MODELAGEM COMPARATIVA E ANÁLISE ESTRUTURAL DE UMA AQUAPORINA DE FEIJÃO-CAUPI [Vigna unguiculata (L.) WALP.]

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1 Área: Genética e Melhoramento MODELAGEM COMPARATIVA E ANÁLISE ESTRUTURAL DE UMA AQUAPORINA DE FEIJÃO-CAUPI [Vigna unguiculata (L.) WALP.] João Pacifico Bezerra Neto 1 ; Valesca Pandolfi 2 ; Ederson Akio Kido 3, Semíramis Jamil Hadad do Monte 4, Ana Maria Benko Iseppon 5 1 Biólogo, Doutorando, Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE. pacifico.joao@gmail.com 2 Bióloga, Pós-Doc CAPES/FACEPE, Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE. 3 Agrônomo, Professor, Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE. 4 Doutora, professora, Universidade Federal do Piauí, Laboratório de Imunogenética e Biologia Molecular, Teresina PI. 5 Bióloga, Professora Titular, Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE. Resumo As aquaporinas são proteínas formadoras de canais de membrana envolvidas na absorção e movimento da água e de pequenos solutos para o interior e exterior das células, com papel importante na resposta das plantas à seca e à salinidade. Para um melhor entendimento das relações hídricas e sua associação ao transporte de pequenas moléculas polares faz-se necessário não somente identificar todo o conjunto de aquaporinas, mas também entender sua estrutura tridimensional. Neste sentido, a utilização da sequência de aminoácidos predita para uma aquaporina da subfamília PIP foi submetida a uma modelagem comparativa para a determinação de suas estruturas terciárias, representando a primeira modelagem para membros desta família em feijão-caupi. As estruturas tridimensionais foram construídas a partir do modelo 1Z98 de espinafre (Spinacia oleracea), através do programa MODELLER, o qual apresentou 74,9 % de similaridade com o modelo de feijãocaupi. A confiabilidade dos modelos foi avaliada via Procheck, QMEAN e ProSAT. Todos os valores encontram-se dentro dos padrões de confiabilidade, com pelo menos 83% dos resíduos de aminoácidos localizados em regiões energeticamente mais favoráveis. De modo geral, o modelo gerado apresenta boa qualidade estereoquímica, podendo ser utilizado em inferências biotecnológicas, assim como sobre as características biofísicas dos solutos associados. Palavras-chave: Bioinformática, água, modelagem comparativa. Introdução O feijão-caupi (Vigna unguiculata) é uma das leguminosas mais antigas utilizadas pelo homem, apresentando importância vital na Ásia, África e América (Muchero et al., 2009). Com mais de 8,5 milhões de hectares cultivados e produção anual superior a três milhões de toneladas, é considerada uma importante fonte de proteínas, carboidratos, cálcio, ferro e vitaminas para a alimentação humana (Phillips et al., 2003). Dentre os estresses ambientais que afetam drasticamente a produtividade do feijão-caupi, o déficit hídrico destaca-se como um dos mais importantes, principalmente por afetar todos os aspectos relacionados ao desenvolvimento vegetal, incluindo mudanças bioquímicas e fisiológicas (Mahajan & Tuteja, 2005), sendo a tolerância da maior importância face ao seu cultivo em áreas sujeitas a fortes influências sazonais, como o Nordeste brasileiro. Para facilitar o transporte de água e outras pequenas moléculas polares através das membranas hidrofóbicas, os organismos vivos dispõem de uma variedade de canais proteicos integrantes de membranas. As aquaporinas ou Major Intrinsic Proteins (MIPs Proteínas Intrínsecas de Membrana) formam uma grande e evolutivamente conservada superfamília de canais de membrana, encontradas em todos os tipos de organismos, incluindo eubactéria, arquebactérias, fungos, animais e plantas (Agre & Kozono, 2003). Até o momento, foram 1

2 identificados mais de 35 membros da superfamília MIP em Arabidopsis thaliana (Johanson et al., 2001), 23 na briófita Physcomitrella patens (Danielson & Johanson, 2008) e 71 em algodão (Park et al., 2010). Esta superfamília é dividida em cinco subfamílias evolucionariamente distintas: (i). PIP, proteínas de membrana plasmática (Plasma Membrane Intrinsic Proteins); (ii). TIP, Proteínas de membrana de tonoplasto (Tonoplast Intrinsic Proteins); (iii). NIP, Proteínas de membrana de nódulos (Nodulin26-like Intrinsic Proteins); (iv). SIP, Pequenas proteínas básicas intrínsecas de membranas (Small Basic Intrinsic Proteins) e (v). a recentemente descoberta XIP, uma proteína intrínseca de localização subcelular ainda não caracterizada (Bienert et al., 2011). Estas proteínas apresentam funções chave na condutância de água através das membranas em uma variedade de processos fisiológicos, como a captação de água do solo, transporte célula-célula e raiz-caule, homeostase celular e controle do gradiente osmótico (Heinen et al., 2009). Estudos recentes também relatam membros de aquaporinas com funções importantes em outros processos, como a captação e translocação de nutrientes, remobilização de nitrogênio e transdução de sinais (Soto et al., 2010). Tais propriedades demonstram a importância que os estudos das aquaporinas vegetais apresentam no entendimento de mecanismos de tolerância à seca pelas plantas. Assim, a determinação da estrutura tridimensional dessas proteínas fornece um panorama claro da arquitetura destes canais de água. Homólogos de aquaporinas nos vegetais têm sido utilizados em modelagens comparativas, visando à identificação de sua condutância por água e outros solutos específicos. Entretanto, a estrutura tridimensional de aquaporinas de feijão-caupi continua desconhecida. Desta forma o presente trabalho visou à modelagem comparativa de um membro desta família transportadora, a fim de elucidar sua estrutura e sua aplicabilidade para demais membros desta família de proteínas. Material e Métodos Uma sequência de aquaporina identificada previamente no banco de dados do transcriptoma do feijãocaupi (rede NordEST; < pertencente à subfamília PIP, com 213 aminoácidos de comprimento. A citada molécula foi submetida a uma modelagem comparativa, visando à determinação de sua estrutura terciária, representando a primeira modelagem para os membros desta família de transportadores nesta espécie. Como modelo (template) para a modelagem tridimensional foi utilizada a aquaporina SoPIP2-1 [1z98] de espinafre (Spinacia oleracea), com 2.10 de resolução, disponível no Banco de Dados de Proteínas PDB (Protein Data Bank) (Törnroth-Horsefield et al., 2006), sendo a única aquaporina vegetal disponível no banco, além de apresentar a maior similaridade com a aquaporina identificada em feijãocaupi. A modelagem foi executada através do programa MODELLER 9v9 (Eswar et al., 2008), usando-se a rotina model, que utiliza para o cálculo as coordenadas atômicas do modelo, o alinhamento gerado entre o modelo e as sequências submetidas à comparação, em conjunto com as coordenadas atômicas do molde. As estruturas geradas foram visualizadas e os diversos modos de visualização gerados no programa NOC As avaliações de qualidade foram determinadas pela ferramenta online Protein Structure & Model Assessment da plataforma SWISS-MODEL Workspace ( onde foram obtidos os dados para as avaliações via Procheck (Laskowski et al., 1993), que determinaram a qualidade estereoquímica do modelo através da análise do gráfico de Ramachandran e QMEAN (Benkert et al., 2009), que compara o modelo com estruturas depositadas que apresentam o mesmo tamanho. Informações acerca da qualidade do modelo também foram determinadas via ProSA ( uma ferramenta online 2

3 que compara os padrões de energia e estrutura do modelo com outras proteínas depositadas no banco de dados do PDB (Wiedrstein & Sippl,, 2007). Resultados e Discussão A modelagem comparativa foi baseada na utilização de um modelo conhecido (com estrutura determinada experimentalmente), alinhando-se este com a sequência cuja estrutura terciária foi determinada, pelo dobramento de suas estruturas secundárias e domínios. Dada a similaridade ao nível secundário, semelhanças estruturais podem ser consideradas tão eficientes quanto os métodos experimentais (Difração de Raios-X e Ressonância Magnética Nuclear). A similaridade entre a aquaporina de feijão-caupi e o modelo foi de 74,9% em termos da sequência de aminoácidos - valores de identidade inferiores a 30% acarretam problemas no alinhamento do modelo com a sequência alvo, resultando em erros significantes na modelagem (Khaled et al., 2011). O modelo gerado (Figura 1) apresentara todas as características principais: seis domínios transmembrana (H1-H6) H6) conectados por cinco loops (LA-LE), LE), juntamente com os dois domínios alfa-hélice portadores dos motivos conservados NPA, que interagem internamente, formando o poro seletivo (Gomes et al., 2009). Como estabelecido para as aquaporinas, os modelos apresentam extremidades carboxi- e aminoterminais, juntamente com loops A, C e E voltados para a região citoplasmática, além de exibirem a conformação hourglass, evidenciando a simetria dos segmentos transmembrana e alfa-hélices portadoras dos motivos NPA, apontando para o fato das estruturas tridimensionais de famílias proteicas serem mais conservadas entre si que a estrutura secundária propriamente dita. A estrutura modelada apresentou peso molecular de 22,52 kda e pontos isoelétrico de Figura 1: Modelo tridimensional de uma aquaporina da subfamília PIP de feijão-caupi, obtida via modelagem comparativa, a partir do modelo SoPIP2-1 disponível no PDB. À esquerda vista lateral indicando os motivos NPA, responsáveis pela formação do poro; à direita vista superior expondo os resíduos da constrição secundária. Os modelos analisados via Procheck (Laskowski et al., 1993), QMEAN (Benkert et al., 2009) e ProSA (Wiedrstein & Sippl,, 2007) apresentaram valores dentro dos padrões de confiabilidade, com Z-score igual a - 3,62 (quanto mais negativos, maior nível de confiabilidade para o modelo) e score QMEAN igual a 0,43 (valores mais próximos a um representam modelos com maior qualidade). A estrutura estereoquímica dos modelos 3

4 (Figura2A; via gráfico de Ramachandaran) apresentou 92,6% dos resíduos de aminoácidos localizados nas regiões energeticamente mais favoráveis, refletindo a boa qualidade estereoquímica do modelo gerado. Figura 2: Qualidade do modelo de aquaporina de feijão-caupi. (A) Gráfico de Ramachandran para o modelo tridimensional de feijão-caupi, indicando as regiões energeticamente favoráveis (mais escuras) e menos favoráveis (mais claras), bem como a localização dos resíduos de aminoácidos do modelo. (B) Gráfico representativo do Z-score do modelo gerado, comparativamente aos modelos de cristalografia de raios-x (em cinza claro) e ressonância magnética (em cinza escuro) disponíveis no PDB. Em preto a posição do modelo em relação às proteínas do PDB. Na análise do desvio total de energia via Z-score com todas as estruturas proteicas depositadas no PDB, verificou-se que o modelo tridimensional de feijão-caupi situa-se dentro da área referida a padrões de qualidade desejada, próximo inclusive do modelo de espinafre. Encontra-se, portanto, numa posição favorável em comparação aos modelos obtidos via raios-x e ressonância magnética (Figura 2B), indicando que os modelos estão intimamente relacionados com as estruturas terciárias de proteínas obtidas experimentalmente. Conclusões O modelo tridimensional gerado mostra-se satisfatório com relação aos principais valores estatísticos, apontando para a possibilidade da utilização deste em outras análises, tal como modelos gerados por cristalografia de raios-x ou ressonância magnética, assim como a utilização dessa metodologia para outras aquaporinas de feijão-caupi. Por apresentar o modelo de feijão-caupi todas as estruturas necessárias para permitir sua funcionalidade, este apresenta potencial para possíveis inferências biotecnológicas. Agradecimentos Agradecemos o suporte financeiro à CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior), CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), BNB (Banco do Nordeste do Brasil), FINEP (Financiadora de Estudos e Projetos) e FACEPE (Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia de Pernambuco). 4

5 Referências AGRE. P.; KOZONO, D. Aquaporin water channels: molecular mechanisms for human diseases. FEBS Letters, v. 555, n. 1, p , BENKERT, P.; SCHWEDE, T.; TOSATTO, S.C.E. QMEANclust: Estimation of protein model quality by combining a composite scoring function with structural density information. BMC Structural Biology, n. 20, p. 9-35, BIENERT, G.P.; BINERT, M.D.; JAHN, T.P.; BOUTRY, M.; CHAUMONT, F. Solanaceae XIPs are plasma membrane aquaporins that facilitate the transport of many uncharged substrates. The Plant Journal, DANIELSON, J.A.; JOHANSON, U. Unexpected complexity of the aquaporin gene family in the moss Physcomitrella patens. BMC Plant Biology, v. 8, n. 45, ESWAR, N.; ERAMIAN, D.; WEBB, B.; SHEN, M.Y.; SALI, A. Protein Structure Modeling with Modeller. Methods in Molecular Biology, v. 426, p , GOMES, D.; AGASSE, A.; THIEBAUD, P.; DELROT, S.; GEROS, H.; CHAUMONT, F. Aquaporins are multifunctional water and solute transporters highly divergent in living organisms. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1788, p , HEINEN, R.B.; YE, Q.; CHAUMONT, F. Role of aquaporins in leaf physiology. J. Exp. Bot., v. 60, n , JOHANSON, U.; KARLSSON, M.; JOHANSSON, I.; GUSTAVSSON, S.; SJOVALL, S.; FRAYSSE, L.; WEIG, A.R.; KJELLBOM, P. The complete set of genes encoding major intrinsic proteins in Arabidopsis provides a framework for a new nomenclature for major intrinsic proteins in plants. Plant Physiology, v. 126, n , KHALED, K.; KARIM, K.; MOURAD, O.; ABDEKARIM, K.; NOUREDINE, R. PIP Aquaporin Protein of in Durum Wheat, Homology Modelling and 3D Structure Analysis. BIOMIRROR, v. 2, p. 1-7, LASKOWSKI, R.A.; MACARTHUR, M.W.; MOSS, D.S.; THORNTON, J.M. PROCHECK: A program to check the stereochemical quality of protein structures. Journal of Applied Crystallography, v. 26, p , MAHAJAN, S.; TUTEJA, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 444, n , MUCHERO, W.; DIOP, N.N.; BHAT, P.R. et al. A consensus genetic map of cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp.] and synteny based on EST-derived SNPs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 106, n. 43, p , PARK, W.; SCHEFflER, B.E.; BAUER, P.J.; CAMPBELL, B.T. Identification of the family of aquaporin genes and their expression in upland cotton (Gossypium hirsutum L.). BMC Plant Biology, v. 10, p. 142, PHILLIPS, R.D.; MCWATTERS, K.H.; CHINNAN, M.S.; HUNG, Y.B.; LARRY, R.; SEFA-DEDEH, S.; SAKYI- DAWSON, E.; NGODDY, P.; NNANYELUGO, D.; ENWERE, J.; KOMEY, N.S.; LIU, K.; MENSA-WILMOT, Y.; NNANNA, I.A.; OKEKE, C.; PRINYAWIWATKUL, W.; SAALIA, F.K. Utilization of cowpeas for human food. Field Crops Research, v. 82, n. 2-3, p , SOTO, G.; FOX, R.; AYUB, N.; ALLEVA, K.; GUAIMAS, F.; ERIJMAN, E.J.; MAZZELLA, A.; AMODEO, G.; MUSCHIETTI, J. TIP5;1 is an aquaporin specifically targeted to pollen mitochondria and is probably involved in nitrogen remobilization in Arabidopsis thaliana. Plant Journal, v. 64, p , TÖRNROTH-HORSEFIELD, S.; WANG, Y.; HEDFALK, K.; JOHANSON, U.; KARLSSON, M.; TAJKHORSHID, E.; NEUTZE, R.; KJELLBOM, P. Structural mechanism of plant aquaporin gating, Nature, v. 439, p , WIEDERSTEIN, M.; SIPPL, M.J. ProSA-web: interactive web service for the recognition of errors in three-dimensional structures of proteins. Nucleic Acids Research, v. 35, W407-W410,