Flow cytometry: immunophenotyping in 48 hairy cell leukemia cases and the relevance of fluorescence intensity in CDs expression for diagnosis

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1 Citometria de fluxo: imunofenotipagem em 48 casos de leucemia de células cabeludas e a relevância das intensidades de fluorescências nas expressões dos anticorpos monoclonais para o diagnóstico 123 artigo Original Citometria de fluxo: imunofenotipagem em 48 casos de leucemia de células cabeludas e a relevância das intensidades de fluorescências nas expressões dos anticorpos monoclonais para o diagnóstico Flow cytometry: immunophenotyping in 48 hairy cell leukemia cases and the relevance of fluorescence intensity in CDs expression for diagnosis Nydia Strachman Bacal 1, Eduardo Mantovani 2, Silvia Grossl 3, Sonia Tsukasa Nozawa 4, Ruth Hissae Kanayama 5, Ana Claudia Miranda Brito 6, Claudio Ernesto Mendes Albers 7, João Carlos de Campos Guerra 8, Cristóvão Luis Pitangueira Mangueira 9 RESUMO Objetivo: Relatar a experiência e importância da imunofenotipagem por citometria de fluxo por meio da positividade e intensidade de expressões antigênicas no diagnóstico de 48 pacientes com leucemia de células cabeludas. Métodos: Entre novembro de 1991 e junho de 2005 foram analisados por citometria de fluxo casos, sendo pacientes com doenças oncoematológicas (82,3%), e diagnosticados 48 casos (1,3%) de leucemia de células cabeludas. As análises morfológicas foram realizadas em laminas coradas pelo método pancromático May Grunwald Giemsa, por pelo menos dois experientes morfologistas. As análises citoquímicas realizadas foram: fostatase ácida e fosfatase ácida inibida por tartarato (TRAP). Foram analisadas as expressões antigênicas dos anticorpos monoclonais: CD2, CD3, CD5, CD7, CD10, CD11c, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD38, HLA-DR, FMC-7, CD79b, CD103, IgM, IgG, IGD, Kappa e Lambda. Resultados: Por meio das análises dos porcentuais de positividade e intensidade de expressão dos anticorpos monoclonais encontrados nas regiões de células dos histogramas de volume e complexidade (utilizados de 1991 a outubro de 2001) e análise nas regiões de células CD19 positivas com histogramas seqüenciais, foi possível identificar essa patologia, inclusive com discriminação de células residuais após terapêutica específica. Conclusão: A confirmação diagnóstica das leucemias de células cabeludas por citometria de fluxo é um método rápido e preciso, sendo útil no laboratório clínico. A opção por um histograma inicial de CD19 x SSC e analisar a intensidade de expressão antigênica na medula óssea mostrou-se estatisticamente mais eficiente. Descritores: Leucemia de célula pilosas; Citometria de fluxo; Imunofenotipagem; Anticorpos monoclonais ABSTRACT Objectives: To report the experience and the importance of flow cytometry immunophenotyping by measuring the positivity and antigenic expression intensity in the diagnosis of 48 patients with hairy cell leukemia (HCL). Methods: From November 1991 to June 2005, 4318 cases were analyzed by flow cytometry, 3556 (82.3%) of which were oncohematological diseases. Forty-eight cases of hairy cell leukemia (1.3%) were diagnosed. Morphological analysis was performed on slides stained with Grunwald Giemsa panchromatic dye, analyzed by two experienced professionals. The cytochemical analyses made were for acid phosphatase and tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP). For antigenic expression analysis, the monoclonal antibodies used were: CD2, CD3, CD5, CD7, CD10, CD11c, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD38, HLA-DR, FMC-7, CD79b, CD103, IgM, IgG, IGD, kappa and lambda. Results: By analyzing positivity and monoclonal antibody expression intensity in the forward scatter vs. side scatter histograms (used between 1991 and 2001), and in CD19 1 Médica Hematologista e Patologista Clínica do Hospital Israelita Albert Einstein HIAE, São Paulo (SP), Brasil. 2 Biomédico do Laboratório Diagnósticos da América, São Paulo (SP), Brasil. 3 Biomédica do Laboratório do Hospital Edmundo Vasconcelos, São Paulo (SP), Brasil. 4 Biomédica do Laboratório Clínico do Hospital Israelita Albert Einstein HIAE, São Paulo (SP), Brasil. 5 Farmacêutica do Laboratório Clínico do Hospital Israelita Albert Einstein HIAE, São Paulo (SP), Brasil. 6 Farmacêutica do Laboratório Clínico do Hospital Israelita Albert Einstein HIAE, São Paulo (SP), Brasil. 7 Biomédico do Laboratório Clínico do Hospital Israelita Albert Einstein HIAE, São Paulo (SP), Brasil. 8 Médico Hematologista do Hospital Israelita Albert Einstein HIAE, São Paulo (SP), Brasil. 9 Médico Coordenador do Laboratório Clínico do Hospital Albert Einstein HIAE, São Paulo (SP), Brasil. Autor correspondente: Nydia Strachman Bacal Setor de Citometria de Fluxo do Laboratório Clínico do Hospital Israelita Albert Einstein Av. Albert Einstein, 627 Morumbi CEP São Paulo (SP), Brazil nsbacal@einstein.br. Data de submissão: 4/9/2006 Data de aceite: 2/5/2007

2 124 Bacal NS, Mantovani E, Grossl S, Nozawa ST, Kanayama RH, Brito ACM, Albers CEM, Guerra JCC, Mangueira CLP vs. SSC histograms with sequential histograms (after 2001), it was possible to confirm this pathology and to discriminate residual cells after the specific therapy. Conclusion: Diagnostic confirmation of hairy cell leukemia by flow cytometry is a fast and accurate method that is useful in the clinical laboratory. The option for an initial CD19 vs. SSC histogram and an analysis of antigenic expression intensity in the bone marrow showed to be statistically more efficient. Keywords: Leukemia, hairy cell; Flow cytometry; Immunophenotypi ng; Antibodies, monoclonal e nos histogramas CD45 x SSC a região dessas células é tipicamente ao lado da região de linfócitos maduros (figura 2). Ao trabalhar em histogramas seqüenciais discriminam-se as células pan-b (CD19, CD20), o que auxilia a precisão da análise (figura 3). A análise de histogramas seqüenciais é indicada principalmente nos aspirados de medula óssea pela população de linhagem linfóide medular ser composta de toda a ontogênese da célula B. INTRODUÇÃO A origem da leucemia de células cabeludas (HCL) foi controversa por vários anos. A publicação por Bouroncle et al., em 1958, com o título Reticuloendoteliose Leucêmica (1) afirmava ser uma neoplasia de células reticulares. O debate sobre a origem dessas células mononucleares ser do sistema fagocítico apresentou posições contrárias pela sua fraca capacidade fagocítica e pela presença de receptores Fc da molécula de imunoglobulina na superfície celular. A demonstração de que a imunoglobulina é restrita à cadeia leve indica que a HCL origina-se de uma célula B maligna. É uma doença rara, com incidência de 2% entre as leucemias, observadas em adultos, geralmente homens (relação 5:1), com idade média de 55 anos. O quadro de pancitopenia com esplenomegalia associado a uma punção aspirativa seca da medula óssea, decorrente da fibrose reticulínica, sugere o diagnóstico de HCL (2-4). As células características são mononucleares com citoplasma abundante, com projeções finas e alongadas pela superfície celular, núcleos redondos ou ovais, observadas no sangue periférico, infiltrando a medula óssea e na polpa vermelha do baço (figura 1). Figure 2. Histogramas com análise de células linfóides B/células cabeludas na medula óssea A B Figure 1. A - Células cabeludas no sangue periférico B - Fosfatase ácida inibida por tartarato Figure 3. Histogramas característicos de pacientes com leucemia de células cabeludas As células tumorais apresentam imunoglobulinas de superfície IgM, IgD, IgG ou IgA e expressam antígenos de linhagem linfóide B (CD19, CD20, CD22, CD79b). São tipicamente CD5, CD10 e CD23 negativas e expressam fortemente o CD25, CD11c e CD103 (5,6). O FMC-7 apresenta expressão variável. A HCL apresenta expressão intensa do CD45, semelhante a outras leucemias linfóides B maduras. Nos histogramas de FSC (Forward Scatter volume) x SSC (Side Scatter granularidade) A baixa especificidade isoladamente dos anticorpos monoclonais CD11c, CD22, CD25 e FMC-7 no diagnóstico de HCL pode ser contornada com a coexpressão desses marcadores, e a forte intensidade de expressão do CD20, CD103 e do próprio CD19, CD20 e do CD22 e da morfologia característica e citoquímica de fosfatase ácida tartarato resistente (figura 1). O TRAP está presente na maioria dos casos, sendo muito sensível, mas pouco específico (7). Ocorre na virose por Epstein-

3 Citometria de fluxo: imunofenotipagem em 48 casos de leucemia de células cabeludas e a relevância das intensidades de fluorescências nas expressões dos anticorpos monoclonais para o diagnóstico 125 Barr, na síndrome de Sézary, na leucemia pró-linfocítica B e na leucemia linfocítica crônica/linfoma linfocítico difuso de pequenas células. A composição de isotipos de imunoglobulinas de cadeia pesada IgG, IgA, IgM e IgD pode ser explicada por estudos funcionais que sugerem que a HCL representa uma leucemia pós-proliferativa, nos últimos estágios da ontogênese das células B normais. A forte expressão antigênica do CD11c e do CD103 é específica de HCL. O CD25 apresenta intensidade fraca a moderada. A HCL variante (HCLv) expressa os antígenos pan- B e imunoglobulina de superfície, assim como o CD11c e o FMC7 (fraca intensidade) não expressam o CD25 e o CD23. Dos antígenos característicos de HCL, quase sempre um deles está ausente: o CD11c, ou o CD25 ou o CD103. A diferenciação com HCL é também pela linfocitose, a célula contém nucléolo evidente e ausência de neutropenia. Em relação ao TRAP, ocasionalmente é positivo, porém não ocorre uma forte marcação. A diferenciação com o linfoma esplênico da zona marginal é possível pela fraca intensidade de expressão do CD103 e dos outros marcadores imunológicos característicos de HCL. O linfoma esplênico de células vilosas (SLVL) apresenta esplenomegalia maciça com linfocitose e ausência de fibrose reticulínica na medula óssea. Os linfócitos apresentam projeções citoplasmáticas semelhantes às da HCL, mas apenas em um a dois sítios da superfície celular. Os anticorpos CD19, CD20 e CD22 e a imunoglobulina de superfície apresentam-se de moderada a forte intensidade, a célula pode expressar o FMC-7 e o CD11c, mas não se observa a co-expressão dos três antígenos característicos de HCL: CD11c, CD25 e CD103 (tabela 1). Tabela 1 - Imunotipagem nas doenças linfoproliferativas B MoAb B-LL/SLL B - PLL HCL HCLv SLVL/SMZL CD5 (++) (+) ( - ) (+/-) (+/-) CD10 (-) (-) (-) (+/-) (-) CD11c (+/-) (-) (++) (+/-) (+/-) até (++) CD23 (++) (-) (-) (-) (+/-) CD25 (+/-) (+/-) (+) (+/-) (+/-) CD103 (++) (+/-) (+/-) FMC-7 (+/-) (++) (++) ( - ) (+/-) até (++) Ig H IgM/D IgM IgG/A/M Ig sup. (+/-) (++) (++) (++) (++) TRAP (++) (+/-) MoAb = anticorpos monoclonais B-LL = leucemia linfocítica B; SLL: linfoma linfocítico de células pequenas B-PLL = leucemia prolinfocítica B; HCL: leucemia de células cabeludas HCLv = leucemia de células cabeludas variante; SLVL: linfoma esplênico de células vilosas SMZL = linfoma esplênico da zona marginal TRAP = fosfatase ácida tartarato resistente Expressão antigênica: (-):negativa; (+/-): fraca; (+): moderada; (++): forte A citometria de fluxo permite o diagnóstico diferencial com outras afecções por meio da presença ou não da expressão de antígenos específicos e pela intensidade da expressão antigênica desses antígenos. OBJETIVO Demonstrar a importância da imunofenotipagem por citometria de fluxo por meio da positividade e intensidade de expressões antigênicas na confirmação do diagnóstico de HCL. MÉTODOS No período de novembro de 1991 a junho de 2005, foram diagnosticados 48 novos casos de HCL no Laboratório Clínico do Hospital Israelita Albert Einstein, sendo 16 amostras de sangue periférico e 32 de medula óssea; 39 pacientes eram do sexo masculino e 9 do feminino. As análises morfológicas foram realizadas pelo método pancromático May Grunwald Giemsa e foram feitas 12 citoquímicas de fosfatase ácida e fosfatase ácida tartarato resistente (TRAP) pelo método de Goldberg e Barka. Os citômetros utilizados foram o Profile II Coulter até 1993, após o XL-MCL-Coulter. As amostras foram preparadas por meio da separação de células no início somente em Ficoll-Hypaque, posteriormente em Opti- Lyse C (Immunotech) ou Q-Prep (Coulter), e atualmente usa-se cloreto de amônia. Os anticorpos monoclonais utilizados foram: CD2, CD3, CD5, CD7, CD10, CD11c, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD38, CD45, CD79b, CD103, HLA- DR, FMC-7, imunoglobulinas de cadeia leve Kappa e Lambda, cadeia pesada IgM, IgG, IgD (superfície e/ou intracitoplasmática) (tabela 2). Tabela 2. Painéis de anticorpos monoclonais utilizados atualmente com os respectivos fluorocromos e fabricantes MoAb Fluorochrome Fabricantes CD5 FITC IMMUNOTECH CD10 PE IMMUNOTECH CD11c PE IMMUNOTECH CD19 PC5 IMMUNOTECH CD20 RPE DAKO CYTOMATION CD22 FITC IMMUNOTECH CD23 RPE DAKO CYTOMATION CD25 RD1 CYTOSTAT/COULTER CD79b PE IMMUNOTECH CD103 FITC IQPRODUCTS FMC-7 FITC DAKO CYTOMATION HLA-DR FITC IMMUNOTECH KAPPA FITC DAKO CYTOMATION LAMBDA FITC DAKO CYTOMATION IgM FITC DAKO CYTOMATION IgD FITC DAKO CYTOMATION IgG FITC DAKO CYTOMATION MoAb = anticorpos monoclonais

4 126 Bacal NS, Mantovani E, Grossl S, Nozawa ST, Kanayama RH, Brito ACM, Albers CEM, Guerra JCC, Mangueira CLP Até junho de 2000 a metodologia empregada para analisar células cabeludas nos histogramas era em regiões de volume x granularidade (gate 1 tabela 3); posteriormente trabalhamos com a identificação de células pan-b, CD19 positivas x granularidade (gate 2 tabela 3) com maior sensibilidade de discriminação de células. Tabela 3. Porcentagem mediana de células positivas e expressão antigênica de vários anticorpos monoclonais na medula óssea (MO) e sangue periférico (SP) por meio de análise em diferentes regiões: GATE 1 - Forward Scatter vs. Side Scatter (Volume vs. Granularidade) N/32 Med % BM N/16 Med % PB N/32 Med Exp. BM N/16 Med Exp. PB CD11c 11/ / / / CD20 14/ / / / CD22 14/ / / / CD25 14/ / / / CD103 1/ / / / FMC-7 12/ / / / Kappa 11/ / / / Lambda 8/ / / / IgM 6/ / / / IgD 5/ / / / IgG 1/ / / / HLA-DR 13/ / / / GATE 2 - CD 19 vs. Side Scatter N/32 Med % BM N/16 Med % PB N/32 Med Exp. BM N/16 Med Exp. PB CD11c 17/ / / / CD20 17/ / / / CD22 17/ / / / CD25 17/ / / / CD103 17/ / / / FMC-7 17/ / / / Kappa 14/ / / / Lambda 14/ / / / IgM 17/ / / / IgD 16/ / / / IgG 16/ / / / HLA-DR 17/ / / / Nas análises estatísticas as variáveis quantitativas foram apresentadas em tabelas contendo medianas, valores de máximo e mínimo pela distribuição assimétrica. O teste de Shapiro-Wilks (14) foi aplicado para testar a normalidade de variáveis quantitativas que foram comparadas entre dois grupos independentes utilizando teste não-paramétrico de Mann-Whitney (15-17). Todas as probabilidades de significância (valores de p) apresentadas são do tipo bilateral e valores menores que 0,05 considerados estatisticamente significativos. O software Minitab 14.1 (State College, PA, USA) foi utilizado na análise estatística dos dados. RESULTADOS A freqüência de HCL em nosso serviço foi de 1,3%, mais freqüente no sexo masculino (4,3:1) e a média de idade encontrada foi de 53 anos. Nos 12 pacientes nos quais foi solicitado o TRAP, este teste mostrou-se positivo e a doença foi confirmada por meio da citometria de fluxo. O antígeno de superfície na célula cabeluda com mais intensa expressão antigênica foi o CD20. Em escala logarítmica o canal de expressão, em amostras de sangue periférico (16 casos), teve mediana de 17,45 e em amostras de medula óssea (32 casos) foi de 55,60, o que pode ser observado na tabela 4 por diferentes análises. O CD45 foi o segundo antígeno de maior intensidade de expressão. O CD22 mostrou-se de média a forte intensidade de expressão e o FMC-7 apresentou-se com expressão variável. O CD11c foi o de expressão mais intensa, seguido pelo CD103 e pelo CD25. A expressão antigênica do CD79b mostrouse de moderada a forte intensidade. A ausência de expressão de CD5 e CD10 pôde ser mais bem observada no gate CD19 x Side Scatter, assim como as outras características expostas acima.

5 Citometria de fluxo: imunofenotipagem em 48 casos de leucemia de células cabeludas e a relevância das intensidades de fluorescências nas expressões dos anticorpos monoclonais para o diagnóstico 127 Tabela 4. Porcentagem e expressão antigênica de anticorpos em 48 pacientes com hipótese diagnóstica de leucemia de células cabeludas Medula óssea (32) Sangue periférico (16) % EXP % EXP MoAb N median N median N median N median CD CD CD11c CD CD CD CD CD CD CD79b CD FMC HLA-DR KAPPA LAMBDA IGM IGG IGD K INTRA L INTRA MoAb = anticorpos monoclonais; % = porcentagem; EXP = expressão antigênica; N = número de pacientes avaliados; INTRA = intracitoplasmática Positividade (acima de 20%) Expressão forte Expressão moderada Expressão fraca Pudemos observar nas análises estatísticas comparativas entre expressões antigênicas que os anticorpos monoclonais CD11c, CD20, CD22, CD23, CD25 e FMC-7 foram significativamente mais expressos em medula óssea do que em sangue periférico. (tabela 5). Nas análises dos diversos casos observamos quatro pacientes com ausência de expressão do CD25, mas levando em conta que somente após o ano de 1995 iniciamos com o CD11c e o FMC-7 e apenas depois de novembro de 2000 com o CD103. Três desses pacientes não puderam ser analisados adequadamente. Em um caso ficamos em dúvida da marcação do CD25, uma vez que todas as outras expressões antigênicas indicavam HCL. Observou-se o CD10 positivo em 10% dos pacientes. DISCUSSÃO A HCL é doença rara, como tem sido observado em nosso serviço, e a média de idade encontrada em nossos pacientes, bem como a predominância do sexo masculino, mostrou-se de acordo com a literatura (8). O antígeno de superfície na célula cabeluda com mais intensa expressão Tabela 5. Comparação entre expressões antigênicas de anticorpos monoclonais no sangue periférico (SP) e medula óssea (MO) SP MO p CD ( ) 7.84( ) n CD ( ) 2.94(0-11) n CD 11c 5.37( ) 11.50( ) n CD ( ) 16.05( ) n CD ( ) 49.10( ) n CD ( ) 14.90( ) n CD ( ) 3.37( ) n 7 25 CD ( ) 5.88( ) n CD ( ) 29( ) n CD 79b 10.30( ) 18.10( ) N/A n 3 15 CD ( ) 16.55( ) N/A n 4 18 FMC ( ) 13.20( ) n HLA-DR 11( ) 14.70( ) n Kappa 3.96( ) 4.75( ) n 8 25 Lambda 7.19( ) 4.23( ) n N/A = não se aplica Teste não paramétrico de Mann-Whitney

6 128 Bacal NS, Mantovani E, Grossl S, Nozawa ST, Kanayama RH, Brito ACM, Albers CEM, Guerra JCC, Mangueira CLP antigênica foi o CD20, o que também se encontra na literatura (9). O CD45 mostrou ser o segundo antígeno de maior intensidade de expressão, o que também pode se observar em outras leucemias linfóides B maduras (10). Em nosso estudo, observamos que o CD22 mostrouse de média a forte intensidade de expressão e o FMC-7 apresentou-se com expressão variável. Dos antígenos que concomitantemente caracterizam a HCL, o CD11c foi o de expressão mais intensa, seguido pelo CD103 e pelo CD25, em conformidade com a literatura (11). Nos casos analisados, diferentemente de alguns relatos da literatura (12-13), a expressão antigênica do CD79b mostrou-se de moderada a forte intensidade. Dez por cento dos pacientes analisados apresentaram o CD10 positivo, o que é compatível com dados da literatura (18-19). Para separação de células, a utilização do Ficoll Hipaque não tem sido recomendada pela possibilidade de perda de células durante o processo. A utilização de Q-Prep e Optilyse C aumenta a inespecificidade e requer uma precisa titulação dos anticorpos monoclonais e esses métodos são mais dispendiosos que o tampão hemolítico com cloreto de amônia, que é o método que utilizamos atualmente. O TRAP (7) era mais solicitado até o ano de 2000, pela agilidade e precisão da imunofenotipagem por citometria de fluxo, mas atualmente são raras as solicitações. O avanço metodológico com a modificação dos histogramas de FSC x SSC para seqüenciais iniciando com o CD 19 x SSC tem permitido uma precisão maior da análise. A maior densidade antigênica observada pelo CD20, CD45 e CD22 é encontrada também em outras doenças linfoproliferativas crônicas B, mas a concomitância do CD11c, CD25 e CD103 permite uma especificidade ao diagnóstico. A imunofenotipagem por citometria de fluxo mostrouse metodologia rápida e precisa e, com a disponibilidade dos anticorpos monoclonais e suas combinações, é ferramenta complementar útil no diagnóstico rápido da HCL. As expressões antigênicas de forte intensidade dos anticorpos monoclonais pan-b e mais específicos combinados possibilitam a detecção de doença residual e a monitorização terapêutica. CONCLUSÕES Pelo presente estudo concluímos que devemos optar por análises em histogramas de CD19 x SSC com histogramas seqüenciais em gates fixos do CD19 e separar no momento da análise a população de células linfóides B normais das patológicas na medula óssea. As expressões antigênicas de vários anticorpos monoclonais foram mais intensas nas células da medula óssea do que nas células circulantes em sangue periférico. REFERÊNCIAS 1. Bouroncle BA, Wiseman BK, Doan CA. Leukemic Reticuloendotheliosis. Blood. 1958;13(7): Keren DF, Mccoy Jr JP, Carey JL. 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