Estudos de adsorção de fosfatidilcolinas em. interfaces ar-água e líquido-líquido polarizadas

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1 Hélder Almeida Santos Estudos de adsorção de fosfatidilcolinas em interfaces ar-água e líquido-líquido polarizadas Relatório de Seminário Química Analítica Dissertação para Licenciatura em Química Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Departamento de Química 2003

2 Agradecimentos Aos que tronaram o trabalho possível: Ao Departamento de Química da Faculdade de Ciências da Universidade do Porto por todas as condições proporcionadas para a realização deste trabalho. Aos colegas e amigos com quem partilhei o laboratório, e que sempre me apoiaram e ajudaram, em especial, aos Licenciados Ricardo Silva, Ana Barbosa, Tiago Silva e Sérgio Barreira, por todo incentivo, bom ambiente de trabalho proporcionado, camaradagem e simpatia. Ao Prof. Doutor Carlos Melo Pereira, meu orientador, pelo apoio na execução experimental, pela inestimável ajuda, interesse e dedicação com que sempre soube atender às minhas solicitações e por toda a amizade revelada, que foram preponderantes para a obtenção deste excelente trabalho, os meus mais sinceros agradecimentos. À minha família e aos que de uma forma ou de outra me ajudaram. A todos o meu muito obrigado. i

3 Resumo O presente trabalho é constituído por duas partes. Na primeira parte estudou-se o comportamento de fosfolípidos na formação de monocamadas na interface ar-água, por aplicação da técnica de Langmuir-Blodgett (LB), e na segunda, o efeito da adsorção dos fosfolípidos em interfaces líquido-líquido polarizadas, por aplicação de técnicas voltamétricas e espectroscopia de impedância electroquímica (EIE). Utilizando a técnica de LB mediram-se as curvas de tensão superficial dos fosfolípidos, diaraquidoilfosfatidilcolina (DAPC), dibenoilfosfatidilcolina (DBPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) e distearoilfosfatidilcolina (DSPC), bem como, a influência de diversos parâmetros na formação e estabilidade de monocamadas desses fosfolípidos, nomeadamente a temperatura, o tipo de electrólito de suporte e a sua concentração na subfase, e o efeito da presença da enzima Glucose Oxidase (GOx) na subfase aquosa. Efectuaramse também, estudos de transferência de filmes de LB para slides de Ouro e utilizou-se a espectroscopia de infravermelho (FT-IR) para analisar esses slides. Utilizando técnicas voltamétricas e recorrendo à EIE, estudou-se o efeito da adsorção de diferentes fosfatidilcolinas (DAPC, DBPC e DPPC), em interfaces líquido-líquido polarizadas, bem como, a interacção observada entre estes fosfolípidos presentes, e a enzima GOx, e os catiões acetilcolina (ACh + ) e butirilcolina (BuCh + ). Verificou-se que os diferentes fosfolípidos (DAPC, DBPC, DPPC, e DSPC), apresentam diferentes comportamentos quando comprimidos sobre uma subfase aquosa. Os resultados parecem depender, fundamentalmente, do comprimento da sua cadeia, não sendo notório, a diferença do comportamento dos fosfolípidos por variação da concentração do electrólito de suporte da subfase aquosa. A temperatura afectou drasticamente a estabilidade das monocamadas dos fosfolípidos. O estudo da transferência de filmes de LB para slides de Ouro pretendeu avaliar a estrutura do filme dos fosfolípidos adsorvidos neste material, no entanto, os resultados obtidos foram insuficientes para tirar qualquer tipo de conclusão. Da observação das isotérmicas de mistura de fosfolípidos, pareceu que, a presença de GOx na subfase aquosa afectou o seu comportamento, mas, uma vez mais, os resultados não foram totalmente esclarecedores para se tirar uma conclusão definitiva. Através das curvas de capacidade observou-se que a adsorção dos diferentes fosfolípidos foi mais fraca a potenciais positivos, enquanto que a potenciais negativos foram obtidas monocamadas estáveis, devido a uma forte adsorção dos fosfolípidos na interface. A presença de GOx dificultou a adsorção dos fosfolípidos a potenciais negativos, enquanto que, a potenciais positivos, o aumento dos valores das curvas de capacidade indicou uma desorção do fosfolípido e uma possível adsorção da GOx na interface. Estes efeitos foram variáveis com a concentração de GOx na fase aquosa e foram mais notórios na presença do solvente 1,2-dicloroetano, do que na presença do solvente éter 2-nitrofeniloctílico. Na presença de ACh + e BuCh + na fase aquosa, observa-se um pico nas curvas de capacidade a potenciais positivos, devido à sua transferência iónica, não tendo estes qualquer influência na adsorção dos fosfolípidos observada a potenciais mais negativos. ii

4 Índice geral Página Agradecimentos Resumo Índice geral Lista de símbolos e abreviações i ii iii vi Capítulo 1 - Introdução Filmes de Langmuir-Blodgett Pequena história dos filmes de Langmuir-Blodgett Tensão superficial Técnica e filmes de Langmuir-Blodgett Surfactantes e filmes de Langmuir Monocamadas insolúveis e balança de Langmuir Forças que actuam na superfície da subfase Isotérmicas: pressão superficial vs. área Fases dos filmes monomoleculares Aplicações de Filmes de Langmuir Materiais adequados para a técnica de LB Subfase aquosa Processo de deposição de filmes LB sobre um substracto (hidrofóbico ou hidrofílico) Tipos de deposição de filmes de LB Métodos Voltamétricos Voltametria Cíclica As ITIES, a dupla camada eléctrica e a microinterface. A electroquímica nas interfaces líquido-líquido Interface entre duas soluções de electrólitos imiscíveis (ITIES) Interfaces líquido-líquido idealmente polarizadas Dupla camada eléctrica numa interface líquido-líquido Janela de potencial Transferência iónica Transporte de massa nas ITIES: migração, convecção e difusão Espectroscopia de impedância electroquímica (EIE) 29 iii

5 A impedância nas interfaces líquido-líquido Dupla camada eléctrica Formação de uma monocamada na interface Membrana celular Os fosfolípidos Glucose Oxidase (GOx) Neurotransmissores Adsorção nas ITIES 39 Capítulo 2 Execução Experimental Reagentes utilizados na preparação das soluções Técnica de Langmuir-Blodgett (LB) Material e instrumentação Procedimentos experimentais Espectroscopia de impedância electroquímica Material e instrumentação Reagentes Solventes Electrólitos Eléctrodos Procedimentos experimentais 51 Capítulo 3 Resultados e Discussão Filmes de Langmuir-Blodgett Estudo das isotérmicas de diferentes fosfolípidos na interface ar-água Estudo da isotérmica do fosfolípido DBPC (C22) na interface ar-água. Estudo do efeito do electrólito da subfase aquosa Estudo da isotérmica do fosfolípido DAPC (C20) na interface ar-água Estudo da isotérmica do fosfolípido DSPC (C18) na interface ar-água. Estudo do efeito do electrólito da subfase aquosa Estudo da isotérmica do fosfolípido DPPC (C16) na interface ar-água. Estudo do efeito do electrólito de suporte e da sua concentração na subfase aquosa, e estudo do efeito da temperatura na isotérmica de DPPC Estudo da isotérmica de misturas de fosfatidilcolinas na presença da enzima Glucose Oxidase (GOx) na interface ar-água Transferência de monocamadas de fosfolípidos para substractos sólidos Transferência da monocamada de DBPC para slides de Au Estudos de adsorção de fosfatidilcolinas e da enzima GOx em interfaces líquido-líquido polarizadas 68 iv

6 Efeito do ph na adsorção de GOx na interface água/1,2-dce polarizada Estudo de adsorção da GOx na interface água/1,2-dce Estudos de adsorção de DAPC (C20). Efeito da presença de GOx na fase aquosa Estudos de adsorção de DBPC (C22). Efeito da presença de GOx na fase aquosa Estudos de adsorção da DPPC (C16) Adsorção de DPPC. Estudos da presença da enzima GOx na fase aquosa Comparação do efeito de adsorção dos diferentes fosfolípidos estudados Estudos de adsorção de fosfolípidos na interface água/2-npoe polarizada na presença da enzima GOx Efeito do solvente orgânico na adsorção da Glucose Oxidase (GOx) Efeito do ph Efeito do solvente orgânico na adsorção de DPPC Estudos de adsorção de DPPC na interface água/1,2-dce polarizada na presença da acetilcolina (ACh + ) Estudos da transferência iónica através da interface água/1,2-dce na presença da acetilcolina na fase aquosa Estudos da transferência iónica através da interface água/1,2-dce da acetilcolina (ACh + ) na presença do fosfolípido DPPC Estudos de adsorção de DPPC na interface água/1,2-dce polarizada na presença da butirilcolina (BuCh + ) Estudos da transferência iónica através da interface água/1,2-dce na presença da butirilcolina na fase aquosa Estudos da transferência iónica através da interface água/1,2-dce da butirilcolina (BuCh + ) na presença do fosfolípido DPPC 115 Capítulo 4 Conclusões finais 117 Capítulo 5 Bibliografia 121 v

7 B Lista de símbolos e abreviaturas EIE Espectroscopia de impedância Electroquímica ITIES Interface entre duas soluções de electrólitos imiscíveis TOATPB Tetrafenilborato de tetraoctilamónio TBATPB Tetrafenilborato de tetrabutilamónio NaTPB Tetrafenilborato de sódio GOx Glucose Oxidase (Aspergillus Niger) 1,2-DCE 1,2-dicloroetano 2-NPOE Éter 2-nitrofeniloctílico LiCl Cloreto de Lítio NaCl Cloreto de Sódio KCl Cloreto de Potássio HCl Ácido Clorídrico CHCl 3 Clorofórmio CdCl. 2 H 2 O Cloreto de Cádmio monohidratado Ag/AgCl Prata/Cloreto de prata N 2 Au DLPC DMPC DPPC DSPC DAPC DBPC LB Π Π c γ 0 γ γ prato Azoto líquido Slide de Ouro Dilauroilfosfatidilcolina (C12:0) Dimiristoilfosfatidilcolina (C14:0) DL-α-Dipalmitoilfosfatidilcolina(C16:0) DL- α-distearoilfosfatidilcolina (C18:0) L-α-Diaraquidoilfosfatidilcolina (C20:0) L- α-dibenoilfosfatidilcolina (C22:0) Filmes ou técnica de Langmuir-Blodgett Pressão superficial do filme de Langmuir (mn/m) Pressão superficial de colapso (mn/m) Tensão superficial do solvente puro Tensão superficial da solução Tensão superficial do prato A 0 Área de pressão molecular zero (Å 2 ) A Área molecular (Å 2 ) T Temperatura absoluta (K) K B l p, w p, t p e ρ p h l ρ l Constante de Boltzmann Respectivamente, o comprimento, a largura, a espessura e a densidade do prato de Wilhelmy Profundidade de imersão do prato de Wilhelmy Densidade de um líquido usado na subfase vi

8 c Concentração (mol.dm -3 ) Γ Excesso superficial (mol.m -2 ) g Aceleração da gravidade (~ 9.8 m.s -2 ) Π-A Isotérmica pressão superficial vs. área por molécula G Estado gasoso de isotérmica L1 ou LE Estado líquido expandido de isotérmica L2 ou LC Estado líquido condensado de isotérmica LE+LC Estado intermediário líquido condensado-líquido expandido de isotérmica (também representado por L1+L2) S Estado sólido de isotérmica Ai Pressão superficial à qual a transição de fase ocorre entre o estado L1 e L2 e os Estados L2 e S τ Velocidade de transferência ou espessura de uma monocamada de fosfolípido adsorvido A L A S LS FAD v v.c. PVC L-L Z ou Z Im Área ocupada pela monocamada na superfície aquosa durante uma deposição Área coberta do substrato sólido Técnica de Langmuir-Schaeffer Flavina Adenina Dinucleótido Velocidade de varrimento ou Velocidade termodinâmica Voltametria cíclica Cloreto de polivinilo Interface imiscível Líquido-Líquido Componente imaginária da impedância Z ou Z real Componente real da impedância R s C d, C dc ou d.c. R tc Z w ou W Z R Z f Z C Z t K 0 ε r Resistência da solução Capacidade da dupla camada eléctrica Resistência de transferência de carga Impedância de Warburg Impedância da resistência Impedância faradaica Impedância da capacidade Impedância total Velocidade específica da reacção Constante dieléctrica da região adsorvida ε 0 Constante dieléctrica relativa do vácuo (8.85x10-12 F.m -1 ) IR Queda óhmica TI Transferência iónica TE Transferência electrónica TFI Transferência facilitada de iões Δ α β φ Diferença de potencial eléctrica Galvânica entre duas fases (α e β) TPAsTPB Tetrafenilarsénio de tetrafenilborato μ i μ 0 i,α Potencial químico da molécula i Potencial químico padrão de i na fase α vii

9 α a i α c i F R z i TOABr C i θ β a p r pcz ACh + BuCh + φ E ΔE J i,m J i,c J i,d D i TBuATPB BTPPATPB Δφ (mín. cap.) Actividade de i na fase α Concentração de i na fase α Constante de Faraday (~96484 C.mol -1 ) ou Força (mn) Constante molar dos gases Carga do ião i Brometo de tetraoctilamónio Capacidade interfacial Cobertura superficial Coeficiente de adsorção Parâmetro de interacção Parâmetro correspondente ao número de colunas de solvente orgânico que pode ser substituído por uma molécula de espécie adsorvida Parâmetro correspondente ao número de agregação das moléculas de espécies adsorvidas na interface Potencial de carga zero Cloreto de acetilcolina ou AChCl Cloreto de Butirilcolina ou BuChCl Parâmetro de deposição ou potencial Galvânico (ou interno) entre duas fases Potencial da célula Diferença de potencial entre o potencial obtido a partir da fase aquosa e o da fase orgânica Fluxo de migração Fluxo de convecção Fluxo de difusão Coeficiente de difusão Tetrafenilborato de tetrabutilamónio Tetrafenilborato de bis-trifenilfosforanilideno Potencial correspondente ao mínimo de capacidade C lip Capacidade interfacial da camada saturada na presença do lípido (μf.cm -2 ) C GOx Capacidade interfacial da camada saturada na presença da enzima GOx (μf.cm -2 ) C aq Capacidade interfacial sem GOx (μf.cm -2 ) C aq Capacidade interfacial sem fosfolípido (μf.cm -2 ) ΔG 0 ads Energia de adsorção de Gibbs (KJ.mol -1 ) + I p - I p FT-IR RT I d Intensidade de corrente do pico positivo Intensidade de corrente do pico negativo Espectroscopia de Infravermalho Razão entre as variações/reduções da área da monocamada durante a deposição e a área do substracto sólido que foi utilizada Intensidade de corrente de difusão viii

10 Capítulo Introdução Neste capítulo, apresenta-se uma breve exposição dos fundamentos teóricos das técnicas utilizadas ao longo deste trabalho, bem como, alguns exemplos práticos onde estas técnicas são aplicáveis, e ainda os princípios teóricos dos sistemas em estudo. Este primeiro capítulo é constituído por seis secções, correspondendo cada uma delas a um tema em estudo. As duas primeiras secções são relativas à técnica de Langmuir-Blodgett (LB). As três secções seguintes dizem respeito às técnicas de voltametria cíclica, electroquímica em interfaces líquido-líquido e espectroscopia de impedância electroquímica (EIE). A última secção está relacionada com os vários aspectos biológicos dos estudos efectuados ao longo deste trabalho.

11 Capítulo 1 Introdução QUÍMICA ANALÍTICA Relatório de Seminário 1.1. Filmes de Langmuir-Blodgett O estudo das interfaces moleculares tem suscitado muito interesse nas últimas décadas devido aos rápidos avanços tanto na teoria como na parte experimental. Estes estudos abrangem a área da química-física, onde se estabelecem modelos relacionados com a reactividade e estrutura, modelos moleculares para a predição das propriedades moleculares, e o uso da espectroscopia e técnicas de superfície para elucidar os passos dos mecanismos de reacções. De entre as várias técnicas que têm vindo a ser utilizadas, destaca-se o uso de técnicas de Langmuir- Blodgett, utilizadas na modificação da estrutura das superfícies para reacções de transferência de carga e permitindo efectuar uma analogia com os processos das membranas celulares. Os filmes de LB têm uma variedade de aplicações em campos como, a electrónica, óptica, a biotecnologia e a electrónica molecular. Os filmes orgânicos com espessura de alguns nanómetros (uma monocamada), são a fonte de alguns dos componentes com aplicações práticas e comerciais, tais como, sensores, detectores, monitores e componentes de circuitos electrónicos [1,2]. A possibilidade de sintetizar moléculas orgânicas, quase sem limitações, com a estrutura e funcionalidade desejada em conjunto com uma tecnologia de deposição sofisticada de filmes finos, facilita a produção de componentes eléctricos, ópticos e biologicamente activos numa escala nanométrica. Um filme fino orgânico pode ser depositado num substrato sólido através de várias técnicas, tais como, evaporação térmica, electrodeposição, adsorção a partir da solução, técnica de Langmuir-Blodgett (LB), automontagem, etc. A técnica LB é uma das mais promissoras para preparar tais filmes finos, porque permite: (i) o controle preciso da espessura da monocamada, (ii) a deposição homogénea da monocamada sobre grandes áreas, (iii) a possibilidade para fazer estruturas de multicamadas com composição de camada variável, e (iv) a deposição de monocamadas em quase qualquer tipo de substrato sólido Pequena história dos filmes de Langmuir-Blodgett Quando se descreve a história dos filmes de Langmuir ou Langmuir-Blodgett, pode começar por citar-se Benjamim Franklin, que em 1774 descreveu à British Royal Society [1], a forma como uma pequena quantidade de azeite (~ uma colher de sopa) se tinha espalhado sobre a superfície de uma pequena lagoa, de cerca de meio acre (~ 2000 m 2 ). Franklin fez alguns cálculos quantitativos simples, chegando à conclusão que se uma colher de sopa (~ 2 ml) de azeite for espalhada em cima de uma área ~ 2000 m 2, a espessura do filme na superfície da água deve ser inferior a 1 nm. Cerca de cem anos depois, Rayleigh suspeitou que a extensão máxima de um filme de azeite em água representa uma camada, uma espessura molecular. Mais tarde, uma alemã chamada Agnes Pockles, estudou os equilíbrios superficiais que ocorrem na interface ar-água, usado-os para determinar a contaminação superficial (da água), para diferentes compostos orgânicos em função da área superficial. A publicação do trabalho de Pockels em 1891 na Nature, foi decisivo para o trabalho quantitativo de Langmuir em monocamadas de ácidos gordos, ésteres e álcoois [3]. 2

12 Capítulo 1 Introdução QUÍMICA ANALÍTICA Relatório de Seminário Irwing Langmuir foi o primeiro a executar estudos sistemáticos em monocamadas flutuantes em água no início do ano de 1910 até finais de Estes estudos conduziram-no ao prémio Nobel da Química em Já em 1920 observara a transferência de moléculas de ácidos gordos das superfícies de água para suportes sólidos, tais como, filamentos de tungsténio e platina. Porém, a primeira descrição detalhada da sequência da transferência de monocamadas, foi dada anos mais tarde por Katherine Blodgett [4]. A preparação de monocamadas montadas, foram então designadas de filmes de Langmuir-Blodgett (LB). O termo "filme de Langmuir" é normalmente atribuído a uma monocamada flutuante. Depois do trabalho pioneiro feito por Langmuir e Blodgett, levou quase meio século antes de outros cientistas do mundo começarem a perceber as oportunidades desta técnica única. A primeira conferência internacional de filmes LB foi realizada em 1979, e desde então, o uso desta técnica tem vindo a aumentar. Desde algum tempo a esta parte, a produção de filmes orgânicos ultra-finos com a técnica LB, começou lentamente a encontrar possíveis aplicações práticas em muitos campos, tais como, a electrónica e a electrónica molecular [5], a óptica [6] e a biotecnologia [7]. Como exemplos podem referir-se: na química, com o desenvolvimento de sensores [8], e na física, com a utilização de condutores de ondas ópticas [9], utilizados, por exemplo, nas comunicações e computadores Tensão superficial Para entendermos o que estamos a medir, e como medir as propriedades de monocamadas (filmes de Langmuir), é útil fazer uma pequena introdução à química das superfícies. As moléculas num líquido têm interacções com as outras moléculas presentes nesse líquido. O grau desta atracção, também chamada coesão, é dependente das propriedades da substância. As interacções de uma molécula no líquido são equilibradas por uma força igualmente atractiva em todas as direcções. As moléculas na superfície do líquido experimentam um desequilíbrio de forças, ou seja, uma molécula na interface ar-água tem uma maior atracção para a fase líquida, do que para o ar ou para a fase gasosa. Consequentemente, haverá uma força de ligação atractiva em relação ao líquido e a interface ar-água minimizará espontaneamente a sua área e o contacto. A tensão superficial é uma medida da energia de coesão presente numa interface (figura 1.1.) [10,11]. Figura 1.1.: Ilustração esquemática da interacção de moléculas numa interface. 3

13 Capítulo 1 Introdução QUÍMICA ANALÍTICA Relatório de Seminário As unidades mais utilizadas para a tensão superficial são dynes/cm ou mn/m, sendo estas unidades equivalentes. Os líquidos polares, como água, têm fortes interacções intermoleculares, e consequentemente, elevadas tensões superficiais. Qualquer factor que diminua a força desta interacção, diminuirá a tensão superficial: são exemplo disso, o aumento na temperatura do sistema, e qualquer contaminação, especialmente através de surfactantes. Assim, é importante haver um grande cuidado em relação à questão da contaminação, sendo a limpeza a palavra-chave em química das superfícies Técnica e filmes de Langmuir-Blodgett Monocamadas monomoleculares insolúveis na superfície de um líquido, são designadas de filmes ou monocamadas de Langmuir [1]. Estas são normalmente formadas à superfície da água por moléculas contendo uma cauda hidrofóbica e uma cabeça hidrofílica (por exemplo, os lípidos). A preparação de filmes de Langmuir pode ser feita de vários modos. Normalmente, a monocamada é formada espalhando as moléculas orgânicas na subfase de água. A solução espalhada é aplicada à superfície da subfase, permitindo que gotas pequenas caiam da seringa. Uma vez evaporado o solvente, o filme monomolecular da espécie anfipática permanece à superfície da subfase, pode ser comprimido e expandido. Quando as primeiras moléculas são espalhadas na água, elas estão muito dispersas, e assim, comportam-se como um gás bidimensional. Isto significa que a área disponível na água para cada molécula é bastante grande e a pressão superficial é baixa. A pressão superficial é normalmente medida usando um prato de Wilhelmy e uma balança de precisão. A pressão superficial pode ser aumentada por meio de uma ou duas barreiras móveis (figura 1.2.). A um certo ponto a pressão superficial começa a subir, mais rapidamente, indicando uma transição para a fase líquida. Quando a barreira é movida até para além da fase sólida, pode-se notar uma subida mais íngreme na pressão superficial. Figura 1.2.: Compressão lateral de um composto com cabeça hidrofílica e cauda hidrofóbica, formando uma monocamada numa superfície de água [1]. Uma vez depositada a primeira camada, poderão ser depositadas camadas adicionais em cada passagem subsequente do substrato pela interface ar-água. As multicamadas podem ser depositadas para produzir um filme, cuja espessura é o produto do comprimento da cadeia molecular individual e o número de vezes que o substrato atravessou a interface ar-água. 4

14 Capítulo 1 Introdução QUÍMICA ANALÍTICA Relatório de Seminário Surfactantes e filmes de Langmuir Os agentes superficiais activos (surfactantes ou tensiactivos), são uma classe de moléculas com grande importância tecnológica e uma enorme importância biológica. Geralmente, estas moléculas consistem numa parte hidrofílica (solúvel em água) e uma parte hidrofóbica (insolúvel em água). Esta natureza anfipática de surfactantes é responsável pelo comportamento de associação em solução (micelas, bicamadas, vesículas, etc.) e a sua acumulação nas interfaces (ar-água ou água-solução orgânica). A parte hidrofóbica normalmente consiste numa cadeia de hidrocarbonetos ou fluorocarbonetos, enquanto que a parte hidrofílica consiste num grupo polar (-OH, -COOH, - NH + 3, -PO - 4, -(CH 2 ) 2 NH + 3, etc.) figura 1.3. Figura 1.3.: Ilustração esquemática que mostra os componentes de um composto anfipático (à esquerda), e a sua orientação adoptada numa interface (à direita) [12]. O comportamento da associação de surfactantes em solução e a sua afinidade para as interfaces é determinado pelas propriedades físico-químicas dos grupos hidrofóbicos e hidrofílicos, respectivamente. O tamanho e a forma da cadeia de hidrocarbonetos, e o tamanho, a carga e a hidratação do grupo hidrofílico, é de extrema importância nesta relação. Os grupos hidrofílicos consistem em grupos, tais como, os ácidos carboxílicos, sulfatos, aminas e álcoois. Estes são atraídos pelas partes polares, tais como, as da água, e as forças que nelas actuam são predominantemente atractivas (1/r²). Os grupos hidrofóbicos (ou oleofílicos), tais como, as cadeia de hidrocarbonetos, gorduras e lipídios são muito menos solúveis em água e as forças que nelas actuam são predominantemente do tipo de Van der Waals (1/r 12 e 1/r 6 ). As moléculas anfipáticas ligam-se à interface, porque elas possuem dois tipos muito diferentes de ligação dentro da sua estrutura molecular. Dependendo do equilíbrio entre estas propriedades, foram observados uma larga variedade de estruturas auto-montadas nas interfaces e em solução. A força motriz que está por detrás da associação, é a diminuição da energia livre do sistema. Por conseguinte, quando um surfactante entra em contacto com a água, acumula-se na interface ar-água, causando uma diminuição na tensão superfícial da água. Quando os surfactantes, dissolvidos num solvente volátil não-aquoso (clorofórmio ou hexano, que são normalmente os solventes mais usados), são introduzidos sobre uma superfície líquida polar, o solvente evaporará deixando os surfactantes orientados na interface gás-líquido. Os grupos de cabeça hidrofílica puxam a molécula para a subfase e os grupos de cauda hidrofóbica direccionam-se para o ar. Uma monocamada de superfície só será alcançada se o equilíbrio anfipático da molécula for correcto; ou seja, o equilíbrio entre as partes hidrofóbicas e 5

15 Capítulo 1 Introdução QUÍMICA ANALÍTICA Relatório de Seminário hidrofílicas. Se o grupo de cauda hidrofóbica é muito pequeno (não suficientemente hidrofóbico), a molécula será arrastada para a água e dissolver-se-á, enquanto que, se não houver nenhuma parte hidrofílica, as moléculas podem formar filmes de multicamadas mais espessas na superfície, ou até mesmo evaporar Monocamadas insolúveis e balança de Langmuir A natureza anfipática dos surfactantes dita a orientação das moléculas na interface (ar-água ou águasolução orgânica), de tal modo que, o grupo de cabeça polar é imergido na água e a longa cadeia de hidrocarbonetos aponta na direcção do ar (figura 1.4.). Ar Água Figura 1.4.: Ilustração esquemática que mostra uma deposição de monocamada na interface ar-água [1]. A cadeia carbonatada da substância usada para estudos de monocamada tem que ser suficientemente longa para ser capaz de formar uma monocamada insolúvel [13]. Como regra, deverão existir mais do que 12 hidrocarbonetos ou outros grupos na cadeia ((CH 2 ) n, n> 12) [14]. Se a cadeia é pequena, embora ainda insolúvel em água, o composto anfipático na superfície da água, tende a formar micelas [1]. Estas micelas são solúveis em água, o que impede a formação de uma monocamada na interface. Por outro lado, se o comprimento da cadeia é muito longo, o composto anfipático tende a cristalizar na superfície da água e, por conseguinte, não forma uma monocamada. É difícil determinar o comprimento óptimo para a cadeia de hidrocarbonetos, porque a sua capacidade de formação do filme também depende da parte polar do composto anfipático. Além disso, o composto anfipático tem que ser solúvel em algum solvente orgânico, muito volátil e insolúvel em água. As monocamadas insolúveis representam meias bicamadas, e consequentemente, são normalmente investigadas como um sistema modelo para entender melhor a estrutura e funcionalidade dos lípidos das biomembranas. Elas são observadas frequentemente com ajuda de uma balança de filme, também chamada balança de Langmuir. A figura 1.5. mostra esquematicamente uma balança de filme de Langmuir. A tina que contém a subfase normalmente é feita de Teflon para impedir qualquer transbordo da subfase sobre as extremidades. A tina é termostatizada por água circulante em canais colocados debaixo da tina. A área superficial da tina pode ser variada efectuando o varrimento com as barreiras móveis sobre a superfície da tina. A barreira é feita de Delrin, um material hidrofílico e suficientemente pesado para impedir qualquer transbordo da monocamada para fora da tina. 6

16 Capítulo 1 Introdução QUÍMICA ANALÍTICA Relatório de Seminário Barreira Balança com prato de Wilhelmy Barreira Monocamada espalhada sobre a subfase Tina com a subfase Figura 1.5.: Ilustração esquemática de uma balança de filme de Langmuir, com um prato de Wilhelmy, para medir a pressão superficial, e as barreiras para reduzir a área superficial da subfase disponível na tina. A balança de Langmuir permite manipular a área molecular por compressão ou expansão do filme, enquanto se mede a pressão do filme. Quando se comprime o filme, ou seja, diminuindo-se a área por molécula, geralmente a pressão aumenta, enquanto que a tensão superficial diminuí. Isto acontece porque a interface ar-água (com tensão superficial elevada), é convertida numa monocamada superficial hidrofóbica (baixa tensão superficial). A barreira pode mover-se sobre a superfície do líquido que tem uma tensão superficial elevada, originando uma redução da energia e da entalpia livre do sistema. A pressão do filme é definida como a diferença entre as tensões superficiais do solvente puro, γ 0, e a tensão superficial da solução, γ: Π = γ 0 - γ (1.1.) A pressão superficial e a área molecular são continuamente monitorizadas durante a compressão. A pressão superficial é medida pelo método do prato de Wilhelmy [15]. Este método permite medir a força que actua no menisco da água no perímetro do prato e é proporcional à tensão superficial da subfase, incluindo a monocamada. Neste método é feita a determinação da força exercida, devido à tensão superficial num prato suspenso, de forma a que este seja parcialmente imergido na subfase (figura 1.6.). Esta força é convertida então em tensão superficial com a ajuda das dimensões do prato. A) B) Figura 1.6.: Um prato de Wilhelmy parcialmente imergido numa superfície de água: A) visão frontal; B) visão lateral. [1] 7

17 Capítulo 1 Introdução QUÍMICA ANALÍTICA Relatório de Seminário Os efeitos da inclinação do prato de Wilhelmy e a validação das medidas efectuadas foram discutidas por Jordan e Lane [16]. O prato é frequentemente muito fino e feito de platina, também podem ser usados pratos feitos de vidro, quartzo, mica, etc. As forças que actuam no prato são a gravidade, a tensão superficial descendente, e a flutuabilidade (devido ao movimento ascendente da água). Para um prato rectangular de dimensões l p, w p e t p (respectivamente, comprimento, largura e espessura), de densidade, ρ p, imergido a uma profundidade h l, num líquido de densidade ρ l, a tensão superfícial é dada por: γ prato = Força / 2.(largura + espessura) (1.2.) onde, a tensão superficial vem em mn/m, a força em mn e o perímetro em metros. Geralmente por essa razão, a tensão superfícial é determinada por: γ = Força / perímetro (1.3.) A pressão superficial é então determinada medindo as alterações em F (força) por um prato estacionário entre uma superfície limpa e a mesma superfície com a monocamada presente. Se o prato está completamente humedecido pelo líquido (isto é, cos θ = 1, ver figura 1.6. B) a pressão superficial é obtida então a partir da seguinte equação [17]: Π = -Δγ = -[ΔF / 2(t p +w p )] = - ΔF / 2w p, se w p >> t p (1.4.) A sensibilidade pode, consequentemente, ser aumentada usando um prato mais fino. A força, é deste modo, determinada por medição das alterações na massa do prato que está associado a uma electrobalança sensível. A monocamada também pode ser mantida a uma pressão superficial constante, através de um sistema de controlo de realimentação por computador entre a electrobalança e o motor responsável pelos movimentos da barreira de compressão. Isto é útil quando se produzem filmes LB, ou seja, quando a monocamada é depositada num substrato sólido Forças que actuam na superfície da subfase As forças que afectam os grupos de cabeça polar, imergidos na subfase, são electrostáticas e proporcionais a 1/r 2 (em que r é a separação intermolecular), enquanto que as forças entre as cadeias de hidrocarbonetos são devido às interacções de Van der Waals, e proporcionais a 1/r 6 e 1/r 12. Consequentemente, as interacções na subfase são de mais longo alcance, do que as da superfase [1]. A isotérmica pode, normalmente, ser dividida em três regiões distintas, correspondendo cada uma delas um estado físico de transição de fase (figura 1.7.): 8

18 Capítulo 1 Introdução QUÍMICA ANALÍTICA Relatório de Seminário Pressão Superficial (mn/m) Sólido Líquido Gasoso Área Molecular (Å 2 ) Figura 1.7.: Exemplo da isotérmica de um ácido esteárico em água pura e os seus respectivos estados físicos de transição de fase [5]. Depois da deposição inicial sobre a subfase, nenhuma pressão externa é aplicada à monocamada e as moléculas comportam-se como um gás bidimensional, pelo que pode ser descrito por: ΠA = KT (1.5.) onde Π, é a pressão superficial, A, a área molecular, K, a constante de Boltzmann, e T, é a temperatura termodinâmica. Na compressão da monocamada, alguns filmes são reorganizados, e comportam-se, de maneira semelhante ao esperado para um líquido bidimensional. À medida que se comprime, o aumento na pressão causa ordenação adicional, e a monocamada comportase como um estado quasi-sólido. Este estado sólido é caracterizado por uma relação, normalmente, linear entre a pressão superficial e área molecular. Eventualmente a pressão de colapso, Π c, é alcançada quando o filme perde irreparavelmente a sua forma monomolecular. O colapso ocorre quando a compressibilidade da monocamada é superior ao máximo de compressão que a monocamada pode sofrer. Neste tipo de colapso as moléculas da monocamada sobrepõem-se umas às outras, formando-se multicamadas desordenadas (figura 1.8.). 1) 2) 3) 4) Figura 1.8.: Colapso de uma monocamada à medida que é efectuada a compressão. 9

19 Capítulo 1 Introdução QUÍMICA ANALÍTICA Relatório de Seminário As forças aqui exercidas tornam-se muito fortes para o confinamento em duas dimensões, e as moléculas são lançadas para fora do plano da monocamada, ou para a subfase (moléculas mais hidrofílicas), ou para a superfase (moléculas mais hidrofóbicas). Porém, o colapso da monocamada não é uniforme mas é, normalmente, iniciado perto da extremidade da barreira principal ou nas discontinuidades da tina (tais como, os cantos ou o prato de Wilhelmy). Normalmente um filme colapsado, consistirá numa grande área de monocamada não colapsada, entrecalada com as monocamadas que foram esmagadas, para formar agregados volumosos. A pressão de colapso pode ser definida como, o valor máximo para o qual uma monocamada pode ser comprimida sem a expulsão detectável de moléculas do filme. Este valor de pressão depende dos detalhes do procedimento experimental usado, ou seja, das substâncias químicas usadas, da temperatura, da velocidade à qual o filme é comprimido e dos procedimentos para os quais o filme foi sujeito. O valor da pressão de colapso para um ácido gordo simples saturado, pode ser de 50 mn/m, que é equivalente a aproximadamente 200 atmosferas, se se fizer uma extrapolação para três dimensões [18]. Quando a monocamada está na fase bidimensional sólida ou líquida condensada, as moléculas estão relativamente bem orientadas e bastante próximas umas das outras, e a área de pressão molecular zero (A 0 ), pode ser obtida extrapolando o declive da fase sólida para a pressão zero o ponto no qual esta linha cruza o eixo das abcissas, correspondente à área hipotética ocupada por uma molécula na fase condensada a pressão zero. Para um ácido gordo completamente saturado, tal como, o ácido esteárico, a área molecular, determinada por este método, é de Å 2 [1]. Tal área, corresponde à área de cruzamento seccional de uma cadeia de hidrocarboneto, sugerindo que a compressão da monocamada consiste em cadeias acumuladas fechadas, orientadas verticalmente. Este estudo permite obter informação sobre o modo como as moléculas se acumulam na interface e a estabilidade da camada comprimida a pressões elevadas. O filme que está a ser comprimido pode ser fortalecido (nunca indo acima de Π c ), depois de se expandir várias vezes. Tal procedimento, permite uma acumulação mais eficiente, e normalmente, é observada um desvio para áreas moleculares mais baixas. Por exemplo, os estudos efectuados com fosfolípidos por Pethica, Mingis e Taylor e os seus colaboradores [19,20,21], sugerem que os filmes de Langmuir podem existir num número diferente de fases líquidas cristalinas na superfície da água, dependendo da temperatura e da pressão do filme Isotérmicas: pressão superficial vs. área A representação gráfica da pressão superficial em função da área molecular (figura 1.9.), é normalmente efectuada a temperatura constante, e é designado por isotérmica. Normalmente uma isotérmica é registada comprimindo o filme (reduzindo a área com as barreiras) a uma velocidade constante enquanto se monitoriza continuamente a pressão superficial. A forma da isotérmica é característica das moléculas que compõem o filme. Uma vez formado o filme, podem efectuar-se deposições em substratos sólidos. Uma ou mais monocamadas podem ser transferidas para um substrato imergido na monocamada. A monocamada é mantida uniforme controlando a pressão superficial com as barreiras ao longo do processo. Dependendo do material em estudo, compressões e expansões repetidas podem ser necessárias para alcançar uma reprodutividade. 10

20 Capítulo 1 Introdução QUÍMICA ANALÍTICA Relatório de Seminário Na figura 1.9. A, está representado o esquema de uma isotérmica Π (pressão superficial) A (área), típica de um ácido gordo (ácido esteárico) com uma única cadeia de hidrocarbonetos (à esquerda) e de um fosfolípido com duas cadeias de hidrocarbonetos (à direita). Na figura 1.9. C, está ilustrado a orientação das moléculas nas diferentes fases em que as monocamadas se podem encontrar. Π Colapso Sólido Líquido condensado Líquido expandido Π C Gasoso A) (Å 2 ) B) A C) Gasoso Líquido Sólido Figura 1.9.: A) Esquema de uma isotérmica típica de um ácido gordo (ácido esteárico) e de um fosfolípido (DPPC) [22]. B) Representação de uma isotérmica pressão superficial-área (Π-A), e as diferentes fases dos filmes monomoleculares. Estados físicos em que a monocamada se pode encontrar: G, gasoso; L1, líquido-expandido; L1- L2 líquido condensado-líquido expandido; L2, líquido-condensado; e S, sólido. C) Orientação das moléculas em diferentes fases [1]. A observação da isotérmica mostra várias regiões distintas. Estas regiões são chamadas de fases. Como se pode ver na figura 1.9. A e B, quando a monocamada está comprimida, esta pode atravessar várias fases diferentes, que são identificadas como discontinuidades na isotérmica. O comportamento da fase de monocamada é principalmente determinado pelas propriedades físico-químicas do composto anfipático, a temperatura da subfase e a composição da subfase. Por exemplo, existem vários estados de monocamadas, dependendo do comprimento da cadeia de hidrocarbonetos e da magnitude de outras forças coesivas e repulsivas que existam entre a cabeça dos grupos hidrofílicos. Um aumento no comprimento da cadeia, aumenta a atracção entre as moléculas, condensando a isotérmica Π-A. Por outro lado, se é usado um composto anfipático ionizável, a ionização das cabeças dos grupos hidrofílicos da cadeia, induzem as forças repulsivas que tendem a opor-se às transições de fase. Uma terminologia simples, usada para classificar as fases de monocamadas de diferentes ácidos gordos, foi proposto por Harkins em 1952 [18]. Na parte mais extensa, as monocamadas existem no estado gasoso (G) estado onde a compressibilidade é mínima. Na compressão este estado pode sofrer uma transição de fase para o estado líquido-expandido (L1). À medida que compressão decorre, a fase L1 sofre uma transição para o estado líquido- 11

21 Capítulo 1 Introdução QUÍMICA ANALÍTICA Relatório de Seminário condensado (L2), e a densidades mais elevadas, a monocamada finalmente alcança o estado sólido (S). Se a monocamada é comprimida, após se ter alcançado o estado S, ela colapsará em estruturas tridimensionais. O colapso, é geralmente visto, como uma diminuição rápida na pressão superficial ou como uma quebra horizontal na isotérmica, se a monocamada está num estado líquido. Neste caso, observa-se uma rápida e brusca diminuição da pressão superficial à medida que ocorre a compressão. Existem ainda outros pontos críticos numa isotérmica Π-A, tal como, a área molecular, na qual é observado um aumento inicial acentuado na pressão superficial, Ai (pressão superficial à qual a transição de fase ocorre entre o estado L1 e L2 e os estados L2 e S). Seguindo as definições acima descritas, pode ver-se que o ácido gordo da figura 1.9. A, tem três regiões distintas: gás (G), líquido (L1) e sólido (S), enquanto que o fosfolípido tem uma fase de transição adicional quase horizontal (L2-L1) entre as duas fases líquidas. Este é um caso muito comum para os fosfolípidos, e a posição desta transição de fase horizontal é dependente da temperatura. À medida que a temperatura aumenta, o valor da pressão superficial à qual a transição de fase horizontal ocorre, aumentará e vice-versa [19] (figura 1.10.). Desta forma, a passagem da fase de transição L1 para L2 é fortemente afectada pela temperatura. Π Temperatura A Figura 1.10.: Alterações na forma da isotérmica (Π-A) com o aumento da temperatura [1]. Para além da temperatura, o comportamento da fase da monocamada é também afectado pelo número de átomos de carbono e pelo grau de saturação das cadeias de hidrocarbonetos do grupo apolar de um composto anfipático. Cadeias mais pequenas (contendo átomos de carbono) existem apenas no estado L1, enquanto que cadeias mais longas (contendo átomos de carbono), existem apenas no estado L2. É ainda de salientar que, os fosfolípidos com cadeias insaturadas existem muitas vezes apenas no estado L1, devido ao aumento da fluidez provocada pela insaturação Fases dos filmes monomoleculares Filmes monomoleculares mostram fases ordenadas semelhantes a sistemas tridimensionais, com uma diferença específica que surge da sua estrutura molecular típica: eles podem formar uma malha bidimensional pseudo-cristalina (posição ordenada), que é geralmente de alcance limitado, e uma orientação definida das 12

22 B Capítulo 1 Introdução QUÍMICA ANALÍTICA Relatório de Seminário moléculas para moléculas vizinhas (ordem orientacional), que é frequentemente de longo alcance. Estas escalas de diferentes ordens conduzem a uma variedade de fases. Estas fases são denominadas mesofases, tal como, para os cristais líquidos, porque elas mostram os mesmos princípios de ordenamento. As fases de uma monocamada nas isotérmicas, pressão-área (figura 1.9. B), parecem ser bastante diferentes de substâncias para substâncias. Os ácidos gordos, fosfolípidos, etc., em água, mostram frequentemente, as seguintes fases [13,23]: Gasosa (G) A equação que define este estado é dada por: ΠA = k B T. Esta pressão do filme, é porém, normalmente tão pequena que é quase imperceptível. A área média por molécula na superfície é muito maior que a da molécula. A área total pode ser expandida indefinidamente sem ter havido uma transição de fase. Há uma transição de fase de primeira ordem para o estado líquido, que ocorre quando as monocamadas existentes no estado gasoso sofrem uma compressão. Filmes líquidos (L) Nesta fase há uma interacção lateral significativa entre as moléculas. Existem pelo menos dois tipos de fases líquidas: Líquido expandido (LE ou L1): neste fase as moléculas tocam umas nas outras, mas não há nenhuma ordem lateral. Elas são altamente hidratadas, e a equação de estado é frequentemente do tipo de Van der Waals. Para hidrocarbonetos de cadeia longa com uma cabeça polar (por exemplo, ácidos gordos), esta área é aproximadamente Å 2 [1]. Líquido condensado (LC ou L2): Depois de passar um patamar em Π c, que indica uma transição de fase de primeira ordem, ocorre uma fase de condensação de um líquido. Aqui, os lípidos exibem uma orientação inclinada com um ângulo decrescente (medido perpendicularmente à subfase). O filme ainda é relativamente rígido, com moléculas de água ainda presentes entre os grupos de cabeça polar. Os gráficos das isotérmicas Π-A são tipicamente lineares. Filmes sólidos (S) Quando a área superficial é reduzida até ao ponto imediatamente antes de se atingir o colapso, a presença de moléculas de água entre os grupos de cabeça polar é mínima. A partir deste ponto (normalmente, para Π entre mn/m) os gráficos da isotérmica pressão superficial-área são lineares. A extrapolação para a pressão zero do filme, resulta numa superfície que corresponde à área molecular resultante do cruzamento com o eixo das abcissas (por exemplo, aproximadamente 20.5 Å 2 para ácidos gordos com longas cadeias [19]). Neste estado, os filmes sólidos têm uma elevada compressibilidade. 13

23 Capítulo 1 Introdução QUÍMICA ANALÍTICA Relatório de Seminário 1.2. Aplicações de Filmes de Langmuir Uma vez definidos os fundamentos teóricos da técnica de LB, importa também salientar algumas das suas aplicações prácticas. A técnica de LB, por definição, exige que as moléculas anfipáticas sejam adsorvidas na interface de duas fases (líquido-líquido ou gás-líquido). Para as moléculas adsorverem na interface, o equilíbrio anfipático, ou seja, o equilíbrio entre os componentes hidrofílicos e hidrofóbicos dentro da mesma molécula, deve ser o adequado para as duas fases em estudo. Por exemplo, o equilíbrio anfipático de uma molécula, pode ser adequado para uma interface ar-água, mas não para uma interface hexano-água. Consequentemente, a correcta escolha dos materiais, é um factor a ter em conta Materiais adequados para a técnica de LB Muitos investigadores têm produzido filmes de multicamadas usando a técnica de LB com moléculas que têm apenas um pequeno componente hidrofílico e que flutuam literalmente na superfície da água. Rigorosamente falando, estes não são filmes de LB. Em geral, os materiais como os ácidos gordos e os álcoois de cadeia longa são usados na preparação de filmes. A parte do hidrocarboneto, -CH 2 - da molécula, é responsável pela repulsão do material em relação à água, enquanto que o grupo polar, -COOH ou OH, tem afinidade suficiente para a água, ancorando a molécula na subfase aquosa. Numa interface ar-água, tais moléculas anfipáticas, orientam-se com a sua cadeia de hidrocarboneto dirigida para o ar, e os grupos de cabeça hidrofílica dirigida para a fase aquosa: Alguns dos materiais mais estudados na formação de monocamadas flutuantes são os ácidos carboxílicos e os seus sais, e os álcoois de cadeias longas. O comprimento da cadeia do hidrocarboneto é crítica e o seu efeito na tensão superficial da subfase é determinada pela regra de Traube, que diz que, para uma determinada série homóloga de compostos anfipáticos, a concentração requerida por um igual abaixamento da tensão superfícial em soluções diluídas, diminui por um factor de cerca de três por cada grupo adicional CH Subfase aquosa A subfase mais usada para o estudo de filmes monomoleculares é água ultra-pura. Normalmente, as medições são efectuadas de forma a excluir qualquer contaminante da subfase, uma vez que, a introdução de iões em água pura pode afectar drasticamente as propriedades da monocamada. A preparação das soluções deve ser feita cuidadosamente, devendo ser usados reagentes de elevada qualidade e água ultra-pura. Além disso, na subfase aquosa existem um número de variáveis, não necessariamente independentes umas das outras. Uma mudança no equilíbrio iónico vai afectar o equilíbrio dentro da subfase. A 14

24 Capítulo 1 Introdução QUÍMICA ANALÍTICA Relatório de Seminário alteração da acidez e a adição de iões divalentes à subfase, permite um grau de controlo considerável sobre o comportamento da monocamada e o sucesso da deposição de multicamadas Processo de deposição de filmes LB sobre um substrato (hidrofóbico ou hidrofílico) Dois tipos de superfícies podem formar camadas pela técnica de LB: hidrofóbica (repulsão da água) e hidrofílica (atracção para a água). A deposição sobre uma superfície hidrofóbica assume sempre lugar na parte inferior, enquanto que, para uma superfície hidrofílica, deposita-se sempre pela parte superior. A superfície de um substrato coberta com um filme LB muda de hidrofóbica para hidrofílica com o aumento do número de camadas. Consequentemente, quando uma superfície hidrofóbica é imergida e coberta com uma monocamada, será completamente hidrofílica enquanto é imergida. Desta forma, quando é retirada da subfase e uma segunda camada é depositada, a superfície será novamente hidrofóbica (figura 1.11.). Quando o substrato sólido é hidrofílico (por exemplo, vidro), a primeira camada é depositada elevando o substrato sólido a partir da subfase através da monocamada, enquanto que, se o substrato sólido é hidrofóbico (por exemplo, slide de ouro), a primeira camada é depositada fazendo baixar o substrato na subfase através da monocamada [24]. Sentido da sequência do processo de deposição A) B) C) Figura 1.11.: Esquema da deposição de filmes de Langmuir sobre um substrato hidrofóbico. A superfície imergida do substrato torna-se hidrofílica depois da deposição da primeira camada A), e fica novamente hidrofóbica, depois da deposição da segunda camada B) e C). Para se determinar que tipo de superfície temos, basta imergir o substrato na subfase. Se o menisco curvar em baixo, a superfície é hidrofóbica (figura A); se curva em cima, então a superfície é hidrofílica (figura B). 15

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