentam-se com maior capacidade de aderir à mucosa. 15

16 A aderência do microrganismo à mucosa do hospedeiro pode, no entanto, sofrer influência de fatores ligados ao hospedeiro como ph, temperatura, dieta alimentar, IgA secretora e quantidade de saliva (Delgado & Aguirre 1997) Dimorfismo Algumas espécies de Candida como C. albicans são capazes de apresentarem-se sob duas formas diferentes: leveduras ou a forma de filamentos. Sua capacidade de mudar de fase de levedura para fase filamentosa é importante para maior interação com o hospedeiro, facilitando a aderência, e aumentando assim a sua virulência (Cutler 1991). As células em forma de leveduras e de hifas podem estar presentes no hospedeiro durante o crescimento comensal e também durante o processo de infecção. A formação de hifas é considerado importante fator de virulência por promover a invasão da célula para dentro da mucosa e também evitar que as células de Candida sejam englobadas por macrófagos e neutrófilos. A transição de leveduras para hifas pode ser influenciada pela temperatura, ph, fontes de carbono (Odds 1988) Exoenzimas secretadas por leveduras A atividade das Saps tem sido correlacionadas com a virulência de Candida por alguns pesquisadores. Isolados de Candida fortemente proteolíticas mostram maior aderência as células do epitélio bucal e células endoteliais quando comparadas as cepas menos proteolíticas (Klotz et al. 1983, Ghannoum & Abu Elteen 1986). A atividade de proteinase de Candida está associada com uma família de isoenzimas Sap com pesos moleculares entre 35 e 50 kda, codificadas pelos genes SAP As Saps 1-3 estão associada às células na forma de leveduras e têm atividade ótima em ph 3-5. As Saps 4-6 estão associadas à formação de hifas e têm atividade em ph 5-7. Dessa maneira pode-se dizer que as Sap com atividade em intervalos de ph entre 3 e 7 são importantes para a sobrevivência e infecção de espécies de Candida dentro do hospedeiro (Monod et al e 1998). 16

17 Estudos prévios criaram um modelo hipotético que correlacionam a expressão do gene SAP com a patogenicidade de espécies de Candida. A aderência dessas leveduras nas células epiteliais da mucosa bucal, o fenômeno de switching, assim como, a invasão e danos aos tecidos do hospedeiro os quais contribuem para o desenvolvimento de infecções sistêmicas, ocorrem pela secreção das Saps 1 e 3. A habilidade de formar lesões na pele está relacionada a secreção da Sap 1, já as interações com o sistema imune do hospedeiro, ocorrem quando a Sap 2 é secretada, pois esta proteinase é responsável pela hidrólise das proteínas do sistema imune. No entanto para que esse microrganismo escape da fagocitose dos macrófagos e consiga sobreviver é necessário a expressão do gene SAP 4, que também está ligado a capacidade de fazer infecções sistêmicas junto com a secreção da Sap 6. O dimorfismo apresentado por C. albicans é conferido pelas Saps 4, 5 e 6 enquanto nas culturas formadas em biofilmes ocorre também uma alta secreção das Saps 5,6 e 9 (Naglik et al. 2003b). As espécies de Candida produtoras de proteinase aspartil secretoras (Saps) secretadas por são altamente virulentas. Esta virulência se deve ao fato de que as espécies que secretam Saps são capazes de aderirem à superfície epitelial mais agilmente (Bektic et al. 2001). A atividade proteolítica da proteinase aspartil secretora que é caracterizada por ter um ph ótimo ácido permite a levedura colonizar e invadir o tecido impedindo a defesa imunológica do hospedeiro (Ribeiro et al. 2004). As proteinases estão envolvidas em vários processos bioquímicos (Davies 1990), e estão associadas a diversos fatores de virulência que incluem a formação de pseudomicélio, a aderência e o fenômeno switching, que contribuem ainda mais para a complexidade dos mecanismos de patogenicidade de leveduras (Naglik et al. 2003a). Os genes que codificam para proteinase mais comumente expressos na cavidade bucal de indivíduos carreadores de Candida e com candidíase bucal, são SAP 2 e SAPs 4-6 enquanto que SAP 1 e SAP 3 são expressos somente em pacientes com candidíase bucal (Samaranayake et al. 2002). 17

18 Resistência aos agentes antifúngicos Fluconazol, voriconazol, itraconazol e anfotericina B são os fármacos mais frequentemente empregados para tratamento das infecções causadas por Candida (Costa et al. 2004) Os poliênicos como a anfotericina B agem alterando a permeabilidade celular da membrana fúngica, enquanto os derivados azólicos atuam na inibição da síntese do ergosterol, principal constituinte da membrana através da inibição do citocromo P-450 dependente da enzima lanosterol 14-α-demetilase (Vanden Bossche et al. 1994, Vanden Bossche 1997, Silva et al & Maertens 2004). Anfotericina B é usada no tratamento de infecções fúngicas mais graves como as sistêmicas (Cuenca-Estrela et al. 2000). Este fármaco atua ligando-se ao ergosterol, produzindo poros, resultando no aumento da permeabilidade o que acarreta desequilíbrio osmótico pela perda de íons intracelulares e consequentemente lise e morte celular (Rex et al. 1994). Embora os fungos normalmente não apresentem resistência a este agente poliênico, seu uso tem sido limitado devido aos graves efeitos colaterais como os nefrotóxicos e devido à dificuldade na sua administração que deve ser feita por via endovenosa (Nenoff et al. 1999). Este fármaco é usado no tratamento de micoses graves refratárias ao tratamento antifúngico convencional (Carrillo-Muñoz & Quindós 2001). Os azólicos são divididos com base na quantidade de átomos de nitrogênio em imidazólicos diazólicos (miconazol, clotrimazol, econazol e cetoconazol) e imidazólicos triazólicos (fluconazol, itraconazol e voriconazol) (Como & Dismukes 1994, Silva P 2005, Ghannoum & Hossain 2000, Klepser et al. 2000). Os antifúngicos triazólicos, fluconazol e itraconazol são considerados bastantes efetivos para o tratamento de candidíases e são menos tóxicos que a anfotericina B, podendo ser administrados por via oral (Nenoff et al. 1999, Burgess et al. 2000). Apesar de efetivos, com poucos efeitos colaterais, tem sido observado que alguns isolados de fungos apresentam resistência aos derivados azólicos. São conhecidos dois (2) mecanismos de resistência aos azólicos. 1- Redução do acúmulo intracelular do fármaco resultando na diminuição da utilização deste agente antifúngico ou do aumento da excreção do fármaco devido a ação de produtos de genes de resistência, 2- Alteração estrutural da enzima 14 α demetilase, resultando em uma diminuição na sua ligação aos azólicos (Nenoff et al. 1999). 18

19 A resistência aos derivados azólicos pode ser influenciada pela imunossupressão dos pacientes, uso prolongado do agente antifúngico, uso de outras substâncias quimioterápicas e resistência intrínsica de espécies de Candida não albicans (Lattif et al. 2004). O uso freqüente de terapia antifúngica em pacientes com AIDS, em decorrência de constantes recidivas de candidíase bucal ou esofágicas, é o fator que provavelmente tenha maior influencia na ocorrência de resistência a diferentes fármacos. Espécies de Candida como C. glabrata e C. krusei tem se mostrado comumente resistentes ao fluconazol devido ao uso prolongado deste agente antifúngico (Taylor et al. 2000, Colombo et al. 2002). Segundo Barchiesi et al. (2002) pacientes infectados pelo HIV que fazem uso de (HAART), freqüentemente apresentam leveduras na cavidade bucal resistentes ao fluconazol Fatores relacionados ao hospedeiro As espécies de Candida são microrganismos comensais da flora bucal, encontradas na orofaringe de aproximadamente 30% dos indivíduos saudáveis. Para que estes microrganismos passem de comensais a produtores de lesão, vários fatores podem interferir. A integridade do epitélio da mucosa bucal é considerada de grande relevância na defesa do hospedeiro. Todas as circunstâncias que alteram a superfície da mucosa por traumatismo, maceração e oclusão, favorecem a aderência do fungo e sua invasão na mucosa, propiciando assim a instalação da infecção (Urizar 2002). O uso de prótese dentária altera as condições da mucosa bucal, produz lesões por microtraumatismo, dificultando a chegada dos anticorpos salivares e determina o aparecimento de um meio ácido e anaeróbio que favorece a proliferação dos fungos (Urizar 2002). Outro fator de grande importância é a presença da flora bucal bacteriana que regula o número de fungos, inibindo sua aderência a superfície bucal por bloqueio de receptores celulares, e competindo com os fungos para utilização de nutrientes. Além disto algumas bactérias são capazes de produzir antifúngicos o que altera a proliferação das leveduras. È conhecido que o uso de antibióticos favorece o crescimento de fungos do gênero Candida na cavidade bucal, devido à redução da flora bacteriana (Urizar 2002). 19

20 Além destes fatores, mecanismos mediados por imunidade celular e humoral constituem uma eficiente proteção contra infecções por fungos do gênero Candida (Richardson & Warnock 1994). O papel da atividade de neutrófilos contra infecções sistêmicas pode ser evidenciado pelo aumento de infecções disseminadas em pacientes submetidos à quimioterapia (Merz, 1990). A defesa do hospedeiro com relação a neutrófilos e macrófagos é realizada através da ação microbicida destas células (Greenfield 1992). Com relação às células T verifica-se que estas apresentam grande relevância na prevenção de candidíase mucocutânea. Este tipo de infecção é freqüente em crianças com problemas no timo, principal órgão formador de linfócitos T e em pacientes com a síndrome da imunodeficiência humana adquirida (AIDS ou SIDA), em que se observa uma acentuada diminuição destas células (Merz 1990). A imunidade humoral é efetuada pela formação de anticorpos, que associados ao sistema complemento, atuam como opsonizadores para as células fagocitárias ou impedem a aderência do microrganismo às células IgA secretoras (Odds 1988, Samaranayake & Macfarlane 1990). Além destes fatores citados acima, como características locais tais como variações do fluxo salivar, barreira epitelial, constituintes antimicrobianos da saliva, liberação de lisozima e lactoferrina, presença de flora bacteriana e imunidade local são consideradas de grande relevância para proteger o hospedeiro contra proliferação de leveduras da mucosa bucal, inibindo assim a infecção (Arribas et al. 2000) Infecção em pacientes com AIDS Os indivíduos infectados com o HIV são predispostos a um grande número de infecções por fungos devido às alterações que ocorrem no sistema imunológico mediado por células, principalmente, linfócitos T. Nesses indivíduos, candidíase de orofaringe é a infecção fúngica oportunística mais comum (Vargas & Joly 2002). Várias espécies de Candida como C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, C. glabrata têm sido apontadas como causadoras de lesões nestes indivíduos. Em 1995, Sullivan e colaboradores isolaram e caracterizaram uma nova espécie de Candida, Candida dubliniensis, o qual apresenta características fenotípicas semelhantes à C. albicans. Esta espécie tem sido isolada da mucosa bucal de pacientes HIV + com relativa freqüência (Sullivan et al. 1995). 20

21 Espécies de Candida podem ser carreadores comensais bucais em indivíduos saudáveis e dependendo de fatores locais e sistêmicos incluindo infecção pelo HIV estas espécies passam a ser patogênicas produzindo candidíase bucal (Pongsiriwet et al. 2004). A candidíase bucal ou esofágica em pacientes com AIDS caracteriza-se por um quadro clínico grave, com manifestações crônicas e recidivantes que são atribuídas à diminuição da função de células T helper (Chandler 1985, Samaranayake & Holmstrup, 1989, Whelan et al. 1990). Candidíase bucal ocorre em 80 a 95% dos pacientes com AIDS, quando a contagem de linfócitos T CD4 está abaixo de 200 células/mm 3 (Dupont et al. 1994, Samaranayake et al. 2002). A forma clínica mais conhecida de candidíase bucal é a pseudomembranosa. Clinicamente, essas lesões iniciam se por pequenos pontos esbranquiçados na mucosa, que se tornam confluentes, formando pseudomembranas de coloração esbranquiçadas, aderidas à mucosa com um fundo eritematoso. Essas placas de coloração esbranquiçadas são fortemente aderidas à cavidade bucal. Acometem, com maior frequência, as mucosas que revestem as bochechas, ponta de língua e palato mole, podendo ocorrer invasão maciça da cavidade com comprometimento generalizado, dificultando a deglutição (Sangeorzan et al. 1994). Outras formas clínicas como a candidíase eritematosa ou queilite angular associadas a Candida são também freqüentes e podem existir concomitantemente. A forma eritematosa ou de queilite pode algumas vezes ser a primeira manifestação de uma alteração sistêmica, incluindo infecção pelo HIV. Outras formas clínicas como a hiperplásica e/ou leucoplásica mantém aspectos controvertidos tanto em sua patogenia como em seu verdadeiro significado. Nos pacientes HIV positivos ocorre progressão clinica das candidíases desde a forma leve inicial como a eritematosa e queilite angular a formas mais graves e tardias cronificadas como pseudomembranosas ou hiperplásicas. Esta progressão está relacionada além do número de linfócitos CD4, com aumento da carga viral e evolução da imunossupressão (Ceballos et al. 1996, Ceballos 2001, Detel et al. 2001). A combinação de terapia antiretroviral usando inibidor de protease, análogo de nucleotídeo e inibidor de transcriptase reversa leva a um aumento da contagem de células 21

22 T CD4 e diminuição da carga viral em alguns pacientes levando a uma redução dos casos de infecções oportunísticas (Jung & Paauw 1998). 1.4 Candidíase bucal como marcador para linfócitos T CD4 + e carga viral na era dos antiretrovirais Contagem de linfócitos T CD4 + e quantificação do RNA viral no plasma sanguíneo tem sido os principais marcadores da progressão da doença produzida pelo HIV. Alta contagem de linfócitos CD8, baixa relação CD4/CD8 e alta carga viral são comuns nos pacientes com candidíase bucal sendo um dos principais indicadores de imunodepressão induzida pelo HIV (Klein 1984, Greenspan et al. 1998, Patton et al. 1999). Alguns parâmetros imunológicos podem ser melhorados quando há envolvimento da reconstituição da população de células T CD4 + periférica. Acentuada diminuição da incidência de lesões bucais são relatadas em pacientes que receberam terapia antiretroviral. Tratamentos combinados de antiretrovirais denominado terapia antiretroviral altamente ativa (HAART) que representam uma combinação de duas ou três classes de fármacos: inibidor de transcriptase reversa nucleosidico (ex. Zidovudina), inibidor de transcriptase reversa não nucleosidico (ex. Neviparina) e inibidor de protease (ex. Saquinavir) são administradas com o objetivo de reduzir a carga viral para níveis não detectáveis levando a restauração do sistema imune do hospedeiro (Eyeson et al. 2002, Hardy et al. 2003). Essa diminuição de casos de candidíase e lesões orais em pacientes que fazem uso de HAART foram atribuídas à reconstituição imune, por elevação de células T CD4 + circulante após a redução da carga viral (Nicolatou-Galitis et al. 2004). Além da restauração do sistema imune e redução de carga viral os antiretrovirais inibidores da protease agem sobre as Saps produzidas por C. albicans. Sendo assim, os antiretrovirais podem então interferir na infecção por Candida inibindo as Saps que tem importante papel na virulência e invasão da mucosa (Barchiesi et al. 2002). 1.5 Distinção entre C. dubliniensis e C. albicans 22

23 Com o aumento da incidência de infecções fúngicas e várias espécies de Candida se apresentarem como agentes de candidíase, verificou-se um grande interesse na identificação das espécies (Kurtzman & Fell 1998). A espécie C. albicans descrita como a principal causadora de candidíase, apresenta características semelhantes à espécie C. dubliniensis, proposta por Sullivan et al. (1995). C. dubliniensis é um patógeno emergente identificado como constituinte secundário da microbiota bucal humana. Este microrganismo é isolado da cavidade bucal de pacientes com AIDS, de indivíduos infectados pelo HIV que apresentam infecção na corrente sanguínea com história de candidíase bucal recidivante e daqueles com exposição prévia a terapia com fluconazol. C. dubliniensis é considerada uma espécie resistente ao fluconazol e de difícil tratamento (Kirkpatrick et al. 1998, Odds et al. 1998, Sullivan et al. 1999, Kim et al. 2003). Esta espécie tem sido identificada erroneamente como C. albicans. Ambas as espécies formam tubo germinativo, produzem clamidoconidios e exibem padrões bioquímicos semelhantes (Sullivan et al. 1995, 1998, 1999). A distinção das duas espécies (quadro1) tem sido estudada por diferentes pesquisadores. C. dubliniensis pode diferir de C. abicans pelos padrões de assimilação de hidratos de carbono como a xilose, e a α metil-d-glucoside (Salkin et al. 1998), pela coloração em meio de CHROMagar (Schoofs et al. 1997), e ainda através de outros testes fenotípicos como crescimento a 45 o C, crescimento em meio contendo cloreto de sódio, opacidade ao tween 80, produção de clamidoconidios e características morfológicas exibidas em meio de agar Staib (Staib & Morschhãuser 1999, Alves et al. 2002, Mariano et al. 2003). Quadro 1. Métodos fenotípicos usados na distinção de Candida albicans e Candida dubliniensis Métodos Espécies C. albicans C. dubliniensis Assimilação de xilose e α metil D-glucoside + _ Coloração em meio de CHROMagar Verde clara Verde escura Crescimento à 45 0 C + _ Crescimento em meio contendo cloreto de sódio + _ Formação de halo de opacidade ao tween 80 + _ 23

24 Características morfológicas em meio de ágar Staib Colônias lisas e sem clamidoconídios Colônias rugosas e com clamidoconídios Além dos métodos fenotípicos, os métodos moleculares que detectam diferenças genotípicas são importantes para distinção entre C. albicans e C. dubliniensis. Algumas técnicas como DNA fingerprinting, método de reação de polimerase em cadeia (PCR) e análise de DNA polimórfico amplificado randomicamente (RAPD) tem sido empregadas na diferenciação das duas espécies (Milan et al. 2001). A técnica molecular que tem alto potencial para diminuir tempo de diagnóstico de infecção fúngica e reduzir a mortalidade associada a candidíase sistêmica é baseado no uso de reação de polimerase em cadeia (PCR). Essa técnica pode detectar baixas quantidade de ácido nucléico no sangue ou tecido (Aracia et al. 2004). 1.6 Teste de suscetibilidade in vitro para leveduras do gênero Candida Os testes de suscetibilidade in vitro para leveduras tornaram-se de grande relevância em face aos eventos de resistência. A técnica de macrodiluição em caldo padronizada pelo NCCLS em 2002, documento M27-A 2, é adequada para avaliar a concentração mínima do fármaco capaz de inibir o crescimento do fungo (CIM), ou ainda a concentração fungicida mínima (CFM) que é a menor concentração do agente antifúngico capaz de matar o fungo (NCCLS M27-A 2 ). O método de microdiluição em caldo apresenta altos índices de correlação com o método de macrodiluição em caldo. O NCCLS estabeleceu parâmetros de suscetibilidade, resistência e dose dependência para iraconazol, fluconazol e fluorcitosina (Espinel-Ingroff et al. 1992, NCCLS 2002). O perfil de suscetibilidade aos agentes antifúngicos devem, ser uma ferramenta importante para evitar o tratamento inadequado aos fungos resistentes. 24

25 25

26 2 OBJETIVOS 2.1 Geral: Verificar a diversidade de espécies de Candida na cavidade bucal em pacientes HIV positivo durante o período de um (1) ano na cidade de Goiânia, Goiás. 2.2 Específicos: 1- Investigar o agente etiológico de carreadores de Candida na mucosa bucal de pacientes HIV positivo 2- Avaliar quantitativamente as células T CD4 + e carga viral nos pacientes carreadores e não carreadores de Candida na mucosa bucal 3- Diferenciar por meio de métodos fenotípicos as espécies C. albicans de C. dubliniensis. 4- Analisar in vitro a suscetibilidade dos isolados de Candida obtidos da cavidade bucal de pacientes infectados pelo HIV frente ao fluconazol, itraconazol, anfotericina B e voriconazol. 26

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29 Eyeson JD, Tenant-Flowers M, Cooper DJ, Johnson NW, Warnakulasrlya KAAS Oral manifestations of an HIV positive cohort in the era of highly active anti-retroviral therapy (HAART) in South London. J Oral Pathol Med 31: Ghannoum MA Candida: A causative agent of an emerging infection. J Investig Dermatol Symp Proc 6: Ghannoum MA, Abu Elteen K Correlative relationship between proteinase production, adherence and pathogenicity of various strains of Candida albicans. J Med Vet Mycol 24: Ghannoum MA, Hossain MA New investigational antifungal agents for treatening invasive fungal infections. Expert Opin Investig Drugs 9: Greenfield, RA Host defense system interactions with Candida albicans. J Med Vet Mycol 30: Greenspan D, Komaroff E, Alves M et al Oral mucosal lesions, CD4 count, viral load and others covariates in women enrolled in the Womens s interagency HIV study. Int Conf AIDS 12: 1054 (abstr n o 60299). Hardy GAD, Imami N, Sullivan AK, Pires A, Burton CT, Nelson MR, Gazzard BG, Gotch FM Reconstitution of CD4 + T cell responses in HIV-1 infected individuals initiating highly active antiretroviral therapy (HAART) is associated with renewed interleukin-2 production and responsiveness. Clin Exp Immunol 134: Jung AC, Paauw DS Diagnosing HIV-Related Disease Using the CD4 Count as a Guide. J Gen Intern Med 13: Kim JO, Garofalo L, Blecker-Shelly D, McGowan KL Candida dubliniensis Infections in a Pediatric population: Retrospective Identification from Clinical Laboratory Isolates of Candida albicans. J Clin Microbiol Kirkpatrick WR, Revankar SG, Mcatee RK, Lopez-Ribot JL, Fothergill AW, McCarthy DI, Sanche SE, Cantu RA, Rinald MG, Patterson TF Detection of Candida dubliniensis in oropharyngeal samples from human immunodeficiency virus-infected patients in North America by primary CHROMagar Candida screening and susceptibility testing of isolates. J Clin Microbiol 36: Klein RS Oral candidiasis in high-risk patients as the initial manifestation of AIDS. N Engl J Med 311:

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34 1 O. ARTIGO: ASYMPTOMATIC ORAL CARRIAGE OF CANDIDA SPECIES IN HIV-INFECTED PATIENTS IN THE HIGHLY ACTIVE ANTIRETROVIRAL THERAPY ERA. 34

35 Asymptomatic oral carriage of Candida species in HIV-infected patients in the highly active antiretroviral therapy era. Carolina Rodrigues Costa (1), Ana Joaquina Cohen (2), Orionalda Fátima Lisboa Fernandes (1), Karla Carvalho Miranda (1), Xisto Sena Passos(1), Lúcia Kioko Hasimoto Souza (1), Maria do Rosário Rodrigues Silva(1). Summary Oropharyngeal candidiasis is the most common opportunistic fungal infection in individuals infected with human immunodeficiency virus. CD4 + lymphocytes count and the quantification of viral RNA in blood plasma have been found to be the main markers of HIV disease progression. The present study was conducted to evaluate Candida sp diversity in the oral cavity of HIV infected patients and to determine whether there was association of CD4 + cell count and viral load with asymptomatic oral Candida carriage. Out of 99 HIV-positive patients studied, 62 (62.6 %) had positive culture for Candida (oral carriage) and 37 patients (37.4%) had Candida negative culture (no oral carriage). The etiologic agents most common were C. albicans and C. tropicalis. Of the 62 oral carriage patients, the mean of CD4 + was cells/mm 3, while the mean of viral load was copies/ml; for no carriage the mean of CD4 + was cells/mm 3, while the mean of viral load was 9956 copies/ml. Our results showed that there was no significant difference of the variables CD4 + cell count and viral load between oral candida carriage and no oral candida carriage patients. (1) Laboratório de Micologia, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil 35