Tutorial. Análise de Microarray usando o R e o Bioconductor

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA SUPERIOR DE AGRICULTURA LUIZ DE QUEIROZ Tutorial Análise de Microarray usando o R e o Bioconductor DIÓGENES FERREIRA FILHO ROSELI APARECIDA LEANDRO São Carlos SP 29/07/2009

2 Tutorial Análise de Microarray usando o R e o Bioconductor Tutorial apresentado no 54 RBRAS e 13 SEAGRO DIÓGENES FERREIRA FILHO ROSELI APARECIDA LEANDRO São Carlos SP 29/07/2009

3 Índice 1. Introdução Objetivos Revisão da Técnica de Microarray cdna Microarray Fixação dos cdnas nas lâminas de vidro Extração de RNA e hibridização Aquisição de Imagens Análise das imagens Microarray de uma cor Delineamento Visualização dos dados Correção do background Normalização dos dados Normalização Global Normalização dependente da intensidade de expressão Normalização dentro de grupo de impressão Normalização dentro do array para escala Normalização entre arrays Análise dos dados - Busca de genes Diferencialmente Expressos Modelos Lineares Matriz Delineamento Matriz Contraste Teste t Abordagem Bayesiana Empírica Testes Múltiplos Materiais e Métodos Material Banco de dados Swirl Zebrafish Banco de dados ApoAI Knockout Softwares utilizados na análise dos dados Métodos Procedimentos para análise dos dados utilizando o pacote limma do Bioconductor Instalação do R e do Bioconductor Análise dos dados Banco de dados Swirl Zebrafish Banco de dados ApoAI Knockout Analisando microarray de uma cor como delineamento com referencia comum Referências Bibliográficas 49

4 1. Introdução Com raras exceções todas as células que constituem um organismo vivo contêm a mesma carga genética, ou seja, o mesmo DNA. O que diferencia dois grupos celulares morfologicamente distintos são os genes expressos nesses dois tipos de células e os níveis de expressão desses genes. A comparação dos níveis de expressão dos genes de diferentes tecidos pode levar ao entendimento dos diversos fenômenos encontrados em um organismo e, experimentos para a detecção de genes com expressão diferencial entre tecidos e órgãos podem ser realizados com microarrays (microarranjos) de DNA. Essa técnica permite mensurar os níveis de expressão de milhares de genes simultaneamente. A capacidade de obtenção de dados de expressão gênica superou a capacidade de analisá-los manualmente. O uso de softwares para a análise de dados genômicos tornou-se imprescindível. 2. Objetivos Nesse tutorial faremos uma revisão de literatura mostrando as etapas da técnica de microarray, desde a fabricação dos arrays até a análise de genes diferencialmente expressos utilizando modelos lineares. Para realização das análises utilizaremos o software R e o pacote limma do Bioconductor. O objetivo principal é fornecer ao leitor passos para análise de um experimento de microarray utilizando o R e o Bioconductor. Serão mostradas e explicadas as linhas de comando necessárias para realizarmos a análise em dois bancos de dados reais bastante utilizados na literatura. 3. Revisão da Técnica de Microarray Antes da tecnologia de microarray a pesquisa genética era quase artesanal e os avanços faziam-se passo a passo, gene a gene. A técnica de microarray permite mensurar os níveis de expressão de milhares de genes simultaneamente, possibilitando comparações entre amostras de tecidos pelos perfis de expressão. São realizados milhares de testes simultâneos para diferentes variáveis-respostas na mesma estrutura de unidades experimentais. 1

5 Figura 3.1: Imagem de um microarray. Algumas aplicações de Microarray Além da análise de expressão gênica, experimentos de microarray podem ter outras aplicações como, por exemplo: Detecção de polimorfismos; Re-seqüenciação genética; Genotipagem; Escalagem genômica. Algumas técnicas de Microarray As técnicas de microarray diferem quanto à forma de fixação do material genético nas lâminas sendo o restante do processo semelhante para todas. Alguns exemplos de técnicas são: Ilumina bead array ( Nylon Membrane ( Agilent: Long oligo Ink Jet ( GeneChip Affymetrix ( cdna microarray; Microarrays de proteínas e Oligo Microarrays; Fabricação de Microarrays A construção dos microarrays pode ser feita por diferentes técnicas onde estas diferem quanto à forma de fixação do material genético nas lâminas. A figura abaixo ilustra três técnicas de fabricação de microarrays: (a) Photolithography, (b) Mechanical microspotting e (c) Ink jetting. Veremos apenas a técnica (b) Mechanical microspotting. 2

6 Figura 3.2: Técnicas de fabricação de microarray. (a) Photolithography, (b) Mechanical microspotting, (c) Ink jetting. Fonte: Schena et al. (1998). Segundo Lopes e Pais (2006) apesar da existência de microarrays de expressão gênica em vários formatos, são usados com mais regularidade duas categorias: Microarrays de cdna compostos por cdna ou oligonucleotídeos; Arrays de grande densidade produzidos comercialmente que contêm oligonucleotídeos sintetizados. O princípio pelo qual todos os microarrays se regem é o da capacidade de uma seqüência presa de nucleotídeos se colar ou hibridar com sua seqüência complementar e formar uma seqüência dupla de DNA (Lopes e Pais, 2006). Figura 3.3: DNA. 3

7 3.1. cdna Microarray Segundo Esteves, 2007, nos experimentos de cdna microarray, é necessário um banco de clones de seqüências expressas (ESTs). As ESTs são produzidas através da criação de fragmentos de DNA dupla fita a partir de uma seqüência expressa (RNA mensageiro - mrna) por transcrição reversa. Esse procedimento experimental dá origem a moléculas de DNA complementar (cdna) que são então clonados em bactérias. A construção da lâmina começa com a seleção dos clones que contém as seqüências específicas dos genes de interesse. Essas seqüências são removidas dos clones, amplificadas por PCR e fixadas em posições específicas da lâmina, conhecidas como spots, através de agulhas de impressão que são controladas por um robô específico Fixação dos cdnas nas lâminas de vidro Seleção de clones: A fase inicial de um experimento consiste na seleção de clones de cdna vindos de algum banco de clones que geralmente estão relacionados com algum projeto genoma específico. Amplificação dos fragmentos por PCR: Como em experimentos de microarray podem ser utilizados vários microarrays a quantidade inicial de cdnas pode não ser suficiente, e deve então ser amplificada por PCR (Reação em cadeia por Polimerase). Figura 3.4: Termociclador. Aparelho utilizado para realização de PCR. Fixação das cdnas: Os fragmentos selecionados são fixados nas lâminas de vidro por um robô chamado Arrayer em posições específicas conhecidas como spots. Os cdnas fixados na lâmina são chamados cdnas sonda, os quais contém, cada um, as seqüências de um único gene. 4

8 Figura 3.5: Arrayer depositando os cdnas nas lâminas de vidro Extração de RNA e hibridização São extraídos o RNA mensageiro (mrna) ou RNA total das duas populações celulares de interesse (Tratamento e Controle, por exemplo: células cancerígenas e células normais). A partir de cada amostra de RNA é produzido cdna (DNA complementar) por transcrição reversa. Os cdnas de cada amostra são tingidos com os corantes fluorescentes Cy3 e Cy5 os quais serão excitados com comprimentos de onda diferentes. Os cdnas da população controle serão tingidos com Cy3 e os cdnas da população tratamento serão tingidos com Cy5. Os cdnas alvo de duas amostras distintas (uma com Cy3 e outra com Cy5) são misturados e hibridizados contra a lâmina de vidro; Nesse processo as seqüências de cdnas das duas amostras, em contato com a lâmina de vidro, irão se anelar com suas seqüências complementares dos cdnas sonda. Haverá competição entre as duas amostras. Figura 3.6: As duas amostras de cdnas marcados são misturadas e colocadas na lâmina para hibridização. Fonte: Souto (2008). 5

9 Figura 3.7: Etapas do processo de hibridização Aquisição de Imagens Depois que a lâmina foi hibridizada ela passa por uma etapa de lavagens para remover o excesso de material genético que não hibridizou com os as sondas e é feita a leitura do microarray pelo scanner para digitalização da imagem; Existem dois tipos de scanners: Scanner CCD: Na tecnologia CCD as lâminas são excitadas com uma luz branca em toda sua extensão e uma câmera fotografa a imagem decorrente da emissão de intensidade proveniente dos fluorocromos (Cy3 e Cy5) presentes nos alvos (populações celulares de interesse) que foram utilizados para a hibridização (Esteves, 2002). Scanner a laser: Os scanners a laser fazem uma varredura na lâmina com um raio laser nos comprimentos de onda específicos digitalizando a imagem gerada. Figura 3.8: Leitura de um microaray pelo scanner a laser. Os dados brutos resultantes de um experimento de microarray de duas cores são imagens monocromáticas, uma para cada corante, usualmente um arquivo.tif. Posteriormente um software de análise de imagens atribui cores a cada uma das imagens e mescla essas imagens dando origem a uma única imagem. O ScanAlyse, por 6

10 exemplo, é um programa para análise de imagem de microarrays de DNA, Eisen (1998) c1G 12130c1R Figura 3.9: Imagens de um experimento de microarray. A figura 12130c1G corresponde à leitura do scanner no comprimento de onda que excita o Cy3 e a figura 12130c1R corresponde à leitura do scanner no comprimento de onda que excita o Cy5. Estas figuras fazem parte do experimento Apo AI o qual é tratado por Dudoit et al. (2000). O banco de dados desse experimento, incluindo as imagens, está disponível em Figura 3.10: Software de análise de imagens de microarray ScanAlyse gerando uma nova imagem pela composição das imagens 12130c1G e 12130c1R atribuídas das cores verde para 12130c1G e vermelha para 12130c1R. 7

11 Figura 3.11: Outro exemplo de imagem de microarray. Figura 3.12: Diagrama ilustrativo da técnica de cdna microarray. Fonte: Fujita (2007). 8

12 Análise das imagens As imagens constituem os dados da análise de expressão gênica; Vejamos, segundo Esteves (2002), alguns termos usados na linguagem de processamento de imagens de microarray: Foreground ou região de sinal: Região ocupada pelo spot; Background: Imagem de fundo da lâmina (região onde não se encontram os spots); Ruído: Falta de contribuição de sinal devido a moléculas que não se anelam com nenhuma molécula fluorescente; Artefato: Sinais inespecíficos decorrentes de sujeira na lâmina ou hibridização inespecífica que contaminam o background; Figura 3.13: Termos usados na linguagem de processamento de imagens de microarray. O processamento de imagens de microarray pode ser dividido em três partes: 1. Endereçamento ou gradeamento; 2. Segmentação do sinal (ou dos spots); 3. Quantificação da intensidade; 9

13 Endereçamento ou gradeamento; Nessa etapa localizamos os blocos e os spots. Assim devem ser feitos dois gradeamentos: Blocos; Região de influência do spot; Figura 3.14: Gradeamento dos blocos no software Bioinfo. Fonte: Esteves (2002). Figura 3.15: Gradeamento e segmentação dos spots. Fonte: Esteves (2002). 10

14 Segmentação do sinal (ou dos spots) Verifica se o pixel pertencente ao foreground ou ao background; Métodos de segmentação: Segmentação de círculo fixo; Segmentação de círculo adaptativo; Segmentação por histograma; Segmentação por variação de intensidade; Figura 3.16: Imagens de segmentação por círculo fixo e segmentação por variação de intensidade respectivamente. Fonte: Esteves (2002). Quantificação da intensidade São feitos os cálculos das intensidades background e do foreground. Observe na figura abaixo, Target Median é a mediana da intensidade de luz (vermelha ou verde) dentro do círculo, e Bkgd Median é a mediana da intensidade de luz do background (região fora do círculo porém dentro do quadrado). A Área é calculada como sendo o número de pixels dentro do círculo cuja intensidade seja maior que todos os pixels fora do círculo mas dentro do quadrado. Assim a intensidade do spot é calculada por: Intensidade = (Target median Bkgd median)*area. 11

15 Figura 3.17: Cálculo da intensidade do spot. Fonte: Carazzolle (2008). Após a análise da imagem de microarray o resultado é uma tabela contendo os níveis de expressão dos genes. Figura 3.18: Banco de dados de microarrays com o background corrigido. Esses dados são parte do experimento Apo AI o qual é tratado por Dudoit et al. (2000). Banco de dados disponível em: 12

16 Microarray de uma cor Segundo Pereira (2008), nos arrays de uma cor, um procedimento de transcrição reversa é usado para produzir cdna de fita dupla, que é transcrito e amplificado in vitro para crna marcado com biotina. O crna biotinizado é, então, fragmentado e hibridizado no chip. Após a hibridização, o crna não hibridizado é removido do array e o este é submetido a uma série de lavagens e etapas de coloração, em que o corante fluorescente streptavidin-phycoerythrin (SAPE) liga com a biotina do crna marcado. Finalmente, o array é digitalizado usando-se um laser que excita o corante fluorescente. O processo de leitura da imagem é o mesmo que o de arrays de duas cores. Figura 3.19: Esquema da técnica de microarrays para arrays de duas cores e uma cor. 4. Delineamento O delineamento adotado deve eliminar o confundimento nas fontes de variação e evidenciar a variabilidade biológica, Haddad (2007) apud Rosa et al.(2005b). Para a representação do delineamento de um experimento de microarray de duas cores utilizaremos flechas para representar os microarrays (lâminas) e letras para representar as amostras biológicas (amostras de cdna). A base da flecha indica que a 13

17 amostra correspondente foi marcada com Cy3 e a ponta da flecha indica que a amostra correspondente foi marcada com Cy5. Por exemplo, na figura abaixo, o experimento (a) tem um único microarray onde a amostra A foi marcada com Cy3 (verde) e a amostra B foi marcada com Cy5 (vermelho), já o experimento (b) tem dois microarrays onde no primeiro a amostra A foi marcada com Cy3 e a amostra B com Cy5 enquanto no segundo microarray foi feito o inverso, ou seja, a amostra A foi marcada com Cy5 e a amostra B com Cy3. Figura 4.1: Exemplos de delineamentos para microarray de duas cores. Na figura acima temos: (a) Delineamento com comparação direta; (b) Delineamento com Inversão de Corantes (Dye Swap); (c) Delineamento com Referência; (d) Delineamento em Loop. O delineamento com inversão de corantes (dye swap) tem como objetivo eliminar o confundimento devido ao efeito dos corantes. No delineamento com referência as amostras de interesse são comparadas indiretamente, através de uma referência comum. Esse tipo de delineamento tem a vantagem de outros tipos de amostras poderem ser adicionados posteriormente para serem comparadas com as amostras que já haviam sido comparadas, bastando utilizar a mesma referencia comum utilizada nas amostras anteriores. Podemos também analisar experimentos de microarray de uma só cor como se fosse um delineamento com referência comum. 5. Visualização dos dados Os dados de intensidade de fluorescência são tradicionalmente visualizados utilizandose gráficos de dispersão. Os gráficos a seguir foram feitos com dados do experimento APO AI, Dudoit et al. (2000). Os gráficos mais comuns são: 14

18 Cy3 x Cy5; MA-plot; onde M = log 2 (R) - log 2 (G) e A = ½ [log 2 (R) + log 2 (G)]. Figura 5.1: Gráfico de dispersão de Cy3 x Cy5 para o microarray c1 Figura 5.2: MA-plot para o microarray c1. Sobre a transformação M = log 2 (R) - log 2 (G), A = ½ [log 2 (R) + log 2 (G)] são aplicadas então as técnicas de normalização, que buscam reduzir a variação da técnica e tornar as intensidades comparáveis entre diferentes hibridizações. 6. Correção do background Segundo Esteves, 2007, a intensidade do background é necessária para a correção dos valores de intensidade obtidos. A motivação para a utilização deste dado está no fato 15

19 de que não é possível obter exatamente os valores de ruído encontrados nos spots, entretanto o efeito desse ruído pode ser minimizado através da correção dos valores de intensidade da região de sinal pelos valores de intensidade do background. A correção do background é feita subtraindo as intensidades do background das intensidades do foreground. 7. Normalização dos dados Experimentos de microarray têm muitas fontes de variação sistemática as quais podem afetar as medições dos níveis de expressão gênica. Para comparar microarrays devem ser removidas as fontes de variação de cada um deles. As técnicas de normalização são transformações dos dados que buscam remover essas fontes de variação. A normalização pode ser feita: Dentro do array; Entre os array; A Normalização dentro do array é feita em cada array separadamente e pode envolver todos os genes do array, ou ser realizada por regiões do array. Esse tipo de normalização busca remover, por exemplo, o viés dos corantes dentro de cada array ou corrigir a locação; A normalização entre array é utilizada para permitir a comparação entre os array do experimento. Causas de variação Diferenças na eficiência da incorporação dos corantes; Diferenças na quantidade de RNA inicial utilizado para marcação e hibridização; Diferenças de ajuste de parâmetros do scanner de leitura das lâminas; Falhas na impressão das sondas, etc. Imprecisão de equipamentos; Procedimentos de localização e quantificação adotados pelos softwares; 7.1. Normalização Global É feita para correção de locação. É aplicada quando existe uma relação constante (Cy5=k.Cy3). Log (Cy5/ Cy 3) = Log (Cy5/ Cy 3) µ 2 i 2 = Log (Cy 5/ k.cy 3) 2 i i 16

20 O centro da distribuição de todos os logaritmos da razão das amostras é zero. Tem a desvantagem de não considerar os efeitos da distribuição espacial dos spots nos arrays na expressão dos genes e por considerar que as diferenças são independentes da intensidade de expressão. Figura 7.1: Possível problema em uma imagem de microarray. A mancha na figura aparenta ser uma marca de dedo. Fonte: Esteves (2007) Normalização dependente da intensidade de expressão Vícios dependentes da intensidade de expressão na distribuição dos log-ratios. Isto pode ser notado quando se observa o MA-plot. Figura 7.2: MA-plot com curva de lowess para o slide swirl.1 Utiliza-se um método não paramétrico para regressão de M em A, chamado Lowess (Local-Weighted Regression and Smoothing Scatterplot). Esse método adapta uma curva linear de regressão localmente ponderada, que é uma das técnicas estatísticas de suavização de gráficos de dispersão. Tais métodos tentam estimar curvas não lineares capazes de resumir os dados observados. A partir da regressão, a correção é feita como: 17

21 Log ( Cy3/ Cy5) = Log ( Cy5/ Cy3) b( A) 2 i 2 = Log ( Cy5/ k( A). Cy3) 2 i i Os valores de Cy5 e Cy3 ajustados podem ser obtidos como: b(a) é o ajuste de lowess para o MA-plot. Log ( Cy5) = A+ Log ( Cy5/ Cy3) / 2 e 2 i 2 Log ( Cy3) = A Log ( Cy5/ Cy3) 2 i 2 i i 7.3. Normalização dentro de grupo de impressão O processo de depositar os oligonucleotídeos de cdna nos respectivos pontos (spots) nas placas (slides) é chamado de impressão. Figura 7.3: À esquerda temos as lâminas sendo impressas e à direita temos um microarray onde podemos observar os grupos de impressão. Este conjunto de agulhas pode ser uma fonte de variação sistemática de variação no nível de expressão medido. Este tipo de normalização é semelhante à normalização dependente da intensidade de expressão sendo, no entanto, realizado por grupo de impressão. Figura 7.4: Grupos de impressão de um microarray com correspondentes curvas de lowess. 18

22 7.4. Normalização dentro do array para escala Segundo Stafford (2008) a normalização dentro do array para escala ajusta a diferença de escala entre os valores M dentro do array ou entre os arrays. Assume que a maioria dos genes não são diferencialmente expressos entre diferentes amostras no banco de dados, portanto, a escala de seus valores M deve ser constante. Se denotarmos Ms como o log da razão normalizado para escala, então Ms = M/s, onde M é o log da razão de genes antes da normalização, e s é o fator de escala. O fator de escala pode ser calculado s pode ser calculado usando a median absolut deviation (MAD) que é uma estimativa robusta de s. Então MAD = mediana { M mediana( M ) } i i i i onde Mi representa o log da razão de genes no array i antes da normalização, e o fator de escala s i para o array i pode ser estimado como: s MAD i = I I i = 1 i MAD i 7.5. Normalização entre arrays Esta normalização é utilizada para permitir a comparação entre os arrays do experimento. É aplicada após a normalização dentro do array para correção dos efeitos de escala entre arrays. O mesmo método utilizado para a correção de escala dentro do array pode ser diretamente estendido para esta situação. 8. Análise dos dados - Busca de genes Diferencialmente Expressos Nesta etapa, é possível seguir diferentes abordagens matemáticas e estatísticas, dependendo das questões biológicas envolvidas com o experimento. Os tipos mais comuns de análise de microarrays são: a) Busca de genes diferencialmente expressos (DE); b) Construção de agrupamentos (tanto para genes como para amostras); c) Busca de grupos de genes capazes de discriminar tipos biológicos diferentes (análise discriminante). Iremos considerar nesse trabalho apenas a Busca de genes diferencialmente expressos. 19

23 O objetivo desse tipo de análise é a identificação de genes com diferenças significativas de expressão entre os tecidos biológicos estudados. Em um estudo com dois tecidos biológicos, cancerígeno e sadio, por exemplo, esse tipo de análise busca identificar genes que estejam se expressando de maneira diferencial no tecido cancerígeno ou no tecido sadio Modelos Lineares O delineamento de qualquer experimento de microarray pode ser representado em termos de um modelo linear para cada gene. Essa abordagem requer que duas matrizes sejam definidas: Matriz delineamento (design matrix) Matriz contraste (contrast matrix) Matematicamente assumimos um modelo linear: E[ Y ] = Xα onde: y j contém os dados de expressão para o gene j; X é a matriz delineamento; α j é um vetor de coeficientes. j j Matriz Delineamento Essa matriz representa as diferentes amostras de RNA que serão hibridizadas no array. É uma matriz de coeficientes onde cada linha representa um array e cada coluna corresponde a um coeficiente. Os coeficientes devem ser independentes. Veja mais sobre matriz delineamento em Thorne. Exemplo: Considere o delineamento com três arrays onde comparamos duas amostras (A e B) indiretamente através de uma referência comum (Ref). Quando utilizarmos um delineamento com dye swap deveremos indicar invertendo o sinal do coeficiente. Cada array será representado fazendo-se a amostra na ponta da flecha menos a amostra na base da flecha. Assim o array 1 será representado por (A Ref), o slide 2 será representado por (Ref A) ou (A Ref) e o slide 3 será representado por (B Ref): 20

24 array1 A Ref array 2 (A Ref) = array 3 B Ref Se considerarmos como coeficientes (A Ref) e (B Ref), por exemplo, teremos: A Ref α j = B Ref Assim a matriz delineamento deverá ser uma matriz X tal que: array1 A Ref array 2 = X B Ref array 3 ou A Ref A Ref (A Ref) = X B Ref B Ref Logo a matriz delineamento será: array1 1 0 array array O sinal (-1) na segunda linha indica que houve inversão de corante (dye swap) no array 2. Temos então: A Ref 1 0 A Ref (A Ref) 1 0 = x B Ref B Ref 0 1 Escreveremos o modelo linear para o gene j usando a matriz delineamento: y1 1 0 A Ref E y = x B Ref y

25 Observe que o modelo acima compara apenas A com Ref e B com Ref, porém a comparação de interesse que seria A com B não é feita. Para comparar as amostras A e B devemos podemos utilizar a matriz contraste ou nesse caso podemos simplesmente especificar esse coeficiente no vetor α j. Faremos então um novo vetor α jcontendo o coeficiente B A: Teremos agora: α j A Ref = B A A Ref A Ref (A Ref) = X B A B Ref Assim a matriz delineamento deverá ser: Temos então: X 1 0 = A Ref 1 0 A Ref (A Ref) 1 0 = x B A B Ref 1 1 Escreveremos o modelo linear para o gene j usando a matriz delineamento: y1 1 0 A Ref E y = x B A y Observe que esse modelo contém o coeficiente de interesse (B A). Depois de ajustar um modelo linear para cada gene os coeficientes são estimados pelo método dos mínimos quadrados e submetidos a testes de significância. 1 E( Y ) = X. α α = ( X ' X ) X ' Y 22

26 Matriz Contraste Como na matriz delineamento todos os coeficientes devem ser independentes pode ocorrer de algum contraste de interesse não estar incluído. Deveremos então fazer uma nova matriz para incluir esses coeficientes na análise, a matriz contraste. Essa matriz permite que os coeficientes definidos pela matriz delineamento sejam combinados em contrastes de interesse. Cada contraste corresponde uma comparação de interesse entre as amostras de RNA. Para experimentos simples a matriz contraste pode ser omitida. Os contrastes de interesse são dados por: onde C é a matriz contraste. T β = C α j j Exemplo: Considere o delineamento em loop com três arrays e três amostras: O pesquisador pode ter interesse nos contrastes B A, C B e C A, porém, a matriz delineamento define apenas dois desses coeficientes pois eles devem ser independentes. Entretanto podemos utilizar a matriz contraste para fazer combinações dos dois coeficientes definidos pela matriz delineamento e obter os três contrastes de interesse. Considere o modelo em que a matriz delineamento define os contrastes B A e C B: Y j1 1 0 B A Y j 2 E 0 1 = C B Y j3 1 1 Onde: Matriz delineamento: X 1 0 = 0 1 ; 1 1 B A Vetor de coeficientes: α j = C B. 23

27 Tomando a matriz contraste: C= T Temos que os coeficientes de interesse são obtidos por β = C α Assim: 0 1 C B B A β j = 1 0 β j B A C B = 1 1 C A j j 8.2. Teste t Em geral em estudos com microarrays o número de lâminas n h é pequeno, e, portanto as estimativas da variância por gene vão ter muito poucos graus de liberdade e serão muito instáveis, Soler e Rosa (2004). Para contornar esse problema é proposta em Smyth (2004) uma abordagem Bayesiana empírica Abordagem Bayesiana Empírica A estatística utilizada para análise de significância é a estatística t moderada. Tem a mesma interpretação que a estatística t ordinária exceto que os erros padrões foram moderados ao longo dos genes, isto é, reajustados em direção a um valor comum, usando um modelo Bayesiano, Smyth (2005). A estatística t moderada conduz a p-valores do mesmo modo que as estatísticas t ordinárias, com exceção dos graus de liberdade que são aumentados, refletindo maior confiabilidade associada com os erros padrões suavizados. Outra estatística utilizada é a estatística B ou lods ( log( odds )), é o logaritmo da probabilidade do gene ser diferencialmente expresso, Smyth (2004) Testes Múltiplos Consideremos que para cada gene j foi conduzido um teste de hipótese para verificar se há diferença de expressão. Digamos que concluímos que os genes j 1 e j 2 são diferentemente expressos, com um nível de significância individual α = 0, 05. Isso significa que a probabilidade de um falso positivo é de 5%, isto é, de j 1 não ser diferentemente expresso e estarmos identificando ele como tal. O mesmo vale para j 2. Consideremos agora a probabilidade de que ambos os genes sejam identificados corretamente: assumindo independência entre as inferências, temos que essa 24

28 2 probabilidade é dada por (1 0, 05) = 0, É imediato então que a probabilidade de estarmos cometendo algum erro será de1 0, 9025= 0, Ou seja, apesar de estarmos tolerando um erro de 5% individualmente, quando consideramos a probabilidade de todas as nossas afirmações estarem corretas no conjunto de testes realizados, estamos lidando com um erro quase duas vezes maior, Soler e Rosa (2004). Quanto maior o número de hipóteses rejeitadas, ou de genes identificados segundo esse critério, maior será a probabilidade de que hajam falsos positivos. Para controlar a taxa de erro global podemos utilizar o método de Bonferroni ou o ajuste por FDR, por exemplo, que ajusta os níveis descritivos individuais, garantindo o controle da taxa de falsas descobertas. 9. Materiais e Métodos 9.1. Material Banco de dados Swirl Zebrafish O experimento Swirl Zebrafish é muito conhecido na literatura de microarray. Esse experimento foi realizado utilizando o peixe Zebrafish como um organismo modelo para estudo de crescimento em vertebrados. Swirl é uma mutação no gene BMP2 que afeta o eixo dorsal/ventral do corpo do animal. Objetivo: O objetivo do experimento é identificar genes com expressão alterada nos peixes com a mutação Swirl em relação a peixes do tipo selvagem. Figura 9.1: Peixe Zebra (Zebrafish) Delineamento: 4 microarrays em dois pares de dye swap. 25

29 Figura 9.2: Delineamento do experimento Swirl Layout do slide: sondas; 4 x 4 sub-arrays (blocos); 22 x 24 spots. Figura 9.3: layout do array do experimento Swirl. O banco de dados está disponível para download em: Banco de dados ApoAI Knockout O experimento ApoAI foi parte de um estudo sobre metabolismo de lipídio e suscetibilidade à arteriosclerose em ratos Dudoit (2000). Apolipoprotein AI (ApoAI) é um gene importante no metabolismo do colesterol HDL. Ratos com o gene ApoAI knocked-out tem níveis muito baixos de colesterol HDL. Objetivo: O objetivo desse experimento foi comparar genes com nível de expressão alterada no fígado de ratos knock-out com ratos controle. Delineamento: Para cada um dos 16 ratos cdna marcado foi obtido do mrna por transcrição reversa e tingido usando o corante fluorescente vermelho Cy5. A amostra referência usada em todas as hibridizações foram preparadas misturando cdna dos 8 ratos controle e foram tingidos com o corante fluorescente verde Cy3, Dudoit (2001). 26

30 Figura 9.4: A referência comum foi feita misturando RNA dos oito ratos normais, as amostras para os outros grupos são formadas com o RNA de cada rato, oito ratos formam o grupo controle e oito ratos formam o tratamento (ratos knockout). Foram utilizados 16 microarrays no total: Layout do slide: Figura 9.5: Delineamento do experimento ApoAI. Cada microarray tem sondas de cdna impressas em arranjos 4x4 (16 blocos), onde cada bloco tem 19 linhas e 21 colunas Softwares utilizados na análise dos dados Analisaremos os dois bancos de dados utilizando o software estatístico livre R e o pacote limma do Bioconductor. 27

31 Bioconductor é um projeto de software de código e desenvolvimento aberto pra prover ferramentas para análise e compreensão de dados genômicos. Funciona no ambiente computacional estatístico livre R Métodos Analisaremos os dados utilizando a abordagem de modelos lineares, a qual está implementada no pacote limma do Bioconductor. Para verificação de expressão diferencial utilizaremos a abordagem Bayesiana empírica e, para controlar a taxa de falsos positivos utilizaremos o critério FDR. 10. Procedimentos para análise dos dados utilizando o pacote limma do Bioconductor Instalação do R e do Bioconductor Inicialmente precisamos ter instalados o R e o Bioconductor. 1 Passo Faça o download e instale o software R. Ele está disponível para download em: 2 Passo Instale os pacotes do Bioconductor. Basta digitar diretamente no R os comandos abaixo (é necessário conexão com a internet): > source(" > getbioc() Obs.: Não digite o símbolo ( > ) que inicia a linha. Depois de Instalados o r e o Bioconductor, podemos prosseguir para as análises Análise dos dados Banco de dados Swirl Zebrafish 1 Passo 28

32 Faça o download do Banco de Dados. Está disponível para download na página: Após o download extraia os arquivos. 2 Passo Mudar o diretório para a pasta onde foram extraídos os arquivos do Banco de Dados. > setwd("c:/rbras_2009/swirl") > getwd() [1] "C:/RBRAS_2009/Swirl" > dir() [1] "fish.gal" "SpotTypes.txt" "swirl.1.spot" [4] "swirl.2.spot" "swirl.3.spot" "swirl.4.spot" [7] "SwirlSample.txt" 3 Passo Carregar o pacote limma: > library(limma) 4 Passo Carregar o objeto que mostra como foram feitas as hibridizações (arquivo target). > targets <- readtargets("swirlsample.txt") > targets SlideNumber FileName Cy3 Cy5 Date 1 81 swirl.1.spot swirl wild type 2001/9/ swirl.2.spot wild type swirl 2001/9/ swirl.3.spot swirl wild type 2001/11/ swirl.4.spot wild type swirl 2001/11/8 5 Passo Carregar um objeto com as intensidades de expressão (ler os arquivos com extensão.spot que contém os níveis de expressão dos genes). Como as imagens desse experimento foram analisadas pelo software Spot, os dados podem ser lidos pelo limma. Deveremos indicar que esses dados são provenientes do software Spot, pois eles têm uma estrutura própria desse software. > RG <- read.maimages(targets$filename, source="spot") Read swirl.1.spot Read swirl.2.spot 29

33 Read swirl.3.spot Read swirl.4.spot > names(rg) [1] "R" "G" "Rb" "Gb" "targets" [6] "source" "genes" "printer" Caso as imagens não tivessem sido analisadas no Spot ou em nenhum outro software que o limma é capaz de ler os arquivos de dados, eles poderiam ser organizados em um arquivo de texto na forma de uma matriz, de forma que cada linha represente um gene e cada coluna uma hibridização. Assim poderemos ler os dados diretamente no R utilizando o comando: > read.table() ou o comando > read.delim() 6 Passo Acrescentar ao objeto RG a localização, tipo e nome de cada gene (essas informações estão no arquivo com extensão.gal). > RG$genes <- readgal("fish.gal") > names(rg) [1] "R" "G" "Rb" "Gb" "targets" [6] "source" "genes" > RG$genes[1:10,] Block Row Column ID Name control geno control geno control geno control 3XSSC control 3XSSC control EST control geno control geno control geno control 3XSSC 7 Passo Como estamos utilizando saídas.spot, o layout de impressão 4x4x22x24 também precisa ser fixado. Faremos isso utilizando o arquivo.gal. 30

34 > RG$printer <- getlayout(rg$genes) > RG$printer $ngrid.r [1] 4 $ngrid.c [1] 4 $nspot.r [1] 22 $nspot.c [1] 24 attr(,"class") [1] "PrintLayout" 8 Passo Fazer a correção do background. O comando: > RGb <- backgroundcorrect(rg, method="subtract ) pode ser utilizado para calcular os valores do background corrigido, porém o comando > MA <- normalizewithinarrays(rg, method="none") corrige o background e calcula os valores M e A. > names(ma) [1] "targets" "source" "genes" "printer" "M" [6] "A" 9 Passo Fazer um MA-plot para cada array: > plotma(ma, array=1) > plotma(ma, array=2) > plotma(ma, array=3) > plotma(ma, array=4) 31

35 Figura 10.1: MA-plots dos quatro arrays do experimento swirl. 10 Passo Fazer MA-plots dos grupos de impressão para cada array. > plotprinttiploess(ma, array=1) > plotprinttiploess(ma, array=2) > plotprinttiploess(ma, array=3) > plotprinttiploess(ma, array=4) 32

36 Figura 10.2: Gráficos MA dos grupos de impressão (blocos), sem normalização, para os arrays 1, 2, 3 e 4 respectivamente do experimento swirl. 11 Passo Normalização dentro do array: > MA <- normalizewithinarrays(rg) Visualização dos gráficos após a normalização: > plotprinttiploess(ma, array=1) > plotprinttiploess(ma, array=2) > plotprinttiploess(ma, array=3) > plotprinttiploess(ma, array=4) 33

37 Figura 10.3: Gráficos MA dos grupos de impressão (blocos), após a normalização dentro dos arrays, para os arrays 1, 2, 3 e 4 respectivamente do experimento swirl. 12 Passo Fazer um boxplot de cada array. > boxplot(ma$m~col(ma$m),names=colnames(ma$m),col=rainbow(4)) 34

38 Figura 10.4: Boxplot dos quatro arrays do experimento swirl. Por esses gráficos podemos observar que as intensidades estão centradas na média zero, ou seja, foram corrigidas quanto à locação pela normalização dentro do array, entretanto a variação nos arrays é diferente, então devemos fazer uma normalização entre os array para correção de escala. 13 Passo Fazer uma normalização de escala entre os arrays. > MA <- normalizebetweenarrays(ma,method="scale") Verificação da normalização: > boxplot(ma$m~col(ma$m),names=colnames(ma$m),col=rainbow(4)) Figura 10.5: Boxplot dos quatro arrays do experimento swirl depois da normalização entre os arrays. 35

39 14 Passo Ajustaremos um modelo linear para cada gene. > design <- c(-1,1,-1,1) > fit <- lmfit(ma,design) > names(fit) [1] "coefficients" "rank" [3] "assign" "qr" [5] "df.residual" "sigma" [7] "cov.coefficients" "stdev.unscaled" [9] "pivot" "genes" [11] "Amean" "method" [13] "design" 15 Passo Calcular as estatísticas de teste usando a abordagem bayesiana empírica. > fit <- ebayes(fit) > names(fit) [1] "coefficients" "rank" [3] "assign" "qr" [5] "df.residual" "sigma" [7] "cov.coefficients" "stdev.unscaled" [9] "pivot" "genes" [11] "Amean" "method" [13] "design" "df.prior" [15] "s2.prior" "var.prior" [17] "proportion" "s2.post" [19] "t" "p.value" [21] "lods" "F" [23] "F.p.value" 16 Passo Tabela de Genes Diferencialmente Expressos > options(digits=3) > toptable(fit,number=30,adjust="fdr") Block Row Column ID Name logfc AveExpr t P.Value adj.p.val B control BMP e control BMP e control Dlx e control Dlx e fb94h06 20-L e fb40h07 7-D e fc22a09 27-E e fb85f09 18-G e fc10h09 24-H e

40 fb85a01 18-E e fb85d05 18-F e fb87d12 18-N e control Vox e fb85e07 18-G e fb37b09 6-E e fb26b10 3-I e fb24g06 3-D e fc18d12 26-F e fb37e11 6-G e control fli e control Vox e fb32f06 5-C e fb50g12 9-L e control vent e fb23d08 2-N e fb36g12 6-D e control vent e control vent e fb22a12 2-I e fb38a01 6-I e Passo Fazer um gráfico Volcano. Este gráfico é feito como: log2(fold-change) VS log10(p-valor). Vamos carregar um objeto contendo os log2(fold-change) e p-valores para todos os genes (especificaremos que são todos os genes colocando o comando number = nrow(ma$m) em toptable, onde nrow(ma$m) é o número de linhas de M, ou seja, número total de genes ). > y<-toptable(fit,number=nrow(ma$m),adjust="fdr") > names(y) [1] "Block" "Row" "Column" "ID" [5] "Name" "logfc" "AveExpr" "t" [9] "P.Value" "adj.p.val" "B" Como log2(fold-change) está na coluna 6 e os p-valores ajustados estão na coluna 10 utilizaremos essas colunas para criar o gráfico. > plot(y[,6],-log(y[,10],10),xlab="log2(fold-change)", ylab="-log10(p.value)",main="volcano plot",cex=0.1,pch=19) > abline(v=c(-1,1),col="blue") > abline(h=-log(0.05,10),col="red") 37

41 Figura 10.6: Gráfico Volcano do experimento swirl. Os pontos acima da linha vermelha representam os genes com p-valor menor que 0,05, ou seja, genes que apresentam expressão diferencial com um nível de confiança de 5%. Os genes acima da linha vermelha e à esquerda da linha azul correspondente à log2(fold-change)= -1 e à direita da linha azul correspondente à log2(fold-change)= 1 são genes que se expressam mais do que duas vezes em uma amostra em relação à outra Banco de dados ApoAI Knockout 1 Passo Faça o download do Banco de Dados. Está disponível para download na página: Após o download extraia os arquivos. 2 Passo Mudar o diretório para a pasta onde foram extraídos os arquivos do Banco de Dados. > setwd("c:/rbras_2009/apoai") > getwd() [1] "C:/RBRAS_2009/ApoAI" > dir() [1] "ApoAI.gal" "ApoAISpotTypes.txt" [3] "ApoAITargets.txt" "c1.spot" [5] "c2.spot" "c3.spot" [7] "c4.spot" "c5.spot" 38

42 [9] "c6.spot" "c7.spot" [11] "c8.spot" "k1.spot" [13] "k2.spot" "k3.spot" [15] "k4.spot" "k5.spot" [17] "k6.spot" "k7.spot" [19] "k8.spot" 3 Passo Carregar o pacote limma: > library(limma) 4 Passo Carregar o objeto que mostra como foram feitas as hibridizações (arquivo target). > targets <- readtargets("apoaitargets.txt") > targets SlideNumber Name FileName Cy3 Cy5 1 1 c1 c1.spot Ref wild type 2 2 c2 c2.spot Ref wild type 3 3 c3 c3.spot Ref wild type 4 4 c4 c4.spot Ref wild type 5 5 c5 c5.spot Ref wild type 6 6 c6 c6.spot Ref wild type 7 7 c7 c7.spot Ref wild type 8 8 c8 c8.spot Ref wild type 9 9 k1 k1.spot Ref ApoAI KO k2 k2.spot Ref ApoAI KO k3 k3.spot Ref ApoAI KO k4 k4.spot Ref ApoAI KO k5 k5.spot Ref ApoAI KO k6 k6.spot Ref ApoAI KO k7 k7.spot Ref ApoAI KO k8 k8.spot Ref ApoAI KO 5 Passo Carregar um objeto com as intensidades de expressão (ler os arquivos com extensão.spot que contém os níveis de expressão dos genes). Como as imagens desse experimento foram analisadas pelo software spot, os dados podem ser lidos diretamente no limma. Deveremos indicar que esses dados são provenientes do software spot, pois eles têm uma estrutura própria desse software. 39

43 > RG <- read.maimages(targets$filename, source="spot") Read c1.spot Read c2.spot Read c3.spot Read c4.spot Read c5.spot Read c6.spot Read c7.spot Read c8.spot Read k1.spot Read k2.spot Read k3.spot Read k4.spot Read k5.spot Read k6.spot Read k7.spot Read k8.spot > names(rg) [1] "R" "G" "Rb" "Gb" "targets" [6] "source" 6 Passo Acrescentar ao objeto RG a localização, tipo e nome de cada gene (essas informações estão no arquivo com extensão.gal). > RG$genes <- readgal("apoai.gal") > names(rg) [1] "R" "G" "Rb" "Gb" "targets" [6] "source" "genes" > RG$genes[1:10,] Block Row Column ID Name CloneID Control Cy3RT BLANK Control Cy5RT BLANK cdna msrb1 msrb BLANK BLANK BLANK BLANK BLANK BLANK BLANK BLANK BLANK cdna cdna 5'similartoSW:BTF3_H cdna 5'similartogb:J cdna 5'.gi gb W

44 7 Passo Como estamos utilizando saídas SPOT, o layout de impressão 4x4x19x21 também precisa ser fixado. Faremos isso utilizando o arquivo GAL. > RG$printer <- getlayout(rg$genes) > RG$printer $ngrid.r [1] 4 $ngrid.c [1] 4 $nspot.r [1] 19 $nspot.c [1] 21 attr(,"class") [1] "PrintLayout" 8 Passo Fazer a correção do background. > MA <- normalizewithinarrays(rg, method="none") > names(ma) [1] "targets" "source" "genes" "printer" "M" [6] "A" 9 Passo Fazer MA-plots dos arrays: > plotma(ma, array=1) > plotma(ma, array=2).. > plotma(ma, array=15) > plotma(ma, array=16) 41

45 .. Figura 10.7: MA-plots para os arrays 1, 2, 15 e 16, respectivamente, para o experimento ApoAI. 10 Passo Fazer MA-plots dos grupos de impressão para os arrays. > plotprinttiploess(ma, array=1) > plotprinttiploess(ma, array=2).. > plotprinttiploess(ma, array=15) > plotprinttiploess(ma, array=16) 42

46 .. Figura 10.8: Gráficos MA dos grupos de impressão (blocos), sem normalização, para os arrays 1, 2, 15 e 16 respectivamente do experimento ApoAI. 11 Passo Normalização dentro do array: > MA <- normalizewithinarrays(rg) Visualização dos gráficos após a normalização: > plotprinttiploess(ma, array=1) 43

47 > plotprinttiploess(ma, array=2).. > plotprinttiploess(ma, array=15) > plotprinttiploess(ma, array=16).. Figura 10.9: Gráficos MA dos grupos de impressão (blocos), após a normalização dentro dos arrays, para os arrays 1, 2, 15 e 16 respectivamente do experimento ApoAI. 12 Passo Fazer um boxplot de cada array. > boxplot(ma$m~col(ma$m),names=colnames(ma$m),col=rainbow(16)) 44

48 Figura 10.10: Boxplot dos 16 arrays do experimento ApoAI. 13 Passo Fazer uma normalização de escala entre os arrays. > MA <- normalizebetweenarrays(ma,method="scale") Verificação da normalização: > boxplot(ma$m~col(ma$m),names=colnames(ma$m),col=rainbow(16)) Figura 10.10: Boxplot dos 16 arrays do experimento ApoAI após a normalização entre os arrays. 45

49 14 Passo Ajustaremos um modelo linear para cada gene. > design <- cbind("control-ref"=1, "KO- Control"=c(rep(0,8),rep(1,8))) > design Control-Ref KO-Control [1,] 1 0 [2,] 1 0 [3,] 1 0 [4,] 1 0 [5,] 1 0 [6,] 1 0 [7,] 1 0 [8,] 1 0 [9,] 1 1 [10,] 1 1 [11,] 1 1 [12,] 1 1 [13,] 1 1 [14,] 1 1 [15,] 1 1 [16,] 1 1 > fit <- lmfit(ma,design) > names(fit) [1] "coefficients" "stdev.unscaled" [3] "sigma" "df.residual" [5] "cov.coefficients" "pivot" [7] "genes" "Amean" [9] "method" "design" 15 Passo Calcular as estatísticas de teste usando a abordagem bayesiana empírica. > fit <- ebayes(fit) > names(fit) [1] "coefficients" "stdev.unscaled" [3] "sigma" "df.residual" [5] "cov.coefficients" "pivot" [7] "genes" "Amean" [9] "method" "design" [11] "df.prior" "s2.prior" [13] "var.prior" "proportion" [15] "s2.post" "t" [17] "p.value" "lods" [19] "F" "F.p.value" 46

50 16 Passo Tabela de Genes Diferencialmente Expressos > names(toptable(fit,coef=2, number=30,adjust="fdr")) [1] "Block" "Row" "Column" "ID" [5] "Name" "CloneID" "logfc" "AveExpr" [9] "t" "P.Value" "adj.p.val" "B" > options(digits=3) > toptable(fit,coef=2, number=30,adjust="fdr") Name logfc AveExpr t P.Value adj.p.val B 2149 ApoAI,lipid-Img e e CATECHOLO-METHYLTRAN e e EST,HighlysimilartoA e e EST,WeaklysimilartoC e e ApoCIII,lipid-Img e e est e e ESTs,Highlysimilarto e e similartoyeaststerol e e EST,WeaklysimilartoF e e ESTs,Weaklysimilarto e e estrogenrec e e Meox e e Musmusculustranscrip e e MousemRNAfortypeIIDN e e BLANK e e APXL2,5q-Img e e '.gi gb W e e Caspase7,heart-Img e e Olf e e Cy3RT e e psoriasis-associated e e ADENOSINEA1RECEPTOR, e e BLANK e e FGF12A e e MDB e e '.gi gb W e e NCAM-120,Brain-Img e e BLANK e e ESTs,Moderatelysimil e e e e Passo Fazer um gráfico Volcano. > y<- toptable(fit,coef=2, number=nrow(ma$m), adjust="fdr") 47

51 > names(y) [1] "Block" "Row" "Column" "ID" [5] "Name" "CloneID" "logfc" "AveExpr" [9] "t" "P.Value" "adj.p.val" "B" > plot(y[,7],-log(y[,10],10),xlab="log2(fold-change)", ylab="-log10(p.value)",main="volcano plot",cex=0.2,pch=19) Figura 10.11: Gráfico Volcano do experimento ApoAI Analisando microarray de uma cor como delineamento com referência comum. Podemos analisar um experimento de uma cor como se fosse um experimento de duas cores com referência comum. Se tivéssemos, por exemplo, quatro microarrays, cada dois formando dois grupos A e B, poderíamos compará-los como um delineamento com referencia comum utilizando a matriz delineamento: X = que especifica os contrastes: 48

52 α j A - Ref = B - A Observe que a referencia comum não existe, porém, no comando toptable informamos que queremos o resultado referente ao coeficiente 2 (toptable(fit,coef=2)), que compara os grupos A e B. Após definirmos a matriz delineamento ajustamos um modelo linear com o comando lmfit() e calculamos as estatísticas de teste e os p-valores com o comando ebayes(). 11. Referências Bibliográficas CARAZZOLLE, M. F., (2008) Análises de microarranjos de DNA. Disponível em: DUDOIT, S. et al. Statistical methods for identifying dierentially expressed genes in replicated cdna microarray experiments DUDOIT, S. et al. Normalization for cdna Microarray Data EISEN, M. ScanAlyze User Manual. Stanford University; Disponível em: ESTEVES, G.H. Validação de procedimentos para medida de expressão gênica a partir de imagens de cdna Microarray. São Paulo; [Dissertação de Mestrado Fundação Antônio Prudente]. ESTEVES, G.H. Métodos estatísticos para a análise de dados de cdna microarray em um ambiente computacional integrado. São Paulo; [Tese de Doutorado Universidade de São Paulo]. FUJITA, A. Análise de dados de expressão gênica: normalização de microarrays e modelagem de redes regulatórias. São Paulo; [Tese de Doutorado Universidade de São Paulo]. HADDAD, S. R., APLICAÇÃO DE MODELOS LINEARES PARA ANÁLISE DE EXPRESSÃO GÊNICA EM EXPERIMENTOS DE MICROARRAYS. Botucatu; [Dissertação de mestrado UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA]. LOPES, F. C.; PAIS, H. L. M., (Jul. 2006) Relatório de Projecto de Final de Curso. 49