FATORES DE RISCO PARA GRAVIDADE E LETALIDADE DOS ACIDENTES OFÍDICOS OCORRIDOS NO ESTADO DO AMAZONAS: UM ESTUDO DE CASO E CONTROLE

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1 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS FATORES DE RISCO PARA GRAVIDADE E LETALIDADE DOS ACIDENTES OFÍDICOS OCORRIDOS NO ESTADO DO AMAZONAS: UM ESTUDO DE CASO E CONTROLE ESAÚ SAMUEL LIMA FEITOSA MANAUS 2015

2 ESAÚ SAMUEL LIMA FEITOSA FATORES DE RISCO PARA GRAVIDADE E LETALIDADE DOS ACIDENTES OFÍDICOS OCORRIDOS NO ESTADO DO AMAZONAS: UM ESTUDO DE CASO E CONTROLE Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado, para obtenção grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas. Orientador (a): Prof. Doutor Wuelton Marcelo Monteiro MANAUS 2015

3 Ficha Catalográfica F311f Feitosa, Esaú Samuel Lima. Fatores de risco para gravidade e letalidade dos acidentes ofídicos ocorridos no estado do Amazonas: um estudo de caso e controle./esaú Samuel Lima Feitosa. -- Manaus : Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical, f. : il. Dissertação (Mestrado) apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas UEA/FMT, Orientador: Prof. Dr. Wuelton Marcelo Monteiro 1.Acidentes por serpentes 2 Ofidismo. 3.Epidemiologia 4.Fatores de risco - Amazônia Título. CDU: 615.9:31(811.3) Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária Maria Eliana N Silva, lotada na Escola Superior de Ciências da Saúde - UEA

4 FOLHA DE JULGAMENTO FATORES DE RISCO PARA GRAVIDADE E LETALIDADE DOS ACIDENTES OFÍDICOS OCORRIDOS NO ESTADO DO AMAZONAS: UM ESTUDO DE CASO E CONTROLE ESAÚ SAMUEL LIMA FEITOSA Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado. Banca Julgadora: Presidente Membro Membro

5 AGRADECIMENTOS Aos meus pais, Jacqueline Lima e Jânio Feitosa, que com sabedoria sempre me incentivaram a seguir o melhor caminho, mesmo que fosse o mais difícil ou demorado. Ao meu irmão, George Feitosa, um exemplo de dedicação e inteligência. À minha família que, mesmo tão distante, consegue ser presente e sólida na maior parte do tempo. Ao meu orientador, Professor Doutor Wuelton Marcelo Monteiro, que foi paciente, competente e amigo em todas as etapas. Aos colegas do grupo de pesquisa e de sala de aula. Aos amigos e colegas de trabalho, que foram pacientes e compreenderam cada etapa desse processo. À Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado e Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical pelos auxílios e incentivos oferecidos no decorrer desse trabalho.

6 DECLARAÇÃO DAS AGÊNCIAS FINANCIADORAS Este trabalho foi realizado a partir de informações geradas pela Fundação de Vigilância em Saúde do Estado do Amazonas (FVS-AM), utilizando a estrutura da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado.

7 RESUMO Introdução: No Brasil, a região Amazônica é responsável pela maior incidência de acidentes ofídicos entre as regiões. Connhecer melhor os fatores envolvidos com a gravidade e a mortalidade dos acidentes ofídicos levaria a uma melhor abordagem sobre o problema, podendo reduzir sequelas e mortes em localidades remotas da Amazônia brasileira. O objetivo deste estudo é analisar o perfil dos acidentes ofídicos notificados no Estado do Amazonas, na Amazônia Ocidental Brasileira, e investigar possíveis fatores de risco para gravidade e letalidade. Metodologia/Resultados: O estudo trata-se de uma coorte retrospectiva que utiliza dados dos sistemas oficiais de notificação do Brasil, entre os anos de 2007 e A fim de identificar os fatores associados com a gravidade do envenenamento e sua mortalidade, dentro da coorte foi utilizado um estudo de caso-controle aninhado em que o paciente evolui com gravidade ou morte, compreendendo dois grupos de "casos" e os acidentes não graves foram incluídos no grupo "controle". Durante o período, acidentes foram registrados, resultando em uma taxa incidente de 52,8 casos por pessoas/ano. Os acidentes ofídicos ocorreram principalmente no sexo masculino (79,0%). Em relação à área de ocorrência, 70,2% foram notificados em áreas rurais. A faixa etária mais acometida foi entre 16 e 45 anos (54,6%). A proporção de 55,0% dos acidentes foi relacionada com atividades de trabalho. Idade 15 anos [OR=1,26 (IC95%=1,03-1,52); (p=0,018)], idade 65 anos [OR=1,53 (IC95%=1,09-2,13); (p=0,012)], picadas relacionados com as atividades de trabalho [OR=1,39 (IC95%=1,17-1,63); (p<0,001)], o tempo até que a assistência médica >6 horas [OR=1,73 (IC95%=1,45-2,07); (p<0,001)] e envenenamento por Micrurus [OR=5,54 (IC95%=2,61-12,20); (p<0,001)] foram fatores de risco independentes associados com desfechos graves. Idade 65 anos [OR=3,19 (IC95%=1,40-7,25); (p=0,006)] e tempo até a assistência médica >6 horas [OR=2,01 (IC95%=1,15-3,50); (p=0,013)] foram as variáveis independentes associadas ao risco de morte. Conclusões: A incidência dos acidentes ofídicos no Amazonas apresenta uma extensa distribuição espacial. Envenenamentos por serpentes representam um importante problema de saúde ocupacional para as populações rurais da região. Idade 15 anos, idade 65 anos, acidentes relacionados com as atividades de trabalho e o tempo até assistência médica >6 horas foram fatores independentes associados com o risco de desenvolver gravidade. Idade 65 anos e tempo até que a assistência médica >6 horas foram as variáveis independentes associadas com o risco de morte. As características das vítimas de ofidismo demandam manejo precoce nos serviços de atenção terciária e uma resposta do sistema de vigilância e dos tomadores de decisão em saúde, em relação aos grupos identificados como vulneráveis. Palavras Chaves: Acidentes por Serpentes, Ofidismo, Epidemiologia, Fatores de Risco, Amazônia.

8 ABSTRACT Background: In Brazil, the Amazonian region reports the highest incidence of snakebite envenomings. A better knowledge of severity and mortality due to snakebite would lead to improved management, and it may reduce sequelae and case fatality rate in remote localities in the Brazilian Amazon. The aim of this study is to analyze the profile of snakebites reported in the state of Amazonas, in the Western Brazilian Amazon, and to investigate potential risk factors for severity and lethality. Methodology/Principal Findings: This is a retrospective cohort using official Brazilian reporting systems, from 2007 to In order to identify factors associated with snakebite severity and mortality, within the cohort a nested case-control study was used wherein patients evolving to severity or death, comprising two groups of cases and those non-severe bites were included in the control group. During the period, 9,191 snakebites were recorded, resulting in an incidente rate of 52.8 cases per 100,000 person/year. Snakebites mostly occurred in males (79.0%). Regarding the area of occurrence, 70.2% were reported from rural areas. The most affected age group was between 16 and 45 years old (54.6%). A proportion of 55.0% of the snakebites were related to work activities. Age 15 years [OR=1.26 (95% CI= ); (p=0.018)], age 65 years [OR=1.53 (95% CI= ); (p=0.012)], bites related to the work activities [OR=1.39 (95% CI= ); (p<0.001)], time until medical assistance >6 hours [OR=1.73 (95% CI= ); (p<0.001)] and Micrurus bites [OR=5.54 (95% CI= ); (p<0.001)] were independently associated with the risk of severity after snakebites. Age 65 years [OR=3.19 (95% CI= ); (p=0.006)] and time until medical assistance >6 hours [OR=2.01 (95% CI= ); (p=0.013)] were the variables independently associated with the risk of death. Conclusions/Significance: Incidence of snakebites in this area with a large spatial distribution. Snakebites represent a potential occupational health problem for rural populations in this region. Age 15 years, age 65 years, bites related to the work activities and time until medical assistance >6 hours were independently associated with the risk of developing severity. Age 65 years and time until medical assistance >6 hours were the variables independently associated with the risk of death. These features of victims of snakebite demand early referral to and management in tertiary care centres and a response from suveillance system and policy makers for these vulnerable groups. Keywords: Snakebites; Ofidism; Epidemiology; Risk factors; Amazon.

9 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Carga estimada mundial de acidentes ofídicos por ano Figura 2 Distribuição de algumas serpentes do gênero Micrurus no Brasil Figura 3 Distribuição de serpentes dos gêneros Crotalus e Lachesis no Brasil Figura 4 Distribuição de 3 espécies do gênero Bothrops no Brasil Figura 5 Sazonalidade dos acidentes ofídicos nas diferentes Regiões do Brasil Figura 6 Distribuição dos acidentes com serpentes ocorridos na Região Norte do Brasil de acordo com dados do SINAN.... 9

10 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Soroterapia para acidentes ofídicos no Brasil

11 LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA CEP CNCZAP IDW IRA LHFII OMS OR PLA2 SAV SABL SAB SAC SAE SINAN SNABS/MS 3FTx Comitê de Ética em Pesquisa Coordenação Nacional de Controle de Zoonoses e Animais Peçonhentos Inverse Distance Weighting Insuficiência Renal Aguda Lachesis hemorrhagic factor Organização Mundial de Saúde Odds Ratio Fosfolipase A2 Soro antiveneno Soro antibotrópico-laquético Soro antibotrópico Soro anticrotálico Soro antielapídico Sistema de Informação de Agravos de Notificação Secretaria Nacional de Ações Básicas em Saúde do Ministério da Saúde Three finger toxins

12 SUMÁRIO iii SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO EPIDEMIOLOGIA ACIDENTES OFÍDICOS NO MUNDO VIGILÂNCIA E CARGA DOS ACIDENTES OFÍDICOS NO BRASIL EPIDEMIOLOGIA DOS ACIDENTES OFÍDICOS NA AMAZÔNIA O AGRAVO ASPECTOS CLÍNICOS DOS ACIDENTES OFÍDICOS TRATAMENTO FATORES DE RISCO JUSTIFICATIVA OBJETIVOS GERAL ESPECÍFICOS MÉTODOS ÁREA DE ESTUDO ACIDENTES OFÍDICOS EXPOSIÇÕES E DESFECHOS DISTRIBUIÇÃO ESPACIAL ANÁLISE ESTATÍSTICA QUESTÕES ÉTICAS RESULTADOS ARTIGO ARTIGO DISCUSSÃO CONCLUSÂO REFERÊNCIAS ANEXO A FICHA DE NOTIFICAÇÃO/INVESTIGAÇÃO DE ACIDENTES POR ANIMAIS PEÇONHENTOS...106

13 1 1 INTRODUÇÃO 1.1 EPIDEMIOLOGIA ACIDENTES OFÍDICOS NO MUNDO A Organização Mundial de Saúde (OMS) considera os acidentes ofídicos um problema de saúde mundialmente negligenciado. O impacto social e econômico provocado pelas mortes e sequelas, que atingem principalmente jovens em idade produtiva, bem como a elevada carga de acidentes em todo o mundo, o coloca como problema emergente de saúde pública global [1,2]. A verdadeira carga de acidentes ofídicos no mundo é difícil de ser estimada, uma vez que poucos países apresentam um sistema de informações epidemiológicas confiáveis para esse tipo de problema [3]. Uma revisão sistemática baseada em publicações científicas de todos os continentes permitiu estimar a carga de acidentes ofídicos em nível global, atribuindo valores máximos e mínimos para cada região estudada de acordo com as publicações científicas de cada país [4]. Este trabalho demonstrou que dos 227 países que apresentaram dados na literatura sobre ofidismo, apenas 58 se mostraram livres de envenenamentos por serpentes. A incidência estimada por região está representada na Figura 1. Em uma perspectiva mais conservadora, considerando os menores números, as regiões do sul da Ásia ( casos/ano ou 7,84 casos/ habitantes), sudeste da Ásia ( casos/ano ou 18,82 casos/ habitantes) e África Subsaariana ( casos/ano ou 12,94 casos/ habitantes) são as que mais apresentaram casos de envenenamentos por serpentes. Os países mais afetados foram Índia ( casos/ano), Sri Lanka ( casos/ano), Vietnam ( casos/ano) e Brasil ( casos/ano). A carga total de envenenamentos por acidentes ofídicos no mundo, de acordo com o estudo, pode variar entre casos por ano, seguindo estimativas mínimas, à casos por ano, utilizando os valores máximos por região [4].

14 2 Estima-se que morram pelo menos 20 mil pessoas anualmente em decorrência de acidentes com serpentes peçonhentas e suas complicações. Esses números podem ser, contudo, ainda maiores, chegando a mais de 90 mil óbitos anuais. As regiões que mais apresentam mortes relacionadas a acidentes ofídicos são o Oceania e sul da Ásia, com 2,43 e 0,91 mortes por habitantes, respectivamente [4]. Figura 1 Carga estimada mundial de acidentes ofídicos por ano [4]. Observando a Figura 1 percebe-se que os países mais afetados por acidentes ofídicos apresentam características semelhantes, como localização intertropical e elevada taxa de utilização do campo para o desenvolvimento de atividades produtivas. Em concordância com o observado, o perfil de população mais acometido por acidentes ofídicos é formado por homens adultos, de 15 a 45 anos, que trabalham em atividades agrícolas ou desenvolvem atividades rotineiras em sua proximidade [1,5,6].

15 VIGILÂNCIA E CARGA DOS ACIDENTES OFÍDICOS NO BRASIL Apesar do longo histórico de acidentes com animais peçonhentos e da relevância social desse tipo de agravo no país, apenas em 1988, com uma crise na produção de soro antiofídico e uma elevação no número de óbitos, foi institucionalizada uma política de controle para esse problema. Neste ano a Secretaria Nacional de Ações Básicas em Saúde do Ministério da Saúde (SNABS/MS) implantou o Programa Nacional de Ofidismo [7]. O Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN), implantado a partir de 1993, passou a permitir o acompanhamento de agravos de notificação compulsória no Brasil. Dessa forma a Coordenação Nacional de Controle de Zoonoses e Animais Peçonhentos (CNCZAP) passou a adotar, desde 1995, o SINAN para consolidar os registros dos acidentes por animais peçonhentos no país [7]. No Brasil, desde então, a notificação de acidentes ofídicos ocorre por meio do preenchimento da Ficha de Notificação de Animais Peçonhentos (ANEXO A). As serpentes no Brasil apresentam ampla distribuição geográfica, sendo encontradas nos mais diversos tipos de clima e vegetação. Em números oficiais são mais de 50 espécies de serpentes peçonhentas catalogadas no Brasil, dos gêneros Bothrops, Crotalus, Lachesis, Micrurus, Bothrocophias, Leptomicrurus [8 11]. Contudo, para o Ministério da Saúde, a carga de acidentes ofídicos no país relaciona-se principalmente a quatro gêneros de serpentes peçonhentas, são elas: Bothrops, Crotalus, Lachesis e Micrurus [8]. A distribuição aproximada de algumas espécies pelo território brasileiro pode ser observada nas Figuras 2, 3 e 4.

16 Figura 2 Distribuição de algumas serpentes do gênero Micrurus no Brasil [8]. 4

17 Figura 3 Distribuição de serpentes dos gêneros Crotalus e Lachesis no Brasil [8]. 5

18 6 Figura 4 Distribuição de 3 espécies do gênero Bothrops no Brasil [8]. A distribuição dessas serpentes no Brasil é um importante fator preditivo da epidemiologia dos casos, direcionando a distribuição da soroterapia preconizada para cada espécie envolvida no acidente. Espécies do gênero Bothrops distribuem-se por todo o território, com a espécie Bothrops atrox predominando na Amazônia legal, Bothrops jararaca e Bothrops jararacussu em partes do Sul e Sudeste do País [8]. O gênero Crotalus possui como representantes no Brasil as espécies Crotalus durissus cascavella, Crotalus durissus collilineatus, Crotalus durissus dryinas, Crotalus

19 7 durissus marajoensis, Crotalus durissus ruruima e Crotalus durissus terrificus, habitando campos abertos e secos de partes do Sudeste, Nordeste e Centro-Oeste, bem como regiões isoladas de Roraima, Rondônia e sul do Amazonas. O gênero Lachesis possui como representante no Brasil a espécie Lachesis muta, que habita partes densas de floresta na Amazônia e na Mata Atlântica. Já o gênero Micrurus, que possui mais de 30 espécies, está distribuído em todo o Brasil [8]. No Brasil são notificados cerca de 26 mil casos anuais, com incidência acumulada de 13,8 casos/ habitantes. Verifica-se uma distribuição variável entre as regiões do país, com maior incidência nas regiões Norte (52,6 casos/ habitantes), seguida pela região Centro-Oeste (16,4 casos/ habitantes) [8]. Esses valores podem ser maiores devido ao elevado grau de subnotificação de acidentes com animais peçonhentos, que se acentua ainda mais na Região Norte do país [7]. Assim como observado em outros países do mundo, os acidentes ofídicos no Brasil apresentam forte relação com atividades rurais, ocorrendo em habitats próximos ou no exercício de atividades como agricultura, caça e extrativismo. A maioria dos acidentes ocorre durante o dia, atingindo os membros inferiores de adultos entre 20 e 34 anos, ocasionadas pelo gênero Bothrops. Outro importante fator observado é a sazonalidade dos casos, que na maioria das regiões se concentra nos períodos quentes e chuvosos do ano (Figura 5) [7,12 14].

20 8 Figura 5 Sazonalidade dos acidentes ofídicos nas diferentes Regiões do Brasil [8]. Uma revisão da epidemiologia dos acidentes ofídicos ocorridos nos últimos 100 anos no Brasil constatou que a maioria dos casos de envenenamento apresenta gravidade moderada [14]. Outros autores identificaram a mesma característica referente à gravidade em diferentes regiões do país [15,16]. A letalidade média por acidentes ofídicos no Brasil é estimada em 0,45%, resultando em cerca de 120 mortes anuais. Esse é um valor médio, mas podemos observar importantes variações se considerarmos as diferentes regiões do Brasil, bem como a espécie da serpente envolvida no acidente. A letalidade pode variar entre 0,81% no Nordeste e 0,21% no Sudeste do País. A região Norte apresenta, segundo dados do Ministério da Saúde, letalidade média de 0,53% [8]. Quanto às mortes ocasionadas pelos diferentes gêneros de espécies no Brasil temos que o gênero Crotalus apresenta maior letalidade (1,87%), seguido de Lachesis (0,95%), Micrurus (0,36%) e Bothrops (0,31%) [8,12,15].

21 EPIDEMIOLOGIA DOS ACIDENTES OFÍDICOS NA AMAZÔNIA O Norte é a região do país com maior carga de acidentes ofídicos. Registram-se em média mil casos anuais, com incidência acumulada média de 52 casos por habitantes [8]. Em 2012, segundo dados do SINAN, foram notificados casos de acidentes por serpentes em toda a região, representando cerca de 30% dos casos notificados em todo o País. Apesar disso, existe uma escassez de dados publicados sobre ofidismo nesta região. A distribuição de casos por estado em 2012, de acordo com dados do SINAN, pode ser observada na Figura 6. Figura 6 Distribuição dos acidentes com serpentes ocorridos na Região Norte do Brasil de acordo com dados do SINAN. Em um levantamento clínico-epidemiológico realizado no Acre, o perfil dos agravos apresentou predominância de envenenamentos botrópicos (75,6%), seguidos de laquéticos (2,1%) e elapídicos (0,7%). A maioria dos atingidos era do sexo masculino (78,5%) que estavam na área rural do estado no momento do acidente (82,6%) [16].

22 10 Em Roraima os acidentes ocasionados pelo gênero Bothrops também são predominantes (81%), seguidos de acidentes por Crotalus (13%) Lachesis (4%) e Micrurus (0,5%) [10]. No estado do Amapá um levantamento epidemiológico realizado entre os anos de 2003 a 2006 observou em média 227 casos anuais, o que representa uma incidência de 32 casos/ habitantes/ano. Assim como nos outros estados, a maioria dos acidentes notificados eram botrópicos em homens adultos jovens. A atividade laboral estava relacionada a 60% dos agravos notificados no Amapá [17]. No Amazonas o perfil de acidentes ofídicos se assemelha aos demais estados da região, os afetados são do sexo masculino (81,3%), agricultores (50,4%) e o acidente ocorreu no período diurno (76,3%) [9]. Além dessas características observa-se que os membros inferiores são os principais atingidos (88%) [18]. Em todos os estudos o tipo de acidente predominante foi o botrópico. A Região Norte, de acordo com o Ministério da Saúde, diferentemente das demais regiões do país, não apresenta sazonalidade tão bem definida como em outras regiões do país. Esse fato pode estar relacionado ao período de chuvas e calor intenso que acomete a região em praticamente todo o ano [19]. Mesmo não havendo acentuada diferenciação, pode-se observar leve predominância de acidentes nos períodos de maiores índices pluviométricos que, por sua vez, estão relacionados aos meses onde se intensifica o extrativismo nas regiões rurais [10,16,18]. A maioria dos estudos na região observou relação entre acidentes ofídicos e o trabalho no campo, que pode ser agricultura, pecuária ou extrativismo. Na região do médio rio Purus, no Amazonas, o extrativismo florestal (39%), agricultura (17%) e caça (17%) foram as principais atividades relacionadas aos acidentes [8 10,18]. Segundo o Ministério da Saúde, a letalidade dos acidentes no Norte apresenta índices menores que em outras regiões do país [8], apesar de alguns levantamentos terem demonstrado médias maiores que as nacionais, chegando a 1% no Amazonas e 3,9% em Roraima [9,10].

23 O AGRAVO ASPECTOS CLÍNICOS DOS ACIDENTES OFÍDICOS Os venenos das serpentes são misturas complexas de proteínas, que representam cerca de 90% do seu peso seco, e possuem grande variação nas atividades biológicas. A fração não proteica apresenta cátions metálicos, carboidratos, nucleotídeos e aminas biogênicas. Toda essa variação, quando envolvida em envenenamentos, proporciona uma extensa diversidade de atividades farmacológicas e toxicológicas [20,21]. Apesar de características gerais semelhantes para cada gênero, com marcadores específicos para cada veneno, a composição e atividade toxicológica do veneno apresenta significativa variação mesmo quando consideradas serpentes do mesmo gênero ou espécie [22]. Variantes como idade, estação do ano e origem geográfica são características que podem alterar a composição da peçonha e os efeitos clínicos do envenenamento [3,23,24]. O gênero Bothrops apresenta em seu veneno uma série de serinoproteases, fosfolipases e metaloproteinases. Estas últimas são as principais responsáveis pela mionecrose, inflamação e hemorragias decorrentes de acidentes botrópicos. O gênero Crotalus apresenta como principal componente químico de seu veneno a crotoxina (chega a atingir 65% do peso), responsável por sua ação miotóxica e neurotóxica, agindo na junção neuromuscular e, dentre outras ações, inibe a liberação de neurotransmissores [21]. A peçonha laquética apresenta composição semelhante à botrópica, com ações hemorrágicas e coagulantes similares [25]. Alguns dos componentes encontrados são as metaloproteinases I e III, o fator hemorrágico LHFII e serinoproteases [26].

24 12 A peçonha de serpentes do gênero Micrurus é composta, principalmente, por neurotoxinas elapídicas que atuam na junção mioneural, inibindo a liberação da acetilcolina ou bloqueando seus receptores [27]. Entre os componentes peptídicos, os grupos mais abundantes relatados nestes venenos são fosfolipases A2 (PLA2) e as 3FTx [28]. Dessa forma, a sintomatologia dos acidentes ofídicos, bem como suas complicações, relaciona-se diretamente com a composição da peçonha de cada espécie. Essas características clínicas podem auxiliar na elucidação da classificação do envenenamento, mesmo sem a observação direta da serpente [19]. Contudo, em regiões onde os sintomas relacionados a cada tipo de acidente são similares, a diferenciação do tipo de acidente em decorrência dos sintomas do envenenamento pode apresentar falhas. Os acidentes botrópicos apresentam como principais características manifestações proteolíticas, coagulantes e hemorrágicas, com edema e necrose em um número elevado de casos [8,29]. Observa-se ainda uma série de manifestações sistêmicas como sangramentos, hematúria, hematêmese, hemorragia e hipotensão [8,30]. Uma análise dos acidentes causados por serpentes do gênero Bothrops, no estado da Paraíba, identificou que 95,9% dos acidentados alegaram dor, 87,1% apresentaram edema e 2,2% necrose. Esses pacientes apresentaram diferentes manifestações sistêmicas, dentre elas as mais comuns foram cefaleia (23%), hemorragia (10,5%) e vômito (9%) [13]. Outros estudos apresentaram valores semelhantes para as complicações dos acidentes causados pelo gênero Bothrops [31,32]. Uma das complicações mais frequentes em acidentes ofídicos, especialmente em Bothrops e Crotalus, é o desenvolvimento de insuficiência renal aguda (IRA), que chega a atingir 30% dos pacientes [29,30,33,34]. Manifestações clínicas características de pacientes com IRA que sofreram acidentes botrópicos são uremia, hiperpotassemia,

25 13 infecção urinária e anemia. Pacientes admitidos com esse diagnóstico, e acometidos por outras complicações relacionadas ao veneno, como edema pulmonar, podem apresentar até 15% de letalidade [29]. Pacientes com histórico de acidentes ofídicos apresentaram risco 2,5 vezes maior de desencadear insuficiência renal crônica, em relação aos pacientes não expostos a esse tipo de acidente [35]. Acidentes crotálicos apresentam como características principais a atividade neurotóxica e miotóxica [32]. A crotoxina contida no veneno é responsável pelo bloqueio da liberação de acetilcolina, do qual decorrem as paralisias motoras apresentadas pelos pacientes. O envenenamento crotálico apresenta importantes alterações sistêmicas, com manifestações neurológicas, dores musculares generalizadas e incoaguabilidade sanguínea [8,33]. Os acidentes crotálicos também apresentam a IRA como a complicação grave mais frequentemente encontrada, caracterizada por uremia, hiperpotassemia e anemia na maioria dos casos. A morte nesse tipo de situação pode atingir até 10% dos pacientes, sendo potencializada por outros problemas decorrentes da peçonha crotálica, como insuficiência respiratória [29,33,36]. Acidentes laquéticos apresentam poucas informações sobre a clínica dos envenenamentos, principalmente devido ao fato desses acidentes ocorrerem em áreas isoladas de floresta [8,26]. Envenenamentos por espécies do gênero Lachesis apresentam forte ação proteolítica, hemorrágica, miotóxica e coagulante, semelhantes ao envenenamento botrópico. A síndrome vagal, caracterizada por hipotensão arterial, tonturas, escurecimento da visão, bradicardia, cólicas abdominais e diarreia, é a característica do envenenamento laquético que pode diferenciar do botrópico [8,32,37]. Apesar dessa ação neurotóxica diferencial, a maioria dos casos de envenenamento por Lachesis apresenta sintomatologia idêntica aos acidentes botrópicos, dificultando a notificação diferencial do acidente [25,32,38].

26 14 Os acidentes elapídicos, causados por espécies do gênero Micrurus no Brasil, apresentam como característica marcante a ação neurotóxica, com fácies miastênica ou neurotóxica como expressão clínica mais comum. A progressão dessa paralisia, atingindo músculos respiratórios, é responsável pela gravidade potencial desse tipo de acidente [19,27]. As espécies Micrurus mipartitus e Micrurus dissoleucus demonstraram importante bloqueio neuromuscular pós-sináptico dose-dependente [39]. Outras complicações também são comuns em acidentes ofídicos, tais como déficits funcionais, amputações nos membros acometidos e lesões renais irreversíveis [19]. Como o perfil dos acidentados é de jovens trabalhadores rurais do sexo masculino, o impacto dessas sequelas possui relevante peso econômico [6]. A cura com algum tipo de sequela pode chegar a até 35% dos casos, a maioria acarretando em perda de massa muscular, amputações em decorrência de necrose e deficiências motoras [40]. Além de sequelas físicas, acidentes ofídicos causados por serpentes do gênero Bothrops causam, em sua maioria, abcessos com infecções bacterianas secundárias. Culturas aeróbias e anaeróbias demonstram que as bactérias mais freqüentemente isoladas são Morganella morganii, Providencia rettgeri, Enterobacter sp., Escherichia coli, estreptococos do grupo D e Bacteroides sp. [41] TRATAMENTO No Brasil o tratamento dos envenenamentos por serpentes é realizado pela aplicação intravenosa de soro antiveneno (SAV). Estes soros são direcionados para cada gênero de serpente, sendo eles o soro antibotrópico (SAB), soro antibotrópicolaquético (SABL), soro anticrotálico (SAC) e soro antielapídico (SAE). A administração deve ser controlada de acordo com a gravidade do acidente, como se observa na Tabela 1 [19,27]. A composição variável dos venenos de cada espécie, bem como as limitações de identificação do gênero que causou o acidente, pode dificultar a correta aplicação do

27 15 soro. A ação do antiveneno botrópico e antiveneno botrópico-crotálico foram comparados em pacientes acidentados pela espécie Botrops jararacussu, avaliando-se a neutralização da atividade letal, hemorrágica, miotóxica e coagulante do veneno. O soro botrópico-crotálico mostrou ser mais eficaz em neutralizar ações miotóxicas, coagulantes e de letalidade [42]. Outro problema relacionado à soroterapia é o aparecimento de efeitos adversos. Em um estudo, pacientes que receberam soro antiofídico polivalente foram acompanhados a fim de verificar o aparecimento de reações adversas à terapia. O grupo acompanhado apresentou algum tipo de reação adversa à soroterapia em 88,5% dos casos. Reações pirogênicas estiveram presentes em 80.64% e anafiláticas em 64.51% [43]. No Amazonas, não foi verificada variação estatística no aparecimento de reações adversas quando administrados soros antiofídicos de origens diferentes [44]. A soroterapia antiveneno é essencial para definir o desfecho dos acidentes ofídicos, sendo considerado importante fator de proteção para os mesmos [45]. Contudo, outras medidas terapêuticas também são utilizadas para minimizar o agravo. A antibioticoterapia é indicada quando houver sinais de infecção bacteriana secundária. Nestes casos os agentes mais comuns nos acidentes botrópico são sensíveis ao cloranfenicol [8,31]. Tabela 1 Soroterapia para acidentes ofídicos no Brasil [19]. Acidentes Soros Gravidade N ampolas Leve: quadro local discreto, 2 a 4 Soro antibotrópico sangramento em pele ou mucosas; pode haver apenas distúrbio na coagulação. Botrópico Moderado: edema e equimose 5 a 8 evidentes, sangramento sem Soro antibotrópico- comprometimento do estado

28 16 laquético geral; pode haver distúrbio na coagulação. Grave: alterações locais 12 intensas, hemorragia grave, hipotensão, anúria. Moderado: quadro local 10 presente, pode haver sangramentos, sem manifestações vagais. Soro antibotrópico- Grave: quadro local intenso, 20 Laquético laquético hemorragia intensa, com manifestações vagais. Leve: alterações 5 neuroparalíticas discretas; sem mialgia, escurecimento da urina ou oligúria. Moderado: alterações 10 neuroparalíticas evidentes, Crotálico mialgia e mioglobinúria (urina Soro anticrotálico escura) discretas, porém discretas Grave: alterações 20 neuroparalíticas evidentes, mialgia e mioglobinúria intensas, oligúria. Considerar todos os casos 10 Elapídico Soro antielapídico potencialmente graves pelo risco de insuficiência respiratória

29 FATORES DE RISCO Mesmo quando consideradas condições similares no acidente, como tipo de serpente e local da picada, cada caso pode evoluir para desfechos diferentes. Os pacientes podem apresentar quadros leves, moderados ou graves, e ainda ter um desfecho de cura, sequela ou morte decorrente do envenenamento [19]. A evolução do caso e a determinação de suas complicações podem estar relacionadas com uma série de outras variáveis, como idade, tempo transcorrido até o atendimento e fatores biológicos pré-existentes. Entender quais os fatores que estão relacionados à gravidade e morte dos acidentes pode direcionar a implantação de políticas de saúde reduzindo o impacto desse agravo. A evolução de acidentes ofídicos em crianças foi avaliada no Nepal, para correlacionar os principais fatores de risco que contribuíram para a gravidade e morte. O maior número de complicações encontradas, com elevado número de mortes, ocorreu por paralisia respiratória, que atingiu principalmente crianças menores de cinco anos [46]. Na Índia, em um estudo nacional que avaliou mais de 120 mil casos envenenamento, os acidentes apresentaram como principais fatores de risco a relação com o trabalhado rural e o período de ocorrência, notadamente nos meses de chuva intensa [5]. Crianças menores de 12 anos admitidas em um centro de saúde da Índia, diagnosticadas com envenenamento ofídico, foram acompanhadas a fim de se determinar fatores de risco relacionados à gravidade. Ter caminhado mais de 1 km após o acidente e apresentar anemia no momento da admissão foram fatores de risco para gravidade e morte. Outro importante fator observado foi que quanto mais velha era a criança, menor a propensão a desenvolver um desfecho de gravidade [47]. Em um hospital rural desse mesmo país, observando-se pacientes que deram entrada após serem acometidos por acidentes ofídicos, observou-se que a presença de vômito e neurotoxicidade tinham relação direta com desfechos graves e óbitos [48].

30 18 Outro importante fator relacionado à gravidade é o suporte e tratamento do paciente em tempo hábil. Em um estudo prospectivo realizado no Hospital de Doenças Tropicais de Goiânia, ficou demonstrado que o atraso na administração de soro antiofídico foi importante fator de risco independente para o desenvolvimento insuficiência renal aguda [36]. Síndrome de extravasamento capilar, paralisia respiratória e hemorragia intracerebral também foram considerados fatores de risco para mortalidade de pacientes que receberam soro antiofídico polivalente (SAV) como terapia. Aqueles que receberam SAV precoce (<6h) apresentaram reações locais mais graves do que aqueles que receberam SAV tardio (>6 h), mas este último grupo foi mais propenso a apresentar complicações. Aproximadamente 40% dos pacientes acompanhados desenvolveram complicações, como insuficiência renal aguda, em 25% dos casos. A cada hora de atraso no início da terapia antiveneno o risco de um desfecho grave para o paciente é majorado [45,49]. Elevadas taxas de complicações para acidentes ofídicos também foram observadas em pacientes com coagulopatias graves, leucocitose e naqueles que receberam terapia tardia [50]. Outro estudo identificou que o desenvolvimento de coagulopatias relacionadas a acidentes ofídicos apresenta como fator de risco a presença de rabdomiólise [49]. Outros fatores são responsáveis por adicionar risco à terapêutica dos acidentes ofídicos. Apresentar trombocitopenia, hemorragia interna ou mucosa espontânea, distúrbios coagulopáticas, inchaço, equimose e dificuldade respiratória eleva o risco de falha terapêutica nos casos de envenenamento por serpentes [51]. Em uma análise multivariada de pacientes acometidos por acidentes ofídicos, que deram entrada no departamento de medicina no Government Medical College, na Índia, identificou-se que hipotensão, albuminúria, tempo de sangramento, tempo de

31 19 protrombina, hemoglobina bilirrubina total foram fatores de risco independentes para o desenvolvimento de insuficiência renal aguda [34]. 1.4 JUSTIFICATIVA Os acidentes ofídicos são considerados um problema de saúde mundialmente negligenciado, que afeta preponderantemente países pobres com economia rural. O Brasil é um dos países que mais notifica casos no mundo. Os acidentes ofídicos apresentam um elevado impacto social e econômico nas regiões rurais da Amazônia. Como a população atingida é, em geral, de trabalhadores rurais ou extrativistas, a morte e as sequelas consequentes do envenenamento são ainda mais sentidas nas famílias. Apesar de alguns estudos sobre o tema na região, ainda há escassez de dados na literatura sobre os acidentes ofídicos no Amazonas. Não existem estudos sobre os fatores de risco relacionados à gravidade e morte dos acidentes ofídicos no estado do Amazonas. Dessa forma, identificar os agravantes para esse tipo de problema pode servir como base para o planejamento de pesquisas futuras, além de servir como referência para o direcionamento de políticas de saúde.

32 20 2. OBJETIVOS 2.1 GERAL Identificar fatores de risco para gravidade e mortalidade dos acidentes ofídicos notificados no Amazonas entre 2007 e ESPECÍFICOS Estimar a carga de acidentes ofídicos no Estado do Amazonas; Identificar o perfil epidemiológico dos acidentes ofídicos no Estado do Amazonas; Apresentar a distribuição geográfica por municípios dos acidentes ofídicos no Amazonas; Caracterizar a sazonalidade dos acidentes ofídicos ocorridos no Amazonas entre 2007 e 2012; Estimar a carga de cada tipo de acidente ofídico no Amazonas; Estimar a frequência de gravidade e letalidade dos acidentes ofídicos no Amazonas.

33 21 3. MÉTODOS 3.1 ÁREA DE ESTUDO O Estado do Amazonas está localizado na Amazônia Ocidental Brasileira, compreendendo uma área de ,8 km 2, distribuídos em 62 municípios. A população estimada do estado era de habitantes em 2010, com 74,2% destes vivendo nas zonas urbanas e 25,8% em áreas consideradas rurais. Cerca de 45% da população vive na capital do Estado, Manaus. O Estado possui uma cobertura reduzida de rodovias e estradas, com grande parte do deslocamento intermunicipal sendo feito pelo transporte fluvial. A cobertura vegetal é predominantemente de floresta tropical densa, destacando-se as florestas de terra firme, as planícies aluviais (várzeas) e áreas inundadas (igapós). Florestas de terra firme estão localizadas em regiões de alto relevo, geralmente longe dos grandes rios. Várzeas são típicas de áreas periodicamente inundadas pelas cheias dos rios. Os igapós estão localizados em áreas baixas, próximos aos leitos dos rios, permanecendo inundados durante quase todo o ano. O clima é classificado como do tipo super-úmido equatorial, com chuvas de mais de milímetros por ano, e temperaturas médias anuais em torno de 28 C. A maior parte do PIB do estado é baseada no setor industrial da capital Manaus, que abriga um grande número de empresas nacionais e multinacionais. O Sul do Estado, com forte crescimento da pecuária, agricultura familiar e, mais recentemente, do cultivo mecanizado da soja, tem apresentado maiores áreas de desmatamento. 3.2 ACIDENTES OFÍDICOS Acidentes ofídicos são agravos de notificação obrigatória no Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN), por meio do preenchimento da ficha de notificação de acidentes por animais peçonhentos (ANEXO A). O SINAN é um sistema de vigilância eletrônica nacional que armazena as notificações de uma variedade de doenças em um banco de dados integrado, dentre os agravos estão os acidentes ofídicos [18]. Este estudo foi realizado incluindo todos os casos de acidentes ofídicos

34 22 notificados no SINAN no Estado do Amazonas entre 1º Janeiro de 2007 e 31 de dezembro de EXPOSIÇÕES E DESFECHOS Foi realizada análise descritiva das frequências absolutas e relativas das características dos pacientes acometidos por acidentes ofídicos. As variáveis analisadas foram: sexo, idade (em anos), região anatômica da picada, área de ocorrência (rural ou urbana), acidente relacionado ao trabalho (sim ou não), tempo decorrido entre a picada e de assistência médica (em horas), classificação clínico-epidemiológico do acidente (Bothrops, Lachesis, Crotalus, Micrurus ou serpentes não venenosas), severidade de classificação da picada (leve, moderada ou grave) e desfecho (alta ou óbito). Todas as variáveis foram verificadas quanto à duplicidade e completude por dois pesquisadores independentes antes da análise e investigadas para uma possível associação com a classificação de gravidade e letalidade, como variáveis dependentes. A informação sobre a classificação de gravidade e evolução do caso (alta ou óbito) dos acidentes ofídicos são informações de preenchimento obrigatório no SINAN e é inserida por um profissional de saúde no momento da notificação de um caso. A gravidade clínica dos acidentes ofídicos neste trabalho foi classificada de acordo com a orientação do Ministério da Saúde do Brasil [52]: i) um caso leve é definido como uma picada de serpente com dor local, edema local e hematomas por picadas de Bothrops e Lachesis, por ptoses, ligeira visão turva e mialgias leves ou ausentes para picadas de Crotalus, raramente encontrada na área de estudo [53]; ii) um caso moderada é definido como uma picada de serpente com manifestações locais e manifestações sistêmicas menores. Fenômenos hemorrágicos menores podem ser observados em acidentes por Bothrops e Lachesis, mialgia e urina escura em acidentes por Crotalus; iii) um caso grave é definido como uma picada de cobra com risco de vida, com hemorragia grave, hipotensão/choque e insuficiência renal aguda por acidente com Bothrops e Lachesis. Em picadas graves de Lachesis, sintomas vagais pode estar presente em cerca de 14% dos casos [54]. Picadas graves de Crotalus apresentam mialgia generalizada, urina

35 23 escura, oligúria ou anúria. Recomenda-se considerar todos os casos confirmados de Micrurus, raros no Amazonas, como potencialmente graves, devido ao risco potencial de insuficiência respiratória. Como os pacientes acometidos por acidentes ofídicos devem ser notificados no SINAN antes mesmo do início da soroterapia, com posologia definida de acordo com a classificação clínica de cada caso, a classificação de gravidade de caso do SINAN é provavelmente confiável. No entanto, devido à gravidade potencial de acidentes por Lachesis, esses poucos casos são geralmente considerados clinicamente moderados ou graves. Dessa forma, em áreas onde há sobreposição na distribuição geográfica de Bothrops e Lachesis, como é na Amazônia brasileira, o diagnóstico diferencial é sempre menos preciso. Este é um estudo observacional com uma coorte retrospectiva. A fim de identificar os fatores associados à gravidade do acidente ofídico e sua mortalidade, dentro da coorte, foi aplicado um estudo de caso-controle aninhado em que os pacientes que evoluíram para grave ou morte foram considerados casos e, aqueles que evoluíram para acidentes classificados como leves e moderados, ou tiveram alta, foram incluídos no grupo "controle". 3.4 DISTRIBUIÇÃO ESPACIAL Um mapa foi criado com o software ArcMap 10.1 no ArcGIS 10.1 (ESRI, EUA) utilizando as estimativas da incidência média por município. A taxa de incidência foi calculada dividindo-se os casos de cada município por sua população, considerando a metade do período de estudo [31], para 100 mil habitantes. A interpolação espacial da incidência dos acidentes ofídicos foi mapeada usando dados de 62 municípios pelo método de Inverse Distance Weighting (IDW). Para esta análise, o tamanho da célula de saída foi ajustado para 0,33, utilizando-se um valor de potência de dois, a circumvizinhança de pesquisa foi definida para suavizar o círculo com um raio de 30,15, e um fator de alisamento de 0,2 foi utilizado. Nenhum recurso foi utilizado como barreira.

36 ANÁLISE ESTATÍSTICA Foram analisadas apenas as variáveis que apresentaram integridade superior a 85%. As duplicidades foram resolvidas antes do início da análise de dados. Os dados foram analisados por meio do SPSS versão 21.0 para Windows (SPSS Inc. Chicago, IL, EUA). A incidência anual foi calculada utilizando a média de casos em seis anos e da população em risco na metade do período para o estado do Amazonas, e em cada município, por habitantes. A letalidade correspondeu ao número de mortes decorrente dos acidentes ofídicos, dividido pelo número total de pacientes acidentados. As proporções de casos graves e mortes foram comparadas pelo teste do qui-quadrado (corrigido pelo teste de Fisher "se necessário); as diferenças foram consideradas estatisticamente significativas para p <0,05. O Odds Ratio (OR), com seu respectivo intervalo de confiança de 95% (IC 95%), foi determinado considerando gravidade e morte como variáveis dependentes. A regressão logística foi utilizada para as análises multivariadas e as Odds Ratio ajustadas, com IC 95%, também foram calculados. A regressão logística multivariada foi realizada para gravidade e mortalidade dos acidentes ofídicos, através de uma estimativa backward e forward. Todas as variáveis que foram associados com os resultados a um nível de significância de p <0,20 na análise univariada foram incluídas na análise multivariada. A significância estatística foi considerada se p <0,05 no teste de Hosmer-Lemeshow goodness-of-fit. 3.6 QUESTÕES ÉTICAS Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP), da Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado (número de aprovação 872,520/2014), bem como pelo CEP da Fundação de Vigilância em Saúde do Estado Amazonas. Todos os dados analisados foram anônimos. Como os dados foram obtidos exclusivamente a partir de bases de dados de vigilância, o CEP deu uma renúncia de consentimento informado.

37 25 4. RESULTADOS O artigo intitulado Risk factors for snakebite severity and lethality in the Western Brazilian Amazon: a case-control study (Artigo 1), a ser submetido ao periódico PLOS ONE (Fator de impacto=3.534), como artigo original (Vide Instruções aos Autores no link compõe os resultados principais desta dissertação de mestrado. Resultados complementares desta dissertação estão apresentados no artigo intitulado Snakebites as a largely neglected problem in the Brazilian Amazon: highlights to the epidemiological trends in the State of Amazonas, no prelo da Revista Brasileira de Medicina Tropical (Fator de impacto=0.942), como artigo de revisão (

38 ARTIGO 1 Risk factors for snakebite severity and lethality in the Western Brazilian Amazon: a case-control study Snakebites in the Western Brazilian Amazon Esaú L. Feitosa 1,2, Vanderson S. Sampaio 1,2,3, Jorge L. Salinas 4, Amanda M. Queiroz 1,2, Iran Mendonça da Silva 1,2, André A. Gomes 1,2, Jacqueline Sachett 1,2, André M. Siqueira 5, Maria Cristina dos Santos 6, Marcus Lacerda 1,2,7, Wuelton Monteiro 1,2 * 1 Departamento de Ensino e Pesquisa, Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado, Manaus, Brazil, 2 Escola Superior de Ciências da Saúde, Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, Brazil, 3 Núcleo de Sistemas de Informação, Fundação de Vigilância em Saúde do Amazonas, Manaus, Brazil, 4 Emory University, Atlanta, USA, 5 Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brazil, 6 Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas, Manaus, Brazil, 7 Instituto Leônidas & Maria Deane, Fundação Oswaldo Cruz, Manaus, Brazil * wueltonmm@ibest.com.br

39 27 Abstract Background: The Amazon region reports the highest incidence of snakebite envenomings in Brazil. We aimed to describe snakebite epidemiology in the state of Amazonas and to investigate factors associated with disease severity and lethality. Methodology/Principal Findings: We used a nested case-control study, in order to identify factors associated with snakebite severity and mortality using official Brazilian reporting systems, from 2007 to Patients evolving to severity or death were considered cases and those with non-severe bites were included in the control group. During the study period, 9,191 snakebites were recorded, resulting in an incidence rate of 52.8 cases per 100,000 person/years. Snakebites mostly occurred in males (79.0%) and in rural areas (70.2%). The most affected age group was between 16 and 45 years old (54.6%). Fifty five percent of the snakebites were related to work activities. Age 15 years [OR=1.26 (95% CI= ); (p=0.018)], age 65 years [OR=1.53 (95% CI= ); (p=0.012)], work related bites [OR=1.39 (95% CI= ); (p<0.001)], time to medical assistance >6 hours [OR=1.73 (95% CI= ); (p<0.001)] and Micrurus bites [OR=5.54 (95% CI= ); (p<0.001)] were independently associated with the risk of severity. Age 65 years [OR=3.19 (95% CI= ); (p=0.006)] and time to medical assistance >6 hours [OR=2.01 (95% CI= ); (p=0.013)] were independently associated with the risk of death.

40 28 Conclusions/Significance: Snakebites represent an occupational health problem for rural populations in the Brazilian Amazon with a wide distribution. These results highlight the need for public health strategies aiming to reduce occupational injuries. Most cases of severe disease occurred in the extremes of age, in those with delays in medical attention and those caused by Microrus bites. These features of victims of snakebite demand adequate management according to well-defined protocols, including prompt referral to tertiary centres when necessary, as well as an effective response from surveillance systems and policy makers for these vulnerable groups. Keywords: Snakebites; Ophidism; Epidemiology; Risk factors; Amazon.

41 29 Background Snakebites represent a treatable health problem affecting predominantly tropical low- and middle-income countries [1,2]. The annual number of snakebite cases worldwide is largely unknown and probably underreported with estimates that could reach 5.5 million snakebites annually, with 94,000 estimated deaths [1]. Rural areas in developing countries are the most affected, with varying seasonality usually characterized by peak incidences seen in the rainy and harvesting seasons [3]. The burden of human suffering caused by snakebite has not received the attention it deserves from the public health community, development agencies and governments, and may therefore be appropriately categorized as a neglected tropical disease [1,4]. Most snakebite reporting systems are fragile and underestimate the actual injury burden [5]. Better epidemiological surveillance is necessary to assess the extent of this important public health problem to improve prevention and treatment measures. Most deaths and sequelae from snakebites are preventable by interventions such as making antivenom widely available [6]. In 2013, the Brazilian Ministry of Health reported 27,181 snakebite cases [7]. The highest incidence was observed in the Brazilian Amazon (52.6 cases/100,000 inhabitants) followed by the Midwest (16.4/100,000). These values are expected to be higher in remote areas of the Brazilian Amazon [8] due to considerable underreporting. In this region, adult males living in rural areas [3,9 13] and/or workers exerting farming, hunting and forestry activities [14,15] are the most affected groups, strongly suggesting an occupational risk. A community survey conducted with forest-dwelling Indians and rubber

42 30 tappers (seringueiros) revealed that 13% of the surveyed population had been bitten during their lifetime [14]. Snakebite incidence correlates with the period of higher rainfalls as increased river levels force snakes to seek new shelters closer to human settlements [3,9,11,12], highlighting the vulnerability of Amazonian communities living in riverbank areas. Some studies indicate that snakes of the genus Bothrops account for around 80% of the snakebites in the Brazilian Amazon region [16 18]. Lachesis accidents predominated in case series from Manaus (46.8%) [9] and Cruzeiro do Sul (51.3%) [12]. Bothrops atrox and Lachesis muta share the same popular name surucucu in certain Amazonian areas, bringing a confounding factor in snake identification by the local population [12]. In the Amazon, clinical data from Bothrops atrox bites show pain as the most frequent local manifestation, followed by swelling and warmth on palpation [18,19]. Around 25% of the patients present systemic manifestations, including spontaneous systemic bleeding, ranging from 16-18% [16,18,19] and acute renal failure registered in 10.9% in a case series [19]. A total of 39.0% of patients developed secondary complications, such as cellulitis and abscesses [18]. The clinical picture caused by Lachesis bites is very similar to Bothrops, except for vagal symptoms that may be present especially in severe Lachesis cases [7,8]. In the Brazilian Amazon, relatively few accidents are caused by coral snakes (Micrurus sp.) [20] or rattlesnakes (Crotalus sp.) [21]. Surveillance systems shows an overall case-fatality rate ranging from 0.4 to 3.9% in the Brazilian Amazon [9,11,12,14,15].

43 31 Snakebite clinical severity varies by snake species and patient characteristics, but there are few studies identifying the more vulnerable subgroups developing poor outcomes. In India, patient-related factors such as child age, previous health condition and time elapsed until medical assistance can act as risk factors for severity, sequelae and death [22 26]. In the same country, patients admitted with symptoms of neurotoxicity and vomiting [22,24], coagulopathy and leukocytosis [23], hypertension, albuminuria, changes in bleeding and prothrombin time [25] were more likely to develop severe outcomes. The delay in antivenom administration was also a risk factor for severity in Nigeria [27]. Capillary leak syndrome, bleeding and respiratory paralysis were risk factors for mortality in patients who received snake antivenom in Nigeria and Korea [28,29]. A better knowledge of severity and mortality due to snakebite would lead to improved management, with expected reduction of sequelae and lethality rates in remote localities in the Brazilian Amazon. The aim of this study is to analyze the profile of snakebites reported in the state of Amazonas, in the Western Brazilian Amazon, and to investigate potential risk factors for severity and lethality.

44 32 Methods Study area The State of Amazonas is located in the western Brazilian Amazon, comprising an area of 1,570,946.8 km 2, with 62 counties. The estimated population of the state was 3,807,921 inhabitants in 2010, with 74.2% living in urban zones and 25.8% in rural areas. Approximately 45% of the population lives in the state capital, Manaus. The state has a reduced coverage of highways and roads, with much of the displacement happening via river transportation. The state is densely covered by an evergreen rain forest, standing out the upland forests (terra firme forest), floodplains (várzeas) and flooded areas (igapós). Upland forests are located in the highlands, usually far from large rivers. Lowland forests are typical of areas periodically flooded by river floods. The igapós are located in low areas near the riverbeds, remaining flooded for almost the entire year. Climate is classified as equatorial super-humid, with rainfalls over 2,000 mm per annum and average annual mean temperatures around 28 o C. Most of the state's GDP is based on the industrial sector in the capital Manaus, which hosts a large number of national and multinational companies. In the South of the state, an increase of cattle, family farming and most recently mechanized cultivation of soybeans, has led to deforestation of large areas.

45 33 Data source Snakebites are compulsorily recorded by the Brazilian Notifiable Diseases Surveillance System [Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN)] based on data report forms used in the investigation and follow-up of cases of venomous animals. The SINAN is a national electronic surveillance system that contains a variety of diseases in an integrated database that also includes snakebites [15]. We included all snakebite cases in the state of Amazonas reported to SINAN from January 1, 2007 to December 31, Snakebite treatment is provided free of charge only by the Brazilian Government and is not available for purchase in the private sector. Exposure and outcome definitions Reporting on snakebites severity grading and outcomes (discharge or death) is required by SINAN and is entered by healthcare providers at the time of case notification when the diagnosis is made as this is relates to the dosage of antivenom administered to the patient. Clinical severity of snakebites in this work was classified according the Brazilian Health Ministry guideline [17]: i) mild case local pain, local swelling and bruising for Bothrops and Lachesis bites or ptosis, slight blurred vision and mild or absent myalgia for Crotalus bites (rarely found in the study area) [21]; ii) a moderate case: local manifestations and minor systemic symptoms. Minor bleeding phenomena may be observed in Bothrops and Lachesis bites and myalgia and dark urine in Crotalus bites; iii) severe case: A life-threatening snakebite, with severe bleeding, hypotension/shock

46 34 and/or acute renal failure for Bothrops and Lachesis bites. In severe Lachesis bites, vagal symptoms may be present in about 14% of cases [30]. Severe Crotalus are those presenting with generalized myalgia, dark urine, oliguria or anuria. It is recommended to consider all confirmed Micrurus cases, although scarcely seen in the Amazonas, as potentially severe due to the risk of respiratory failure. For more details concerning the severity grading and treatment fof snakebites used in Brazil see Supplementary File 1. We performed descriptive analysis of the absolute and relative frequencies of the characteristics of the patients presenting with snakebites to ensure distributional assumptions for statistical tests were met. The variables analyzed were sex, age (in years), anatomical region of the bite, area of occurrence (rural or urban), work-related injury (yes or no), time elapsed between the bite and the medical assistance (in hours), perpetrating species (Bothrops, Lachesis, Crotalus, Micrurus or non-venomous snakes), severity grading (mild, moderate or severe) and outcome (discharge or death). All variables were checked for duplicity and completeness by two independent researchers before analysis and further investigated for a possible association with severity and lethality as dependent variables. Because snakebite diagnosis and treatment are free of charge in Brazil and because patients must be notified to SINAN before specific antivenom treatment is started, reporting of severity classification to SINAN is reliable. Due to the potential severity of Lachesis confirmed bites, these few cases are generally considered clinically moderate or severe. However, in areas where there is overlap in the geographical distribution of

47 35 Bothrops and Lachesis, such as in the Brazilian Amazon, the differential routine diagnosis when the snake has not been captured can be misleading and be associated with misclassification of the causing species. In order to identify factors associated with snakebite severity and mortality, a nested case control study within the cohort was used wherein patients evolving to severity or death, comprising two groups of cases and those mild and moderate bites were included in the control group. Spatial distribution A map was created with the software ArcMap 10.1 in ArcGIS 10.1 (ESRI, USA) using estimates of the mean incidence by municipality. The incidence rate was calculated by dividing cases by the population of each municipality [31] by 100 thousand inhabitants. Spatial interpolation of snakebites incidence was mapped using data from 62 municipalities by the Inverse Distance Weighting (IDW) method. For this analysis, the output cell size was set to 0.33, a power value of 2 was used, the search neighborhood was set to smooth circular with a radius and a smoothing factor of 0.2 was used. No features were used as barriers.

48 36 Statistical analysis Only variables presenting completeness higher than 85% were analyzed. Duplicity was solved before data analysis. Data were analyzed using SPSS version 21.0 for Windows (SPSS Inc. Chicago, IL, USA). The annual incidence was calculated using the average of cases in six years and the population at risk in the middle of the period for the state of Amazonas and in each municipality, for 100,000 inhabitants. Lethality was the number of deaths due to snakebites divided by the total number of cases of biting events in that same period. Proportions of severe cases and deaths were compared by Chi-square test (corrected by Fisher' test if necessary); differences were considered statistically significant for p<0.05. The crude Odds Ratio (OR) with its respective 95% Confidence Interval (95% CI) was determined considering the severity and deaths as the dependent variables. Logistic regression was used for the multivariable analyses and the adjusted Odds Ratios with 95% CI were also calculated. A multivariable logistic regression was performed using both severity and lethality as outcomes, using an automated backward and forward stepwise estimation. All variables associated with the outcomes at a significance level of p<0.20 in the univariable analysis were included in the multivariable analysis. Statistical significance was considered if p<0.05 in the Hosmer-Lemeshow goodness-of-fit test.

49 37 Ethical clearance This study was approved by the Ethics Review Board (ERB) of the Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (approval number /2014), as well as by the ERB of the Health Suveillance Foundation of the Amazonas State. All data analyzed were anonymized. Since data were obtained exclusively from surveillance databases, the ERB gave a waiver of informed consent. Results Characteristics of the study population According to the official reporting systems, 9,191 snakebites were recorded in the Amazonas State from 2007 to 2012, resulting in an incidence rate of 52.8 cases per 100,000 person/year. There was a slight variation in the annual incidence rates during the study period. Incidence was higher in 2009 (58.5 per 100,000 inhabitants) and 2012 (53.7 per 100,000) and lower in 2011 (49.5 per 100,000) (Figure 1). All the variables retrieved from the original dataset presented completeness higher than 85% (Table 1). Snakebites mostly occurred in males (7,257 cases; 79.0%). Regarding the area of occurrence, 70.2% were reported from rural areas. The most affected age group was between 16 and 45 years old (5,019 cases; 54.6%). A proportion of 55.0% of the snakebites were related to work activities. Regarding time elapsed from the bite until medical assistance, 68.4% of the cases received treatment within the first six hours after the snakebite, 13.7% within 6-

50 38 12 hours and 17.9% with more than 12 hours after bite. Snakebites occurred mostly in the feet (58.8%) and legs (27.4%). Snakebites were mostly caused by Bothrops (73.9%; 35.5 cases per 100,000 person/year) and Lachesis (23.9%; 11.5 cases per 100,000 person/year). Crotalus and Micrurus snakes were responsible for 0.5% (0.2 cases per 100,000 person/year) and 0.4% (0.2 cases per 100,000 person/year) of the bites, respectively. Non-venomous snakebites were recorded in 1.3%. Cases were mostly mild (46.1%), followed by moderate (45.8%) and severe (8.1%). There were 55 deaths due to snakebites in the study period, resulting in a 0.6% lethality rate. Lethality rate was 0.7% for Bothrops snakebites and 0.6% for Lachesis snakebites. There were no records of deaths due to Crotalus and Micrurus snakebites in the study period. According to age groups, lethality rate was 0.5% for the 15 years group, 0.5% for the 15 to 60 years group and 2.0% for the 60 years group. Time elapsed from bite to antivenom administration at a health facility was 6.2 (SD±7.2) hours for mild cases, 7 (SD±7.1) hours for moderate cases, 9 (SD±8.1) hours for severe cases and 15.5 hours (SD±10.2) for cases evolving to death (Figure 2).

51 39 Spatial distribution Incidence rates were unevenly distributed across the Amazonas State, although there were snakebites cases reported from all the 62 municipalities. Mapping showed a large area with high incidence rates extending from the Northeast to the Central region of the state, including three hotspots located in São Gabriel da Cachoeira (in the Colombian border), in the Uarini/Alvarães municipalities area and in Novo Airão, where incidence rates were higher than 150 cases per 100,000 inhabitants/year. Smaller areas with high snakebite incidences were located in Rio Preto da Eva, in the vicinity of the capital city, and in Borba, in the upper Southeast region of the state (Figure 3). Incidence rates by municipality are presented in Supplementary File 2. Risk factors for severity and mortality From the 9,191 snakebite cases reported in the Amazonas State in the study period, we excluded102 cases of non-venomous snakebites and 422 cases without severity classification. We used the remaining 8,667 eligible cases to evaluate risk factors for severity and mortality. A total of 708 severe cases and 52 deaths were included as cases and 7,959 snakebites were included as controls (Figure 4). Table 2 summarizes the results of the univariable and multivariable logistic regression models evaluating factors associated with snakebite severity. Age 15 years [OR=1.26 (95% CI= ); (p=0.018)], age 65 years [OR=1.53 (95% CI= );

52 40 (p=0.012)], bites related to work activities [OR=1.39 (95% CI= ); (p<0.001)], time until medical assistance >6 hours [OR=1.73 (95% CI= ); (p<0.001)] and Micrurus bites [OR=5.54 (95% CI= ); (p<0.001)] were independently associated with the risk of developing a severe illness after snakebites. Table 3 compares patients evolving to death versus patients. Age 65 years [OR=3.19 (95% CI= ); (p=0.006)] and time to medical assistance >6 hours [OR=2.01 (95% CI= ); (p=0.013)] were independently associated with risk of death. Discussion Few previous attempts have been made to quantify the burden from envenoming resulting from snakebites in the Brazilian Amazon. Assessing disease burden through population and hospital-based field studies in remote areas is essential for prevention programs. Our study confirms previous hospital based reports of a wide geographical distribution of snakebites in the state of Amazonas [9]. We provide a more accurate, upto-date estimate of the scale of the problem in the Brazilian Amazon by using official surveillance data to estimate the disease burden due to snakebites and to identify independent risk factors for severity and mortality. The mean incidence rate in the study area was 52.8 cases per 100,000 person/year, reaching more than 150 cases per 100,000 person/year in several municipalities, estimates comparable to projections for sub-saharan Africa and Oceania [1]. In the

53 41 Brazilian Amazon, reaching health centers is difficult for riverine and indigenous populations as a result of distance and underdevelopment of means of transportation. If we account for a possible underreporting to official surveillance systems [32], the actual incidence of snakebites in this region could be among the highest in the world. We observed a large area with high incidence rates extending from the Northeast to the Central region of the state, where incidence rates were above 150 cases per 100,000 inhabitants/year. This area coincides with municipalities where Amerindian populations predominate, highlighting the vulnerability of this groups and the need for attention from policy-makers responsible for health services in those areas. A previous study found and association between snakebite incidente and deforestation [33]. Indeed, the hotspots identified in Novo Airão and Rio Preto da Eva, both in the Manaus region, and in Borba, correspond to areas with intense deforestation, and likely reflect the emergence of economical activities in this municipalities, namely farming and cattle raising. Snakebites mostly occurred in males, ages between 16 and 45 years, living in rural areas and mostly related to work activities. This profile has been reported in other regions in Brazil [13,16,34,35] and other countries [36,37] and reaffirms the strong relationship between snakebites and rural economical activities in poor regions [38]. This group, in general, has no social benefits in case of absence from work, thus negatively affecting family economies in the area. Currently, there are no interventions for primary prevention of snakebites as an occupational hazards or to speed access to health services, making snakebite envenoming a major neglected occupational problem in developing settings.

54 42 Our study is unique in the long time elapsed from bite to healthcare [6,10]. More than 30% of patients took more than six hours to receive medical assistance and such delay was an independent risk factor for severity and mortality. A delay to medical care was also identified as a risk factor for poor outcomes in India [23,39], Nepal [36,40] and Nigeria [27,28]. Patients from Amazonian communities depend mainly on river transportation to reach hospitals in urban seats, causing a delay in treatment. Moreover, many victims seek medical care after a considerable delay or fail to reach a hospital in time as a result of first seeking treatment from traditional healers [9]. The lethality rate of 0.6% observed in this work is higher than some previous national reports [7,35]. We hypothesize that implementing a rapid transport system for snakebite patients would significantly reduced lethality rates as has been reported in other settings [41]. Interestingly, occupational accidents were more likely to develop into severe disease. This relationship between severity and occupational exposure was also observed in India, where rural workers bitten by snakes were more prone to death [37]. We can not precisely establish a direct association between snakebite severity and the occupational exposure, but the distance to be walked from the workplace in farming areas to medical care could explain this risk association. In India, patients who walked more than 1 km after the snakebite, had delayes in care and a higher risk of death [22]. Reassurance and immobilization of the affected limb with prompt transfer to a medical facility are the cornerstones of the immediate care of snakebites [29,42].

55 43 In this work, being less than 15 years old was also an independent risk factor for severity. This risk factor was also observed in India [22]. In Turkey, snakebites were considered particularly important conditions of medical emergencies in children with high morbidity and mortality [43]. Half of deaths from snakebites in California affected children under 5 years of age [44]. Snakebite is a widespread and under-reported global injury problem in which children and young people are disproportionately represented and suffer more severe effects than adults, among other factors, as a result of smaller body volumes [2]. Age 65 years was a risk factor for severity and mortality. This is relevant as literature reporting elderly as being at a higher risk is scarce. In Bothrops and Crotalus snakebites reported in São Paulo, Brazil; patients 50 years-old had a higher mortality when compared to younger patients [45]. Taking into account that most snakebite complications, especially by Bothrops, are due to acute renal failure [46 50], the greater severity associated with the elderly may be related to higher prevalences of chronic comorbidities (i.e. hypertension and diabetes) that can lead to a predisposition to evolve to necrosis and acute kidney injury after a bite [51,52]. One especulates that comorbidities leading to vascular disease, such as hypertension and diabetes, commonly found in the elderly, may precipitate life-threatening complications after snakebite envenomings. In a case series from Brazil, eight of 309 patients (2.6%) developed a cerebrovascular events after Bothrops envenoming; five of the eight patients died despite therapy, and the remaining three had irreversible sequelae [53]. Cases of stroke related to Bothops envenomings have been reported in Brazil in the elderly, including in the Amazon region [54,55]. Population aging will likely affect snakebite epidemiology and its

56 44 public health impact thus requiring preparation by local health services with a wider distribution of antivenom and life-sustaining supportive therapies besides health care workers training in the management of envenoming in this neglected age group. Our study is probably limited by a lack of standardization in data collection in different regions of the state, which likely affects the recorded data. Record keeping may also have been influenced by the nature of the surveillance system. Some patients with mild bites in inaccessible areas may not report to hospitals and those evolving to severity may die on the way before reaching medical attention. Linkage with official mortality datasets should help to solve the last situation. In Brazil, antivenoms are prescribed exclusively by physicians in hospital settings. However, only a few patients bring the snakes for identification to the health unit, therefore the clinical-epidemiological classification is subject to misclassification, based on clinical discrition. Since misclassification may lead to mistaken choice of the antivenom to be administered to the patient, a bias may be introduced to this study. For instance, in the absence of the Lachesis or Bothrops- Lachesis antivenoms or in case of snake misclassification, health services could use Bothrops antivenom in the treatment of laquetic accident. However, in this region it was shown that Bothrops antivenom was ineffective on the neutralization of the coagulant activity for the L. muta venom in humans, contributing to severity [56]. In spite of these limitations, the broad population coverage and the low cost associated with data collection allows to obtain a valuable baseline information to the public health system. Furthermore, the completeness of the variables analyzed in this study suggests that the SINAN snakebite dataset was a good source for research. We highlight that estimates of

57 45 independent risk factors for complications should be confirmed by means of prospective multicenter studies. In conclusion: i) incidence of snakebites in the Western Brazilian Amazon is among the highest in the world; ii) snakebites show a wide distribution in this region; iii) snakebites represent an occupational health problem for rural populations and public heath measures are needed to prevent occupational snakebites; iv) age 15 years, age 65 years, work related bites and delays to medical care >6 hours were independently associated with the risk of developing severity; v) age 65 years and time to medical assistance >6 hours were independently associated with mortality. These features highlight the need for public health interventions aiming to decrease times to medical attention in vulnerable groups. In the Amazon, a major concern relates to the failure in antivenom distribution and storage. The lack of an adequate cold chain impairs antivenom distribution to rural areas and may result in loss of material. Moreover, there is a lack of systematic professional training on diagnosis, specific therapy and clinical management of complications [32]. Improvements in antivenom distribution and time to medical attention could have a significant impact in patient outcomes.

58 46 Acknowledgements We thank Dr. Bernardino Albuquerque, director of the Fundação de Vigilância em Saúde do Estado do Amazonas (FVS-AM), for granting access to data for this research.

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64 52 Table 1. Characteristics of 9,191 snakebite cases reported in the State of Amazonas, from 2007 to Characteristics (n; completeness) Number % Sex (n=9,191; 100%) Male 7, Female 1, Area of occurrence (n=9,010; 98.0%) Rural 6, Urban 2, Age group in years (n=9,191; 100%) , , , > Work-related accident (n=8,200; 89.2%) Yes 4, No 3, Time to medical assistance (hrs) (n=8,612; 93.7%) 0-6 5, , >12 1, Anatomical site (n=9,122; 99.2%) Feet 5, Legs 2, Trunk Upper limbs 1, Head

65 53 Species (n=8,366; 91.0%) Bothrops 6, Lachesis 1, Crotalus Micrurus Non-venomous snakebites Clinical severity (n=8,769; 95.4%) Mild 4, Moderate 4, Severe Outcome (n=9,182; 99.9%) Discharged 9, Death Death from other causes 3 <0.1

66 54 Table 2. Factors associated with snakebite severity in the State of Amazonas, 2007 to Cases Controls Crude OR (IC Adjusted OR (IC Variables (n) % (n) % 95%) p 95%) p Sex Male , ( ) Female , Age (years) , ( ) ( ) > , ( ) ( ) < , Anatomical site Lower limbs , ( ) Other sites , Area of occurrence Rural , ( ) ( ) Urban , Work-related injury Yes , ( ) < ( ) <0.001 No , Time to medical assistance (hours) , ( ) < ( ) <0.001 > ,

67 55 Snakebite type Bothrops , Lachesis , ( ) ( ) Crotalus ( ) ( ) Micrurus ( ) < ( ) <0.001 Table 3. Factors associated with snakebites mortality in the State of Amazonas, 2007 to Cases Controls Crude OR (IC Adjusted OR (IC Variables (n) % (n) % 95%) p 95%) p Sex Male , ( ) Female , Age (years) , ( ) ( ) > , ( ) ( ) < , Anatomical site Lower limbs , ( ) Other sites , Area of occurrence Rural , ( )

68 56 Urban ,675 31,1 Work-related injury Yes , ( ) No , Time to medical assistance (hrs) , ( ) ( ) > , Snakebite type Bothops , Lachesis , ( ) 0.86

69 57 Figure Legends Figure 1. Annual incidence of snakebite envenomings in the state of Amazonas, from 2007 to Incidence is expressed as the number of cases per 100,000 inhabitants. Incidence was slightly higher in 2009 (58.5 per 100,000 inhabitants) and 2012 (53.7 per 100,000) and lower in 2011 (49.5 per 100,000). Figure 2. Time elapsed from bite to medical attention at a health facility according to severity grading. Average time directly associated to severity grading, with a longer time observed for cases evolving to death. Figure 3. Spatial distribution of snakebites in the State of Amazonas, from 2007 to A wide area with high incidence rates extends from the Northeast to the Central region of the state, where incidence rates are ~150 cases per 100,000 inhabitants/year. Figure 4. Flow chart of cases and control selection. The selection of cases and controls was based on the Brazilian Ministry of Health classification. All severe bites were included as cases, and three mild and moderate bites were in the control group for each case.

70 58 Figure 1. Annual incidence of snakebite envenomings on Amazonas, from 2007 to Incidence was expressed as the number of cases per 100,000 inhabitants. Incidence was slightly higher in 2009 (58.5 per 100,000 inhabitants) and 2012 (53.7 per 100,000) and lower in 2011 (49.5 per 100,000).

71 59 Figure 2. Time elapsed from the bite until antivenom administration at a health facility according to severity grading. Average time directly associated to severity grading, with a longer time observed for cases evolving to death.

72 60 Figure 3. Spatial distribution of snakebites in the State of Amazonas, from 2007 to A large area with high incidence rates extends from the Northeast to the Central region of the state, where incidence rates higher than 150 cases per 100,000 inhabitants/year.

73 61 Figure 4. Flow chart of cases and control selection. The selection of cases and controls groups was based on the Brazilian Ministry of Health classification. All severe stings were included as cases, and three mild and moderate stings were in the control group for each case.

74 62 Supplementary Box 1. Clinical grading of snakebite according to the Brazilian Ministry of Health [1,2]. Type of Antivenom Clinical grading Number of snakebite antivenom ampoules to be administered Bothrops SAB b, Mild: pain, local swelling and 2-4 SABL c or bruising SABC d Moderate: pain, evident swelling 4-8 and bruising, minor systemic bleeding phenomena Severe: intense local changes, 12 severe bleeding, hypotension/shock, acute renal failure, anuria Lachesis a SABL Moderate: pain, swelling, blistering; 10 there may be bleeding without vagal manifestations Severe: pain, swelling, blistering, 20 bleeding, abdominal cramps, diarrhea, bradycardia, hypotension Crotalus SAC e or Mild: ptosis, slight blurred vision of 5 SABC late onset, without changing the color of urine, mild or absent myalgia Moderate: ptosis, slight blurred 10 vision of early onset, discrete myalgia, dark urine Severe: ptosis, obvious and intense 20 blurred vision, intense and generalized myalgia, dark urine, oliguria or anuria Micrurus SAEla f It is recommended to consider all 10 cases as potentially severe due to the risk of respiratory failure a Due to the potential severity of Lachesis bites, they are considered clinically moderate or severe, and there are no mild cases. Diagnosis is mainly clinical and epidemiological, with no routine laboratory test to confirm the type of circulating venom. For areas where there is overlap in the geographical distribution of snakes Bothrops and Lachesis, such as in the Brazilian Amazon, the differential diagnosis is possible only with the

75 63 identification of the animal or, in the case of Lachesis bites, the possibility of development of vagal manifestations [1,2]; b SAB=anti-Bothrops serum; c SABL=anti- Bothrops plus anti-lachesis serum; d SABC=anti-Bothrops plus anti-crotalus serum; e SAC= anti-crotalus serum; f SAEla= anti-elapidic serum (for Micrurus bites). 1. Brazilian Ministry of Health (2001). Manual de diagnóstico e tratamento de acidentes por animais peçonhentos. Brasília: Brazilian Ministry of Health. 120 p. 2. Brazilian Ministry of Health (2009) Caderno 14-Acidentes por Animais Peçonhentos. Guia de vigilância epidemiológica. Brasília: Brazilian Ministry of Health. p 23.

76 64 Supplementary Information 1 Supplementary Table. Annual mean incidence by municipality in the State of Amazonas, Municipality Cases Cases/year Population Incidence per year estimated in /100,000 inhabitants 2010 Alvarães , Amaturá , Anamã , Anori , Apuí , Atalaia do Norte , Autazes , Barcelos , Barreirinha , Benjamin Constant , Beruri , Boa Vista do Ramos , Boca do Acre , Borba , Caapiranga , Canutama , Carauari , Careiro , Careiro da Várzea , Coari , Codajás , Eirunepé , Envira , Fonte Boa , Guajará , Humaitá , Ipixuna , Iranduba , Itacoatiara , Itamarati , Itapiranga , Japurá ,

77 Juruá , Jutaí , Lábrea , Manacapuru , Manaquiri , Manaus ,802, Manicoré , Maraã , Maués , Nhamundá , Nova Olinda do Norte , Novo Airão , Novo Aripuanã , Parintins , Pauini , Presidente Figueiredo , Rio Preto da Eva , Santa Isabel do Rio Negro , Santo Antônio do Içá , São Gabriel da Cachoeira , São Paulo de Olivença , São Sebastião do Uatumã , Silves , Tabatinga , Tapauá , Tefé , Tonantins , Uarini , Urucará , Urucurituba , Total 9,174 1, ,483, Cases occurred outside 17 the Amazonas State but notified in this state 65

78 66 STROBE Statement Checklist of items that should be included in reports of casecontrol studies Manuscript: Risk factors for snakebite severity and lethality in the Western Brazilian Amazon: a case-control study Item Manuscript No Recommendation Section Title and abstract 1 (a) Indicate the study s design with a commonly used term in Title (Page the title or the abstract 1) and Abstract (Pages 2) (b) Provide in the abstract an informative and balanced Abstract summary of what was done and what was found (Pages 2 and 3) Introduction Background/rationale 2 Explain the scientific background and rationale for the Pages 4 to investigation being reported 5 Objectives 3 State specific objectives, including any prespecified Page 5 hypotheses Methods Study design 4 Present key elements of study design early in the paper Page 10 Setting 5 Describe the setting, locations, and relevant dates, including Page 7 periods of recruitment, exposure, follow-up, and data collection Participants 6 (a) Give the eligibility criteria, and the sources and methods of Pages 8 to case ascertainment and control selection. Give the rationale for 10 the choice of cases and controls (b) For matched studies, give matching criteria and the NA number of controls per case Variables 7 Clearly define all outcomes, exposures, predictors, potential Page 8 confounders, and effect modifiers. Give diagnostic criteria, if applicable Data sources/ 8* For each variable of interest, give sources of data and details Page 8 measurement of methods of assessment (measurement). Describe comparability of assessment methods if there is more than one group Bias 9 Describe any efforts to address potential sources of bias Page 8 Study size 10 Explain how the study size was arrived at Page 8 Quantitative variables 11 Explain how quantitative variables were handled in the Page 8 analyses. If applicable, describe which groupings were chosen and why Statistical methods 12 (a) Describe all statistical methods, including those used to Page 11 control for confounding (b) Describe any methods used to examine subgroups and Page 11 interactions (c) Explain how missing data were addressed Page 11 (d) If applicable, explain how matching of cases and controls was addressed (e) Describe any sensitivity analyses NA NA

79 67 Results Participants 13* (a) Report numbers of individuals at each stage of study eg Pages 12 numbers potentially eligible, examined for eligibility, and 13 confirmed eligible, included in the study, completing followup, and analysed (b) Give reasons for non-participation at each stage Pages 12 and 13 (c) Consider use of a flow diagram Figure 4 Descriptive data 14* (a) Give characteristics of study participants (eg demographic, Pages 12 clinical, social) and information on exposures and potential and 13 confounders (b) Indicate number of participants with missing data for each Figure 4, variable of interest Pages 12 and 13 Outcome data 15* Report numbers in each exposure category, or summary Figure 4, measures of exposure Pages 12 and 13 Main results 16 (a) Give unadjusted estimates and, if applicable, confounder- Table 2, adjusted estimates and their precision (eg, 95% confidence Pages 14 interval). Make clear which confounders were adjusted for and and 15 why they were included (b) Report category boundaries when continuous variables NA were categorized (c) If relevant, consider translating estimates of relative risk NA into absolute risk for a meaningful time period

80 68 Other analyses 17 Report other analyses done eg analyses of subgroups and Page 9 interactions, and sensitivity analyses Discussion Key results 18 Summarise key results with reference to study objectives Abstract, Page 16 Limitations 19 Discuss limitations of the study, taking into account sources of Pages 15 potential bias or imprecision. Discuss both direction and magnitude of and 16 any potential bias Interpretation 20 Give a cautious overall interpretation of results considering objectives, Page 16 limitations, multiplicity of analyses, results from similar studies, and other relevant evidence Generalisability 21 Discuss the generalisability (external validity) of the study results Page 13 Other information Funding 22 Give the source of funding and the role of the funders for the present In study and, if applicable, for the original study on which the present submission article is based *Give information separately for cases and controls. Note: An Explanation and Elaboration article discusses each checklist item and gives methodological background and published examples of transparent reporting. The STROBE checklist is best used in conjunction with this article (freely available on the Web sites of PLoS Medicine at Annals of Internal Medicine at and Epidemiology at Information on the STROBE Initiative is available at

81 ARTIGO 2 ARTIGO Snakebites as a largely neglected problem in the Brazilian Amazon: highlights to the epidemiological trends in the State of Amazonas Esaú Samuel Feitosa I ; Vanderson Sampaio II ; Jaqueline Sachett I ; Daniel Barros de Castro II ; Maria das Dores Nogueira Noronha III ; Jorge Luis López Lozano III ; Emiro Muniz III ; Luiz Carlos de Lima Ferreira I,III, Marcus Vinícius Guimarães de Lacerda I,III ; Wuelton Marcelo Monteiro I,III I Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical, Escola de Ciências da Saúde, Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, AM II Fundação de Vigilância em Saúde, Manaus, AM III Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado, Manaus, AM Address to: Prof. Wuelton Marcelo Monteiro. Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourador. Avenida Pedro Teixeira 25, Bairro Dom Pedro, Manaus, AM, Brasil. Phone: wueltonmm@ibest.com.br

82 70 ABSTRACT Envenoming snakebites are thought to be a particularly important threat to public health worldwide, especially in rural areas of tropical and subtropical countries. The true magnitude of the public-health threat posed by snakebites is unknown, which makes it hard for public-health officials to optimize the prevention and treatment of snakebites. The objective of this work is to conduct a systematic review of the literature to gather data on snakebites epidemiology in the Amazon region and describe a case series of snakebites from the epidemiological surveillance in the state of Amazonas ( ). Only 11 articles regarding snakebites were found. In the State of Amazonas, information on accidents with snakes is scarce. Historical trends show an increasing number of cases after the second half of 1980s. The most affected group was the aged years old (38%), of the male gender (78.94%). Most of the envenomings occurred in rural areas (85.58%). The predominant snake envenomation type was the bothropic. The incidence reported by the epidemiological surveillance in the state of Amazonas (reaching more than 200 cases/100,000 inhabitants in some areas) puts this area as one of the regions with the highest annual incidence of snakebites in the world. A concentration of cases was seen in the rainy season. A case-fatality of 0.6% was observed. Snakebites envenoming poses a great disease burden in the State of Amazonas, representing a challenge for future investigations, including approaches to determine sub-estimation of incidence and case-fatality rates as well as factors related to severity and disabilities. Keywords: Snakebite. Epidemiology. Epidemiological surveillance. Neglected disease. Amazon.

83 71 EPIDEMIOLOGIC CONTEXT OF SNAKEBITES WORLDWIDE AND IN BRAZIL A snakebite is an injury caused by a bite from a snake, often resulting in puncture wounds inflicted by the animal's fangs and sometimes resulting in envenomation. Although snakebites occur throughout the world, envenoming snakebites are thought to pose a particularly important yet largely neglected threat to public health in rural areas of tropical and subtropical countries. The true magnitude of the public-health threat posed by snakebites in these countries is unknown, which makes it hard for publichealth officials to optimize the prevention and treatment of snakebites 1-4. Globally, at least 421,000 envenomings and 20,000 deaths occur each year due to snakebites. These figures may be as high as 1,841,000 envenomings and 94,000 deaths. Based on the fact that envenoming occurs in about one in every four snakebites, between 1.2 million and 5.5 million snakebites could occur annually 4. In Brazil, envenomations became notifiable in 1986, but were removed from the national list in 1993, returning only in This importance is given by the high number of reported cases in the Brazilian Information System of Notifiable Diseases (SINAN). Underreporting of these accidents probably is serious problem, which were previously reported mostly from specialized poisoning control centers. The objectives of epidemiological surveillance of snakebites are to reduce the incidence of this type of accident by promoting health education and reduce the severity, frequency of sequelae and lethality through the appropriate use of serum therapy 5. In Brazil, SINAN reported a considerable increase in the number of notified snakebites since In 2008, 26,156 accidents were recorded in the country, corresponding to an incidence of 13.8 cases per 100,000 inhabitants. However, there is a significant variation by region, with the highest incidence in the North Region 5. Outcome of snakebites depends on numerous factors, including the snake species, bitten area of the body, amount of venom injected and health conditions of the person.

84 72 Most snakebites, whether by a venomous snake or not, will have some type of local effect. Bites may be extremely painful, with the local tissue sometimes becoming severely swollen within five minutes. This area may also bleed and blister and can eventually lead to tissue necrosis. Other common initial symptoms include lethargy, bleeding, weakness, nausea, and vomiting. Depending of the snake genus, symptoms may become more life-threatening over time, developing into hypotension, tachypnea, severe tachycardia, severe internal bleeding, altered sensorium, kidney failure, and respiratory failure 5,6. In Brazil, envenoming snakes are represented by the genera Bothrops (known as jararaca, jararacuçu, urutu, caiçaca, comboia), Crotalus (cascavel), Lachesis (surucucu-pico-de-jaca) and Micrurus (true coral) 5. Bites from non-venomous snakes can also cause injury, often due to lacerations caused by the snake's teeth or from a resulting infection 5,6. SNAKEBITES EPIDEMIOLOGY IN THE BRAZILIAN AMAZON: A SYSTEMATIC REVIEW A systematic review was conducted to find relevant information on the snakebite epidemiology in the Brazilian Amazon, using the concept of Legal Amazon that comprises the states of the North Region, Mato Grosso and Maranhão. The sources for published data on snakebites in the Brazilian Amazon were MEDLINE (1948 to March 2013) and LILACS (1982 to March 2013). The following search strategy was devised for both databases: (Snakebite OR Snake bite OR Ophidism OR Ophidia).mp AND (Amapá OR Amazonas OR Acre OR Rondonia OR Roraima OR Tocantins OR Pará OR Maranhão OR Mato Grosso).mp. Studies were also searched in the journal Acta Amazonica (published by the Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus, State of Amazonas), from 1971 to 2013 (April-June issue), directly in the journal site ( This is the most traditional scientific journal published by an Amazonian institution. All types of study designs with primary data were included. The abstracts were analyzed in details by two independent reviewers and publications were selected if they mentioned any type of epidemiological

85 73 information in at least one patient with the diagnosis of snakebite. Disagreement between the two reviewers was solved through consensus. For the included studies, there was extracted data on date of publication, study design, origin of data (epidemiological surveillance or medical records), number of patients, seasonality, snake species/type of accident, anatomical region affected, time until the medical care, characteristics of participants (gender, age range, occupation, rural/urban residence) and case-fatality. Studies were excluded if they did not have snakebites as the target condition and if they focused uniquely on biochemical and pharmacological venom assays, snake biology, physiology and ecology and on results obtained outside Amazon. Results from intervention studies were also excluded. Potentially relevant papers in all languages were accessed in order to review the full text. The references and reviews cited by each relevant paper were scrutinized in order to locate additional papers. Through abstract analysis, 73 articles were retrieved and after application of the inclusion and exclusion criteria, 11 articles 7-17 were selected (Figure 1). These studies were published from1996 to 2012, including six case series (five based on epidemiological surveillance and one on hospital medical records), two questionnairebased community surveys and three case reports. Case series studies were carried out in the states of Acre (one from Cruzeiro do Sul with 195 cases 17 and one from Rio Branco with 140 cases 11 ), Amapá (909 cases throughout the state) 12, Amazonas (1,576 cases from 34 municipalities) 9, Mato Grosso (307 cases from Cuiabá) 8 and Roraima (309 cases from eight municipalities) 10. Community surveys were conducted with forest-dwelling Indians and rubber tappers (seringueiros) in the Juruá Valley, state of Acre 7, and with inhabitants of 10 riverine communities in the municipality of Beruri, Amazonas. Cases reports were all from the state of Pará 13,15,16. Six studies presented data by sex and have shown that snakebites predominated in men, with rates ranging from 75.6% 10 to 82.1% 14. Although age group classification was not the same, in all the studies presenting this information snakebites occurred mostly

86 74 in adults 8-10,17, strongly suggesting an occupational risk. Actually, people living in rural areas 8,9,11,12,17 and/or workers exerting farming, hunting and forestry activities 7,14 were the most affected. In the state of Amazonas, seasonality was tested in 13 municipalities and cases occurred mostly in March, July and April 9. In Roraima, incidence of snakebites was higher from March to July 10. In Cruzeiro do Sul snakebite cases occurred more often from November to April, correlating with the period of higher rainfalls 17. Bothropic accidents were the most commonly recorded in Acre (75.7% in Rio Branco), Amapá (67.5%), Amazonas (48.6%), Mato Grosso (99%) and Roraima (81.8%). Lachetic accidents predominated in the case series from Cruzeiro do Sul (Acre) (51.3%), followed by bothropic snakebites (Bothrops and Bothriopsis) (38%). However, these authors highlight a possible confounding in the identification of the snake by the population living in the study area 17. Accidents caused by non-venomous snakes were mostly recorded in Mato Grosso (56%). All the studies have shown that lower limbs were the most affected anatomical region. The time elapsed from the bite to attending the patient was mostly higher than 6 hours 9,12. Case-fatality was 0.5% in Cruzeiro do Sul 17, 1.0% in the State of Amazonas 9, 400 deaths/100,000 per lifetime in the Juruá Valley 7, 3.6% per lifetime in the riverine population of Beruri 14 and 3.9% in Roraima 10. Three case reports from the state of Pará were included. The first reported case of an accident with Bothriopsis taeniata in Brazil is described in a 43-year-old man presenting local edema with hemorrhage at the bite site and pain, although without coagulopathy 13. The second publication reports a case of hemorrhagic stroke due to bothropic envenomation associated with severe hypertension 15. Two cases of proven coral snake bites were reported in Belém. The first was a severe acute respiratory failure case caused by Micrurus surinamensis. The second case showed just mild signs of envenomation caused by Micrurus filiformis. Both patients received specific Micrurus antivenom and were discharged without further complications 16.

87 75 THE DISEASE IN THE STATE OF AMAZONAS: HISTORICAL PERSPECTIVE The earliest systematic records of snakebites in the state of Amazonas gave up only in 1970, after the establishment of the IMTM (Instituto de Medicina Tropical de Manaus) by the doctors Heitor Dourado and Carlos Borborema, an institution that originated the current FMT-HVD (Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado). This specialized health service went on to serve as a reference for tropical diseases, including accidents caused by poisonous animals. In the second half of the decade comes to Manaus the researcher Paulo Burnheim that with the great support of Heitor Dourado (then director of IMTM), organized the Centre for Poisonous Animals. From 1986, the Ministry of Health takes on whole antivenom production (Butantan Institute, Vital Brazil Institute and Ezequiel Dias Foundation are the producers) in the country and distribute to the State Departments of Health, who became responsible for transfering to municipalities. So, the Centre for Poisonous Animals of the FMT-HVD started its activity in 1985 and was the responsible for distributing the antivenom in the State of Amazonas. From 1974 to 1984, 514 patients snakebite victims were hospitalized in IMTM 18. Figure 2 shows the snakebites case series from 1974 to It is notable the increasing pattern of the number of cases after the second half of 1980s. After the start of the activities of the Centre for Poisonous Animals the information of the total attendance starts. Thus, this increasing pattern probably is the result of the institutional protocols changes, which culminates in an improvement of the epidemiological surveillance system for the state of Amazonas. Moreover, with the establishment of this specialized service, the state has an optimized distribution of antivenoms and get more reliable epidemiological information on snakebites. The first analyzes on demographic characteristics of snakebites, seasonality of cases and the species of snakes causing the accidents came from this period 18,19. These events coincided with a crisis in the system of production of antivenoms in Brazil in 1986, which culminated with the death of a child in Brasília, and made the government implanted the National Programme of

88 76 Snakebites in the former National Secretariat of Basic Health Activities. In fact, in 1986 the notification of snakebites became compulsory in Brazil and, in 1988, the program was renamed National Programme for Control of Venomous Animals. Figure 2 also shows an increasing incidence of snakebites in the 1990s, peaking in 1998 with 554 cases in IMTM. Since the beginning of the epidemiological surveillance of snakebites in the state of Amazonas, showed that rural activities constituted an important factor associated with the occurrence of this problem. In the1990s, there was a stimulus to the development of sustainable forestry, fishing and farming production in the state of Amazonas, officially recognized by the state government for creating the Zona Franca Verde Program. Given the occupational risk of the snakebites, related to rural and forest activities, this fact should have contributed to the increase in the number of cases. Likewise, increase in the number of snakebites may be also related to the intense urbanization of Manaus towards the peripheral areas in this decade, with the reception of migrants and increased human activity, further resulting in ecological unbalance and contact with poisonous snakes. After these years snakebites decreased but assumed a persistent character until the present days with a slight positive trend after However, the real impact of this environmental changes needs to be further evaluated. It is noteworthy that snakebites are among the leading causes of hospitalization in FMT-HVD. RECENT EPIDEMIOLOGICAL SURVEILLANCE SHOWS A HUGE AND PERSISTENT HEALTH PROBLEM IN THE STATE OF AMAZONAS From 2007 to 2012, a total of 9,174 cases of snakebites were recorded in the state of Amazonas. Figure 3 shows that cases were distributed in all 62 municipaties of the state, with the highest incidence rates in Anamã, Novo Airão, Rio Preto da Eva, Borba, Alvarães, São Gabriel da Cachoeira, Japurá and Uarini. Over these six years, there was a little variation in the annual incidence of snakebites, with the largest number in 2009 (1,969 cases) and fewer in 2011 (1,435). In this period, the mean annual

89 77 incidence in the state was estimated in 45.1 cases/100,000 inhabitants (minimum of 6.7 in Manaus and maximum of in Uarini, per 100,000). The huge amount of snakebites recorded in this period demonstrates the high burden of this type of health problem for the region. A previous survey from Cruzeiro do Sul found an incidence of 126,62 cases/100,000 inhabitants per year in the period A systematic review of the global burden of snakebites 4 showed that the most affected areas are Southeast Asia, with a maximum incidence estimates of cases/100,000 inhabitants, and the central portion of sub-saharan Africa, with a maximum value of cases/100,000 inhabitants. In the same study the tropical portion of Latin America showed maximum incidence of cases/100,000 inhabitants. The value reported by the epidemiological surveillance in the state of Amazonas puts this area as one of the regions with the highest incidence of snakebites in the world. The case series presented here clearly shows a seasonal pattern. Most of the accidents occurred in the period from December to June, paralelling with the rainy season in the region, with a peak of cases in March. The months with the lowest number of cases were September and October (Figure 4). Incidence of snakebites in the Amazon is under the influence of pluviometry probably because snakes in the Amazon have increased activity during the months with higher rainfall 20,21, including Bothrops atrox and Bothriopsis bilineata 22,23. Moreover, in this period, the snakes look for land areas during the floods, increasing the likelihood of contact between humans and the animals. A similar seasonal pattern was previously observed in the region, with some microgeographical variations 9,10,17. Table 1 shows the epidemiological characteristics of the 9,174 snakebite cases recorded by the epidemiological surveillance in the State of Amazonas, from The profile was very similar to previous publications from the Brazilian Amazon, as seen in the systematic review presented here.

90 78 The most affected group was the aged years old (38%), of the male gender (78.94%). Of all accidents recorded in this period, the vast majority occurred in rural areas (85.58%). These profile was recorded previously in the Amazon and probably results from the economical activities developed by the victims 9,11,12,14. Another important point observed was that 85.6% of bites occurred in the lower limbs. As snakebites in the Amazon relate predominantly to work in the field, such as forestry and agriculture, the risk of being bitten can be lowered with preventive measures, such as wearing protective footwear and avoiding areas known to be inhabited by dangerous snakes 5. The predominance of accidents in rural areas is especially troubling to some regions of the Amazon, which presents serious problems of displacement for these patients. In some areas roads are absent and displacement by rivers to the nearest healthcare facility can take hours or even days. Thus, snakebite victims often use traditional homemade medicines 7 contributing to the emergence of severity and underreported cases and snakebite-related fatality. In this regard, the average time until health attending was very similar to other Amazonian regions 11, but much higher than in other regions of Brazil 24. However, when compared to a previous case series study in the state of Amazonas (from 1989 to 1996) 9, an improvement in time until the care of the patients was observed. While that period approximately 56% of cases were seen only after 6 hours, in the current study this figure dropped to 29.5%. This evolution can be significant to reduce case-fatality from 1% to 0.6% comparing the two case series. Bothropic accidents predominate in the present series (67.3%) agreeing with studies carried out in other regions of Brazilian Amazon Lachetic accidented responded for 21.8% of the snakebites. This value is higher than the national averages, which show the crotalic accident as the second most important 5. This fact may be related to the absence of favorable conditions for the development of Crotalus durissus (open fields such as savanna biomes) in the state of Amazonas 17.

91 79 DISCUSSION AND FUTURE PERSPECTIVES Socioeconomic burden of snakebites is an issue totally neglected in Brazil. In the Brazilian Amazon, no reliable data were available on the long-term physical and psychological consequences of surviving snakebite, but as most snakebite victims are in the economically productive age group, the economic impact of disability is likely to be high. Global health resource allocation is often based on DALYs (disability-adjusted life-years), and other socioeconomic markers rather than on the number of patients and deaths, despite the limitations of each of these measures of burden. Furthermore, there is no information regarding risk factors for severity, disabilities and case-fatality caused by snakebite. On the same way, very little is known about the frequency of secondary infections, the spectrum of bacteria responsible for wound infections in snakebite patients and on their antimicrobial susceptibility. Very little scientifically based information is available on snakebite case-fatality for many developing countries. In India, verbal autopsy was used to study the fatality associated to snakebite, showing that this problem remains an underestimated cause of accidental death in India 25. A verbal autopsy is a method of finding out the cause of a death based on an interview with next of kin or other caregivers. In recent years, verbal autopsies have been used more widely to provide information on cause of death in areas where civil registration and death certification systems are weak, and where most people die at home without having had contact with the health system. Although Brazil has an active epidemiological surveillance for envenoming animals, its sensitivity needs to be determined. In addition, phylogenetic and venom studies are needed to ensure appropriate design of antivenoms to cover the species responsible for serious envenoming episodes in the Amazon.

92 80 CONCLUSIONS In summary, snakebites represent a huge health problem and a largely neglected problem in the Brazilian Amazon. To address this problem, population-based studies of incidence and mortality in countries that appear to have the highest case load and mortality rates are urgently required to clarify the situation. Given the high burden, the paucity of reliable snakebite data is both surprising and worrying. The fact that snakebite varies geographically and seasonally, that it is mainly a rural tropical phenomenon where reporting and record keeping is poor, and that health-seeking behaviour is diverse with traditional medicines being sometimes preferred by people, all contribute to the difficulties faced when studying its epidemiology. The quality of reporting and record keeping on morbidity and mortality due to snakebite in health facilities should be optimized in the Amazon. ACKNOWLEDGEMENTS Thanks to the personnel of the Fundação de Vigilância em Saúde do Estado do Amazonas and of the Department of Epidemiology and Public Health of the Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado. CONFLICT OF INTEREST The authors declare no conflict of interest during the development of the study. FINANTIAL SUPPORT This work was funded by the Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado.

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96 84 Figure titles Figure 1. Historical evolution in the number of snakebites recorded from the Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado, Manaus ( ). Figure 2. Flow of inclusion of studies on snakebites in the Brazilian Amazon. Figure 3. Mean annual incidence of snakebites by municipality in the state of Amazonas, from 2007 to Figure 4. Seasonality of the snakebites recorded in the state of Amazonas, from 2007 to 2012.

97 85 Table 1. Characteristics of the 9,174 snakebite cases recorded from the State of Amazonas ( ). Characteristics Number Frequency (%) Gender Male 7, Female 1, Not available 1 <0.1 Area of occurence Rural 7, Urban 1, Periurban Not available Age groups , , , > Not available Anatomical region affected Head Upper limbs 1, Body Lower limbs 7, Not available Time elapsed from bite until attending (hours) 0-1 1, , , , > Not available Type of snakebite Bothropic 6, Lachetic 1, Crotalic Elapidic Non-envenoming snakes Not available Evolution Discharge 8,

98 Death due to snakebites Death due to other causes 3 <0.1 Not available Case classification Mild 4, Moderate 4, Severe Not available

99 87 Figure 1. Historical evolution in the number of snakebites recorded from the Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado, Manaus ( ).

100 Figure 2. Flow of inclusion of studies on snakebites in the Brazilian Amazon. 88

101 89 Figure 3. Mean annual incidence of snakebites by municipality in the state of Amazonas, from 2007 to 2012.

102 Figure 4. Seasonality of the snakebites recorded in the state of Amazonas, from 2007 to

103 91 5. DISCUSSÃO Poucos estudos anteriores foram realizados com o objetivo de quantificar e identificar o perfil dos acidentes ofídicos na Amazônia brasileira. Avaliar a carga da doença a partir de estudos populacionais e de dados de vigilância epidemiológica em áreas remotas é essencial para direcionar programas de prevenção, especialmente na distribuição do soro antiofídico. Algumas pesquisas realizadas em comunidades isoladas da Amazônia, com extrativistas [55] e ribeirinhos [18], têm demonstrado que os acidentes com serpentes são um importante problema de saúde nesse meio. A análise de registros médicos de 34 localidades do Amazonas demonstrou que os acidentes ofídicos são um problema de saúde amplamente distribuído no Amazonas [9], fato que foi confirmado no presente estudo. Em uma tentativa de avaliar mais precisamente a quantidade de acidentes ofídicos no Amazonas, utilizamos dados oficiais de vigilância epidemiológica para estimar a carga de acidentes e identificar os fatores de risco independentes para gravidade e mortalidade desse agravo. A incidência média na área de estudo foi de 52,8 casos por habitantes/ano, atingindo um valor máximo de 150 casos por habitantes/ano em vários municípios, número similar a projeções de incidência para a África subsaariana e Oceania [4]. A dificuldade de deslocamento das populações ribeirinhas e indígenas prejudica o acesso aos centros de saúde, impedindo a notificação e tratamento correto de muitos acidentes. Em consequência, o número de casos detectados oficialmente pelo processo de notificação é provavelmente menor do que o número real [56], o que pode elevar a incidência real do Amazonas, tornando-a uma das mais elevadas do Mundo. Observou-se que a área entre o Nordeste e a região Central do estado apresentou elevadas taxas de incidência, superiores a 150 casos por habitantes/ano. Nesta área há forte presença de populações indígenas e ribeirinhas, destacando a vulnerabilidade destes grupos e a necessidade de atenção por parte dos gestores responsáveis pelos serviços de saúde nessas áreas.

104 92 Os acidentes ofídicos ocorreram principalmente em homens, que vivem em áreas rurais e possuem idade entre 16 e 45 anos. Além disso, os acidentes foram relacionados com o trabalho em mais de metade dos casos. Este perfil é semelhante a outras regiões do Brasil [12,16,17,57] e de outros países [58,59], e reafirma a forte relação entre acidentes ofídicos e atividade rural em países pobres [60]. Como pode ser observado neste trabalho, os acidentes ofídicos na Amazônia afetam principalmente trabalhadores, em situações vulneráveis, que exercem a agricultura de subsistência ou o extrativismo vegetal. Este grupo, em geral, não possui proteções sociais e trabalhistas, o que afeta significativamente a economia familiar nestas áreas. Dessa forma, como não há um estímulo à prevenção de acidentes ofídicos no trabalho, e nem uma promoção de acesso, por parte desses trabalhadores, aos serviços públicos de saúde, os acidentes ofídicos se configuram como um grave problema de saúde ocupacional negligenciado. Uma importante característica observada nos acidentes ofídicos do Amazonas é o maior tempo médio transcorrido entre a picada e o atendimento de saúde, em comparação a outras regiões do Brasil [19,61]. Mais de 30% dos pacientes demoraram seis horas ou mais para receber assistência de saúde. Como observado neste trabalho, um tempo de atendimento superior a 6 horas mostrou-se fator de risco independente para a gravidade e mortalidade dos pacientes. A demora em atender os acidentes também foi identificada como fator de risco na Índia [50,62], Nepal [58,63] e Nigéria [45,64]. A demora no atendimento no Amazonas pode estar relacionada à dependência que grande parte da população tem do transporte fluvial para os deslocamentos entre as comunidades e os centros de saúde. Além disso, a procura inicial por curandeiros tradicionais pode acarretar em atrasos ou mesmo, em casos mais graves, na morte do paciente antes mesmo de ser atendido pelos serviços de saúde oficiais [9]. A taxa de letalidade de 0,6% observado no presente trabalho é maior do que alguns estudos anteriores nacionais [12,65]. Ações como as realizadas no Nepal [63], onde a implementação de um transporte rápido para pacientes reduziu

105 93 significativamente a letalidade dos acidentes ofídicos, pode ter sucesso também na Amazônia. Outra observação interessante foi que os acidentes relacionados ao trabalho foram mais propensos a desenvolver casos graves. A relação entre gravidade e exposição ocupacional também foi observado na Índia, onde os trabalhadores rurais acidentados por serpentes eram mais propensas à morte [59]. Não se pode estabelecer precisamente uma associação direta entre gravidade e exposição ocupacional, contudo, a distância a ser percorrida entre o local de trabalho e as respectivas casas, para só então procurarem cuidados médicos, pode explicar esta associação de risco. Na Índia, os pacientes que andaram mais de 1 km depois da picada de cobra, e, consequentemente, demoraram mais a serem atendidos, também apresentaram maior risco de morte [47]. Tranqüilidade e imobilização do membro afetado, com deslocamento rápido para um centro de saúde, são primordiais para um bom atendimento de acidentes ofídicos [49,66]. Neste trabalho, ter idade inferior a 15 anos foi fator de risco independente para o desfecho de gravidade. Esse fator de risco também foi observado na Índia [47]. Na Turquia, os acidentes ofídicos foram considerados condições de emergência médica particularmente importantes em crianças, com elevada morbidade e mortalidade [67]. Metade das mortes por acidentes ofídicos na Califórnia foram de crianças menores de 5 anos de idade [68]. O ofidismo está amplamente distribuído, porém as crianças são desproporcionalmente representadas entre os casos e sofrem efeitos mais graves em relação aos adultos, como resultados da sua menor massa corpórea [3]. A faixa etária acima de 65 anos também se mostrou fator de risco para gravidade e mortalidade. Esta informação é relevante, uma vez que existem poucos dados na literatura que relacionam maior gravidade de acidentes ofídicos em idosos. Acidentes ofídicos provocados por Bothrops e Crotalus, notificados em São Paulo, em pacientes com mais de 50 anos de idade, apresentaram maior mortalidade quando

106 94 comparados aos pacientes jovens [69]. Considerando que a maior parte das complicações decorrentes de envenenamento por serpentes, especialmente por Bothrops, é devido a insuficiência renal aguda [29,36,40,70,71], a maior gravidade associada aos idosos pode estar relacionada com a tendência que este grupo tem de evoluir para necrose renal aguda depois de picado [71,72]. Comorbidades que conduzem à doenças vasculares, como hipertensão e diabetes, comumente encontrada em idosos, também podem precipitar complicações fatais após o envenenamento ofídico. Em uma série de casos realizada no Brasil, 8 dos 309 pacientes (2,6%) desenvolveram um evento cerebrovascular após acidente botrópico; cinco dos oito pacientes morreram, apesar do tratamento, e os três restantes tiveram sequelas irreversíveis [73]. Casos de acidente vascular cerebral relacionados com acidentes botrópicos já foram notificados no Brasil em pessoas idosas, inclusive na região amazônica [74,75]. Nesse sentido, o envelhecimento da população pode afetar o perfil epidemiológico do acidente ofídico, fato que exige acompanhamento por parte dos serviços de saúde. Soroterapia, tratamentos eficazes de suporte à vida e treinamentos de equipes de saúde, que são geralmente negligenciados para essa faixa etária, podem contribuir para a gravidade do desfecho nesse faixa etária. A principal limitação deste estudo é a falta de padronização no processo de coleta de dados nas diferentes regiões do estado, o que provavelmente afeta a integridade dos dados registados, bem como a falta de informações sobre o tipo de serpente causadora do agravo. No entanto, a ampla cobertura de atendimento e o baixo custo para a coleta de dados ainda permite a obtenção de informações valiosas para o sistema público de saúde. Uma vez que o diagnóstico e tratamento dos acidentes ofídicos são gratuitos no Brasil, e que a notificação no SINAN precede a escolha da terapia, com tratamentos específicos conforme a gravidade do acidente, os relatórios de notificação do SINAN podem ser considerados confiáveis nesta variável. Além disso, a plenitude das variáveis analisadas neste estudo sugere que o banco de dados de acidentes ofídicos do SINAN no Estado do Amazonas é uma fonte segura para pesquisa. No entanto, destaca-se que as estimativas de fatores de risco

107 95 independente para as complicações devem ser confirmadas por meio de estudos multicêntricos.

108 96 6. CONCLUSÃO Os acidentes ofídicos são um grave problema de saúde negligenciado no Amazonas. A incidência no estado está entre as mais elevadas do mundo, especialmente se considerarmos o potencial de subnotificação dos casos. O problema mostrou ter uma ampla distribuição no Estado do Amazonas, com elevadas taxas de incidência em regiões onde a presença de ribeirinhos e indígenas é predominante. A população mais atingida pelos acidentes ofídicos no Amazonas é de homens adultos. Durante o ano esses acidentes se concentraram principalmente nos meses chuvosos, sendo causados principalmente pelo gênero Bothrops. Ter menos de 15 ou mais de 65 anos, sofrer o acidente no ambiente de trabalho e demorar mais de 6 horas para receber atendimento médico foram fatores independentes associados com o risco de desenvolvimento de gravidade. Ter mais de 65 anos e demorar mais de 6 horas para receber atendimento médico foram as variáveis independentes associadas ao risco de morte. Estas características demonstram que o encaminhamento precoce dos acidentados e a implantação de políticas de saúde voltadas para os grupos etários mais vulneráveis, crianças e idosos, podem reduzir as consequências relacionadas a gravidade e morte dos acidentes ofídicos. A qualidade dos dados epidemiológicos coletados no momento da notificação deve ser melhorara a fim de subsidiar de forma mais eficaz estudos sobre o perfil epidemiológico e de gravidade dos acidentes ofídicos no Amazonas.

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118 ANEXOS 8.1 ANEXO A FICHA DE NOTIFICAÇÃO/INVESTIGAÇÃO DE ACIDENTES POR ANIMAIS PEÇONHENTOS