Caracterização da atividade reprodutiva e utilização da inseminação artificial em pequenos ruminantes

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1 Caracterização da atividade reprodutiva e utilização da inseminação artificial em pequenos ruminantes Ramiro D. Mascarenhas 1, Maria C. Baptista 1, Sandra Cavaco-Gonçalves 1 e João P. Barbas 1 Resumo A exploração de pequenos ruminantes em regime extensivo constitui a principal atividade da população rural nos locais em que a intensificação agrícola não é viável. A reprodução tem um papel fundamental na rentabilização destas explorações, pelo que é essencial aprofundar o seu conhecimento. Na cabra e na ovelha, têm sido realizados trabalhos para a caracterização da atividade ovárica e sexual ao longo do ano, o anestro pós-parto, a motilidade uterina, a progressão espermática e várias metodologias para o aumento da prolificidade, nomeadamente com recurso ao líquido folicular bovino. A IA (inseminação artificial) é uma tecnologia indispensável no aumento do potencial produtivo das nossas raças e fundamental nos programas de melhoramento genético. A fertilidade nos efetivos inseminados, quer com sémen refrigerado quer com sémen congelado, está aquém do potencial genético das espécies. Assim, tem constituído um grande desafio o aumento de fertilidade em efetivos inseminados, através do estudo e modificação dos fatores que a a condicionam. Em bodes e carneiros tem sido avaliada a qualidade dos ejaculados ao longo do ano e respetiva congelabilidade. Têm sido desenvolvidas metodologias para melhorar a preservação do sémen (refrigeração e criopreservação) e sua capacidade fertilizante. Na ovelha um dos principais fatores limitantes da fertilidade é a conformação do canal cervical. Para ultrapassar essa limitação, têm sido ensaiados vários fármacos que nos permitam flanquear o cérvix dos ovinos e melhorar a fertilidade das fêmeas inseminadas. Ensaios com redução da utilização de produtos hormonais ou a sua substituição por práticas de maneio, nomeadamente alimentares, têm sido implementados em efetivos em que é utilizada a cobrição natural ou a IA. Palavras chave: cabra, fertilidade, IA, ovelha, reprodução, sémen. 1. Introdução Portugal é maioritariamente constituído por solos de baixa produtividade onde existem pastagens naturais que são condicionadas pelo regime pluviométrico e por floresta. Os pequenos ruminantes são essenciais no aproveitamento do espaço agroflorestal contribuindo de uma forma eficiente no aproveitamento de subprodutos da exploração cerealífera, material lenhoso dos nossos espaços florestais e das pastagens naturais e/ou semeadas existentes nos montados de sobro e azinho. Os ovinos e caprinos de raças autóctones são um património genético valioso contribuindo para a biodiversidade do nosso espaço rural. A carne e leite de animais das raças autóctones são de elevada qualidade nutricional e organolética que após a respetiva certificação, são produtos DOP, constituindo a principal receita das populações rurais. Vários fatores condicionam a rentabilidade da exploração dos pequenos ruminantes sendo indispensável aumentar a sua eficiência reprodutiva, só possível após um adequado conhecimento da sua fisiologia e comportamento reprodutivo. Atualmente, Portugal e Espanha pretendem 1 INRB, I.P. / L-INIA, Unidade de Investigação de Recursos Genéticos, Reprodução e Melhoramento Animal, Quinta da Fonte Boa, Vale de Santarém, Portugal; ramiro.mascarenhas@inrb.pt

2 implementar, nas zonas florestais transfronteiriças, um projeto com cerca de caprinos que contribuirão para a limpeza dos matos e a diminuição dos fogos florestais, projeto que virá incrementar a importância desta atividade nas regiões abrangidas. Os principais fatores condicionantes da reprodução dos pequenos ruminantes são o fotoperíodo, nutrição e o maneio que é variável entre explorações. Os pequenos ruminantes são espécies poliéstricas sazonárias, isto é, a atividade reprodutiva só ocorre em determinadas épocas do ano. Nalgumas raças autóctones, porém, o anestro ou repouso sexual é curto e pouco profundo, podendo a reprodução ocorrer durante todo o ano. O controlo da reprodução e a inseminação artificial (IA) são ferramentas essenciais para o melhoramento genético e o aumento da rentabilidade das raças autóctones. A introdução de novas tecnologias reprodutivas, designadamente o efeito macho, associado ou não a fotoperíodos artificiais, a administração de melatonina e de outros fármacos (prostaglandinas), permitirá a redução/substituição dos produtos hormonais na reprodução, contribuindo para uma produção animal mais segura e sem diminuição da rentabilidade. As atividades de I&DE desenvolvidas na URGRMA têm procurado melhorar o conhecimento sobre a atividade reprodutiva das raças autóctones, desenvolver e melhorar a conservação do sémen e a sua capacidade fecundante, estudar e melhorar a eficiência da técnica de IA em ovinos e caprinos e a introdução/desenvolvimento de novos métodos não-hormonais de controlo da atividade reprodutiva. 2. Atividade Reprodutiva A atividade reprodutiva dos pequenos ruminantes é influenciada por fatores genéticos e ambientais designadamente o fotoperíodo, nutrição, condição corporal, estado sanitário, temperatura e humidade atmosférica. Para aumentar a eficiência produtiva é necessária a utilização de tecnologias reprodutivas, só eficazes após o conhecimento da atividade sexual das diferentes raças nos locais de exploração. Em ovelhas Serra da Estrela, observámos que a atividade ovárica acompanhou as modificações do fotoperíodo com valores mais elevados durante os meses de setembro/janeiro. A atividade sexual (percentagem de estros detetados) foi moderadamente sazonária, sendo significativamente mais baixa durante os meses de fevereiro a junho comparativamente ao período de julho a janeiro (Figura 1). A taxa de ovulação média avaliada por laparoscopia foi de 1,3 (Barbas et al., 1991). O período de anestro pós-parto varia com o tipo de aleitamento praticado, observando-se que o desmame precoce dos borregos (às 24 horas de vida) abreviou este período em cerca de 11 dias (Mascarenhas et al., 1985). Também na raça Merino, a atividade sexual não é constante durante todo o ano, verificando-se uma concentração dos partos no fim do inverno e início da primavera (Silva, 1985). Na cabra Serrana a atividade ovárica anual pode ser repartida em três períodos nomeadamente (1) um período de anestro entre janeiro e abril, (2) um período transitório de atividade ovárica de abril a junho no qual as cabras reagem positivamente ao efeito macho e (3) um período de atividade sexual regular de julho a dezembro (Mascarenhas et al., 1995).

3 Fig. 1. Atividade ovárica e sexual em ovelhas Serra da Estrela. 3. Conservação do Sémen (Refrigeração ou Congelação) O sémen pode ser conservado por refrigeração (+ 4ºC ou + 15ºC) ou por congelação (-196ºC.). Quer num caso, quer noutro, o sémen deve ser recolhido pelo método da vagina artificial, utilizando uma fêmea em estro natural ou induzido. 3.1 Conservação por refrigeração Após a recolha, os ejaculados são avaliados, diluídos e arrefecidos até uma temperatura de +4ºC ou +15ºC. A refrigeração permite a conservação do sémen durante 6 a 8 horas, sem diminuição significativa da fertilidade após inseminação artificial. (Barbas e Mascarenhas, 2009). Os ejaculados destinados a serem congelados deverão ser de ótima qualidade e o arrefecimento deve ser efetuado, de forma controlada, em duas etapas (dos +30 aos + 4ºC e dos +4 aos 135ºC), sendo depois congelados por imersão direta no azoto líquido (-196ºC). A curva de arrefecimento deverá ser adaptada a cada espécie animal (Barbas e Mascarenhas, 2009). Fig. 2. Variação da actividade sexual de cabras Serranas, ecotipos ribatejano e transmontano.

4 3.2. Sémen congelado (SC) 3.3. Congelabilidade do sémen de pequenos ruminantes A congelação do sémen provoca danos irreversíveis na estrutura da membrana plasmática, daí a necessidade de um controlo rigoroso de todos os fatores que condicionam a congelabilidade do sémen. A membrana plasmática dos espermatozoides (spz) tem uma proporção elevada de ácidos gordos saturados comparativamente aos insaturados que, associada à diminuta capacidade antioxidante dos spz, condiciona a respetiva aptidão à congelação (Barbas e Mascarenhas, 2009). A congelação diminui significativamente todos os parâmetros seminais quantitativos e qualitativos, comparativamente ao sémen fresco. Foi avaliada a possibilidade para predizer a fertilidade in vivo do sémen congelado (SC), através da utilização da fertilização homóloga e heteróloga, tendo sido obtidas, em ovinos, correlações positivas significativas entre a mobilidade individual do SC e a taxa de clivagem das células embrionárias (Valente et al., 2010). Foram detetadas variações individuais e sazonárias para o volume, percentagem de spz vivos, normais e percentagem de anomalias em bodes de raça Serrana (Sousa et al., 2001; Barbas et al., 2006) e em carneiros de raça Saloia (Marques et al., 2006). Existe também uma variação sazonária da congelabilidade do sémen, mais evidente nas raças Serra da Estrela e Merino do que na raça Saloia (Barbas et al., 2000). 4. Indução e Sincronização da Ovulação A sincronização do estro e indução da ovulação associada à IA permite melhorar a eficiência reprodutiva em períodos desfavoráveis e viabiliza o agrupamento dos partos com vantagens para o maneio e para a formação de lotes homogéneos para comercialização. Nos ovinos e nos caprinos, a indução e sincronização da ovulação é realizada através de administração de progesterona ou análogos sintéticos (acetato de fluorogestona ou melengestrol), impregnados em esponjas ou pessários intravaginais. A sincronização do estro nos pequenos ruminantes é condicionada pela dose de ecg administrada no fim do tratamento progestagénico, que depende do peso, estado fisiológico, nível de produção leiteira da fêmea e da época do ano (Chemineau et al., 1997). A dose de ecg (250 vs 500 UI) em ovelhas submetidas a duas IA não influenciou a fertilidade, prolificidade e fecundidade cujos valores foram respetivamente 52, 143 e 74%. Estes resultados sugeriram que a dose de ecg poderá ser reduzida sem afetar a eficiência reprodutiva (Barbas et al., 2002). Em caprinos, constatou-se que 400 UI de ecg são adequadas nos protocolos de sincronização nas raças autóctones; também foi confirmado que a dose de 50 µg de PGF 2 α é suficiente para provocar a luteólise (Mascarenhas e Barbas, 2005). 5. Inseminação Artificial A IA em rebanhos comerciais é realizada em momento fixo relativamente ao momento de retirada das EV tanto com sémen refrigerado (SR) como com sémen congelado (SC). A fertilidade após a IA é influenciada pelo método de conservação do sémen (SR vs SC), e também pelo número de spz por IA e pela época do ano (Evans e Maxwell, 1990). No entanto, em ensaios realizados com ovelhas Saloias, inseminadas com SR, não foi observado efeito da época de IA (primavera vs outono) (Barbas et al., 2004).

5 Em diversos trabalhos realizados nos últimos anos, em que foram inseminadas 1116 ovelhas, sem prévia deteção do estro, verificou-se que a fertilidade obtida com SR (48,51%) foi significativamente superior à obtida com SC (13,4%). (Quadro 1). Quadro 1. Fertilidades obtidas na raça ovina Saloia após IA com SR ou SC. Sémen Total IA (n) Fertilidade (%) Mínimo Máximo Refrigerado ,51ª 28,57 63,15 Congelado ,04 b 6,66 20,13 a b, P<0,01. Também não foi observado qualquer efeito da época de congelação de sémen sobre a fertilidade em ovelhas de raça Saloia inseminadas na primavera, nem foram determinadas correlações significativas entre os parâmetros seminais e a fertilidade (Marques et al., 2006). A fertilidade média obtida em cabras de raças autóctones inseminadas com SR, após sincronização e sem prévia deteção do estro, foi de 51,3%; a fertilidade obtida na IA com SC (46,4%) foi ligeiramente inferior à obtida com SR, não sendo as diferenças estatisticamente significativas (Quadro 2) (Barbas e Mascarenhas, 2005). O local de deposição do sémen no momento da IA parece influenciar significativamente a fertilidade. Num ensaio de IA com SR em cabras de raça Charnequeira (n=229), a fertilidade foi significativamente mais elevada (P<0,05) quando o sémen foi depositado no canal cervical (75,0%) do que quando foi depositado na cavidade uterina (57,6%); quando a IA foi feita à entrada da cérvix, a fertilidade foi intermédia (64,3%), mas não significativamente diferente (Mascarenhas et al., 2003). Também em cabras de raça Serrana (n=467) se verificou que apenas a fertilidade após a IA intrauterina (45,9%) foi significativamente inferior (P<0,05) à obtida com as IA à entrada da cérvix (57,2%) ou no canal cervical (54,2%) (Barbas e Mascarenhas, 2005). A diminuição da fertilidade observada na IA intrauterina com SR pode ser devida a diversos fatores, entre os quais são de considerar: 1 o possível traumatismo da mucosa uterina, provocado pela penetração do cateter de IA, com uma reação inflamatória da mucosa adversa à sobrevivência dos spz; 2 a função do canal cervical e das suas secreções, como local de reserva de spz e/ou da sua capacitação, poderá ser importante tendo em conta a variação do intervalo entre o momento da IA e a ovulação (Leboeuf, 2001). Por outro lado, com a utilização de SC, a fertilidade foi significativamente superior (P<0,05) nas inseminações intrauterinas (55,0%), que nas IA intracervicais (31,0%) ou nas cervicais (16,0%) (Mascarenhas et al., 2007). Estas diferenças entre os resultados com SR ou SC, poderão ser devidas quer à perda de capacidade do SC por efeito da congelaçãodescongelação, quer à menor concentração de spz utilizada no SC, sendo, por isso, benéfica a sua deposição mais próxima do local de fecundação. Quadro 2. Fertilidades obtidas após IA em raças caprinas autóctones. Sémen Total IA (n) Fertilidade (%) Mínimo Máximo Refrigerado ,3 46,4 60,2 Congelado 69 46,4 35,3 62,5 6. Trânsito Espermático e Motilidade Uterina Durante o estro, existe um aumento da atividade elétrica da cérvix (Cavaco Gonçalves et al., 2006), que se traduz numa maior atividade muscular, o que facilita o transporte e

6 o estabelecimento duma reserva espermática e contribui para a regulação da fertilidade (Ayad et al., 2004). Por isso, a administração de fármacos que estimulem a atividade muscular na cérvix, o relaxamento simultâneo da musculatura lisa da cérvix e da vagina e o aumento das secreções locais e da retenção espermática podem constituir uma alternativa para melhorar o transporte dos spz e a fertilidade após IA por via cervical, (Horta et al., 2010). Nas ovelhas a deposição vaginal conjunta de misoprostol (análogo da PGE 1 ) e de sulfato de terbutalina (β 2 -agonista) cerca de 56 horas após a remoção da EV aumentou a penetrabilidade cervical (Barbas et al., 2001). Porém, o mesmo tratamento efetuado no momento da IA não provocou o aumento esperado da fertilidade (Barbas et al., 2003), parecendo ser necessário um maior intervalo entre a administração dos fármacos e a IA para viabilizar transformações bioquímicas necessárias ao nível da cérvix. Novos ensaios realizados com a administração dos mesmos fármacos, 6 horas antes do momento da IA, evidenciaram um aumento significativo da fertilidade nas ovelhas tratadas em relação às ovelhas controlo (64,4% vs 42,9%; p=0.035). Estas diferenças foram mais evidentes nas IA vaginais (60,7% vs 30,4%; p=0,03) do que nas IA cervicais (70,06% vs 57,9%; p=0.33) (Horta et al., 2010), o que poderá sugerir que o mecanismo de ação destes fármacos possa estar relacionado com uma diminuição da quantidade de sémen que é expulso pela vagina, uma vez que a maioria do sémen aí depositado é rapidamente perdido para o exterior, por expulsão e/ou drenagem, contribuindo para uma baixa fertilidade (Horta et al., 2010). 7. Práticas para Aumento da Prolificidade O líquido folicular bovino (LFB) é um produto biológico produzido principalmente pelas células da granulosa do folículo ovárico. É rico em inibina (glicoproteina) que contribui para a regulação da secreção de FSH (hormona folículo estimulante) e da ovulação (Knight et al, 1991). A imunização com LFB aumentou significativamente a prolificidade em ovelhas de raça Merino e Saloia, podendo constituir uma alternativa para a melhoria dos parâmetros reprodutivos em efetivos habitualmente explorados em regime extensivo (Barbas, 1998). 8. Estratégias Reprodutivas sem Utilização de Produtos Hormonais A pressão exercida pela opinião pública para eliminar/reduzir a utilização de produtos hormonais em produção animal tem estimulado o desenvolvimento de novas metodologias de controlo da reprodução, nomeadamente através da manipulação do fotoperíodo (tratamentos com luz artificial), associada ou não a outros métodos nãohormonais como o flushing alimentar e o efeito macho, ou à administração de produtos hormonais não sujeitos a restrições como a melatonina ou as prostaglandinas (PGF 2 α). Em ovelhas, a utilização do efeito macho em épocas desfavoráveis só se revelou eficaz quando o anestro era pouco profundo, com mais de 30% de animais cíclicos (Horta et al., 2004), não se verificando melhoria da fertilidade quando a inatividade ovárica era superior a 70% (Vasques et al., 2006). A suplementação com tremoço (Lupinus albus) de ovelhas de raça Merino com condição corporal estável ou crescente, no período pré-ovulatório, não produziu qualquer diferença na fertilidade ou na prolificidade, comparativamente com o grupo controlo. Estes resultados sugerem que o aumento da fertilidade ou da prolificidade descrita por outros autores poderá ser atribuído ao incremento energético e proteico

7 (flushing) em animais com baixa condição corporal e não a qualquer nutriente específico do tremoço (Cavaco-Gonçalves et al., 2010). Atualmente, a URGRMA participa num projeto de I&DE (FLOCK-REPROD, ), apoiado pela UE, que tem como objetivo desenvolver tecnologia inovadora, economicamente viável e amiga do ambiente, que permitirá o controlo da reprodução, e a IA em caprinos, sem-hormonas, e a produção de leite e queijo durante todo o ano. Estes objetivos serão atingidos através de estudos visando o melhoramento da utilização do efeito macho, combinado ou não com tratamentos luminosos (dias longos ou curtos artificiais), de forma a induzir ovulações sincronizadas em cabras leiteiras e otimizar a eficiência da inseminação artificial. Bibliografia Ayad, V.; Leung, S.; Parkinson, T.; Wathes, D Coincident increases in oxytocin receptor expression and EMG responsiveness to oxytocin in the ovine cervix at oestrous. Anim. Reprod. Sci. 80: Barbas, J.; Vasques, M.; Mascarenhas, R Actividade ovárica da ovelha Serra da Estrela, variação sazonária. Jornadas Internacionais sobre Reprodução Ovina e Caprina, Seminário Maior, Novembro, Évora. Barbas, J Contribuição para o melhoramento da eficiência reprodutiva das raças ovinas nacionais através da imunização com líquido folicular bovino. Tese de doutoramento, UTAD, Vila Real, 268 p. Barbas, J.;. Ferreira, G.; Sousa, J.; Baptista, M.; Horta, A Efeito da congelação de sémen de carneiros Merino Regional e Serra da Estrela, sobre as características seminais à descongelação. X Congresso de Zootecnia Progressos Zootécnicos nos Países de Língua Oficial Portuguesa, 2-4 Novembro, EZN, Vale de Santarém, p. 86. Barbas, J.; Cavaco Gonçalves, S.; Marques, C.; Horta, A Efeito da aplicação vaginal de agentes dilatadores do cérvix durante a fase folicular do ciclo em ovelhas. III Congresso Ibérico de Reprodução Animal, 6-8 Julho, Porto, pp Barbas, J.; Mascarenhas, R.; Baptista, C.; Horta, A Efeito de duas doses de ecg em ovelhas Serra da Estrela submetidas a dupla inseminação artificial sobre a fertilidade, prolificidade e fecundidade. Revista Portuguesa de Zootecnia 9, 2: Barbas, J.; Cavaco Gonçalves, S.; Baptista, M.; Marques, C.; Vasques, M.; Horta, A Effect of vaginal application of cervical dilating agents (misoprostol and terbutalin sulphate on AI results in ovine Portuguese local breeds. Rev. Port. Ciênc. Vet. 98: Barbas, J.; Mascarenhas, R.; Horta, A.; Tavares, H.; Cannas-Serra, C.; Cardigos, L.; Moura, R.; Simões, J Influência do diluidor de sémen, época e exploração, nos resultados da inseminação artificial em ovelhas de raça Saloia. Rev. Port. Ciênc. Vet. 99, 549: Barbas, J.; Mascarenhas, R Eficiência da inseminação artificial em caprinos de raças autóctones. 3.º Congresso da SPCV 2005 Ciências Veterinárias, Livro de resumos, p Barbas, J.; Marques, C.; Baptista, M.; Vasques, M.; Pereira, R.; Cavaco-Gonçalves, S.; Mascarenhas, R.; Poulin, N.; Cognie, Y.; Horta, A Reproduction in the goat S Serrana breed: seasonal and individual factors affecting fresh and frozen semen performance, in vivo and in vitro fertility. In: Ramalho Ribeiro, J.M.C.; Horta, A.E.M.; Mosconi, C.; Rosati, A. (Eds.), Animal products from the Mediterranean area. EAAP publication No. 119, Wageningen Academic Publishers, Nederlands, pp Barbas, J.; Mascarenhas, R Cryopreservation of domestic animal sperm cells. Cell Tissue Banking 10, 1: Cavaco Gonçalves, S.; Marques, C.; Horta, A.; Figueiroa, J Increased cervical electrical activity during oestrous in progestagen treated ewes: possible role in sperm transport. Anim. Reprod. Sci. 92: Cavaco-Gonçalves, S.; Jorge, S.; Cunha, T.; Baptista, M.; Barbas, J.; Marques, C.; Vasques, M.; Pereira, R.; Nobre, J.; Horta A.; Caldeira, R.; Mascarenhas, R Effect of Lupinus albus

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