Hadla Sousa Ferreira

Transcrição

1 UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA Hadla Sousa Ferreira Desenvolvimento de estratégias analíticas para determinação de cádmio e chumbo em amostras de água de refinaria e especiação de arsênio e antimônio em amostras de alimentos Salvador - Ba março / 2009

2 Hadla Sousa Ferreira Desenvolvimento de estratégias analíticas para determinação de cádmio e chumbo em amostras de água de refinaria e especiação de arsênio e antimônio em amostras de alimentos Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química, Instituto de Química, Universidade Federal da Bahia, como requisito para a obtenção do grau de Doutor em Ciências / Área de concentração Química Analítica. Orientador: Profº Dr. Sérgio Luís Costa Ferreira Salvador - Ba Março / 2009

3 F383 Ferreira, Hadla Sousa. Desenvolvimento de estratégias analíticas para determinação de cádmio e chumbo em amostras de água de refinaria e especiação de arsênio e antimônio em amostras de alimentos. / Hadla Sousa Ferreira f. : il. Orientador: Prof. Dr. Sérgio Luís Costa Ferreira. Tese (doutorado) - Universidade Federal da Bahia, Instituto de Química, Salvador, Espectrometria de absorção atômica. 2. Petróleo - resíduos. 3. Vegetais - contaminação. 4. Vinhos. 5. Hidreto. I. Ferreira, Sérgio Luís Costa. II. Universidade Federal da Bahia. Instituto de Química. II. Título. CDU:

4

5 Para desenvolver uma mente completa, estude a arte da ciência; estude a ciência da arte. Aprenda a enxergar. Perceba que tudo se conecta a tudo. Leonardo da Vinci

6 À minha mãe, Antonia Sousa e a meus irmãos, Hadma, Hyrlam, Harlam e Hyderlam.

7 AGRADECIMENTOS A Deus por ter me dado vida e estado sempre presente na minha caminhada, sem ele não conseguiria. A minha família, por todo amor, carinho, incentivo, apoio e compreensão. Ao professor Dr. Sérgio Luis Costa Ferreira, por ter me recebido como filha no seu grupo de pesquisa e me dado uma oportunidade de crescimento profissional; por sua orientação presente no desenvolvimento do meu mestrado e doutorado; seu apoio, carinho e sobretudo sua valiosa amizade. A Universidade de Valência, Espanha, e os Profs Dr. Miguel de la Guardia e Drª Mariza Cervera pela orientação no Doutorado Sanduíche no Exterior. Ao coordenador da pós-graduação e a todos os professores e funcionários que fazem parte e contribuem para formação de mestres e doutores. Ao CNPq pelas bolsas de doutorado no país e doutorado sanduíche no exterior. Ao prof. Dr. Antonio Celso Spínola pela amizade e incentivo. A profª Drª Maria das Graças Korn pela colaboração. Aos professores, Marcos Bezerra, Anderson Souza, Neyla e Ana Pinto pelo incentivo e amizade. À Cristóvão e Paulo, funcionários competentes e adoráveis, que facilitam nossas vidas em todas as horas.

8 Ao Dr Geraldo Matos pela parceria no desenvolvimento de trabalhos e pela amizade. Aos meus colegas e amigos Lindomar, Pedro e Rennan Geovany, pelo apoio e pala amizade. Aos colegas do Grupo de Pesquisa em Química e Quimiometria (GRPQQ) e do Grupo de Pesquisa em Química Analítica (GPQA)..

9 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS ABREVIATURAS E SIGLAS RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO GERAL...1 OBJETIVOS...2 CAPÍTULO 1- PROCEDIMENTOS ANALITICOS UTILIZANDO SISTEMA DE PRÉ- CONCENTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA E TS- FF- AAS PARA DETERMINAÇÃO DE CÁDMIO E CHUMBO 1 Métodos de separação e pré-concentração Extração em fase sólida (EFS) Princípios Básicos Sistemas de EFS em linha Parâmetros que caracterizam sistemas de pré-concentração em linha Extração de cádmio Extração de chumbo Espectrometria de absorção atômica com tubo na chama ( TS FF AAS)...15

10 CAPÍTULO 2- METODOLOGIAS PARA DETERMINAÇÃO DE ARSÊNIO E ANTIMÔNIO 2.1 O elemento químico arsênio O elemento químico antimônio Metodologias para determinação de antimônio e arsênio em amostras sólidas Preparo da amostras para determinação de arsênio total Preparo de amostra para determinação de antimônio total Estratégia de análise de especiação Métodos de extração de arsênio Métodos de extração de antimônio Métodos de detecção com geração de hidreto por espectrometria atômica Geração de Hidreto Espectrometria de absorção atômica (AAS) Atomização em tubo de quartzo com chama e elétrico Espectrometria de fluorescência atômica (AFS) Análise de especiação não-cromatográfica de arsênio e antimônio por técnicas de. espectrometria atômica com geração de hidreto Análise de especiação de arsênio Análise de especiação baseada na seletividade da HG Técnica de FI- HG AAS...39

11 Técnica de HG AFS Técnica de geração de hidreto eletroquímica (EcHG) Análise de especiação de antimônio Análise de especiação baseada na seletividade da HG Técnica de FI- HG AAS Técnica HG - GF AAS e AFS...44 CAPÍTULO 3 DETERMINAÇÃO DE CÁDMIO E CHUMBO EM EFLUENTES SALINOS DE REFINARIA DE PETRÓLEO APÓS CONCENTRAÇÃO ON-LINE EM UM SISTEMA DE INJEÇÃO EM FLUXO ACOPLADO A UM TS FF AAS 3.1 Introdução Parte Experimental Instrumentação e Acessórios Reagentes Preparação da minicoluna Sistema de pré-concentração on-line Otimização Resultados e Discussão Determinação das condições experimentais do sistema on - line Características analíticas Exatidão do método desenvolvido...62

12 3.3.4 Aplicação Conclusão...65 CAPÍTULO 4. DESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO NÃO-CROMATOGRÁFICO PARA ANÁLISE DE ESPECIAÇÃO DE ANTIMÔNIO E ARSÊNIO EM AMOSTRAS DE VEGETAIS POR HG AFS 4.1 Introdução Parte Experimental Instrumentação e Acessórios Reagentes Material de Referência e Amostra Procedimento geral Preparo de amostra Mineralização por via seca para determinação de antimônio e arsênico total em amostra de vegetais Extração ultrasônica para determinação de espécies de antimônio e arsênico Resultados e Discussão Seleção das condições de extração para determinação de antimônio e arsênio tóxicos Extração de antimônio em amostras de cogumelo...75

13 Extração de arsênico em amostras de alho Análise de Especiação Características analíticas Exatidão do método desenvolvido Análise das amostras de cogumelos Análise das amostras de alho Considerações Finais...84 CAPÍTULO 5 DETERMINAÇÃO DE ARSÊNICO TOTAL EM AMOSTRAS DE VINHO COMERCIALIZADAS NO BRASIL POR HG AAS 5.1. Introdução Parte Experimental Instrumentação e Acessórios Reagentes Procedimento geral Amostra Mineralização por via seca para determinar arsênio total em vinho Determinação de arsênio total em amostras de vinho Otimização Resultados e Discussão...93

14 5.3.1 Otimização do procedimento de pré-concentração Estudo do tipo de Atomizador Características Analíticas Exatidão do método Aplicação do método desenvolvido Considerações Finais CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS...104

15 LISTA DE FIGURAS...Pg Figura 1.1 Etapas da extração em fase sólida...7 Figura 1.2 Representação esquemática das etapas de um procedimento de extração em fase sólida usando minicolunas...8 Figura 1.3 Diagrama esquemático do TS-FF AAS...16 Figura 1.4 Comparação do sinal do padrão de Pb obtidos com TS-FF-AAS e com FAAS...17 Figura 3.1 Coluna empregada no sistema analítico em linha. Fase sólida XAD 7 impregnada com ditizona, TP: Tubo plástico usado para soro (equipo), TG: Tubo Tygon, TC: tubo capilar de Teflon...51 Figura 3.2 Diagrama esquemático do sistema de pré-concentração de Cd ou Pb, acoplado ao TS-FF-AAS Figura 3.3 Representação do desenho Box-Behnken como resultado da interlocação de desenhos fatoriais Figura 3.4 Superfícies de respostas para o planejamento obtido pelo ajuste de uma função quadrática aos dados da tabela Figura 3.5 Superfícies de respostas obtidas para cádmio pelo ajuste de uma função quadrática aos dados da tabela

16 Figura 4.1 Sistema em fluxo empregado para determinação de antimônio e arsênio por HG AFS...70 Figura 5.1 Sistema em fluxo para geração de hidreto por AAS...89 Figura 5.2 Superfícies de respostas para o planejamento obtido pelo ajuste de uma função quadrática aos dados da tabela Figura 5.3 Concentração de arsênio (µg L -1 ) em amostras de vinho brasileiros...100

17 LISTA DE TABELA...Pg Tabela 2.1. Valores experimentais de LD 50 (dose letal para 50% de uma população) de espécies de As...22 Tabela 3.1-Parâmetros instrumentais para determinação de cádmio e chumbo por TS-FF- AAS...50 Tabela 3.2 Matriz do planejamento Box-Behnken com valores reais codificados...55 Tabela 3.3 Análise de variância (ANOVA) para (a) cádmio e (b) chumbo...59 Tabela 3.4 Determinação de cádmio e chumbo em material de referência certificado...62 Tabela 3.5 Determinação de cádmio e chumbo em amostras de efluente hídrico de refinaria de petróleo...63 Tabela 3.6 Comparação entre diferentes sistemas de pré-concentração para determinação de cádmio e chumbo por espectrometria de absorção atômica...64 Tabela 4.1 Condições químicas e instrumentais empregadas para determinação de Sb e As total e espécies por HG-AFS...71 Tabela 4.2 Estudo de agentes extratantes para determinação de antimônio em cogumelos...77 Tabela 4.3 Estudo de agentes extratantes para determinação de arsênio em amostra de alho...77 Tabela 4.4 Características analíticas do método desenvolvido...79

18 Tabela 4.5. Recuperação de espécies de antimônio, utilizando adição de analito em amostras de cogumelos analisadas por HG-AFS...81 Tabela 4.6. Recuperação de espécies de arsênio, utilizando adição de analito em amostras de alho analisadas por HG-AFS...81 Tabela 4.7. Análise de especiação não-cromatográfica do material de referência certificado NIST 1573a (tomato leaves)...81 Tabela 4.8. Concentrações de espécies de Sb em amostras de cogumelos comerciais, determinadas por HG-AFS...83 Tabela 4.9 Concentrações de espécies de As em amostras de cogumelos comerciais, determinadas por HG-AFS Tabela 5.1 Condições químicas e instrumentais empregadas para determinação de As total por HG-AAS...89 Tabela 5.2 Matriz de planejamento Box-Behnken para otimização das condições de geração de hidreto...94 Tabela 5.3 Curvas de calibração para As usando atomização eletrotérmica e atomização na chama para o sistema de FI-HG - AAS...96 Tabela 5.4 Características analíticas do método desenvolvido...97 Tabela 5.5 Recuperação de arsênio total utilizando o teste de adição do padrão, em amostras de vinhos analisada por HG-AAS...98 Tabela 5.6 Determinação de arsênio total em amostras de vinhos comercializadas no Brasil...99

19 ABREVIATURAS E SIGLAS ICP OES Plasma Indutivamente Acoplado à Espectrometria de Emissão Ótica ICP-MS Plasma Indutivamente Acoplado à Espectrometria de Massa HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência FAAS Espectrometria de absorção atômica com chama GF AAS Espectrometria de absorção atômica em forno de grafite ET AAS Espectrometria de absorção atômica com atomização eletrotérmica AAS Espectrometria de absorção atômica BIFF-AAS do inglês, Beam Injection Flame Furnace Atomic Absorption Spectrometry TS-FF-AAS Espectrometria de absorção atômica baseada em spray térmico do inglês, Thermospray Flame Furnace Atomic Absorption Spectrometry HG ET- AAS Espectrometria de absorção atômica com atomização eletrotérmica e geração de hidreto. CPE Extração em Ponto Nuvem EFS Extração em Fase Sólida THB Tetrahidroborato ABS Absorvância ANOVA Análise de Variância LD Limite de detecção LQ Limite de quantificação RSD Desvio padrão relativo

20 RESUMO Neste trabalho, foram desenvolvidos métodos para determinação de cádmio e chumbo em amostras ambientais e antimônio e arsênio em amostras de alimentos, utilizando técnicas de espectrometria atômica. A determinação do cádmio e do chumbo foi realizada através de um sistema de injeção em fluxo acoplado a técnica TS FF AAS. Os íons de cádmio (II) e chumbo (II) foram retidos em uma mini-coluna de Amberlite de XAD 7 impregnada com ditizona. O planejamento Box- Behnken foi empregado para determinação das condições ótimas da etapa de concentração do chumbo e do cádmio. Os limites de detecção foram de 0,012 e 0,34 µg L -1 para cádmio e chumbo, respectivamente. O método foi aplicado em amostras de resíduos de refinaria de petróleo. A exatidão foi confirmada por análise da CRM NIST 1643d. Foi também desenvolvido um método para determinação de espécies tóxicas de arsênio e antimônio em amostras de alho e cogumelos, respectivamente por HG AFS. A determinação das espécies (III) e (V) de arsênio e antimônio foram baseadas na eficiência de geração de hidreto empregando NaBH 4, com e sem uma prévia redução com KI, usando equações proporcionais correspondentes para as duas condições de medida. Os analitos foram extraídas com ácido sulfúrico nas condições de 1,0 e 0,5 mol L -1 para arsênio e antimônio, respectivamente. Com o método desenvolvido obteve-se limites de detecção de 0,6, 1,1, 0,84 e 1,4 ng g -1 para Sb(III), Sb(V), As(III) e As(V), respectivamente. A exatidão do método foi confirmada através de testes de adição e recuperação das espécies bem como, um material de referência certificado NIST 1573a. Um método para determinação de arsênio total em vinho também foi desenvolvido. O arsênio foi determinado por FI-HG AAS com um sistema de atomização eletrotérmica. O planejamento Box-Behnken foi utilizado na determinação das condições ótimas para geração de hidreto. Com método proposto obteve um limite de detecção de 0,06 µg L -1 e foi aplicado em 20 amostras de vinhos comercializadas do Brasil. Palavras Chaves: espectrometria de absorção atômica com geração de spray térmico, espectrometria atômica com fluorescência atômica e geração de hidreto, espectrometria de absorção atômica com geração de hidreto, efluentes de refinaria de petróleo, amostras de vegetais, vinhos.

21 ABSTRACT In this work, methods were developed for determination of cadmium and lead in environmental samples besides antimony and arsenic in food samples using atomic spectrometric techniques. The determination of cadmium and lead was performed by a flow injection system technique coupled with TS FF AAS. The ions of cadmium (II) and lead (II) were retained in an Amberlite XAD 7 mini-column impregnated with dithizone. The Box-Behnken design was employed to determine the optimum conditions of the concentration stage of lead and cadmium. The detection limits were and 0.34 µg L -1 for cadmium and lead, respectively. The method was applied to samples of waste from oil refinery. The accuracy was confirmed by CRM NIST 1643d analysis. It was also developed a method for determination of arsenic and antimony toxic species in samples of garlic and mushrooms, respectively, by HG AFS. The determination of the species (III) and (V) of arsenic and antimony were based on the efficiency of hydride generation using NaBH 4 with and without a previous reduction with KI, using proportional equations corresponding to the two measuring conditions. The arsenic and antimony were extracted with sulfuric acid under 1.0 and 0.5 mol L -1 conditions, respectively. Along with the developed method detection limits of 0.6, 1.1, 0.84 and 1.4 ng g -1 for Sb (III), Sb (V), As (III) and As (V) were obtained, respectively. The accuracy of the method was confirmed through tests of addition and recovery of species and a certified reference material NIST 1573a. A method for determination of total arsenic in wine was developed. The arsenic was determined by FI- HG AAS system with electrothermal atomisation. The Box-Behnken design was used in determining the optimum conditions for hydride generation. The proposed method achieved a detection limit of 0.06 μg L -1 and was applied on 20 samples of wine sold in Brazil. Keywords: hydride generation atomic fluorescence spectrometry, thermospray flame furnace atomic absorption spectrometry, hydride generation atomic absorption spectrometry, oil refinery effluent samples of foods.

22 Introdução Geral No meio ambiente, existem cerca de vinte elementos considerados tóxicos para os humanos, incluindo cádmio, chumbo, arsênio e antimônio. Desta forma, é de grande importância o entendimento dos mecanismos de translocação desses elementos no meio ambiente e seus efeitos em sistemas biológicos. Em amostras de água e de alimentos, o cádmio, chumbo, arsênio e antimônio geralmente encontram-se em quantidades traço. Isto requer o desenvolvimento de métodos cada vez mais sensíveis, para determinação das concentrações totais e também de suas espécies químicas, nestes tipos de amostras. A espectrometria de absorção atômica com chama é uma técnica bastante promissora para análise de rotina de metais em amostras ambientais e de alimentos, devido ao seu baixo custo de manutenção e simplicidade de operação. Entretanto, o seu sucesso depende do procedimento de introdução da amostra. No procedimento mais comum, através de um nebulizador pneumático, ocorre perda de grande parte da amostra, menos de 10% da amostra aspirada é utilizada, sendo que sua maior parte é descartada. Esse nebulizador também apresenta dificuldades quando são usadas soluções muito viscosas ou com alto teor salino ou, ainda, quando se dispõe apenas de micro-volumes de amostra [1]. Uma alternativa para melhorar a sensibilidade da espectrometria de absorção atômica em chama é o acoplamento de um sistema de geração de hidreto com atomização da espécie de interesse em uma célula de quartzo (HG - AAS). Outra alternativa seria um sistema com a formação de um spray térmico e atomização em um tubo de níquel (TS-FF- AAS). Ambas as técnicas possuem grandes vantagens em termos de sensibilidade e vêm sendo empregadas para determinação de metais e ametais em amostras de alimentos e ambientais, com características analíticas satisfatórias.

23 2 Os procedimentos de pré-concentração do analito também podem ser utilizados para melhorar a sensibilidade e diminuir o efeito de matriz durante a análise [2]. Como por exemplo, a extração em fase sólida, que pode ser utilizada para este fim, sendo que a mesma possui a vantagem de permiti automação do sistema. A espectrometria de fluorescência atômica com geração de hidreto é uma técnica bastante sensível para determinação de metalóides em quantidades traço, como As e Sb, em amostras ambientais e de alimentos [3]. Os limites de detecção na faixa de ng L -1 dispensam o uso de procedimentos de concentração. Neste trabalho, foram desenvolvidos procedimentos analíticos para determinação de cádmio e chumbo, em amostras de água de refinaria, e antimônio e arsênio em amostra de alimentos, utilizando diferentes estratégias. A tese consta de uma parte introdutória com fundamentações teóricas a respeito dos métodos desenvolvidos, e nos últimos três capítulos serão apresentadas as estratégias analíticas desenvolvidas para determinação do conteúdo total de metais e ametais, bem como as espécies químicas de antimônio e arsênio inorgânicos. Objetivo Geral Desenvolver procedimentos para determinação de cádmio e chumbo em amostra de água e especiação de antimônio e arsênio em amostra de alimentos, empregando técnicas de espectrometria atômica.

24 3 Objetivos Específicos Desenvolver e validar um método analítico para quantificar cádmio e chumbo em amostras de água com alto teor salino. Empregar técnicas quimiométricas modernas de planejamento de experimentos na otimização do procedimento de pré-concentração. Utilizar o planejamento Box-Behnken como matriz experimental na otimização da etapa de pré-concentração em fase sólida. Aplicar o procedimento de extração e pré-concentração em fase sólida para melhor a sensibilidade do TS-FF-AAS. Desenvolver um método que permita a extração de espécies de arsênio e antimônio em amostras de alho e cogumelo. Desenvolver um método analítico para determinação do conteúdo total e das espécies químicas de antimônio e arsênio, por espectrometria de fluorescência atômica. Empregar a geração de hidreto com atomização eletrotérmica, para quantificar arsênio em amostras de vinho. Avaliar o conteúdo total de arsênio em amostras de vinhos brasileiros.

25 4 CAPÍTULO 1 PROCEDIMENTOS ANALÍTICOS UTILIZANDO SISTEMA DE PRÉ- CONCENTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA E TS - FF- AAS PARA DETERMINAÇÃO DE CÁDMIO E CHUMBO

26 5 1- Métodos de separação e pré-concentração Os métodos de separação e pré-concentração são de grande importância para determinação de metais em quantidades traço. Estes métodos possibilitam a eliminação dos efeitos de matriz e a diminuição do limite de detecção da técnica, utilizada no processo de quantificação do analito. A pré-concentração também aumenta a sensibilidade, melhora a precisão dos resultados e oferece alto grau de seletividade [2,4]. Os procedimentos de separação e pré-concentração do analito, desenvolvidos para cádmio e chumbo, baseiam-se nas propriedades físico-químicas desses elementos. Entre estes, podemos destacar: a extração líquida líquido, deposição eletroanalítica, coprecipitação e precipitação, extração em ponto nuvem, e a extração em fase sólida [5,6]. A extração em fase sólida está sendo mais utilizada, devido a sua simplicidade, facilidade de automação, adequados fatores de pré-concentração e à elevada freqüência analítica. 1.1 Extração em fase sólida (EFS) A extração em fase sólida baseia-se na partição do analito entre uma fase aquosa e uma fase sólida adsorvente. Este fenômeno ocorre, através de adsorção física, troca iônica ou reações de formação de complexos. A transferência da massa do analito é favorecida através da seleção das condições ótimas no sistema composto da fase líquida, pela substância escolhida e o sorvente, fase sólida. Após a retenção na fase sólida, processo de sorção, o analito é re-extraído com um pequeno volume de eluente e, desta maneira, recuperado. Este procedimento permite fatores de pré-concentração bastante elevados [7].

27 Princípios Básicos [7] Um método de EFS é constituído de três a quatro sucessivas etapas, conforme ilustrado, na Figura 1.1. Na primeira etapa, um sorbente sólido deve ser acondicionado utilizando um solvente apropriado. Esta etapa é fundamental, pois permite a hidratação do material empacotado e a solvatação dos grupos funcionais. No segundo passo, a amostra é colocada em contato com a fase sólida. Dependendo do sistema utilizado, os volumes podem variar de 1 ml a 1 L. A amostra pode ser introduzida na coluna por gravidade, bombeamento, aspirada pelo vácuo ou por um sistema automatizado. A razão de fluxo da amostra, através do sorbente, deve ser suficientemente baixa para permitir a retenção eficiente dos analitos, e alta o suficiente para evitar um tempo excessivo. Os componentes da matriz também podem ser retidos pelo sólido sorbente ou passarem através dele. Neste último caso, permitindo assim a purificação (separação da matriz) da amostra. A terceira etapa, que é opcional, ocorre à lavagem do sólido sorbente com um solvente adequado, que possua uma baixa força de eluição, para remover os componentes da matriz, que tenham sido retidos pela fase sólida, sem perda dos analitos. A etapa final consiste na eluição dos analitos de interesse por um solvente apropriado, sem remover componentes retidos da matriz. O volume do solvente deve ser ajustado de forma a conseguir recuperações quantitativas do analito, com diluição reduzida. Além disso, a razão de fluxo deve ser ajustada corretamente para assegurar a eficiência da eluição.

28 7 Figura 2.1 Etapas da extração em fase sólida: (A) condicionamento; (B) sorção; (C) lavagem; (D) eluição [7]. A extração pode ser feita em batelada, onde o sorbente sólido é misturado à amostra por agitação e a fase sólida separada por filtração, ou em fluxo, na qual a extração ocorre com a passagem da amostra por um pequeno tubo contendo a fase sólida empacotada e pré-condicionada Sistemas de EFS em linha A injeção em fluxo (FI) pode ser definida como um processo de automação de procedimentos analíticos, nos quais a amostra em solução aquosa é introduzida em um fluido carregador, que a transporta em direção ao detector. Durante o transporte da amostra, seus componentes podem sofrer reações químicas e/ou passar por etapas de separação e retenção de analito [8].

29 8 Os sistemas em fluxo são considerados promissores devido à versatilidade e possibilidade de acoplamento com os mais distintos sistemas de detecção disponíveis, em instrumentação analítica, pré-concentração eficiente, remoção de matriz, redução do volume da amostra e reagentes, redução do risco de contaminação, apresentando custos operacionais e de manutenção relativamente baixos. Os sistemas de EFS em linha geralmente são compostos por diferentes componentes, tais como; uma bomba peristáltica, amostradores, pontos de adição de reagentes, reatores, colunas de troca iônica e comutadores, que deslocam o percurso do analito de sua posição original até outra pré-selecionada, proporcionando uma grande variedade de procedimentos analíticos O processo de pré-concentração usando a EFS em linha ocorre basicamente em duas etapas, as quais envolvem a retenção e a eluição [10]. Na Figura 1.2, encontra-se a representação esquemática das etapas. Figura 1.2. Representação esquemática das etapas de um procedimento de extração em fase sólida usando minicolunas. A: etapa de amostragem, B: etapa de eluição, C: coluna, V: válvula, P: bomba peristáltica, S: amostra, E: Eluente e W: descarte.

30 9 Os sorventes podem ser empacotados em diferentes formas: cartuchos, seringas, discos e mini-colunas [11,12,13]. Os sistemas de EFS baseados no uso de minicolunas estão ganhando destaque na química de separação, porque apresentam algumas vantagens, que incluem a facilidade de operação, a robustez e a versatilidade devido ao grande número de sorventes, reagentes complexantes e eluentes. Entretanto, níveis diferenciados de resistência à passagem do fluxo e a necessidade de pré-condicionamento antes da amostragem, após cada ciclo de eluição, constituem algumas das restrições ao seu uso [14] Parâmetros que caracterizam sistemas de pré-concentração em linha [14] No sentido de avaliar o desempenho de um método analítico, baseado em procedimentos de separação e pré-concentração, em sistemas em linha, além dos critérios normalmente usados em outros métodos (limites de detecção e quantificação, exatidão e precisão) são também empregados critérios, que descrevem a habilidade do sistema em préconcentrar os elementos em estudo. Os parâmetros que caracterizam sistemas de préconcentração em linha são de extrema importância, pois permitem selecionar o método, que apresenta características desejáveis para uma finalidade específica. Estes parâmetros são os seguintes: Fator de enriquecimento (FE) O fator de enriquecimento ou de pré-concentração é um parâmetro bastante utilizado para avaliação do sistema de pré-concentração. Teoricamente, este fator é representado pela razão entre a concentração do analito, na fase concentrada (Ce), e a

31 10 concentração do analito na amostra original (Ca). Este parâmetro pode ser expresso pela Equação 1. FE = Ce / Ca ( Equação 1) Entretanto na EFS, nem sempre é possível uma retenção de 100% do analito, sendo assim o fator de enriquecimento é geralmente expresso como a razão entre os coeficientes angulares das curvas analíticas com e sem pré-concentração. Desta forma, a avaliação é baseada no aumento das respostas e não no aumento da concentração. Neste caso, o FE é expresso pela Equação 2. FE = A 1 / A 2 ( Equação 2) Onde : A 1 é o coeficiente angular da curva analítica com pré-concentração e A 2 o coeficiente da curva analítica sem pré-concentração. Apesar do FE ser indispensável para avaliação de um sistema de préconcentração, nem sempre alto fator de enriquecimento significa alta eficiência do sistema de pré-concentração. Estes fatores podem ser obtidos por longos tempos de préconcentração, acarretando alto consumo de amostras e diminuindo o número de amostras analisadas por hora Eficiência de concentração (EC) A eficiência de concentração (EC) é definida como o produto do fator de enriquecimento e a freqüência de amostras (f), em número de amostras analisadas por minuto, expressa em min -1 (Equação 3).

32 11 EC = FE x ( f / 60 ) ( Equação 3) O valor obtido indica o fator de enriquecimento de um analito promovido pelo sistema em um minuto. O EC permite a comparação das eficiências de procedimentos de pré-concentração, baseados em diferentes princípios de separação Índice de consumo (IC) O índice de consumo é outro parâmetro que reflete a eficiência do sistema de pré-concentração. O IC é definido como sendo o volume de amostra consumidos (V a ), em mililitros, para se obter uma unidade de fator de enriquecimento (FE). IC = V a / FE ( Equação 4) Conhecer o valor do IC, que é expresso pela Equação 4, é de grande importância, quando a quantidade de amostra é limitada ou quando um grande número de amostras deve ser coletado e levado para laboratórios distantes Fator de transferência de fase (F) Em métodos de pré-concentração em linha, utilizando a EFS, a transferência do analito da amostra para a fase sólida nem sempre é completa. Isto pode ser devido o tempo de equilíbrio insuficiente ou da capacidade inadequada do meio de coleta. A perda do analito nem sempre afeta o fator de enriquecimento, caso as perdas forem reprodutíveis para amostras e padrões. Entretanto, quando ocorre perda devido à insuficiente capacidade do meio de coleta, os resultados são mais comumente afetados por efeitos de matriz e interferências de espécies concorrentes.

33 12 O fator de transferência de fase é definido como a razão entre a massa do analito na fase concentrada (m e ) e a massa do analito na amostra original (m s ). O F é expresso pela Equação 5. F = m e / m s ( Equação 5) Freqüência de amostragem A freqüência de amostragem estabelece a quantidade de amostras que podem ser analisadas por hora. Altas frequências representa uma vantagem, quando o método se destina a análise de um número muito grande de amostras em um período curto de tempo. 1.3 Extração de cádmio Devido às baixas concentrações do cádmio no meio ambiente freqüentemente é necessário um sistema de pré - concentração para sua determinação. A extração em fase sólida apresenta um conjunto de características desejáveis, quando aplicados na quantificação de íons cádmio em diversos tipos de amostras. Numerosos sorventes são empregados em procedimentos de pré-concentração do cádmio, baseados na EFS, incluindo materiais sintéticos e naturais. Muitos materiais sintéticos, como polímeros divinilbenzeno, zeólitos e espuma de poliuretano, são empregados para pré-concentração de íons cádmio. A partir destes materiais, resinas quelantes podem ser preparadas por meio de diferentes procedimentos [5]. Os reagentes complexantes podem ser associados ao sorvente por dois meios diferentes: (1) através da ligação química destes reagentes com os sorventes existentes

34 13 (sorventes funcionalizados); (2) ligações físicas de um ligante quelante com o sorvente, por impregnação da matriz sólida com uma solução contendo substâncias específicas (sorventes impregnados) [15]. A interação física é a mais simples e mais utilizada na prática. No entanto, a ligação química permite uma maior durabilidade da coluna, devido às ligações covalentes entre o ligante e o suporte. Esta propriedade evita a possibilidade de arraste do ligante, da coluna durante percolação da amostra ou etapa de eluição. Vários reagentes complexantes têm sido imobilizados sobre uma variedade de matrizes sólidas e utilizadas com sucesso na pré- concentração e determinação de cádmio [5]. Uma resina de XAD - 4 (AT-XAD) funcionalizada com 2- aminotiofenol foi empregada para extração de íons de cádmio em amostras de tabaco. A minicoluna empacotada com a AT-XAD foi conectada em um sistema on-line de concentração e o metal foi detectado por FAAS [16]. A impregnação do sorvente com um reagente quelante foi relatada para concentração de Cd (II). Nesse caso, a escolha de um quelante, que tenha uma elevada afinidade com o cádmio é preferível, para garantir seletividade. Por exemplo, BSQ foi imobilizada em Amberlite XAD-7 e utilizada em um sistema em fluxo, obtendo um limite de detecção de 1,9 µg L -1 [17]. No entanto, Zn (II) também foi retido e outros íons foram encontrados como interferentes: (Mg (II), Cu (II), Fe(III)). Amberlite XAD- 7 revestida com DMBS também permite a retenção de Cd (II) em meio neutro com simultânea retenção do Pb (II) [18]. Um método para concentração de cádmio e outros metais traço complexados com APDC foi desenvolvido usando uma minicoluna empacotada com uma resina de XAD-2000 [19].

35 Extração de chumbo Os sorventes utilizados em sistemas de EFS de chumbo podem ser não-iônicos, iônicos ou quimicamente modificados com a ajuda de reagentes complexantes. Suportes não - iônicos são potenciais coletores de analitos, na forma de um único íon ou associados com outras espécies como complexos [6]. Nesta classe de sorventes, incluem-se carvão ativado [20], adsorventes naturais [21], resinas Amberlite XAD [22,23,24,25], polietileno [26] e outros [27]. O chumbo também pode ser complexado com ligantes em vários suportes, tais como: espuma de poliuretano [28,29] e materiais poliméricos [30,31], que aumentam a eficiência para procedimentos de concentração. Muitos reagentes foram utilizados para impregnar esses suportes e reter íons de chumbo por complexação. Estes incluem: 2 - (2- Tiazolilazo-)-p-cresol (TAC) [32], 2 - (2-benzotiazolilazo)-2-p-cresol (BTAC) [29,33], 1 - (2-piridilazo)-2-naftol (PAN) [34], ditizona [35,36] e 2 - (5-bromo-2-piridilazo)-5-dietilaminofenol (5-Br-PADAP) [37]. Resinas quelantes também foram sintetizadas para a seletiva concentração de Pb (II) [7]. A amberlite de XAD-2 foi funcionalizada por vários agentes quelantes, como CA (ácido cromotrópico), PC (pirocatecol) e TSA (ácido tiosalicilico), e usada para a retenção de Pb (II), em amostras de água [38]. Similarmente, este sorvente funcionalizado com SA ( ácido salicílico) também permite a retenção de Pb (II) [39].

36 Espectrometria de absorção atômica com tubo na chama (TS - FF - AAS) A espectrometria de absorção atômica em chama (FAAS) é ainda a técnica mais utilizada entre as técnicas de espectrometrias atômicas, para determinação de elementos na concentração de mg L -1. Isto acontece devido ao seu baixo custo, a robustez, simplicidade e seletividade. Entretanto, a técnica não possui sensibilidade para determinação de cádmio e chumbo em quantidades traço, um dos motivos é a sua baixa eficiência de nebulização, pois apenas 5-10% dos aerossóis produzidos atingem a chama [40]. A sensibilidade das medidas em absorção atômica em chama pode ser melhorada significativamente, aumentando a eficiência da geração do aerosol e prolongando o tempo de permanência dos átomos, do analito, livre no caminho óptico. Neste sentido, Gaspar e Berndt desenvolveram um sistema de introdução da amostra por um jato de líquido sob alta pressão que ficou conhecido como beam injection flame furnace atomic absorption spectrometry (BIFF - AAS) [41]. Em BIFF-AAS, a amostra líquida a ser analisada é transportada, em alta velocidade, produzindo um jato, o qual se choca contra a parede interna do tubo aquecido sobre a chama, causando a formação de um aerosol pelo efeito de nebulização por impacto de jato [41]. Como a amostra é introduzida completamente no local da medida da AAS, o analito permanece mais tempo no caminho óptico, aumentando assim, o limite de detecção. Utilizando o sistema de BIFF- AAS, foi observado um aumento de detecção em até duas ordens de grandeza para dezessete elementos estudados [41]. Outro sistema, (TS FF- AAS), do inglês thermospray flame furnace atomic absorption spectrometry, foi desenvolvido para possibilitar a introdução completa de uma

37 16 amostra líquida em forno sobre a chama. Diferente do BIFF-AAS, um sistema de spray térmico é usado na introdução da amostra dentro de um forno metálico, aquecido sobre uma chama de ar/acetileno. No sistema do spray térmico empregado na absorção atômica com chama, um tubo metálico ou cerâmico é posicionado sobre o queimador de um espectrômetro de chama convencional e a amostra é introduzida por um capilar conectado a ele (Figura 1.3). O tubo funciona como uma célula de atomização, aumentando o tempo de residência do analito no caminho óptico, conseqüentemente, aumentando a eficiência do processo de atomização, e concentração da nuvem atômica. A introdução de 100% da amostra é garantida pela formação de um aerosol térmico, no interior do capilar em contado com o tubo aquecido sobre a chama. Geralmente, em aplicações do spray térmico, uma bomba de HPLC é usada no transporte do líquido. No entanto, no sistema do TS - FF - AAS o uso de uma bomba peristáltica ou de baixa pressão é suficiente para alcançar os resultados analíticos satisfatórios [42]. Figura 1.3- Diagrama esquemático do TS-FF -AAS [42]

38 Absorvância 17 O desempenho da técnica TS-FF-AAS pode ser melhorado, ainda mais, empregando-se etapas de pré-concentração em linha [43], podendo alcançar limites de detecção comparáveis com aqueles encontrados na ET AAS, reduzindo o custo de análise. Porém, uma limitação da técnica TS-FF-AAS é o seu emprego apenas para espécies voláteis, devido ao fato da temperatura máxima atingida pelo tubo de níquel ser aproximadamente 1000 C. O chumbo e o cádmio são alguns dos elementos que podem ser determinados por TS-FF-AAS. Estudos realizados por Gaspar e Berndt demonstraram a superioridade do TS- FF-AAS na determinação de cádmio e chumbo, em relação ao FAAS. Os limites de detecção para cádmio e chumbo aumentaram numa ordem de grandeza 57 e 31, respectivamente [42]. A Figura 1.4 apresenta a comparação do sinal obtido pelo chumbo nas duas técnicas. Figura 1.4. Comparação do sinal do padrão de Pb obtidos com TS-FF-AAS e com FAAS [42]. Tempo (min)

39 18 Apesar da técnica ainda ser pouco empregada, o número de trabalhos publicados vem crescendo nos últimos anos e diversas metodologias estão sendo empregadas, para determinação de cádmio e chumbo em diversas amostras. Lemos e colaboradores desenvolveram um procedimento de concentração online para determinação de cádmio, cobre e zinco em amostras biológicas por TS-FF-AAS. Os metais foram retidos em uma mini-coluna contendo uma resina de (XAD4-DHB) funcionalizada. Os limites de detecção encontrados foram de 28, 100 e 77 ng L -1, para cádmio, cobre e zinco, respectivamente [43]. Schiavo e colaboradores avaliaram a aplicabilidade da técnica para determinação direta de Cu, Cd e Pb, em amostras de vinhos e sucos de uva utilizando a metodologia da adição padrão. Os limites de detecção (LD) obtidos foram de 12,9, 1,8 e 5,3 µg L -1 para Cu, Cd e Pb, respectivamente [44]. Coelho e colaboradores propuseram um procedimento de concentração de Cd, Cu e Pb, usando extração por ponto nuvem (CPE) e determinação multielementar seqüencial em amostras de água mineral. Os limites de detecção (LD) obtidos foram de 0,025, 0,38, e 0,43 µg L -1 de Cd, Cu e Pb, respectivamente [45]. Petrucelli e colaboradores descreveram uma metodologia para determinação de Cd e Pb em suspensão de lodo de esgoto. Os limites de detecção e quantificação foram, respectivamente, 0,2 e 0,7 µg kg -1 de Cd e 8 e 26 µg kg -1 para Pb [46].

40 19 CAPÍTULO 2 METODOLOGIAS ANALÍTICAS PARA DETERMINAÇÃO DE ARSÊNIO E ANTIMÔNIO

41 O elemento químico arsênio O arsênio é o vigésimo elemento mais abundante na crosta terrestre, encontra-se amplamente distribuído no meio ambiente e em sistemas biológicos. A abundância terrestre do arsênio é cerca de 1,5 3,0 mg kg -1 [48]. Sua presença é proveniente tanto de fontes naturais quanto antrópicas. As principais fontes naturais de arsênio são atividades geotermal e vulcânica, os minerais e as rochas, que contêm o elemento, os solos e os sedimentos formados a partir dessas rochas. As fontes antrópicas incluem à utilização de pesticidas, aplicação de fertilizantes e aos rejeitos provenientes da mineração e da queima de carvão rico em arsênio [47,48]. O arsênio é o componente de mais de duzentos e quarenta e cinco minerais em sua maioria combinado com cobre, níquel, chumbo, cobalto, enxofre, entre outros [48]. Ao redor do mundo, existem diferentes depósitos minerais de arsênio, sendo que arsenopirita é o mineral mais comum. O arsênio e seus componentes são móveis no ambiente. O intemperismo de rochas converte os sulfetos de arsênio em trióxido, que entram no ciclo do arsênio, como poeira ou por dissolução na chuva, nos rios ou nas águas subterrâneas. As águas subterrâneas contaminadas por arsênio são uma grande ameaça a humanidade, porque pode também participar da cadeia alimentar, se expandindo por todo o reino vegetal e animal [48]. Nas rochas, a concentração varia de 0,5 a 2,5 µg g -1, embora já tenha sido encontrado em concentrações maiores, variando entre as regiões geográficas de todo o mundo [49]. Em águas naturais não poluídas, encontra-se em concentrações na razão de 1 a 10 µg L -1 ; 100 a 5000 µg L -1 para águas em áreas com atividade mineral [50], em água do

42 21 mar, geralmente encontra-se entre 1 e 8 µg L -1 [48]. Em plantas, a concentração depende da quantidade que é exposta. Sua concentração varia de menos de 0,01 a cerca de 5 µg g -1 (resíduo seco) [51]. As formas químicas de arsênio encontradas na natureza incluem espécies orgânicas e inorgânicas, como resultado de sua participação em complexos biológicos, processos químicos e algumas aplicações industriais, tais como: a manufatura de certos vidros, materiais semicondutores, fotocondutores, entre outros [52,53,54]. As formas químicas mais comuns são arsenato [As +5 ], arsenito [As 3+ ], arsênio elementar [As ] e a arsina [As 3- ]. As formas orgânicas mais comuns são dimetilarsenato [DMA 5+ ], dimetilarsenito [DMA 3+ ], monometilarsenato [MMA 5+ ], monometilarsenito [MMA 3+ ], arsenobetaína [AsB] e arsenocolina [AsC]. As espécies com estados de oxidação 0 e -3 existem somente em condições extremamente redutoras, enquanto que os estados +3 e +5 ocorrem em ambientes oxigenados ou fracamente redutores [55]. Os compostos de arsênio são facilmente absorvidos, tanto oralmente quanto por inalação, sendo que a extensão da absorção depende da solubilidade do composto. Uma longa exposição a compostos inorgânicos de arsênio, através da água de consumo, pode conduzir o individuo a várias doenças tais como: conjuntivite, hiperqueratose, hiperpigmentação, doenças cardiovasculares, distúrbios no sistema nervoso central e vascular periférico, câncer de pele e gangrena nos membros [56]. O efeito tóxico das espécies de arsênio depende, principalmente, de sua forma química. A ordem decrescente de toxidez dos compostos de arsênio é a seguinte: arsina > arsenito > arseniato > ácidos alquil-arsênios > compostos de arsônio > arsênio elementar. O arsênio trivalente (arsenito) é sessenta vezes mais tóxico, que a forma oxidada pentavalente (arsenato). Os compostos

43 22 inorgânicos são cem vezes mais tóxicos, que as formas parcialmente metiladas (MMA e DMA) [57,58,59,60]. Analisando os valores experimentais de LD 50, encontrados na tabela 2.1, pode-se verificar que, com exceção do íon tetrametilarsênio (TeMA), o grau de toxidez geralmente decresce com o aumento da metilação. Tabela 2.1. Valores experimentais de LD 50 (dose letal para 50% de uma população) de espécies de As [61] Espécies de Arsênio LD 50 (g/kg) As (III) 0,0345 MMA 1,8 DMA 1,2 TeMA 0,89 TMAO 10,6 AsC >6,5 AsB >10,0 2.2 O elemento químico antimônio O antimônio é um elemento que pertence ao grupo quinze da tabela periódica dos elementos. Existi em uma variedade de estados de oxidação (-III, 0, III, V), mas é encontrado principalmente em dois estados de oxidação, III e V em amostras ambientais, biológicas e geoquímicas. O antimônio ocorre na natureza principalmente como Sb 2 S 3 e Sb 2 O 3. Estes compostos de antimônio são comumente encontrados em minérios de cobre, prata e chumbo, no carvão e em petróleo [62]. O composto organoantimônio também pode ser encontrado no ambiente, todavia suas baixas concentrações e a falta de metodologias adequadas dificultam a sua detecção [63]. Dodd e colaboradores, empregando a HG-GC-MS, conseguiram detectar MeSbH 2, Me 2 SbH e Me 3 Sb em amostras de plantas [64]. Posteriormente, Craig e colaboradores confirmaram a presença de metilantimônio em algumas espécies de plantas.

44 23 Os níveis de MeSbH 2 e Me 2 SbH variavam entre 100 a 200 ng g -1 de Sb encontrados em amostras de musgos [65]. As fontes naturais de antimônio no ambiente resultam do intemperismo de rochas e do processo de lixiviação do solo, enquanto fontes antropogênicas incluem queima de combustíveis fósseis, mineração e atividade de fundição e à aplicação de fertilizantes de superfosfato nos solos agrícolas. A liberação do antimônio, a partir destas fontes, foi encaminhada em quase todos os sistemas ambientais e as concentrações globais presentes nos solos são estimadas entre 1 mg kg -1 [66], entretanto em águas frescas e salinas apresentam concentrações entre 0,01-5,6 ng ml -1 [67,68]. O antimônio e seus compostos foram considerados como poluentes de interesse prioritário pelas agências de proteção ambiental dos Estados Unidos (USEPA, 1979) e da União Européia (Conselho da Comunidade Européia, 1976). O nível máximo permitido em água potável, estabelecido pela USEPA e a União Européia, é de 6 µg L -1 e 5 µg L -1, respectivamente. No Brasil, o Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA 357/2005) também estabelece 5 µg L -1 como limite máximo. O antimônio não possui função biológica conhecida e semelhantemente ao arsênio, é tóxico. A espécie trivalente é mais tóxica, que a forma pentavalente. O antimônio está normalmente presente em níveis inferiores a 1,0 mg g -1 em todos os tecidos humanos, como: pulmão, nódulos linfáticos e cabelo. A maioria dos trabalhos sobre os efeitos tóxicos de antimônio tem sido focada no seu uso na medicina ou na exposição ocupacional. Alguns trabalhos relatam a determinação do antimônio total em plantas [69]. Em plantas terrestres vasculares, o background do conteúdo de antimônio foi encontrado numa faixa de 0,2 a 50 µg kg -1 [70]. No entanto, a determinação da concentração total do antimônio não é uma

45 24 medida adequada, para se estimar o seu risco quando presente em plantas ou alimentos vegetais. Assim, a determinação das espécies de Sb é fundamental para estudos ambientas, porque assim como o arsênio, a toxicidade do antimônio e o seu comportamento biológico dependem da sua forma química [71]. 2.3 Metodologias para determinação de antimônio e arsênio em amostras sólidas A determinação de antimônio e arsênio em amostras ambientais constitui uma problemática analítica, devido às concentrações muito baixas, presentes nas amostras. Várias dificuldades podem ser encontradas na análise de amostras sólidas, como: efeitos de interferências e perda do analito por volatilização. Portanto, a escolha do método de preparo da amostra e a técnica de análise são críticas, sendo que a natureza intrínseca da amostra deve ser cuidadosamente considerada antes da análise. Amostras ambientais podem conter antimônio e arsênio nos estados de oxidação (III) e (V) e ambas as espécies, orgânicas e inorgânicas, podem ser formadas. Sabendo-se que a toxicidade do antimônio e arsênio é dependente da especiação química e que as espécies inorgânicas possuem características mais tóxicas [72,73,74], melhores dados analíticos, relativos ao teor de antimônio e arsênio total e especiação química, são essenciais para compreender o significado das concentrações destes elementos em sistemas ambientais. A maioria dos sistemas analíticos empregados na determinação de elementos químicos em quantidade traços exige que as amostras sejam introduzidas no estado líquido.

46 25 Na determinação de metais e ametais em materiais sólidos, geralmente é necessária a utilização de técnicas de digestão da amostra, que dissolva a matriz e libere o analito de interesse na solução Preparo da amostra para determinação de arsênio total O pré-tratamento de amostras para a determinação de arsênio é sempre associado ao risco inerente de contaminação e perdas por volatilização (cloretos e oxicloretos de arsênio) e adsorção. A mineralização por via seca é um método padrão de preparo de amostras orgânicas, para determinação de arsênio [75]. A utilização de substâncias como MgO e Mg (NO 3 ) 2 na preparação de amostras sólidas, por via seca, evita a perda de arsênio e aumenta a velocidade de oxidação. A sua grande desvantagem é o tempo prolongado, que acaba tornando o método inadequado para ser usado em rotina. A digestão por via úmida pode ser realizada em sistemas fechados ou abertos. Os sistemas fechados funcionam com pressões superiores à dos sistemas abertos, obtendose assim, temperaturas acima daquelas de ebulição do agente oxidante, à pressão ambiente, tendo como resultado um poder de oxidação maior e uma mineralização mais completa da amostra [75]. A determinação de arsênio total pode ser muito difícil se houver resíduo de matéria orgânica, que torna-se crítica nos casos, em que o mesmo está presente como derivados organo-metálicos. Neste caso, a preparação da amostra requer digestão prolongada, em presença de agentes oxidantes, para degradação total da matéria orgânica. Podem ser utilizados vários procedimentos de eliminação da matéria orgânica, entre eles, a

47 26 decomposição em meio alcalino com persulfato de potássio em bomba de Teflon [76] e digestão por via seca seguida de lixiviação com ácidos, estes feitos em batelada [77]. Outros procedimentos utilizam injeção em fluxo contínuo (FI): decomposição em forno microondas com persulfato de potássio e hidróxido de sódio [78,79,80,81], decomposição ácida em fornos de microondas [82,83], decomposição com mistura de ácidos a temperaturas elevadas [84,60,85], digestão com dicromato de potássio e misturas de ácidos, seguida por ataque com peróxido de hidrogênio [86], fotooxidação com persulfato de potássio em meio alcalino[87,88], e termooxidação com persulfato de potássio em meio alcalino [89] Preparo de amostra para determinação de antimônio total [90] Na determinação de antimônio, matrizes sólidas são freqüentemente decompostas em alta temperatura em meio ácido, [91,92,93,94] embora a digestão por incineração seca com Mg (NO 3 ) 2 seja também usada [95]. A escolha do ácido empregado na decomposição da matriz depende em grande parte da composição da matriz. A digestão eficiente da amostra deve decompor a matriz e liberar o antimônio de uma forma compatível com o método analítico escolhido. A determinação de antimônio em amostras biológicas é freqüentemente realizada por misturas de ácidos oxidantes (H 2 SO 4, HNO 3, HClO 4 ) e H 2 O 2 no caso de matrizes com alto conteúdo orgânico [96,97]. No entanto, quando estes reagentes são utilizados na digestão de materiais, incluindo solos e sedimentos com alto teor de silicato, baixas recuperações, na faixa de 10-56% são relatadas [98,96,91]. Este fato pode está associado à formação de silicatos de Sb (V) insolúveis, complexados na presença de ácidos oxidantes e à formação específica de compostos de SbOCl insolúveis,

48 27 quando o meio é ácido perclórico [92,96]. Um maior desempenho da dissolução da amostra é conseguido usando ácido fluorídrico em conjugação com estes reagentes oxidantes. Estas misturas digeridas permitem recuperações médias na faixa de % empregando sistemas de microondas e chapa aquecedora [99,100,101]. O ácido clorídrico é também utilizado na digestão da matriz e a aplicação deste reagente pode melhorar a recuperação de antimônio em solos e sedimentos, em até 90% se comparada com outras técnicas com alguns ácidos oxidantes. Recuperações são relatadas na razão de % [102,96,103], entretanto para matrizes com elevado conteúdo orgânico, como os tecidos biológicos, a decomposição somente com HCl pode não ser suficiente, obtendo baixas recuperações de antimônio em algumas amostras ambientais [96]. A técnica do aquecimento em mufla, utilizando incineração por via seca com Mg (NO 3 ) 2, tem mostrado ser adequada para matrizes com conteúdo orgânico variável e a digestão com êxito de amostras de solos e plantas, é reportada na literatura [102]. Os baixos níveis de recuperação de antimônio total presente em amostras sólidas podem ser resultado da sua perda por volatilização, ou da força do ácido ser insuficiente para a completa decomposição da matriz. As perdas de espécies de antimônio voláteis, incluindo SbCl 3 e SbCl 5. A volatilização de antimônio pode ser evitada pelo uso de técnicas de digestão cuidadosamente adaptadas, através de mecanismos físicos ou químicos, para retrair antimônio volátil em altas temperaturas de digestão. Dentre estas técnicas, pode-se destacar o uso de recipientes fechados em microondas [97], recipientes abertos, incineração com Mg (NO 3 ) 2 [102] e abertura com microondas focalizado [95,104].

49 28 As recentes publicações sobre o tema abordam a digestão em recipientes fechados, que utilizam sistemas de aquecimento com microondas para impedir fisicamente a volatilização de antimônio em altas temperaturas. Estas técnicas são vantajosas, porque altas temperaturas e pressões são desenvolvidas no interior dos recipientes de digestão, diminuindo o tempo de decomposição da matriz. Além disso, várias amostras podem ser digeridas simultaneamente. No entanto, a utilização de recipientes de digestão especializados é fundamental, quando se emprega estas técnicas, uma vez que, impede a perda do analito, através de ventilação ou ruptura do recipiente durante a fase de aquecimento. A utilização da técnica de abertura com microondas focalizadas evita alta pressão durante a digestão e a perda de antimônio por volatilização, pois utiliza um sistema de condensação do vapor por refluxo. Estas técnicas permitem maior digestão de amostras em comparação com o sistema de recipiente fechado, embora o potencial de múltiplas e simultâneas digestões de amostras são limitadas com sistemas de microondas focalizadas [90]. A técnica utilizando forno com incineração por via seca com Mg (NO 3 ) 2 oxida a matéria orgânica presente na amostra durante o aquecimento, impedindo a formação de complexos de Sb voláteis [102]. Estas reações químicas evitam a volatilização de antimônio a elevadas temperaturas, evitando a necessidade de um sistema em recipiente fechado. Entretanto, a aplicação desta técnica pode ser inadequada para as amostras com baixo teor de matéria orgânica. As cinzas geradas na fase de aquecimento são redissolvidos em HCl a temperatura ambiente antes da análise. A vantagem desta técnica consiste em múltiplas e simultâneas digestões das amostras (dependendo do tamanho do

50 29 forno), além de ser relativamente barata, quando comparada às técnicas de microondas. Todavia, são necessárias precauções para evitar a contaminação durante a fase de aquecimento e perda residual das cinzas antes da dissolução. Embora, as técnicas de digestão permitam a determinação de antimônio e arsênio total em amostras sólidas, dados do particionamento do estado sólido, são, muitas vezes, impossíveis de se obter, pois reagentes de digestão alteram quimicamente a integridade da amostra Estratégia de análise de especiação A avaliação dos riscos ambientais causados por metalóides tais como arsênio e antimônio, depende da especiação. Segundo as últimas diretrizes IUPAC, o termo análise de especiação refere-se às atividades analíticas de identificação e/ou de medição da quantidade de uma ou mais espécies químicas em uma amostra. O termo aplicado às espécies químicas refere-se à forma específica de um elemento, definidas como moleculares, complexos, estrutura nuclear ou estado de oxidação [105]. As informações sobre a especiação de um elemento são necessárias para compreender a reação de muitos elementos, estimar o risco envolvido, levando em consideração a variação na toxicidade, o transporte e a biodisponibilidade, que são dependentes das formas químicas, no qual o elemento está presente [106]. A coleta, o tratamento e a preservação das amostras para determinação qualitativa e quantitativa, visando à especiação de um elemento, requerem planejamento e cuidados. A natureza desta tarefa é muito diferente daqueles procedimentos para

51 30 determinação total do elemento. Neste caso, o procedimento a ser adotado é o de manter o equilíbrio estabelecido, entre as formas químicas do elemento nas amostras, desde a coleta até a análise. Entretanto, é essencial ter-se em mente, que os dados sobre a concentração total são necessários para muitas investigações, pois é através dela que podemos prevenir a contaminação e a perda do analito na amostra [107]. Na determinação de espécies de metais em amostras sólidas, o ponto crítico é a forma de extração da amostra original, sendo que o sistema aplicado deve fornecer bons níveis de recuperação, mantendo a integridade e a estabilidade da espécie química durante o processo. O pré-tratamento da amostra, antes da extração, é também importante. Em alguns casos o aumento da temperatura durante o pré-tratamento pode causar alterações em algumas espécies organometálicas. Ainda não existe um protocolo específico para análise de especiação de elementos em amostras de alimentos e ambientais, todavia, algumas recomendações e resultados de experiências de outros grupos de pesquisas são descritos na literatura e serão abordados neste capítulo. Na análise de matrizes sólidas, a amostra geralmente é liofilizada, moída, homogeneizada e peneirada e em seguida extraída, empregando um método adequado, visando extração quantitativa de todas as espécies sem alterar a sua forma original, sendo que o solvente utilizado não deve interagir com as espécies a serem analisadas. A extração com solventes, auxiliada por agitação física ou sonicação, são métodos convencionais de extração de espécies de arsênio e antimônio, em matrizes sólidas [108,109,110]. As extrações eficientes variam muito em função do tipo da matriz e do extrator.

52 Métodos de extração de arsênio Na maioria dos métodos de extração de espécies de arsênio é empregada a mistura de metanol e água (1:1) [111]. Apesar desta mistura ser muito utilizada como um extrator, quando empregada na extração em plantas terrestres, ela geralmente tem uma baixa eficiência de extração [112,113,114115]. O ácido fosfórico (0,3 mol L -1 ) tem sido um eficiente extrator de espécies de arsênio em plantas terrestres [116]. Combinações de solventes como a água-acetonitrila [117] metanol- água-clorofórmio [118] também têm sido empregadas. Reyes e colaboradores realizaram um estudo de diferentes extratores para determinação de arsênio em amostras de cereais. Foram investigados os seguintes reagentes, nas suas respectivas concentrações: HCl 6 mol L 1, HNO 3 1 mol L 1, H 3 PO 4 1 mol L 1, ácido acético 1 mol L 1, água régia, ácido trifluoroacético 2 mol L 1, ácido tricloroacético 2 mol L -1 e a mistura metanol e H 2 O (1:1), sendo selecionado H 3 PO 4 1 mol L 1 como agente extrator [119]. Os métodos baseados na solubilidade com HCl e destilação assistida por microondas têm sido descritos para a extração de arsênio inorgânico, a partir de alimentos marinhos [120,121,122]. Contudo, estes procedimentos não são adequados para especiação destas espécies, porque ocorre conversão de As (V) a As (III) durante a hidrólise e o processo de extração. Isto também foi observado na utilização do ácido trifluoroacético, para determinação de arsênio em amostras de arroz [123]. Outros procedimentos, utilizando digestão por microondas [116,124], como a extração usando enzimas na modificação de matrizes de plantas [117], a extração em Soxhlet [125] e a extração em fase sólida também têm sido empregados [126].

53 Métodos de extração de antimônio Na especiação de antimônio em amostras sólidas, estratégias utilizando diversos extratores têm sido desenvolvidas. Os extratantes empregados geralmente são água, EDTA, metanol, ácido cítrico [127], ácido acético e hidróxido de sódio [128]. Miravet e colaboradores compararam métodos de extração de espécies de antimônio em plantas, utilizando como extratores ácido cítrico e metanol - água [63]. Já Potin-Gautier e colaboradores investigaram a estabilidade das espécies de antimônio e a possibilidade de transformação, durante o procedimento de extração com diferentes reagentes, tais como EDTA, ácido cítrico, ácido oxálico e água, em amostras de sedimentos [129]. Um método de extração on-line de espécies de antimônio, em amostras biológicas, também foi desenvolvido. Neste método, os autores realizaram a extração online e seqüencial de antimônio (III) e antimônio (V) em amostras sólidas liofilizadas de sangue e tecido de fígado, com ácido acético 1,5 mol L -1 e ácido sulfúrico 0,5 mol L -1 [130] Métodos de detecção com geração de hidreto por espectrometria atômica Geração de Hidreto (HG) O processo de determinação espectrométrica, após geração química de vapor, pode ser dividido em três etapas: a geração da espécie volátil, ou seja, a reação química propriamente dita; o transporte da espécie volátil para a célula de atomização (que inclui

54 33 também sua expulsão da solução) e a atomização [131]. Na geração da espécie volátil, para produção de hidretos, vários reagentes foram sugeridos: zinco metálico/hcl, suspensão de alumínio/hcl e mistura de magnésio e cloreto de titânio em meio de HCl e H 2 SO 4 [132,133]. No entanto o borohidreto de sódio (NaBH 4 ), mostrou-se mais adequado, sendo hoje um dos reagentes redutores mais utilizados para geração de hidreto. A utilização do borohidreto de sódio (NaBH 4 ), como agente redutor, permitiu ampliar a aplicabilidade da HG, já que é de fácil introdução em reatores, os valores de branco são baixos e devido a sua elevada reatividade em um curto período de reação, permite a automatização [134]. Entretanto, as soluções aquosas deste redutor são instáveis, devendo ser preparadas para uso imediato [135]. A estabilidade desta solução pode ser aumentada pela alcalinização com hidróxido de potássio ou sódio, necessitando filtração em filtro de 0,45 µm, para remover a turvação produzida pelo precipitado de carbonato [136]. O processo de redução ocorre segundo a equação: NaBH 4 + HCl + 3H 2 O H 3 BO 3 + NaCl + 8H o 8 H o + X m+ XHn + H 2 (excesso) onde m pode ser ou não igual a n e X é o elemento de interesse. Uma vez gerado, o hidreto é separado por arraste com o mesmo hidrogênio molecular, que é produzido em excesso na reação e com a ajuda de um gás de arraste (N 2, Ar ou He). Para o arsênio o produto formado é a arsina (AsH 3 ) e para o antimônio a estibina (SbH 3 ).

55 34 A cinética de formação de hidreto das espécies M (V) é mais lenta que as espécies M (III), sendo assim, para a determinação de arsênio e antimônio inorgânico total [M (III) + M(V)], faz-se a redução do M (V) a M (III) e determina-se o arsênio e o antimônio inorgânico total, como: As (III) e Sb (III). Na etapa de redução, podem ser utilizados diferentes redutores: KI [137,138], tiouréia [139,140] e L-cisteína [141,138,142]. O iodeto de potássio (KI) é utilizado em meio fortemente ácido [143], sendo esta uma grande desvantagem deste redutor, pois é necessário uma alta concentração de HCl para que a redução se complete [144]. O KI pode ser utilizado na presença de ácido ascórbico [145,146,138], com objetivo de prevenir a oxidação do iodeto pelo oxigênio atmosférico. Em amostras tratadas com ácidos oxidantes ou contendo agentes oxidantes, são formadas grandes quantidades de iodo (I - 3 ), já que a quantidade de KI necessária para redução é também grande. O iodo precisa ser retirado da solução antes da adição de NaBH 4, o que pode provocar perdas de As (III)-iodo no gerador [147]. A HG tem sido empregada nas análises de arsênio e antimônio como um passo prévio à detecção, com a qual praticamente se elimina o efeito de matriz, aumenta a sensibilidade e diminui o limite de detecção. Um dos atrativos do método é a sua simplicidade e o fato do mesmo poder ser acoplado em várias técnicas Espectrometria de absorção atômica (AAS) Atomização em tubo de quartzo com chama e elétrico Dentre as técnicas de espectrometria atômica acopladas com HG, a mais popular é a espectrometria de absorção atômica, devido ao seu baixo custo e simplicidade.

56 35 Os elementos que possuem a capacidade de formar compostos voláteis (hidretos), como As e Sb, após reagir com o borohidreto de sódio e forma seus respectivos hidretos (AsH 3, SbH 3 ) podem ser carregados para uma célula de atomização, aquecida em torno de 900 C, onde serão decompostos, liberando o elemento na forma atômica. O aquecimento pode ser realizado tanto por uma chama de ar-acetileno, como por uma resistência elétrica [131]. O atomizador consiste de um tubo T de quartzo, alinhado no caminho ótico, com o braço central servindo de passagem ao hidreto e ao gás carreador, para o interior da parte aquecida do tubo. O aquecimento é externo, realizado por uma chama ou através de uma manta resistora, que o envolve. As duas saídas do tubo são abertas, ou fechadas com janelas óticas [131]. O aquecimento elétrico do tubo possui vantagens em relação ao aquecimento em chama, pois o aquecimento elétrico do tubo é mais homogêneo, sem gradientes de temperatura, permitindo maior reprodutibilidade das leituras. A temperatura também pode ser controlada e ajustada de acordo com o analito. Nos tubos aquecidos externamente por uma chama ar-acetileno, a diferença de temperatura entre a parte inferior e a superior do tubo alcança até 300 C [148]. A chama também ataca rapidamente a parte externa do tubo de quartzo, diminuindo seu tempo de vida. Muitas técnicas automatizadas para a determinação de traços de metais, como por exemplo, a análise por injeção em fluxo (FI), tem atraído atenção devido à alta precisão, à elevada taxa de amostragem e à possibilidade de inclusão de pré-tratamentos da amostra e concentração do analito em linha. Métodos, empregando a técnica de FI são considerados os melhores, pela instrumentação simples e de baixo custo, permitindo procedimentos rápidos e efetivos para a determinação de traços de diversos elementos em

57 36 linha [149,150,151]. Injeção em Fluxo - Geração de Hidretos Espectrometria de Absorção Atômica (FI-HG-AAS) é um acoplamento atrativo, devido à sua simplicidade e alta sensibilidade. Estes procedimentos fazem uso dos benefícios da introdução direta da amostra, volume reduzido da amostra, diminuição da possibilidade de contaminação e do aumento da tolerância para interferentes, quando comparados aos procedimentos convencionais em batelada [152,153]. 2.5 Espectrometria de fluorescência atômica (AFS) A espectrometria de fluorescência atômica é uma técnica consolidada para análise de alguns elementos de importância ambiental, incluindo arsênio e antimônio. A técnica de fluorescência atômica oferece grandes vantagens em termos de linearidade e níveis de detecção. Atualmente, os sinais têm melhorado em função da qualidade das lâmpadas empregadas como fontes de excitação. Suas limitações, como espalhamento e background, dependem dos níveis de impurezas nas amostras com o acoplamento da geração de hidreto na AFS, estes problemas são eliminados, uma vez que, a matriz é separada da amostras pela geração de hidreto, oferecendo assim uma maior sensibilidade e especificidade [154]. Esta sensibilidade oferecida é comparada com a do HG ET AAS, com o custo reduzido, já que não necessita-se utilizar tubos de grafite. O arsênio e o antimônio, elementos formadores de hidretos, podem ser detectados por AFS na região do ultravioleta, abaixo de 259 nm. Nesta região, somente uma pequena emissão de fundo (backgroud) é observada, quando uma chama fria de baixa energia é utilizada. Contudo, para se obter um bom limite de detecção é necessária uma fonte de excitação de alta intensidade de radiação. Recentemente, lâmpadas do tipo

58 37 boosted-discharge hollow cathode (BHDC) tornaram-se comercialmente disponíveis e têm se mostrado uma boa fonte de excitação para a AFS [155,156]. 2.6 Análise de especiação não-cromatográfica de arsênio e antimônio por técnicas de espectrometria atômica com geração de hidreto A análise de especiação geralmente envolve duas etapas: (1) separação das diferentes espécies e (2) a quantificação. Técnicas, baseadas na interface da cromatografia líquida, HPLC- HG - AAS [157], HPLC-HG- AFS [158], HPLC-HG-ICP-MS [159], entre outras têm sido propostas para especiação de elementos, que formam hidretos [160]. Estas técnicas apresentam como vantagem a introdução de espécies separadamente e a detecção em linha específica. Entretanto, possuem algumas desvantagens [161], tais como: o aumento da complexidade, a co-eluição da espécie de alguns elementos [162], os problemas associado com a estabilidade do plasma devido o uso de solventes orgânicos, e as interferências decorrentes de íons poliatômicos na convencional ICP-MS [163]. Além disso, estes equipamentos são de alto custo e não são de fácil manuseio. O tempo de análise é também considerado longo para análise de rotina. O acoplamento da geração de hidreto, em técnicas de espectrometria atômica, é uma ferramenta analítica sensível, para determinação de níveis traços de arsênio e antimônio. Esta técnica tem habilidade de diferenciar estados de oxidação desses elementos, através de procedimentos simples, sem a utilização da separação cromatográfica. A aplicação adequada de técnicas de separação de espécies de elementos, que formam hidretos, pode ser quantitativa. As técnicas de separação incluem a formação seletiva de hidreto baseado no ajuste do ph, uso de solução tampão, meio reacional,

59 38 modificação da matriz, extração com formação de complexo e retenção seletiva, entre outros. Sistemas automatizados com injeção em fluxo (FI) e fluxo contínuo (CF) estão sendo utilizados hifenados com tratamento da amostra em linha. [164] Análise de especiação de arsênio Análise de especiação baseada na seletividade da HG A reação entre tetrahidroborato (THB) e um oxiion em solução é seletiva em um determinado ph, pois, para que a reação se processe rapidamente, a espécie analito deve ser completamente protonada. A diferenciação entre As (III) e As (V) pode ser realizada explorando a dependência do ph na redução com THB. Nakashima determinou As (III) na presença de As (V) utilizando 0,25 mol L -1 HCl com 3-5 mg ml -1 de Zr (IV) e 2% de KI. O arsênio total foi determinado em 2 mol L -1 de HCl, contendo 1% KI. O Zr (IV), junto com o KI suprimiu seletivamente o sinal de As (V) na determinação do As (III) [165]. Baseado na dependência do ph de geração de arsina, outros trabalhos foram publicados [166,167]. As formas metiladas também podem ser determinadas da mesma forma [168]. Todavia, Hinners observou que se o arsênio metilado estiver presente, ele pode contribuir para o aumento do sinal de As (III) e total, então ele sugeriu o uso de soluções tampões para minimizar o erro [169]. Outros autores reportaram o uso do tampão citrato e acetato [170, 171]. Anderson e colaboradores investigaram a seletividade do método de redução das formas orgânicas e inorgânicas do arsênio, usando matrizes tamponadas [172]. Seguindo o método de Anderson, vários artigos foram publicados sobre a análise de

60 39 especiação de arsênio utilizando diferentes ácidos, tampões e meio redox, para determinação de espécies inorgânicas e orgânicas [173,174]. Outros métodos para determinação seletiva de arsênio utilizando também na determinação das espécies incluem extração seletiva e técnicas de co-precipitação [175]. Bombach e colaboradores propuseram a retenção seletiva de As (V) por uma coluna de troca iônica com uma separação on-line das espécies [176]. Okumura e colaboradores empregaram o uso de um sorbente carregado com zircônio para retenção de As (III) e As (V) [177]. Chatterjee e colaboradores descreveram um método para extração de As (III) com dietilditiocarbonato [178]. Dapaah e Ayame extraíram o As (III) com complexo hexametilenoditiocarbamato em 2,6-dimetil -4- heptano [179]. Van Elteren e colaboradores determinaram As (V) e As (III) pela co-precipitação de As (V) como complexo molibdato com cloreto de tetrafenilfosfato e As (III) com dibenzilditiocarbamato [180] Técnica de FI- HG - AAS A introdução da FI e técnicas com métodos de HG em AAS estabeleceram um importante marco no desenvolvimento da HG - AAS [181]. A FI oferece muitas vantagens, entre as quais um curto tempo de análise, pequeno consumo de reagente e amostra, redução da intervenção humana, melhora a sensibilidade e precisão. A diferenciação de As (III) e As (V) foi realizada on-line pela dependência do ph na geração da arsina variando as concentrações do THB e ácido, usando tampões apropriados. A determinação de As (III) e total após a redução on-line usando KI / KI ácido ascórbico [182,183], tiosulfato [184] e L- cisteína [185] tem sido estudada por muitos autores. Como, Nielsen e Hansen que aplicaram uma redução on-line de As (V) com KI - ácido ascórbico em reator enovelado

61 40 [186]. Torralba e colaboradores determinaram As (III) seletivamente em tampão cítrato e arsênio total com 6 mol L -1 de HCl [187]. Co- precipitação em linha com La (OH) 3 em reator knotted para determinação seletiva de As (III) foi proposto [188]. Já Sigrisit e Beldomenic empregaram o uso de uma baixa concentração de THB 0,035% com 2 mol L -1 de HCl para As(III) e As total depois da redução com KI [189]. Uma pré-concentração on-line de As (III) em alumina ativada e As total depois da pré-redução com L-cisteína foi também estudada [190]. Uma pré-concentração simultânea em linha usando uma coluna de troca iônica foi proposta por Narcise e colaboradores. A coluna é seletiva para As (V) no ph neutro e As total em ph >12 [191]. Anthemidis e colaboradores propuseram um sistema de injeção seqüencial em que 0,5% THB com 1,5 mol L -1 de HCl e 3% THB com 9 mol L -1 de HCl foi utilizado para As (III) e As total, respectivamente [192]. Em outro trabalho, dos mesmos autores foi proposta a retenção seletiva de As (V) pela resina de troca iônica e As total após oxidação com KMnO 4 [193] Técnica de HG AFS Tsuji e Kugu foram os primeiros a relatar o uso do HG acoplado a AFS [194, 195]. Mester e Foder estudaram a característica do sinal de AFS de espécies de As e enfatizaram a necessidade da calibração independente para cada espécie de As [196]. D'ulivo e colaboradores discutiram o método para melhorar a desempenho da técnica de HG-AFS usando aditivos e fibras ópticas [197]. El- Hadri e colaboradores determinaram As (III) com 3% de THB e 2 mol L -1 de HCl e As total após a pre-redução

62 41 com KI. Neste trabalho, as concentrações de espécies foram calculadas a partir da inclinação das curvas de calibração [198]. Lee e colaboradores descreveram um método baseado na retenção seletiva de arsênio em uma coluna de troca iônica [199]. Lopez e Castro utilizaram FI acoplado com evaporação prévia antes da HG em amostra de água contendo alto teor de material particulado [200]. Yan e colaboradores aplicaram a técnica de FI - HG AFS, em que As (III) foi seletivamente complexada com APDC e As total foi determinado após pré-redução com L-cisteína [201]. Gong e colaboradores desenvolveram um método de EFS para extração seletiva de As (V) [202]. Leal e colaboradores propuseram uma nova técnica, baseada na injeção de fluxo com multiseringa (MSFI), em que o As (III) e o arsênio total foram determinados simultaneamente após redução com KIácido ascórbico [203]. Reyes e colaboradores desenvolveram um método para determinação das espécies de arsênio em amostras de vegetais, As (III), As (V), ácido dimetilarsênico (DMA) e ácido monometilarsênico (MMA), usando equações proporcionais. O método foi baseado em uma extração simples das espécies com H 3 PO 4 1 mol L 1 [204]. Em outro trabalho, os autores também usaram as equações proporcionais, para determinar espécies de arsênio em amostras de cereais [205]. Montesinos e colaboradores, também, utilizaram equações proporcionais para especiação de arsênio em amostras de peixe, após extração das espécies com ácido nítrico [206]. A mesma estratégia de especiação também foi empregada pelos autores para determinar As (III) e As (V) em amostras de leite. As espécies foram extraídas com água régia [207].

63 Técnica de geração de hidreto eletroquímica (EcHG) A geração de hidreto eletroquímica, como um sistema de introdução de amostras para espectrometria atômica, é uma alternativa para melhorar a HG. Ela tem sido utilizada para determinação do elemento total, mas para análise de especiação pouca informação está disponível. A eficiência da EcHG depende principalmente do material do cátodo, de corrente eletrolítica, da dimensão do fluxo, através da célula e do separador gás líquido. Ding e Sturgeon verificaram que a eficiência na formação da arsina variou segundo a natureza do material catódico e da reação da matriz [208]. Schaumloff e Neidhart determinaram As (III), usando um cátodo de fibra de carbono e arsênio total após redução com L-cisteína [209]. Pyell e colaboradores propuseram o uso da fibra de carbono e chumbo como material catódico para determinar As (III) e Arsênio total [210]. Li e colaboradores desenvolveram o procedimento para análise de especiação de As inorgânico, baseado na eficiência de geração de hidreto entre 0,6 a 1,0 A da corrente eletrolítica. A concentração das espécies foi calculada pela inclinação da curva de calibração [211] Análise de especiação de antimônio Análise de especiação baseada na seletividade da HG Este método baseia-se na dependência do ph da formação de Sb (III) e Sb (V). Nakashima e colaboradores determinaram seletivamente Sb (III) em 0,35 mol L -1 de HCl e 4 mg ml -1 de Zr (IV), com LDs de ng L -1 [212]. Nakahara e Kikui determinaram seqüencialmente Sb (III) e Sb total em meio de ácido maleico e tartárico com um LD de

64 43 0,19 µg L -1 [213]. Garcia e colaboradores relataram a separação on-line de Sb (III) complexizado com PDC e extraído com metilisobutilcetona. Sb (V) foi determinado, após redução com KI na fase aquosa [214]. Feng e colaboradores propuseram um método para determinar espécies de antimônio baseado, na redução cinética com L-cisteína [215] Técnica de FI- HG - AAS A técnica de FI HG, utilizando procedimentos de pré-concentração on-line e ou redução seletiva, tem sido aplicada para análise de especiação de antimônio. Guntinas e colaboradores empregaram ácido crítico a 6% para determinar Sb (III) e o meio de 4 mol L - 1 de HCl, para determinar antimônio total com LD de 7 ng L -1 [216,217]. Garbos e colaboradores relataram o uso de 0,02 mol L -1 de HCl para Sb (III) [218]. A sorção seletiva de Sb (III), em Duolite GT-73 com grupos funcionais SH acoplado no FI- HG AAS, foi estudada por Erdem e Erogulu [219], obtendo LD de 60 ng L -1. Zheng e colaboradores utilizaram o TiO 2 para pré-concentração de Sb (III) e Sb (V), atigindo um LD de 50 ng L -1 [220]. Pena e colaboradores apresentaram um procedimento para especiação de Sb (III) e Sb(V) em amostras de tecidos fígado e sangue. O método envolve uma extração online das espécies, a partir da amostra sólida liofilizada com ácido acético, para determinação de Sb(III) e sulfúrico na determinação de Sb(V) [130].

65 Técnica HG - GF AAS e AFS A concentração in situ com HG no tubo de grafite oferece outra eficiente ferramenta, para análise de especiação de antimônio. Smichowski e colaboradores propuseram um método para pré-concentração simultânea de Sb (III) e Sb (V), baseado na retenção seletiva em uma microcoluna de alumina sob controle do ph, usando ácido fosfórico [221]. Garbos e colaboradores, realizaram uma pré-concentração seletiva de Sb (III) com o complexante pirolidina de ditiocarbonato de amônio (APDC), em uma coluna de C 16, já o Sb total foi obtido após redução com a L-cisteína [218]. Seletiva geração de Sb 3+ in situ no tubo de grafite foi reportado por vários autores com LDs ng L -1 [222, 223, 224]. Chung et al. propuseram a seletiva extração de Sb (III), com o seu complexo de PDC em CCl 4 - CHCl 3 e Sb (V), com redução com TiCl 3 HCl [225]. Cabon e Madec, utilizaram a determinação seletiva de Sb (III) usando o tampão Tris- HCl 0,2 mol L -1 e Sb, após uma oxidação UV on- line [226]. A AFS tem sido demonstrada uma técnica sensível para determinação de elementos, que geram hidretos, tendo linhas de ressonância abaixo de 250 nm [227]. Tsujii propôs a determinação seletiva de Sb (III), usando HF como um agente mascarante para Sb (V) [228]. Deng e colaboradores desenvolveram um procedimento usando 8- hydroxi quinolina, como agente mascarante para Sb (V) na determinação de Sb (III) e o Sb(V) foi determinado após pré- redução com KI, e Sb total foi determinado, após digestão em microondas e pré-redução com KI [229]. El- Hadri et al desenvolveram um método para determinação Sb (III) e Sb (V), baseado na eficiência de geração de hidreto com e sem redução com KI [198].

66 45 Semenova e colaboradoes propuseram um método para determinação de antimônio total e especiação de Sb (III) e Sb (V), por injeção em fluxo com uma multiseringa e detecção por HG AFS [230]. Cava-Montesinos e colaboradoes também utilizaram a eficiência de geração de hidreto com e sem KI para determinação de As (III), As (V), Sb (III) e Sb (V) em amostras de leite [231].

67 46 CAPÍTULO 3 DETERMINAÇÃO DE CÁDMIO E CHUMBO EM ÁGUAS DE REFINARIA DE PETRÓLEO APÓS PRÉ-CONCENTRAÇÃO ON- LINE EM UM SISTEMA DE INJEÇÃO EM FLUXO ACOPLADO A UM TS-FF-AAS

68 Introdução A determinação de metais traço, em águas provenientes de torre de esfriamento de refinaria de petróleo, apresenta dificuldades para análise direta, devido ao elevado teor de sais dissolvidos e à presença de substâncias orgânicas [232]. Isto pode causar sérias interferências no momento da análise, comprometendo a exatidão e a precisão do método, podendo também danificar partes do sistema analítico. Portanto, o desenvolvimento de métodos de separação e pré-concentração do analito é necessário antes da análise desse tipo de amostras. Sistemas de injeção em fluxo (FI) on-line acoplados a espectrômetros de absorção atômica com chama, empregando extração em fase sólida, têm sido utilizados em vários métodos para a pré-concentração e determinação de cádmio e chumbo em amostras de água [233, 234, 235, 236, 237]. Estes procedimentos evitam a manipulação da amostra entre a etapa de pré-concentração e a análise, de modo a minimizar as perdas e os riscos de contaminação, bem como promovem a remoção eficiente da matriz, permitindo maior precisão [238]. Neste contexto, métodos ainda mais sensíveis, poderão ser obtidos se for acoplado um spray térmico no espectrômetro de absorção atômica (TS-FF-AAS). A técnica de TS- FF-AAS proposta por Gaspar e Berndt [41] fornece uma introdução simples e eficiente da amostra. As vantagens desse sistema consistem na maior eficiência de introdução da amostra no atomizador e no aumento do tempo de residência do analito no caminho óptico, aumentando assim a capacidade de detecção do analito [239].

69 48 Neste capítulo, propõe-se um método para determinação de cádmio e chumbo, em amostras de água de refinaria de petróleo, após pré-concentração em linha dos íons metálicos em um sistema de injeção em fluxo acoplado a um TS- FF- AAS.

70 PARTE EXPERIMENTAL Instrumentação e Acessórios Espectrômetro de absorção atômica com chama, marca Varian, modelo SpectrAA 220 equipado com lâmpada de deutério como corretor de fundo, foi usado para determinação dos metais. Lâmpada de cátodo oco multielementar de cádmio e chumbo foi utilizada como fonte de radiação. Os parâmetros instrumentais são apresentados na Tabela 3.1. Um sistema termospray foi composto de um tubo níquel puro (J & JEthen, 52070, Aachen, Alemanha), com 10 cm de comprimento e 2,5 cm de diâmetro interno, contendo 6 furos de 2,0 mm diâmetro interno virados para o queimador visando a penetração da chama no interior do tubo e um capilar de cerâmica (100 mm de comprimento, 0,5 mm de diâmetro interno e 2,0 mm de diâmetro externo) utilizado para o transporte de amostras até o tubo de níquel. A ponta capilar foi inserida em cerca de 1 mm no interior do tubo de níquel. O sistema em fluxo consistiu de uma bomba peristáltica (modelo Alitea C-6 XV, Suécia) de oito canais equipados com tubos de silicone e um injetor caseiro, comutado em acrílico para selecionar as etapas de eluição e pré-concentração.

71 50 Tabela 3.1 Parâmetros instrumentais para determinação de cádmio e chumbo por TS-FF-AAS. Parâmetros Cd Pb Comprimento de onda (nm) 228,8 217,0 Corrente da lâmpada (ma) 10,0 10,0 Razão de ar (Lmin -1 ) 13,5 13,5 Razão de acetileno (Lmin -1 ) 2,0 2,0 Abertura da Fenda (nm) 0,5 1, Reagentes Todos os reagentes utilizados nos experimentos foram de grau analítico. Água ultrapura (resistividade de 18.3 MΩ cm) de um sistema de purificação Milli-Q (Millipore, Bedford, MD, USA) foi usada para preparo de todas as soluções. A vidraria foi mantida em solução de ácido HNO 3 10% v/v durante 12 h, para descontaminar. Antes do uso, foi lavada com água deionizada e seca em um ambiente livre de poeira. As soluções foram preparadas conforme os procedimentos descritos abaixo: (a) As soluções padrões intermediárias de cádmio e chumbo foram obtidas pela diluição de uma solução padrão de (1000 μg ml 1 ) da Merck. (b) A solução de ditizona 0,1% (Merck) foi praparada dissolvendo 0,1g em 100 ml de etanol.

72 51 (c) A solução tampão foi preparada dissolvendo 149 g de trietanolamina (Merck) em 800 ml de água ultrapura e ajustando o ph 7,3 ou 7,8, com ácido clorídrico para cádmio e chumbo, respectivamente, e diluída para 1L com água ultrapura Preparação da minicoluna Uma solução de ditizona 0,1% (w/v) foi percolada, através de uma minicoluna, contendo cerca de 0,1 g de XAD-7 com vazão de 2,0 ml min -1 durante 25 min. Em seguida, a coluna foi lavada com solução de hidróxido de sódio 1% para a eliminação do excesso de reagente ditizona e depois com ácido clorídrico 1 mol L -1 e água deionizada na mesma vazão, a fim de evitar qualquer contaminação metálica. Na Figura 3.1, encontra-se uma ilustração da minicoluna utilizada. TG TP TC XAD - 7 Figura 3.1- Coluna empregada no sistema analítico em linha. Fase sólida XAD 7 impregnada com ditizona, TP: Tubo plástico usado para soro (equipo), TG: Tubo Tygon, TC: tubo capilar de Teflon.

73 Sistema de pré-concentração on-line Na etapa de pré-concentração, 10 ml de solução padrão, contendo chumbo e cádmio ou a amostra (tamponadas), é percolada pela mini-coluna a uma vazão de 4 ml min -1. Os íons metálicos foram retidos por sorção química, como complexo com a ditizona e a solução remanescente foi descartada. A eluição dos íons retidos foi realizada, através de uma solução de HCl 1 mol L -1 [240] em uma razão de fluxo de 0,7 ml min 1, no sentido oposto da pré-concentração. O uso de um fluxo de eluição reverso poderá evitar possíveis problemas de compactação do material adsorvente na mini-coluna e de um tempo elevado de limpeza do sistema, que geraria sinais com intensas caldas. Posteriormente, foram transportados até o sistema TS-FF-AAS para quantificação dos mesmos. Os sinais foram medidos como altura de pico. O diagrama do sistema de pré-concentração é encontrado na Figura Otimização A otimização das condições de trabalho foi realizada por meio de planejamento Box-Behnken (Figura 3.3), incluindo as variáveis, ph de complexação, vazão de préconcentração e concentração do tampão. Os dados experimentais foram processados, utilizando o programa STATISTICA 6.0. Todos os experimentos foram conduzidos usando 10 ml de solução de Cd 1 g L -1 ou de Pb 5 g L -1.

74 53 B HCl 1 mol/l Capilar cerâmico Tubo de níquel Etapa de pré-concentração D M Amostra B Injetor Queimador Ar/acetileno (TS-FF-AAS) HCl 1 mol/l Capilar cerâmico Tubo de níquel D Etapa de eluição M Injetor Amostra Queimador Ar/acetileno (TS-FF-AAS) Figura 3.2. Diagrama esquemático do sistema de pré-concentração de Cd ou Pb, acoplado ao TS-FF-AAS. Mini-coluna de Amberlite XAD-7 impregnada com ditizona. (M: minicoluna, B: bomba peristáltica, D: descarte). X 2 X 3 X 1 Figura Representação do desenho Box-Behnken como resultado da interlocação de desenhos fatoriais 2 2.

75 Resultados e Discussão Determinação das condições experimentais ótimas do sistema on - line A otimização foi realizada usando uma matrix Box-Behnken para as variáveis ph, vazão de amostragem (VA) e concentração do tampão (CT). Outros fatores foram estabelecidos considerando os resultados de experimentos prévios. No desenho Box-Behnken, os pontos experimentais situam-se sobre uma hiperesfera eqüidistante do ponto central, que representa o desenho para otimização de três variáveis. O número de experimentos necessários para otimização são definidos pela equação: N = K 2 + K + 1, onde K é o número de variáveis, portanto para três variáveis o número de experimentos são 13. Na Tabela 3.2, demonstra-se a matriz com os valores reais e codificados e a resposta como sinal analítico (absorvância). O ponto central foi corrido em triplicata, para avaliação do erro experimental. Os dados obtidos na realização dos experimentos que compõem a matriz do Box-Behnken geraram as superfícies de resposta apresentadas nas Figuras 3.4 e 3.5.

76 55 Tabela 3.2 Matriz do planejamento Box-Behnken com valores reais e codificados Expet. ph VA CT Abs Pb Abs Cd 1 7 (-1) 3 (-1) 0,020 (0) 0,0556 0, (+1) 3 (-1) 0,020 (0) 0,0507 0, (-1) 5 (+1) 0,020 (0) 0,0538 0, (+1) 5 (+1) 0,020 (0) 0,0485 0, (-1) 4 (0) 0,010 (-1) 0,0584 0, (+1) 4 (0) 0,010 (-1) 0,0512 0, (-1) 4 (0) 0,030 (+1) 0,0619 0, (+1) 4 (0) 0,030 (+1) 0,0529 0, (0) 3 (-1) 0,010 (-1) 0,0592 0, (0) 5 (+1) 0,010 (-1) 0,0549 0, (0) 3 (-1) 0,030 (+1) 0,0623 0, (0) 5 (+1) 0,030 (+1) 0,0581 0, (0) 4 (0) 0,020 (0) 0,0682 0, (0) 4 (0) 0,020 (0) 0,0687 0, (0) 4 (0) 0,020 (0) 0,0673 0,3192

77 56 As equações (1) e (2), abaixo, ilustram a relação entre as três variáveis estudadas; ph, vazão de amostragem (VA), concentração do tampão (CT) e o sinal analítico (Abs), considerando os valores reais, para o cádmio e chumbo, respectivamente: Cd = - 1, ,2242 (ph) - 0,0164 (ph) 2 + 0,3677(VA) 0,0476 (VA) ,4566 (CT) 557,1666 (CT) 2 + 0, (ph) (VA) + 0,6850 (ph) (CT) 0,1650 (VA) (CT) (1) Pb = -0, ,1455 (ph) 0,0092 (ph) 2 + 0,0528 (VA) 0,0067(VA) 2 + 1,5921(CT) 27,4583 (CT) 2 0,0001 (ph) (VA) 0,0450 (ph) (CT) + 0,0025 (VA) (CT) (2) Estas equações mostram o ponto crítico da superfície de resposta, que é um máximo em ph 7,34 e 7,81, uma vazão de amostragem 3,89 e 3,88 ml min -1 e a concentração do tampão de 0, e 0,0227 mol L -1 para o cádmio e chumbo, respectivamente. Desta forma, as condições experimentais estabelecidas para o método são: vazão de amostragem 4,0 ml min -1 para ambos os metais, ph 7,3 e concentração do tampão de 0,019 mol L -1 para cádmio; ph 7,8 e concentração do tampão 0,023 mol L -1 para o chumbo.

78 Figura 3.4 Superfícies de respostas obtidas para chumbo pelo ajuste de uma função quadrática aos dados da Tabela

79 Figura 3.5 Superfícies de respostas obtidas para cádmio pelo ajuste de uma função quadrática aos dados da Tabela

80 59 Uma análise de variância (ANOVA) apresentada na Tabela 3.3, obtida, através do programa STATISTICA 6.0, mostrou que o modelo não apresenta falta de ajuste. Os valores calculados F para a falta de ajuste foram 11,44 e 4,75 para o cádmio e chumbo, respectivamente. Estes valores são menores que F tabelado de 19,16 para 3 e 2 graus de liberdades. Isto mostra que os modelos descrevem as regiões experimentais adequadamente. Tabela 3.3 Análise de variância (ANOVA) para (a) cádmio e (b) chumbo (a) cádmio SQ gl MQ F p (1) ph L+Q (2) VA L+Q (3) CT L+Q ph * VA ph * CT VA * CT Falta de ajuste Erro puro Total SS (b) chumbo (1)pH L+Q (2)VA L+Q (3)CT L+Q ph * VA ph * CT VA * CT Falta de ajuste Erro puro Total SS SQ, soma quadrática; gl, grau de liberdade; MQ, média quadrática. Nível de confiança de 95%.

81 Características analíticas Avaliando o desempenho do método proposto os seguintes parâmetros de mérito foram obtidos: limites de detecção e quantificação, precisão, fator de enriquecimento, linearidade e exatidão. Além destes, os parâmetros relacionados com o sistema de pré-concentração em linha também foram calculados. Todos esses parâmetros foram estabelecidos usando-se os valores otimizados do sistema de pré-concentração online. O limite de detecção e quantificação são os fatores críticos na seleção de um método usado na análise de traços [241]. A definição de limite de detecção mais aceita atualmente é a concentração ou massa mínima do analito que pode ser detectada em um nível conhecido confiável [242]. O limite de detecção (LD) é expresso matematicamente como três vezes o desvio padrão do valor do sinal analítico correspondente ao branco obtido de 10 determinações, dividido pela inclinação da curva analítica [242].O limite de quantificação (LQ) é definido como o nível acima do qual resultados quantitativos podem ser obtidos com um grau especifico de confiança. O limite de quantificação é calculado de forma semelhante ao LD, sendo utilizado dez vezes o desvio padrão do branco dividido pela inclinação da curva analítica. O limite de detecção e quantificação para o método proposto foi calculado segundo as recomendações da IUPAC [243]. Sendo assim, o LD e o LQ calculados para o procedimento proposto foram 0,012 e 0,04 g L -1 para cádmio e 0,34 e 1,1 g L -1 para chumbo, respectivamente. A precisão dos dados analíticos é o grau de concordância mutua entre os dados que foram obtidos do mesmo modo [242]. A precisão foi determinada e expressa, como

82 61 desvio padrão relativo (n=10). Os valores encontrados foram 1,9% (1,0 g L -1 ) e 1,8% (5,0 g L -1 ) para cádmio e do chumbo, foram de 2,5 (5,0 g L -1 ) e 1,6% (50,0 g L -1 ). O fator de enriquecimento (FE) é a avaliação do aumento do sinal instrumental. Este parâmetro é calculado pela razão entre os coeficientes angulares das curvas analíticas do procedimento com e sem a etapa de pré-concentração. As seguintes equações da curva de calibração foram obtidas, usando o procedimento de pré-concentração em fase sólida: Abs = 0,286 [Cd] + 0,0236 para cádmio e Abs = 0,0143 [Pb] 0,0011 para chumbo, ambas com coeficiente de correlação (R) de 0,9992. As equações de calibração obtidas sem a etapa de pré-concentração foram Abs= 0,0071 [Cd] + 0,0105 e Abs= 0,0004 [Pb] + 0,0062 para cádmio e chumbo, respectivamente. O fator de enriquecimento experimental, calculado pela razão entre a inclinação do gráfico de calibração com e sem pré-concentração, foram de 40 e 36 vezes, para cádmio e chumbo, respectivamente. O sistema em fluxo é linear na faixa de concentração 0,04-10 g L -1 para cádmio e 1,1-70 g L -1 para chumbo. A avaliação da linearidade é muito importante, por isso faz-se necessário fazer distinção entre a linearidade in-line, quando é checada pelo teste de falta de ajuste e a linearidade on-line, grau da dispersão dos dados em torno da linha de calibração e é verificada por meio da expressão 100 [1-RSD (b)], onde RSD (b) é o desvio padrão relativo da inclinação. A linearidade in-line foi p = 0,3636 para Cd e p = 0,4864 para chumbo e online foi 97,99% (Cd) e 97,23% (Pb). Os parâmetros relacionados com o sistema de pré-concentração em linha, como a eficiência de concentração e o índice de consumo também foram calculados, sendo, respectivamente, 11,3 e 0,25 ml para cádmio e 10,2 e 0,28 ml para chumbo. A freqüência

83 62 analítica encontrada, nas condições ótimas, foi de 17 amostras por h 1 para ambos metais. Os fatores de transferência de fase, definida como a razão entre a massa analítica na amostra original e no concentrado, foram de 87,9 e 60 para Cd e Pb, respectivamente. Na Tabela 3.6 são apresentadas algumas características analíticas do método desenvolvido e de outros publicados, utilizando diferentes sorventes nos sistemas de préconcentração. Comparando-se os valores encontrados, pode-se verificar que o método proposto apresenta características analíticas compatíveis aos apresentados Exatidão do método desenvolvido A exatidão do procedimento foi confirmada pela determinação de cádmio e chumbo, no seguinte material de referência certificado: NIST SRM 1643d (Trace Elements in Water), fornecida pelo Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia. Observa-se, que apesar do material de referência certificado não ser da mesma matriz estudada, comparando os dados encontrados, aplicando o método desenvolvido, com os valores certificado, verifica-se que não há diferença significativa entre os valores. Isto indica, também, que o método pode ser aplicado para determinação de cádmio e chumbo em outras amostras de água. Os resultados encontram-se na Tabela 3.4. Tabela 3.4 Determinação de cádmio e chumbo em material de referência certificado (N=3). Amostra Cd ( gl -1 ) Pb ( gl -1 ) Certificado Encontrado Certificado Encontrado CRM 1643d 6,47 0,37 6,51 0,49 18,15 0,64 18,09 1,2 N = número de determinações

84 Aplicação O método proposto foi aplicado para determinação de chumbo e cádmio em amostras de água de refinaria de petróleo. Os resultados encontrados são demonstrados na Tabela 3.5. As concentrações de cádmio e chumbo variaram de 0,32 a 0,64 µg L -1 e 6,7 a 11,8 µg L -1, respectivamente. Testes de adição e recuperação também foram realizados. As recuperações variaram de 97 a 102% para o chumbo e de 93 a 106 para cádmio. Estes resultados indicam que o método não é afetado por efeitos de matriz e pode ser aplicado satisfatoriamente para determinação de chumbo e cádmio, neste tipo de amostra. Tabela 3.5 Determinação de cádmio e chumbo em amostras de água de refinaria de petróleo (N=3) Amostra Cd ( g L -1 ) Pb ( g L -1 ) Adicionado Encontrado % Rec Adicionado Encontrado % Rec 1 0 0,34 0,05 0 6,70 0,16-1 1,37 0, ,0 13, 5 0, ,32 0, ,1 0,90 1 1,29 0, ,5 22,7 0, ,51 0, ,8 0,60 1 1,44 0, ,5 23,5 0, ,64 0, ,8 0,5 1 1,70 0, ,5 22,2 0,3 99 N = número de determinações

85 64 Tabela 3.6 Comparação entre diferentes sistemas de pré-concentração para determinação de cádmio e chumbo por espectrometria de absorção atômica. Volume de Pré-concentração (ml) FE LD ( g/l) Técnica Ref. Cd Pb Amberlite XAD-2 / 2-aminothiophenol ,14 - FAAS [234] Amberlite XAD-2 / TAM ,022 - FAAS [236] Amberlite XAD-4 / DHDAA ,1 - FAAS [237] Amberlite XAD-7 / p-xylenol blue ,7 FAAS [235] Chromosorb-106 / PAN ,19 0,32 FAAS [244] Chromosorb-107 / APDC 25-1,2 GFAAS [245] silica gel / DHAQ ,62 0,45 FAAS [246] Silica gel / DPTH ,1 - ICP-AES [247] Fullerene / APDC e 5 0,1 2,4 TS-FF-AAS [248] Polyurethane foam / DDTP 2 5 0,12 - TS-FF-AAS [249] Polyurethane foam / DDTP 2 6-1,5 TS-FF-AAS [250] multiwall carbon nanotubes ,01 - TS-FF-AAS [251] Amberlite XAD-7 / Ditizona e 36 0,012 0,34 TS-FF-AAS Este trabalho

86 Conclusão O uso do planejamento Box-Behnken se mostrou eficiente para otimização do processo de pré-concentração, usando extração em fase sólida com características analíticas adequadas para determinação de cádmio e chumbo, em amostras de águas provenientes de refinaria de petróleo. O TS-FF-AAS é uma técnica muito sensível, quando comparada à espectrometria de absorção atômica convencional com chama e que, juntamente, com uma extração e préconcentração em linha dos íons metálicos, utilizando uma minicoluna de Amberlite XAD 7, carregada com ditizona é possível atingir limites de detecção compatíveis com os obtidos por GF AAS.

87 66 CAPÍTULO 4 DESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO NÃO-CROMATOGRÁFICO PARA ANÁLISE DE ESPECIAÇÃO DE ANTIMÔNIO E ARSÊNIO EM AMOSTRAS DE VEGETAIS POR HG AFS

88 Introdução Atualmente, sabe-se que não basta conhecer apenas as concentrações totais dos elementos para avaliação de seus compostos sobre o ambiente e os seres vivos. Algumas espécies de elementos traço como ocorrem com o arsênio, antimônio, cromo e mercúrio, apresentam grande diferença de toxicidade. A determinação de arsênio e antimônio em alimentos, não se restringe ao teor total do elemento, mas inclui a determinação das espécies trivalentes inorgânicas, que apresentam um risco à saúde muito superior ao das outras espécies. Então, a determinação de espécies Sb e As inorgânico nos alimentos são de grande importância, na garantia da saúde humana [252,253]. Na análise de especiação de Sb e As, técnicas hifenadas, com base no acoplamento de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), eletroforese capilar (CE) e cromatografia gasosa (GC) com detectores apropriados [253], juntamente com os métodos de análise não - cromatográficos [254], têm sido propostas. A utilização de geração de hidretos (HG) é de interesse para análise de especiação não - cromatográfica de As e Sb [255,256] especialmente com base no uso da espectrometria de fluorescência atômica (HG AFS) [257]. O antimônio está presente em cogumelos comestíveis como outros oligoelementos [258], sendo determinado o conteúdo total de Sb em macrofungos em zonas poluídas e não poluídas [259]. No entanto, na literatura não foi encontrado nenhum procedimento relativo à especiação de Sb em cogumelos. O arsênio está presente em vários vegetais, incluindo no alho [260]. Entretanto, também não há dados

89 68 sobre procedimentos de análise de especiação de arsênio em alho. Portanto, no presente trabalho foi desenvolvido um método de baixo custo, simples e validado para a análise de especiação de antimônio em cogumelos comestíveis e arsênio em alho.

90 Parte Experimental Instrumentação e Acessórios Espectrômetro de fluorescência atômica com geração de hidreto e fluxo contínuo modelo PSA Millennium Excalibur de PS analíticos (Kent, Reino Unido). Lâmpadas de cátodo oco de antimônio e arsênio (Photron, Victoria, Austrália), foram utilizadas como fonte de excitação. Separador de fase gás-líquido foi empregado para separar os hidretos gasosos, a partir da fase líquida e uma membrana Perma Pure (Farmingdale, NJ) foi utilizada para remover a umidade da fase gasosa antes de ser introduzido, em uma chama de difusão de hidrogênio de baixa energia. Uma bomba peristáltica, equipada com tubos de cloreto de polivinila flexível com 1,85 mm d.i, foi empregada para o transporte da solução da amostra, e soluções de HCl e NaBH 4. Um fluxo adicional de H 2 foi obtido, a partir de um gerador de hidrogênio Claind HG-2000 (Lenno, Itália). As medidas de fluorescência de antimônio e arsênio foram realizadas em 217,6 e 197, 3 nm, respectivamente, usando condições químicas e operacionais de acordo com trabalhos prévios [261] e experimentos preliminares. As condições são resumidas na Tabela 4.1. Um banho ultra-sônico (Selecta, Barcelona, Espanha) operado em 130 W e entre Hz foi utilizado para extração dos analitos. Outros equipamentos incluíam um liofilizador (Telstar, Barcelona, Espanha), um banho de areia (Raypa Scharlau, Barcelona, Espanha) e um forno mufla equipado com um controlador Eurotherm Control 902 (Madrid, Espanha).

91 70 Os hidretos covalentes gasosos foram formados em uma bobina de reação, usando sistema indicado na Figura 4.1. Figura 4.1 Sistema em fluxo empregado para determinação de antimônio e arsênio por HG AFS.

92 71 Tabela 4.1 Condições químicas e instrumentais empregadas para determinação de Sb e As total e espécies por HG-AFS. Parâmetros Sb As Comprimento de onda (nm) 217,6 197,3 Corrente primária (ma) 17,5 27,5 Volume de amostra (ml) 5 5 Tempo de Delay (s) Tempo de análise (s) Tempo de memória (s) HCl (mol L -1 ) 3,5 3,5 NaBH 4 % (w/v) 0,7 1,0 Razão de fluxo de Ar (ml min -1 ) Razão de fluxo de ar ( L min -1 ) 2,5 2,5 Razão de fluxo do carreador (ml min -1 ) 9 9 Razão de fluxo de NaBH 4 (ml min -1 ) 4,5 4, Reagentes Todos os reagentes utilizados nos experimentos foram de grau analítico. Água ultrapura (resistividade de 18.3 MΩ cm) de um sistema de purificação Milli-Q (Millipore, Bedford, MD, USA) foi usada para preparo de todas as soluções. A vidraria foi mantida em solução de HNO 3 10% v/v durante 12 h, para descontaminação. Antes do uso, elas foram lavadas com água deionizada e secas em um ambiente livre de poeira. As soluções foram preparadas conforme os procedimentos descritos abaixo:

93 72 (a) Solução padrão de Sb(III) 1000 mg L -1 preparada pela dissolução do C 4 H 4 KO 7 Sb.0,5H 2 O (Fluka) em água na presença de 1% (w/v) de ácido ascórbico (Scharlau ) para prevenir a oxidação. (Fluka) em água. (b) Solução padrão de Sb(V) 1000 mg L -1 preparada pela dissolução de H 6 KO 6 Sb (c) Solução padrão de As (V) e As (III) de 1000 mg L -1 ( Merck). (d) Solução de tetraborato de sódio preparada pela dissolução de uma quantidade apropriada de NaBH 4 em NaOH 0,1 mol L -1 ( Scharlau). Estas soluções foram preparadas no dia e filtradas em uma membrana de 0,45 μm (Lida, Kenosha, USA). (e) Solução de ácido clorídrico preparada pela diluição de HCl 37%, (Merck). (f) Uma suspensão de 20% (w/v) Mg(NO 3 ) 2 H 2 O e 2% (w/v) MgO (Scharlau), empregada para auxiliar na digestão das amostras. A mistura foi mantida em agitação constante. (g) Uma solução redutora de 50% (w/v) iodeto de potássio (KI) em meio 10% (w/v) de ácido ascórbico, empregada na redução das espécies M (V) para M (III). A solução redutora foi preparada em presença de ácido ascórbico para evitar a interferência do excesso de I 3 -. (h) Soluções de HCl, HNO 3, H 2 SO 4, HClO 4, ácido acético, metanol e etanol, usadas no processo de extração, foram de qualidade Suprapur (Merck). As soluções foram preparadas pela diluição direta com água. (i) Solução de 0,1% (w/v) do ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (Panreac), usada também no processo de extração. (j) Argônio C-45 (pureza> 99,995%) foi utilizado como gás de transporte e ar sintético como gás seco, ambos obtidos a partir de carbetos metálicos (Barcelona, Espanha).

94 Material de Referência e Amostra O material de referência certificado NIST 1573a (Tomato leaves) foi obtido pelo Instituto Nacional de Padrão e Tecnologia (Gaithersburg, MD, USA). Valencia (Espanha). As amostras de cogumelo e alho foram adquiridas no mercado local da cidade de Procedimento geral Preparo de amostra As amostras de cogumelo e alho foram liofilizadas e pulverizadas em um moinho doméstico (Taurus), em seguida armazenadas em frascos de polietileno e colocados em um dessecador até a análise Mineralização por via seca para determinação de antimônio e arsênio total em amostra de vegetais Aproximadamente 1 g da amosta foi pesada e tratada com 2,5 ml de uma suspensão de 20% ( p/v ) Mg (NO 3 ) 2. 6 H 2 O e 2% ( p/v ) de MgO, e 5 ml de 50% ( v/v ) HNO 3 para auxiliar a incineração. A mistura foi evaporada à secura num banho de areia e digerida em um forno mufla a 450 C, com um aumento gradual da temperatura [262]. As cinzas brancas foram umedecidas com 1 ml de água e dissolvidas em 9 ml de 10% ( v/v ) de HCl. 3 ml desta solução foram transferidos para um tubo de polietileno de 50 ml. 8,75 ml de HCl concentrado, juntamente com 600 μl da solução redutora (50% KI e 10% de ácido ascórbico) foram adicionados. O volume foi levado até 30 ml com água ultrapura e antimônio e arsênio total

95 74 foram determinados por HG-AFS, utilizando as condições experimentais, apresentadas na Tabela 4.1. Este procedimento de digestão foi realizado, a fim de assegurar a completa destruição da matéria orgânica, evitando possíveis interferências na determinação de Sb e As total, podendo assim ser utilizado como dado de referência deste estudo Extração Ultrasônica para determinação de espécies de antimônio e arsênio Cerca de 1 g de amostra foi pesada com precisão dentro de um tubo de polietileno de 50 ml. As amostras foram tratadas com 10 ml dos diferentes extratores por 10 min, em um banho ultrasônico. Os extratos foram separados por centrifugação a rpm por 10 min. Os sólidos restantes foram lavados com 10 ml de 0,1% ( p/v ) EDTA e centrifugados novamente. O sobrenadante foi misturado com o extrato anterior. Duas alíquotas foram tomadas e acidificadas com HCl a uma concentração final de 3,5 mol L -1. Uma alíquota foi diretamente medida por HG- AFS e a segunda foi preparada em um meio contendo 1% KI e 0,2% de ácido ascórbico. A solução contendo KI foi deixada para reagir durante 30 minutos antes da medida. Em ambos os casos, as condições experimentais indicadas na Tabela 4.1 foram empregadas.

96 Resultados e Discussão arsênio tóxicos Seleção das condições de extração para determinação de antimônio e A seleção dos agentes extrativos foi baseada em trabalhos prévios de determinação de antimônio [263,128,264,265,266] e arsênio [ 119,128] total Extração de antimônio em amostras de cogumelo Foram investigados os seguintes extratores: HCl, HNO 3, H 2 SO 4, ácido acético em diferentes concentrações; metanol/h 2 O (1:1) e etanol/h 2 O (1:1). Os Resultados obtidos são indicados na Tabela 4.2, como antimônio total. Considerando o conteúdo total de antimônio, os agentes mais promissores foram HCl nas concentrações estudadas: HNO 3 1,0 mol L -1, H 2 SO 4 0,5 mol L -1 e ácido acético 0,1 mol L -1. As recuperações maiores que 100% foram obtidas para as concentrações de 3 mol L -1 de H 2 SO 4 e HNO 3. Este aumento pode ser atribuído a interação do Sb com KI, gerando uma quantidade de I - 3, um composto marrom que não pode ser reduzido pelo ácido ascórbico, podendo interferir no processo subseqüente de HG de Sb, aumentando os sinais de AFS. Os baixos rendimentos de extração obtidos para ácido acético 1 mol L -1 e as misturas etanol/água e metanol /água podem ser devido às interferências na geração de hidreto, que dificulta a recuperação quantitativa do antimônio inorgânico. No caso do ácido acético, a concentração de 0,1 mol L -1 proporcionou melhor recuperação do que 1 mol L -1. Para o metanol e etanol, as baixas recuperações poderiam

97 76 está associadas ao fato que espécies inorgânicas e não unicamente orgânicas são compostos predominantes de Sb em cogumelos. Devido à boa eficiência de extração de antimônio total H 2 SO 4 0,5 mol L -1 foi selecionado para futuros estudos Extração de arsênio em amostras de alho Foram investigados os seguintes extratores: HNO 3, H 2 SO 4, HClO 4 e metanol/h 2 O (1:1). Resultados obtidos são indicados na Tabela 4.3, como arsênio inorgânico total. Levando em consideração o conteúdo total de arsênio, os agentes mais promissores foram, H 2 SO 4 1,0 mol L -1 e metanol/h 2 O (1:1). Os baixos rendimentos de extração obtidos para ácido acético e HClO 4 podem ter ocorrido devido as interferências na geração de hidreto, impedindo a recuperação quantitativa de arsênio inorgânico.

98 77 Tabela 4.2 Estudo de agentes extratantes para determinação de antimônio em cogumelos. Resultados expressos com intervalos de confiança (em um nível de 95%). N = 3. Extratante Total Sb (ng g -1 ) % Rec* HCl 6 mol L -1 20,2 ± 2,0 104 HCl 3 mol L -1 19,1 ± 1,0 98 HNO 3 3 mol L -1 31,3 ± 2,0 161 HNO 3 1 mol L -1 17,9 ± 1,4 92 H 2 SO 4 3 mol L -1 30,0 ± 1,1 154 H 2 SO 4 1 mol L -1 22,7± 0,7 117 H 2 SO 4 0,5 mol L -1 19,3 ± 0,8 99 Ácido acético 1 mol L -1 12,7 ± 2,0 65 Ácido acético 0,1 mol L -1 18,8 ± 1,2 96 Metanol / H 2 O 1:1 11,0 ± 1,0 57 Etanol / H 2 O 1:1 16,27 ± 1,5 84 *Porcentagem de extração comparada com os dados encontrados para Sb Total depois da digestão da amostra (19,4 ± 0,8 ng g -1 ). Tabela 4.3 Estudo de agentes extratantes para determinação de arsênio em amostra de alho. Resultados expressos como intervalo de confiança (em um nível de 95%). N = 3. Extratante As total (ng g -1 ) % REC * H 2 SO 4 3 mol L -1 61,1 ± 2,0 83 H 2 SO 4 1 mol L -1 71,6 ± 1,3 97 H 2 SO 4 0,5 mol L -1 38,6 ± 2,0 52 H 2 SO 4 0,1 mol L -1 29,7 ± 2,1 40 HClO 4 1 mol L -1 59,2± 1,7 80 Metanol / H 2 O 1:1 71,1 ± 0,9 96 *Porcentagem de extração comparada com os dados encontrados para As total depois da digestão (73,9 ± 1,1 ng g -1 ).

99 Análise de Especiação Em estudos prévios e testes preliminares, foi observado, que as espécies pentavalentes Sb (V) e As (V), podem reagir com NaBH 4 com cinética de reação mais baixa que o Sb (III) e As (III). Assim, o sinal produzido pelas espécies pentavalentes, depende da condição de geração de hidreto e que representa cerca de 50-70% do que é produzido pelas espécies trivalentes [257]. Uma alíquota do extrato foi misturada com KI/ácido ascórbico (solução redutora) para a determinação de Sb e As total como Sb (III) e As (III) e sem adicionar a solução redutora, a fim de obter informações sobre o estado de oxidação original do Sb e As, usando equações proporcionais apropriadas. A intensidade da AFS foi medida três vezes para cada amostra, em ambas condições, diretas e com redutor. Os dados encontrados podem serem descritos como: I = a M[III] + b M[V] ( Equação 4.1) Ired = c Mtotal ( Equação 4.2) O I e o Ired são os sinais de fluorescência obtidos antes e após redução com KI. M (III) e M (V) correspondem à concentração das duas espécies de Sb e As, a, b e c são as inclinações das curvas de calibração obtidas para padrões de Sb (III), Sb(V), As (III) e As (V) em ambas condições de medidas. Vale salientar, que nas condições reduzidas todo o Sb e As extraído foi medido como (III), sendo: Mtotal = M(III) + M(V) ( Equação 4.3).

100 Características analíticas Os principais parâmetros analíticos do procedimento desenvolvido, como: sensibilidade, limite de detecção e precisão estão resumidos na Tabela 4.4, juntamente com as inclinações das equações de regressão, obtidas antes e após a redução com KI. Os valores do limite de detecção (LD) foram calculados dividindo-se três vezes o desviopadrão de 10 medidas do sinal do branco pela inclinação da curva analítica, nas melhores condições experimentais, para cada espécie de antimônio e arsênio. O limite de detecção foi também estabelecido para amostras secas, levando-se em conta a massa de amostra e o fator de diluição envolvido na metodologia proposta. A precisão expressa como desvio padrão relativo (RSD%) de 10 replicada das amostras analisadas também são apresentadas. Tabela 4.4 Características analíticas do método desenvolvido. Elemento Inclinação a R 2 LD (ng L -1 ) LD (ng g -1 ) LQ (ng g -1 ) %RSD Sb (III) ,9995 3,0 0,6 2,0 5,1 (4,6 ng g -1 ) Sb (III) red ,9994 Sb (V) 655 0,9995 5,5 1,1 3,6 3,8 (14,7 ng g -1 ) Sb (V) red ,9991 As (III) 422,0 0,9985 4,2 0,84 2,8 4 (18,22 ng g -1 ) As (III) red 425,7 0,9994 As (V) 263,8 0,9988 7,0 1,4 4,7 3 (56,80 ng g -1 ) As (V) red 418,0 0,9991 a A curva de calibração foi obtida por padrões de antimônio de Sb(III), Sb(V), As (III) e As (V) na ausência e na presença de KI. Um mínimo de cinco padrões e um branco foram utilizados para a curva de calibração na faixa de concentração de 0 a 1 ng ml -1.

101 Exatidão do método desenvolvido Estudos de recuperação foram realizados nas amostras com mistura de ambas as espécies no nível entre 10 e 20 ng g -1 de Sb (III) e Sb (V), adicionadas nas amostras de cogumelos (ver tabela 4.5). Ao arsênio foi adicionado 50 ng g -1 de As (III) e As (V) em amostras de alho (ver Tabela 4.6). Boas recuperações foram observadas para as duas espécies de arsênio e antimônio estudadas. Observa-se, que as espécies adicionadas permanecem inalteradas, após o processo completo de pré-tratamento, indicando que a sonicação das amostras com H 2 SO 4 (nas concentrações empregadas), à temperatura ambiente não modifica as espécies de arsênio e antimônio presentes nas amostras. O procedimento de digestão por via seca também foi avaliado, através de testes de adição e recuperação dos analitos nas amostras. As recuperações variaram entre 96 a 104 %, verificando que não há perda significativa dos analitos durante o processo de digestão. A exatidão foi confirmada pela análise de um CRM NIST 1573a (tomato leaves). Observa-se, que apesar da amostra certificada não ser a mesma matriz dos vegetais estudados, comparando os dados encontrados pela soma das espécies de As e Sb, com o valor total da amostra certificado, verifica-se que não há diferença significativa entre os valores. Isto indica, também, que o método pode ser aplicado para determinação de antimônio e arsênio em outros vegetais. Os resultados são apresentados na Tabela 4.7.

102 81 Tabela 4.5. Recuperação de espécies de antimônio, utilizando adição de analito em amostras de cogumelos analisadas por HG-AFS, depois da extração de antimônio com 0,5 mol L -1 de H 2 SO 4. Amostra Sb III (ng g -1 ) Sb V (ng g -1 ) % Rec Sb III % Rec Sb V adição adição Pleurotus Eringi ± 0,8 101 ± 0,5 Lactarius volemus ± 1,0 105 ± 0,9 Agaricus Blazei Murril ± 0,7 98 ± 1,1 Tabela 4.6. Recuperação de espécies de arsênio, utilizando adição de analito em amostras de alho analisadas por HG-AFS, depois da extração de arsênio com 1,0 mol L -1 H 2 SO 4. Adicionado As (III) As (V) 0 17,5 ± 0,5 56,3 ± 0,9 50 As (III) 66,8 ± 0,9 55,9 ± 1,1 50 As (V) 17,8 ± 0,8 105,2 ± 0,2 % Rec 98,9 ± 1,4 98,9 ± 0,2 Tabela 4.7. Análise de especiação não-cromatográfica do material de referência certificado NIST 1573a (tomato leaves) Elemento M (V ) M (III) Soma das Espécies Valor Certificado Antimônio (ng g -1 ) 7,3 ± 0,7 55,5 ± 0,5 62,8 ± 0,8 63 ± 6 Arsênio (ng g -1 ) 87,9 ± 2,1 22,6 ± 0,3 110,5 ± 1,7 112 ± Análise das amostras de cogumelos As amostras de cogumelos, obtidas nos mercados da cidade de Valencia na Espanha, foram analisadas pelo método desenvolvido e os resultados encontrados para

103 82 espécies Sb são resumidos na Tabela 4.8, juntamente com os dados encontrados para o Sb total determinados, após mineralização da amostra por HG-AFS. O Teste t demonstrou que não existe diferença significativa entre os resultados encontrados para o Sb total, analisados por ambos os métodos. Os resultados obtidos indicam que Sb (V) é a principal espécie presente nas amostras analisadas. Os resultados encontrados estão em concordância com os de cogumelos comestíveis, cultivados em áreas não poluídas como foi demonstrado anteriormente por Borovič et al [267] Análise das amostras de alho As amostras de alho, obtidas nos mercados da cidade de Valencia na Espanha, foram analisadas pelo método desenvolvido e os resultados encontrados para espécies As são resumidos na Tabela 4.9, juntamente com os dados encontrados para o As total determinados após mineralização da amostra por HG-AFS. O Teste t demonstrou que não existem diferenças significativas entre os resultados encontrados para o As total analisados, por ambas as metodologias. Contudo, podemos verificar, também, que as espécies de arsênio, presentes nas amostras, estão na sua maioria na forma inorgânica. O As (V) é a principal espécie presente nas amostras analisadas. Os resultados encontrados estão em concordância com os de alhos encontrados por Huang et al [260]

104 83 Tabela 4.8 Concentrações de espécies de Sb em amostras de cogumelos comerciais, determinadas por HG-AFS. Resultados expressos com intervalo de confiança (no nível de 95%). Observação número = 3. Amostra Sb III Sb V Soma Total Sb a % Sb(III) % Sb(V) (ng g -1 ) (ng g -1 ) (ng g -1 ) Chines Mushooms 9,7 ± 0,5 21,2 ± 0,6 30,9 ± 0,5 30,7 ± 0, Leucopaxillus Giganteus 6,5 ± 0,5 15,3 ± 0,8 21,8 ± 0,9 22,0 ± 0, Agaricus Blazei Murril 11,4 ± 0,3 16,1 ± 0,5 27,5 ± 0,7 27,3 ± 1, Lactarius volemus 9,1 ± 0,5 15,4 ± 0,7 24,5 ± ,3 ± 1, Pleurotus Eringi 4,6 ± 0,5 14,7 ± 0,8 19,3 ± ,4 ± 0, a Total de Sb determinado depois da mineralização. Tabela 4.9 Concentrações de espécies de As em amostras de cogumelos comerciais, determinadas por HG-AFS. Resultados expressos com intervalo de confiança (no nível de 95%). Número de observação = 3. Amostra As III (ng g -1 ) AsV (ng g -1 ) Soma (ng g -1 ) As Total a % As III % AS V 1 18,2 ± 0,8 56,8 ± 2,0 75,0 ± 1,7 73,9 ± 1, ,4 ± 0,6 67,6 ± 1,6 88,0 ± 1,5 87,3 ± 1, ,6 ± 0,2 54,7 ± 0,6 75,3 ± 0,8 76,2 ± 1, ,1 ± 0,3 64,5 ± 1,4 86,6 ± 1,2 88,3 ± 1, ,8 ± 0,5 57,5 ± 0,4 76,3 ± 0,3 75,0 ± 2, ,1 ± 0,2 59,0 ± 0,3 76,1 ± 0,2 76,2 ± 1, a Total de As determinado depois da mineralização.

105 Considerações Finais A estratégia não-cromatográfica desenvolvida para determinação de Sb (III), Sb(V), As (III) e As (V) por HG AFS oferece um procedimento alternativo simples e rápido, para análise de especiação das formas tóxicas de Sb e As, em amostras de cogumelos e alhos. O procedimento desenvolvido para especiação de antimônio e arsênio demonstrou que a sonicação das amostras estudadas, com soluções de H 2 SO 4 0,5 mol L -1 para Sb e de H 2 SO 4 1,0 mol L -1 para As, em temperatura ambiente, é um procedimento eficiente de extração de Sb e As não modificando as espécies originais. Embora, ainda, não se encontre disponível no mercado materiais de referência certificados para validar o presente trabalho, os resultados encontrados, para a soma das espécies no material de referência certificado, eram concordantes com o valor do conteúdo total dos elementos na amostra certificada. As amostras analisadas apresentaram o conteúdo total abaixo do limite máximo, permitido pela legislação Espanhola [268] e as principais espécies estão presentes na forma menos tóxicas, Sb (V) e As (V), não apresentando risco no consumo de cogumelos e alhos.

106 85 CAPÍTULO 5 DETERMINAÇÃO DE ARSÊNIO TOTAL EM AMOSTRAS DE VINHO COMERCIALIZADAS NO BRASIL POR HG AAS

107 Introdução O vinho é uma bebida amplamente consumida pela população mundial, por isso é relevante a investigação de elementos contaminantes, sob o ponto de vista de segurança alimentar. A presença de metais pesados no vinho está diretamente relacionada com o desenvolvimento da atividade industrial e com a poluição gerada. Por elementos contaminantes dos vinhos, entende-se normalmente o conjunto dos metais pesados, Al, e ainda alguns não metais tais como As, Se e Sb, e mais recentemente Be, com exclusão dos metais alcalinos e restantes alcalino-terroso [269]. O conteúdo do arsênio no vinho depende de inúmeros fatores, incluindo o tipo de solo, condições climáticas, a poluição, a variedade da uva, a utilização de adubos e pesticidas, a viticultura e o processo de fabricação. A Organização Internacional da Vinha e do Vinho (OIV) estabelece que o limite máximo de arsênio permitido em vinhos é de 0,2 mg L -1. Quando em concentrações superiores a 1 mg L -1 constitui perigo para a saúde humana. O teor de As total em vinhos pode ser determinado por AAS, com gerador de hidretos [270], espectrometria de fluorescência atômica com gerador de hidretos [271], ETAAS [272] e ICP-MS [273]. A ETAAS tem sido uma alternativa atrativa para geração de hidreto, visto que a amostra pode ser injetada diretamente no forno de grafite. Vários modificadores químicos, como nitrato de paládio, nitrato de níquel e sulfato de níquel, têm sido usados, contudo a

108 87 decomposição da amostra é requerida, em muitos casos, para aumentar a sensibilidade e obter recuperações quantitativas [275]. A determinação direta de vinho por HG - AAS não é possível devido à forte supressão, causada pelo etanol e da falta de sensibilidade da técnica. Normalmente, requer a decomposição da amostra [274,275]. Segura et al. [275] fizeram uma avaliação da capacidade da técnica HG AAS, para determinação direta de arsênio em vinho e cerveja. De acordo com os resultados, a quantidade de NaBH 4 requerida para geração de hidreto foi considerada maior em relação ao meio aquoso, cerca de 10%. O efeito do HCl foi considerado similar em relação ao meio aquoso. Observaram-se variações no background. Isto pode ser atribuído aos vapores de etanol transportados para o sistema de geração de hidreto. Todavia, a sensibilidade da técnica foi limitada e o sinal de arsênio não foi detectado nas amostras. Logo, a técnica não é sensível para análise direta de arsênio em quantidade traço, µg L -1, sendo necessária uma prévia digestão da amostra. No intuito de avaliar o teor de arsênio, em vinhos comercializados no Brasil, foi desenvolvido um método para determinação de arsênio total por FI-HG AAS, com um sistema de atomização eletrotérmica. As condições de geração de hidreto (concentrações do NaBH 4 e do ácido) e a temperatura de atomização foram otimizadas, através do planejamento Box-Behnken. Comparando-se também a sensibilidade do sistema de HG - AAS com atomização em chama e com atomização eletrotérmica.

109 Parte Experimental Instrumentação e Acessórios Um espectrômetro de absorção atômica com chama, marca Varian, modelo SpectrAA 220, equipado com lâmpada de deutério, como corretor de fundo, foi usado para determinação do metal. Lâmpada de cátodo oco de arsênio foi utilizada como fonte de radiação. Os parâmetros instrumentais são apresentados na Tabela 5.1. Um modulo de geração de hidreto VGA 77, com fluxo contínuo, utilizando uma bomba peristáltica, para misturar os reagentes e as amostra. Utilizou-se também um separador de fase gás-líquido com um fluxo constante de argônio e um sistema de aquecimento eletrotérmico com temperatura controlada (ETC- 60), Varian. O hidreto covalente gasoso foi formado pela reação da amostra, em um meio ácido com HCl e NaBH 4 em bobina de reação, usando o sistema indicado na Figura 5.1.

110 89 Tabela 5.1 Condições químicas e instrumentais empregadas para determinação de As total por HG-AAS Parâmetros As Comprimento de onda (nm) 193,7 Corrente da lâmpada (ma) 10,0 Tempo de Delay (s) 45 Tempo de análise (s) 5 HCl (mol L -1 ) 3,2 NaBH 4 % (w/v) 1,6 Razão de fluxo do Carreador (ml min -1 ) 1,0 Razão de fluxo de NaBH 4 (ml min -1 ) 1,0 Razão de fluxo de amostra (ml min -1 ) 7,0 Figura Sistema em fluxo para geração de hidreto por AAS.

111 Reagentes Todos os reagentes utilizados nos experimentos foram de grau analítico. Água ultrapura (resistividade de 18.3 MΩ cm) de um sistema de purificação Milli-Q (Millipore, Bedford, MD, USA) foi usada no preparo de todas as soluções. A vidraria foi mantida em solução de ácido HNO 3 10% v/v durante 12 h, para descontaminar. Antes do uso, ela foi lavada com água deionizada e seca em um ambiente livre de poeira. As soluções foram preparadas conforme os procedimentos descritos abaixo: (a) Solução padrão de As (III) de 1000 mg L -1 foi preparada pela dissolução de As 2 O 3 em uma solução de 20 % (w/v) KOH, neutralizada com 20% (v/v) de H 2 SO 4 e diluída com 1% (v/v) H 2 SO 4. (b) Solução de tetraborato de sódio foi preparada pela dissolução de uma quantidade apropriada de NaBH 4 em NaOH 0,5 mol L -1 ( Aldrich). Estas soluções foram preparadas no dia e filtradas em uma membrana de 0,45 μm Lida (Kenosha, USA). (Merck). (c) Solução de ácido clorídrico foi preparada pela diluição de HCl 37%, (d) Uma suspensão de 80,0 g de Mg(NO 3 ) 2 H 2 O e 8,0 g (w/v) de MgO em 200mL de água. A mistura foi mantida em agitação constante. ácido ascórbico. (e) Uma solução redutora de 50% (w/v) de iodeto de potássio (KI) / 10% (w/v) (f) Argônio C-45 (pureza> 99,995%) foi utilizado como gás de transporte.

112 Procedimento geral Amostra As amostras de vinho analisadas foram compradas em supermercados da cidade de Salvador, Brasil ( ). Os tipos de vinhos foram, tintos e brancos, suaves, secos e demi-secos Mineralização por via seca para determinar arsênio total em vinho Um volume 10 ml da suspensão de Mg (NO 3 ) 2 - MgO foi adicionado em 10 ml de amostra em um Becker de 500 ml, coberto com um vidro relógio. A mistura foi mineralizada em um forno mufla, com um aumento gradual da temperatura, com o seguinte programa de temperatura: 100ºC por 1h, 250 C por 2 h e 540 C por 14 h [275]. As cinzas brancas foram dissolvidas em ácido clorídrico concentrado e diluídas com água de Milli- Q, para um volume final de 10 ml. O branco foi preparado realizando o mesmo procedimento de digestão com 10 ml da suspensão de Mg (NO 3 ) 2 MgO Determinação de arsênio total em amostras de vinho Um volume de 2 ml da amostra digerida foi transferido para um tubo de polietileno de 50 ml. 2,7 ml de HCl concentrado juntamente com 1 ml da solução redutora (50% KI e 10% de ácido ascórbico) foram adicionados. O volume foi elevado até 10 ml com água ultrapura e o arsênio total foi determinado por FI- HG-AAS com atomização eletrotérmica, utilizando as condições experimentais apresentadas na Tabela 5.1.

113 Otimização O processo de otimização foi realizado usando a metodologia de superfície de resposta. A matriz de planejamento Box-Behnken foi usada para otimização de três variáveis experimentais: concentração do HCl e NaBH 4 e temperatura de atomização do sistema eletrotérmico. Neste caso, todas as variáveis foram estudadas em três níveis. Na realização dos experimentos, utilizou-se uma solução de 3 µg L -1 de arsênio. Replicadas no ponto central foram realizadas para avaliar a variância experimental. As respostas foram obtidas como sinais de absorvância correspondente ao arsênio. Os dados experimentais foram processados no programa STATISTICA, com um nível de confiança fixo de 95% [276].

114 Resultados e Discussão Otimização do procedimento de pré-concentração As condições experimentais de geração de hidreto, para deteminação seletiva de espécies de arsênio, vêm sendo estudada por diversos autores [277, 278, 279]. Entretanto, devido a uma variedade de configurações e condições é difícil obter-se uma descrição clara de como estes fatores influenciam a sensibilidade das medidas [252]. A concentração do NaBH 4 deve ser otimizada para o elemento de interesse, assim como para o equipamento [131]. A acidez também é um fator importante, pois a formação destes hidretos é dependente do ph e está relacionada aos valores do pka de cada espécie individual [277]. A otimização foi realizada usando uma matriz Box-Behnken. As variáveis estudadas foram: concentração do HCl e NaBH 4 e temperatura de atomização do sistema eletrotérmico. Através deste planejamento multivariado, não só as variáveis são estudadas individualmente, mas também a influência de suas interações no momento da geração do hidreto. Na Tabela 5.2, encontra-se a matriz com os valores reais e a resposta como sinal analítico (absorvância). O ponto central foi corrido em triplicata no sentido de avaliar o erro experimental. A equação (1), abaixo, ilustra a relação entre as três variáveis: concentração do HCl e NaBH 4, temperatura de atomização do sistema eletrotérmico e sinal analítico (Abs), considerando os valores reais.

115 94 Abs = -6, ,28936(HCl) 0,01672 (HCl) 2 + 0,29075 ( NaBH 4 ) 0,09038 (NaBH 4 ) 2 + 0,01286(T) 0,00001(T) 2 + 0,00953 (HCl) (NaBH 4 ) 0,00021 (HCl) (T) 0,00004 (NaBH 4 ) (T) Esta equação mostra o ponto crítico da superfície de resposta, que é o máximo na concentração de 3,3 mol L -1 de HCl e 1,57 % de NaBH 4, e a temperatura de atomização de 918. Na Figura 5.2, encontram-se as superfícies de respostas para o planejamento. Analisando a curva de nível, pode-se observar que o sistema é robusto, para as variáveis estudadas e que o valor da temperatura de atomização recomendada pelo fabricante, 925 C está dentro da região ótima no planejamento. Verificando que a recomendação feita pelo fabricante está de acordo com as encontradas no planejamento, para a temperatura de atomização do arsênio. Tabela 5.2 Matriz de planejamento Box-Behnken para otimização das condições de geração de hidreto. HCl ( mol L -1 ) NaBH 4 (%) Temperatura ( C) Abs 1,0 1, ,1281 5,0 1, ,1522 1,0 2, ,1049 5,0 2, ,1672 1,0 1, ,0682 5,0 1, ,1707 1,0 1, ,1603 5,0 1, ,1781 3,0 1, ,1699 3,0 2, ,1968 3,0 1, ,1823 3,0 2, ,2055 3,0 1, ,2270 3,0 1, ,2257 3,0 1, ,2300

116 Figura 5.2 Superfícies de respostas para o planejamento obtido pelo ajuste de uma função quadrática aos dados da Tabela

117 Estudo do tipo de atomizador Um estudo para avaliar a sensibilidade da atomização, no tubo de quartzo, aquecido na chama e eletrotermicamente, foi realizado. Sendo a atomização eletrotérmica (ETA) mais sensível que a atomização na chama. Na Tabela 5.3, encontram-se as equações da curva de calibração. Tabela 5.3 Curvas de calibração para As usando atomização eletrotérmica e atomização na chama para o sistema de FI-HG - AAS. Método Equação linear R 2 ETA HG - AAS Abs = 0,0781x - 0,0054 0,9991 Chama HG - AAS Abs = 0,0424x + 0,0022 0, Características Analíticas Os principais parâmetros analíticos do procedimento desenvolvido, limite de detecção, limite de quantificação e precisão obtidos pelo método, estão resumidos na Tabela 5.4. Os valores do limite de detecção (LD) e quantificação (LQ) foram calculados de acordo com a recomendação da IUPAC. A precisão foi expressa como desvio padrão relativo (RSD%), para 10 determinações de soluções de 1 e 3 g L -1 de arsênio.

118 97 Tabela 5.4 Características analíticas do método desenvolvido. Parâmetros de Mérito Valor Limite de detecção ( g L -1 ) 0,06 Limite de quantificação ( g L -1 ) 0,2 Precisão (1 g L -1 ) 2,1% Precisão (3 g L -1 ) 1,6% Exatidão do método A exatidão do método não é facilmente estabelecida, uma vez que não existe amostra certificada de vinho, disponível para determinação de arsênio. A exatidão foi então avaliada, através de testes de adição do analito e recuperação. Os testes foram feitos em duas amostras de vinhos brancos e vinhos tintos, antes da digestão da amostra. As recuperações variaram entre 96 a 106 %. Estes resultados demonstraram a exatidão e a aplicabilidade deste método na análise de arsênio em vinho. Os testes de adição e recuperação encontram-se na Tabela 5.5.

119 98 Tabela 5.5 Recuperação de arsênio total utilizando o teste de adição do padrão, em amostras de vinhos analisada por HG-AAS. Vinho As adicionado As encontrado (%) Recuperação ( g L -1 ) ( g L -1 ) Tinto seco 0,0 10,4 ± 0,7-10,0 21,0 ± 1,4 106 Branco seco 0,0 18,9 ± 1,3-20,0 38,1 ± 1,1 96 Tinto suave 0,0 15,3 ± 0,7-20,0 34,7 ± 1,2 97 Branco suave 0,0 16,9 ± 0,6-20,0 37,3 ± 0, Aplicação do método desenvolvido O método proposto foi aplicado na determinação de arsênio, em amostras de vinho adquiridas em supermercados de Salvador. Foram analisadas 20 amostras vinho de diferentes regiões do Brasil. Os resultados encontram-se expostos na Tabela 5.6, com suas respectivas concentrações e intervalos de confiança para cada uma das amostras. A Figura 5.3 mostra uma distribuição uniforme dos resultados de arsênio total em vinhos brasileiros. Estes resultados demonstram que as concentrações de arsênio, encontradas nas amostras, estão dentro do limite estabelecido pelo Decreto Federal n /90 da lei 7.678/88 do Ministério da Agricultura.

120 99 Tabela 5.6 Determinação de arsênio total em amostras de vinhos comercializadas no Brasil. Tipo Origem Tipo de Uva As (µg L -1 ) Tinto seco São Francisco Cabernet Sauvignon 14,1 ± 1,2 Tinto seco São Francisco Shiraz 12,7 ± 0,8 Branco seco Bento Gonçalves Chardonnay 15,5 ± 1,7 Branco seco São Francisco Chenin Blanc 10,1 ± 0,6 Tinto demi-seco São Francisco Tannat 19,1 ± 0,5 Branco demi-seco Campanha Riesling 13,6 ± 1,0 Tinto suave Caxias do Sul 10,3 ± 1,0 Branco suave Bento Gonçalves 9,9 ± 0,7 Tinto seco Santana do Livramento Cabernet Franc 14,3 ± 0,9 Branco Seco Bento Gonçalves Chardonnay 17,2 ± 1,4 Tinto demi seco S. Bernado do Campos Cabernet Franc 16,1 ± 1,2 Tinto seco fino Santana do Livramento Merlot 10,4 ± 0,7 Branco seco São Francisco Chenin Blanc 18,4 ± 0,9 Tinto seco Caxias do Sul Cabernet Sauvignon 12,8 ± 0,6 Tinto seco Bento Gonçalves Cabernet Sauvignon, 9,9 ± 0,8 Merlot e Pinot Noir Tinto seco Caxias do Sul Tannat 13,5 ± 1,0 Tinto seco Bento Gonçalves Gamay 8,7 ± 0,8 Tinto suave São Francisco Cabernet Sauvignon 15,3 ± 0,7 e Shiraz Branco suave São Francisco Moscato Canelli 16,9 ± 0,6 Branco seco Campanha Sauvignon Blac 18,9 ± 1,3

121 Figura 5.3 Concentração de arsênio ( µg L -1 ) em amostras de vinhos brasileiros. 100