JBS Kit de Iniciação para a Cristalização Proteica

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1 Cat. No. CS-401PT Quantidade 1 Kit forem geometricamente favoráveis, ocorre a cristalização da proteína. Somente para uso in vitro Garantia válida para 12 meses Conservar a 4 C Introdução e Teoria da Cristalização Atualmente existem dois métodos principais para a determinação da estrutura tridimensional de proteínas: Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e cristalografia de raios-x. RMN possibilita a determinação da estrutura atômica de proteínas com um limite de peso molecular em torno de Da (25 kda, o equivalente a aproximadamente 220 amino ácidos), enquanto que o método de raios-x é mais apropriado para a determinação de estruturas proteicas maiores ou de complexos macromoleculares. Os estudos pioneiros das estruturas cristalográficas da mioglobina (1950) e hemoglobina (1955) foram premiados com o Premio Nobel de Química em Esse reconhecimento demonstra não somente a importância da cristalografia de raios-x, mas também aponta a emergente biologia estrutural como um campo essencial para a ciência no geral. O primeiro passo na determinação de uma estrutura cristalográfica, e frequentemente o mais difícil, é o crescimento de cristais proteicos de tamanhos suficientemente grandes para a realização do experimento. Um cristal é um arranjo periódico tridimensional de blocos, que no nosso caso, são moléculas proteicas, dispostos de maneira regular. Como é possível a obtenção de cristais partindo de uma molécula tão complexa como moléculas proteicas? A fim de se alcançar a forma cristalina partindo de uma solução proteica, a solubilidade das moléculas deve ser diminuída. Por via de regra, a redução da solubilidade leva à formação de um precipitado proteico amorfo. No entanto, se condições apropriadas forem selecionadas de tal maneira que se formem regiões complementares na superfície de moléculas adjacentes, interações específicas podem acontecer entre essas moléculas. Se essas interações Fig. 1: Diagrama esquemático de fases de uma mistura proteína-precipitante O processo de cristalização é caracterizado por dois passos: (1) nucleação e (2) crescimento do cristal. Ambos os passos podem acontecer na zona supersaturada do diagrama de fases, se as condições corretas forem selecionadas (ver Fig.1). De acordo com a Fig.1, há necessidade da formação de uma solução supersaturada de proteína-precipitante, o que ocorre quando moléculas se mantêm dissolvidas em solução numa concentração maior do que a solubilidade em condições normais. Infelizmente é necessário um nível maior de supersaturação para a nucleação do que para o crescimento do cristal, o que dificulta o controle individual desses parâmetros. A área de nucleação também é chamada de zona lábil, enquanto que a área de crescimento do cristal é conhecida como zona metaestável. A nucleação requere que a solução proteica esteja localizada na zona lábil, que é também onde o crescimento rápido de cristais ocorre. Portanto, mantendo-se a solução proteica por muito tempo nessa zona acarretará no crescimento rápido de muitos núcleos cristalinos e a produção excessiva de cristais pequenos. Já que é interessante a obtenção de cristais suficientemente grandes (c.a. 0,5 mm de largura), deve-se evitar a formação de muitos núcleos. Isso significa que a mistura proteínaprecipitante deve alcançar a zona de nucleação lentamente para que os núcleos em formação tenham tempo para crescer. Page 1 of 7 Last update: April 7, 2015

2 A transição de uma solução estável para uma solução supersaturada acontece quando se varia a proporção proteína-precipitante de acordo com o diagrama de fase. Para tanto, aumenta-se a concentração de proteína ou do precipitante (eixos vertical e horizontal na Fig. 1). Os processos físicos que geram essa mudança na concentração são diálise ou difusão, ambos caracterizados pelo transporte de matéria de um meio para o outro. O método de difusão por vapor tem se mostrado muito adequado para a cristalização de proteínas. Esse tipo de experimento, também chamado pelo método de gota pendurada, está ilustrado na Figura 2. A solução proteína-precipitante se encontra em uma gota suspendida na parte inferior de uma lamínula. O tamanho da gota pode variar de 0,5 a 20 µl. A solução do poço (ca. 1 ml), que se encontra no recipiente debaixo da gota, contém uma alta concentração de precipitante, e portanto, uma pressão de vapor inferior à solução proteica. Durante o decorrer do experimento, vapor de água originário da gota se difunde para a solução precipitante do poço. Dessa maneira, a concentração proteínaprecipitante na gota aumenta e, em condições apropriadas, a cristalização da proteína ocorrerá em dias ou semanas. Esse sistema de gota pendurada sobre uma solução precipitante no poço permite que o equilíbrio termodinâmico seja alcançado lentamente com o passar do tempo. Quais Materiais são Utilizados como Precipitante? Em princípio qualquer material de tenha influencia sobre a solubilidade da proteína pode ser utilizado como precipitante, contanto que não desnature a proteína em elevadas concentrações. É possível caracterizar os diferentes precipitantes mais utilizados em cristalização de acordo com os efeitos que exercem sobre a solução proteica. Os precipitantes comumente usados são sais, polímeros orgânicos, álcoois e eventualmente água pura. Sais como (NH 4) 2SO 4, NaCl, LiCl, KH 2PO 4, etc., mudam a forca iônica da solução. A Figura 3 a variação da solubilidade de proteínas em função da forca iônica do meio. Fig. 3: Dependência da solubilidade (S) em função da forca iônica (I) Fig. 2: Experimento de cristalização por difusão de vapor pelo método da gota pendurada A área à esquerda do máximo da solubilidade é denominada de salting-in, em que a solubilidade aumenta devido ao aumento da constante dielétrica do solvente. A área à direita é denominada de salting-out, onde a solubilidade decresce devido à competição das cargas do precipitante com as cargas de superfície da proteína por moléculas de água do meio, diminuindo assim o estado de hidratação geral da proteína. Precipitantes orgânicos como etanol, metanol, propanol, MPD (2-metil-2,4-pentanediol) ou Page 2 of 7 Last update: April 7, 2015

3 acetonitrila, reduzem a solubilidade da proteína por diminuírem a constante dielétrica do solvente. Polímeros orgânicos funcionam da mesma maneira, como os PEGSs (polietilenoglicois), que podem ser encontrados nos diversos pesos moleculares (de 400 a Da). Outro parâmetro importante que influencia a solubilidade das proteínas é o valor do ph da solução. Geralmente, a solubilidade proteica é mais baixa no seu ponto isoelétrico (IEP), já que nesse ponto sua carga total é zero. Devido à grande variedade de parâmetros que podem influenciar a cristalização, e como geralmente se dispõe de uma pequena quantidade de amostra proteica, fica praticamente impossível testar todas as combinações dos parâmetros existentes. Portanto, é extremamente necessário se planejar uma estratégia que permita a obtenção dos resultados desejados de uma maneira rápida e sem se fazer uso de muito material. Características dos Cristais Proteicos Em princípio, os cristais proteicos são formados da mesma maneira que os cristais de pequenas moléculas ou cristais de sal, seguindo as mesmas regras de empacotamento molecular e simetria. No entanto, existem diferenças fundamentais que abrangem desde propriedades mecânicas e óticas até composição. Cristais proteicos são delicados e geralmente contem de 30% a 70% de água, a maior parte de forma desordenada dentro do cristal. A integridade do cristal é mantida devido às interações entre as moléculas proteicas enquanto que o espaço entre essas moléculas é preenchido por água ou moléculas do tampão. Consequentemente, as moléculas de proteína se encontram dentro do cristal em um meio praticamente natural, ou seja, aquoso. Dessa maneira, sua estrutura nativa (arranjo conformacional que confere sua função ou atividade) é conservada, o que pode ser facilmente demonstrado através da realização de ensaios enzimáticos em sua forma cristalina. Em alguns casos, a forma cristalina reflete até mesmo sua forma natural de reserva, como no caso da insulina. Kit de Iniciação para a Cristalização da JBS O Kit de Iniciação para a Cristalização da Jena Bioscience oferece todo o material necessário para analisar a nucleação e crescimento de cristais, partindo-se de uma proteína exemplo (lisozima da clara de ovo) e usando-se o método de difusão de vapor em gota pendurada. Para tanto, variações graduais de ph em função de concentrações crescentes do precipitante (NaCl) foram desenhadas a fim de se visualizar diretamente os efeitos dessas duas variáveis em termos de nucleação, morfologia e tamanho final do cristal. Além disso, no kit também está incluído todo o material para a cristalização da lisozima pelo método em batch, onde a solução de cristalização é misturada diretamente com a proteína sem se aplicar difusão de vapor para se equilibrar a concentração das soluções. Composição do Kit: 1. 2 placas de cristalização 24-well SuperClear TM para o método em gota pendurada 2. 1 seringa com 5 ml de graxa de silicone para a selagem dos poços da placa lamínulas para cristalização 4. 1 lamina ml de solução precipitante NaCl, 20% (m/v) 6. 4x 3 ml de tampão de 2 acetato de sódio nos phs de 4,0, 4,4, 4,8 e 5,2 cada um 7. de solução de lisozima em água (20 mg/ml) 8. 1 ml de solução de cristalização para a cristalização pelo método em batch (30% (m/v) de PEG 5000-MME, 1 M de NaCl, 50 mm de acetato de sódio em um ph de 4,4) Materiais Necessários nao Inclusos neste Kit: 1. Pipetas Eppendorf ou similares, com capacidade de pipetagem de 1 a 2. Ponteiras de tamanhos correspondente 3. Água destilada ou deionizada 4. Uma pinca 5. Local de armazenamento com temperatura controlada (20 22 C) 6. Um microscópio com poder de ampliacao de x para a observacao dos cristais Page 3 of 7 Last update: April 7, 2015

4 Protocolo de Realização do Experimento Segundo o Método de Gota Pendurada No experimento em gota pendurada (Fig. 2), a lisozima é cristalizada equilibrando-se a solução de cristalização do poço (selado com a graxa de silicone) com a gota de proteína diluída em uma gota de solução de cristalização. Para tanto, utiliza-se como solução precipitante o sistema acetato de sódio/nacl, possibilitando a visualização da dependência cristalização no valor do ph e concentração de acetato de sódio/nacl. O experimento se realiza em um valor de ph entre 4,0 a 5,2 em combinação com uma concentração de NaCl entre 4% a 9%. O Experimento: 1. Selagem da placa de cristalização: aplicar a graxa de silicone sobre a superfície circular de cada poço utilizando a seringa do kit. A aplicação deve ser homogênea e evitar a formação de bolhas ou o espalhamento da graxa sobre a placa. 2. Pipetar em cada poço a solução de cristalização de acordo com o esquema da Figura 4: o volume total em cada poço é de 1 ml, sendo a concentração final do tampão, depois da adicao da solução precipitante e de água, de. Atenção: antes de começar a pipetar, certifiquese de que a placa está corretamente orientada através da linha (A-D) e da coluna (1-6) no canto superior esquerdo. 3. Pipetagem da gota para a cristalização: pipetar 1 µl de solução proteica mais 1 µl de solução do poço sobre uma lamínula circular. Pipetar cada linha (A-D) separadamente. Primeiro pipete a gota de solução proteica no centro da lamínula e depois adicione a gota de solução do poço. Para tanto, a ponta da ponteira é cuidadosamente colocada sobre a superfície da gota de proteína e a solução precipitante é dispensada sem a formação de bolhas. A ponteira deve ser trocada antes de pipetar a próxima gota para que não haja contaminação cruzada. 4. Selagem dos poços: com a ajuda de uma pinça, cada lamínula é invertida e colocada gentilmente sobre seu poço correspondente (Fig. 2). Pressione levemente o centro da lamínula com os dedos (ou qualquer outro objeto macio) para que o poço seja selado hermeticamente pela graxa de silicone. Conservar as placas preparadas em um lugar de temperatura constante (20-22 C). Para a observação das gotas no microscópio é recomendável a remoção da tampa da placa. Ao ajustar a objetiva do microscópio, tomar cuidado para não haver contato com a graxa. Procure observar toda a profundidade da gota proteica através do microscópio. Luz polarizada pode também ser usada para a diferenciação entre precipitado amorfo e material cristalino, já que cristais são capazes de transmitir a luz polarizada. A Figura 5 mostra o aspecto das gotas no microscópio (aumento de 40x) depois de 20 horas. O esquema de numeração das coordenadas (A-D, 1-6) é correspondente ao da placa preparada. Pode-se observar claramente que o número de cristais aumenta com o aumento da concentração de NaCl. A concentração ótima para o crescimento de cristais de qualidade é alcançada na concentração de NaCl logo abaixo da máxima, de acordo com o diagrama de fases mostrado na Fig. 1 (para maiores informações, veja a relação entre nucleação e crescimento do cristal na introdução deste manual). Pode-se notar também a nucleação diminui com o aumento do valor de ph, o que significa uma diminuição no número de cristais em ph mais elevados. Protocolo de Realização do Experimento Segundo o Método Batch Para o experimento pelo método batch, a gota proteica também é misturada com a gota de solução de cristalização na lamínula, porém, a composição dessa solução precipitante foi otimizada de tal maneira que a cristalização da proteína tem início imediato. Depois de aproximadamente 20 minutos, cristais pequenos já podem ser vistos no microscópio, e crescem rapidamente nos próximos minutos. Nesse tipo de experimento em específico, os cristais crescem Page 4 of 7 Last update: April 7, 2015

5 mais rapidamente em comparação com o experimento anterior pelo método em gota pendurada. O Experimento: 1. Pipetar a solução de cristalização para a cristalização pelo método em batch em uma lamínula. 2. Pipetar 2 µl da solução proteica sobre a gota de solução precipitante. Agora observe a gota no microscópio. A razão entre o volume de solução de cristalização/proteína também pode ser alterada a fim de se observar diferenças na velocidade de crescimento de cristais e no número total de cristais formados. Agradecimentos Estamos agradecidos ao Dr. Manfred Weiss como autor da ideia original e por sua assistência na elaboração deste kit. Grande parte deste manual foi baseada nas instruções experimentais do Dr. Weiss. Direitos Autorais Todas as figuras incluídas neste manual são e se mantêm propriedade registrada do Dr. Manfred S. Weiss. É proibida a reprodução total ou parcial deste manual sem a autorização expressa e por escrito da Jena Bioscience GmbH. Page 5 of 7 Last update: April 7, 2015

6 Concentração final 20 % NaCl 4 % 5 % 6 % 7 % 8 % 9 % ph 4,0 2 Acetato de Sódio ph 4,4 ph 4,8 ph 5,2 20 % de NaCl 2 de Acetato de Sódio Água Destilada Fig. 4: Esquema de pipetagem segundo o método de gota pendurada Page 6 of 7 Last update: April 7, 2015

7 A B C D Fig. 5: Aparência das gotas de cristalização segundo o método de gota pendurada depois de 20 horas (ampliação de 40x) Page 7 of 7 Last update: April 7, 2015