KIT DE EXTRAÇÃO MINI SPIN VÍRUS DNA

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1 KIT DE EXTRAÇÃO MINI SPIN VÍRUS DNA Instruções de Uso 1. USO PRETENDIDO O BIOPUR Kit de Extração Mini Spin Vírus DNA é a ferramenta ideal para uma extração e purificação manual simples, rápida e eficiente de DNA viral usando o formato filtro spin. Devido ao alto grau de pureza, o DNA viral extraído está pronto para ser utilizado em análises de diagnóstico in vitro e em outras aplicações. É aplicado para as seguintes amostras: 1-200µL de sangue total humano ou de outro mamífero; 1-200µL de fluidos corporais livres de células (soro, plasma, fluido cerebroespinhal, etc.); 1-25µL de sangue de não mamíferos; 1-20µL de medula óssea; Material de swab e lavado de swab; µl de sobrenadante de cultura celular; 1 x 10 6 de células de mamíferos. O kit não foi validado para o isolamento de RNA viral ou RNA total. A aplicabilidade do kit para tecidos, fezes e manchas secas de sangue não foi avaliada. Para outras validações, entrar em contato com o nosso Laboratório. O BIOPUR Kit de Extração Mini Spin Vírus DNA é designado para o processamento de múltiplas amostras simultaneamente, de uma ampla variedade de vírus DNA, encontradas em uma ampla diversidade de amostras biológicas. As amostras podem ser frescas, liofilizadas ou congeladas, mas não devem ser congeladas e descongeladas mais de uma vez. O procedimento é rápido e não requer uma extração com fenol e clorofórmio ou precipitação em etanol, requerendo mínima interação com o usuário. O procedimento foi desenvolvido para evitar contaminação cruzada de amostras e permitir um manuseio seguro de amostras potencialmente contaminantes. Devido à alta pureza, o DNA viral isolado fica pronto para uso em um grande painel de aplicações em Biologia Molecular ou poderá ser armazenado a -20 C para uso subsequente. Aplicações em Biologia Molecular PCR em Tempo Real; PCR; Análise TaqMan; Tecnologia de microarranjo. O produto é indicado para uso por profissionais treinados em técnicas de biologia molecular. Quaisquer resultados de diagnósticos gerados utilizando o procedimento de preparação de amostras em conjunto com qualquer análise de diagnóstico devem ser 1

2 interpretadas considerando outras conclusões clínicas e laboratoriais. Para minimizar irregularidades nos resultados de diagnósticos, controles adequados devem ser empregados. 2. CARACTERÍSTICAS DO PRODUTO Amostra inicial Rendimento Tempo 1-200µL de sangue total humano fresco, velho ou congelado ou sangue de outro mamífero; 1-200µL de fluidos corporais livres de células (soro, plasma, etc.); 1-25µL de sangue total de não mamífero; 1-20µL de medula óssea; Material de swab, lavado de swab; 1-200µL de sobrenadante de cultura celular; 1 x 10 6 de células de mamíferos. Depende da amostra (armazenagem, idade e tipo). Nota: O Carreador RNA adicionado contará para a maioria do DNA eluído. RT-PCR quantitativo é recomendado para a determinação do rendimento do DNA Viral. 25 minutos O rendimento do DNA purificado depende do tipo, origem e idade da amostra, do título do vírus, além do transporte, armazenamento da amostra. Diferentes sistemas de amplificações variam na eficiência dependendo da quantidade total de ácidos nucléicos presentes na reação. Eluídos deste kit contêm DNA viral e Carreador RNA, e o Carreador de RNA gerará volume excedente de ácido nucleico. O rendimento de DNA viral isolado de amostras biológicas é, normalmente, menos que 1µg e, portanto, difícil de determinar fotometricamente. Observações *Observe que o Carreador de RNA (5µg por 200µL de amostra) será contado para a maioria do DNA presente. *Em gel de eletroforese e em eletroforese de capilaridade, o DNA extraído com o kit parece degradado por o kit conter o carreador de RNA, que é uma poli A RNA em fragmentos de 100 até 1000 bases. O kit não é dedicado para aplicações usando este tipo de análise. 2

3 3. COMPOSIÇÃO DO KIT INFORMAÇÕES PRINCIPAIS 10 EXTRAÇÕES (Amostra) 50 EXTRAÇÕES 250 EXTRAÇÕES Código Do Produto BP BP BP Tampão de Lise HL SVM DNA 2 ml 11 ml 55 ml Proteinase K SVM DNA* Carreador RNA SVM DNA* 250 µl solução de trabalho* 240µL solução de trabalho** 1,1mL solução de trabalho* 1,2mL solução de trabalho** 5 x 1,1 ml solução de trabalho* para 3 x 2 ml solução de trabalho** Água Livre de RNase SVM DNA 2 ml 2 ml 3 x 2mL Tampão de Ligação HL SVM DNA 2 ml 12 ml 56 ml Tampão de Lavagem l SVM DNA** Tampão de Lavagem ll SVM DNA** 6 ml (pronto para uso) 15 ml (pronto para uso) 17 ml** (volume final 34 ml) 2 x 12 ml** (volume final 2x40mL) 83 ml** (volume final 166 ml) 2 x 60 ml** (volume final 2 x 200 ml) Tampão de Eluição D SVM DNA 2 ml 6 ml 28 ml Tubo Spin SVM DNA 10 un. 50 un. 5 x 50 un. Tubo de Coleta RTA - SVM DNA 3 x 10 un. 3 x 50 un. 15 x 50 un. Tubo de Reação 1,5mL SVM DNA 10 un. 50 un. 5 x 50 un. Instrução de Uso 1 un. 1 un. 1 un. *Água: ultrapura ou bidestilada ou de injeção. ** Verificar item 9 Preparando os Reagentes Obs.: Verificar item: REAGENTES E EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS, MAS NÃO FORNECIDOS. 4. ARMAZENAMENTO DOS REAGENTES Todos os tampões e componentes do BIOPUR Kit de Extração Mini Spin Vírus DNA, exceto a Proteinase K e o Carreador RNA, devem ser armazenados em temperatura ambiente entre 15 e 30 C e são estáveis por 18 meses sob estas condições. Proteinase K A Proteinase K liofilizada deve ser armazenada em geladeira entre 2 e 8 C. A Proteinase K reconstituída deve ser armazenada a -20 C; recomenda-se dividir a solução em alíquotas para o armazenamento em freezer. Esta solução pode, eventualmente, apresentar aspecto leitoso, principalmente em função de repetidos ciclos de congelamento e descongelamento, armazenamento prolongado ou diluição errada; situações tais que devem ser evitadas. Entretanto, verificou-se que esse aspecto leitoso não interfere no desempenho 3

4 do produto. Não é recomendado dar spin na solução leitosa, pois pode haver formação de pellet, levando à perda de atividade. Carreador RNA O Carreador RNA liofilizado deve ser armazenado em geladeira entre 2 e 8 C, mas para longo período de armazenagem ele deve ser estocado a -20 C e se manterá estável por 12 meses. O Carreador RNA reconstituído deve ser armazenado a -80 C, e se mantém estável por 6 meses. Ciclos repetidos de congelamento e descongelamento degradarão o Carreador RNA e reduzirão a funcionalidade do kit. Por isso, recomenda-se dividir o Carreador em alíquotas para o armazenamento a -80 C. Tampões de Lavagem Tampões de Lavagem l e ll, nos quais foi adicionado etanol, devem ser fechados e armazenados adequadamente, em temperatura ambiente entre 15 e 30 C. Antes de cada uso, certifique-se de que os componentes estão em temperatura ambiente. Se alguma solução apresentar precipitado, dissolva-o com cuidadoso aquecimento até 30 C. 5. INFORMAÇÕES DE SEGURANÇA Sempre que estiver trabalhando com soluções químicas e amostras sanguíneas, EPIs são recomendados conforme normas de segurança regulamentadas. Depois de receber o kit, verifique se as embalagens dos componentes não estão danificadas e se há vazamento dos líquidos. Se os frascos de tampões estiverem danificados ou com vazamento, use luvas e óculos de proteção quando descartar os frascos para evitar acidentes. Não use componentes danificados, pois eles podem gerar baixo rendimento. Sempre troque as ponteiras entre as transferências de líquidos para evitar a contaminação cruzada. É recomendado o uso de ponteiras com filtro. Toda a centrifugação deve ser realizada em temperatura ambiente. Não misture componentes de kits diferentes se eles não tiverem o mesmo lote. Evite contaminação microbiana dos reagentes do kit. Para minimizar risco de infecções é recomendado trabalhar em câmara de fluxo laminar. Este kit deve ser usado apenas por pessoal treinado. Os químicos e plásticos devem ser armazenados em condições próprias para uso em laboratório. Os resíduos gerados pelo uso dos kits não foram testados. Contaminações causadas pelos resíduos são raríssimas, mas não podem ser completamente descartadas. Portanto, os resíduos devem ser considerados como material infeccioso e devem ser manuseados de acordo com as normas de segurança regulamentadas. Caso necessite de mais informações a respeito do produto, entre em contato com a Biometrix e solicite a FISPQ Ficha de Informações de Segurança de Produto Químico relativa a este produto. Veja a seguir a classificação de riscos e frases de segurança utilizadas internacionalmente, que se aplicam aos componentes do BIOPUR Kit de Extração Mini Spin Vírus DNA: 4

5 PRODUTOS RISCOS Tampão de Lise HL H302, 315, 319, P280, 305, 351, 338 Tampão de Ligação HL H225, 319, 336 P210, 233, 305, 351, 338 Proteinase K H315, 319, 334, 335, P280, 305, 351, 338, 310, 405 Tampão de Lavagem I H302 H315 H319 H225 H336 H334 H335 H312 H332 H412 EUH032 P280 P305+P351 + P338 P210 P233 P310 P405 P273 Perigoso se engolido Causa irritação na pele Causa séria irritação aos olhos H302, 312, 332, 412, EURH032, P273 LEGENDA DOS RISCOS Líquido e vapor altamente inflamável Pode causar sonolência e tontura Pode causar sintomas de alergia ou asma ou dificuldade de respirar se inalado Pode causar irritação respiratória Prejudicial se em contato com a pele Prejudicial se inalado Prejudicial para a vida aquática com efeito duradouro Contato com ácidos libera gases muito tóxicos Usar luvas, roupas, protetores de olhos e rosto apropriados Se em contato com os olhos, enxaguar com bastante água por vários minutos. Remover lentes de contato, se usar, e continuar enxaguando Mantenha longe do calor, faíscas, chamas ou superfícies quentes não fume Manter o frasco bem fechado Chamar imediatamente um médico Armazenar em local trancado Evitar liberar no meio ambiente 6. AMOSTRAGEM E ARMAZENAMENTO DE ACORDO COM O TIPO DE AMOSTRA BIOLÓGICA Sangue e Creme Leucocitário (Buffy Coat) Os melhores resultados são obtidos usando amostras recém-extraídas. As amostras de sangue total (conservadas com EDTA e citrato) podem ser armazenadas em temperatura ambiente (15-30 C) por 2 a 3 horas. Para utilização em até 24 horas, as amostras podem ser armazenadas a 4 C. Para longos períodos de armazenamento é recomendado estocar a -20 C ou -80 C. Congelamentos e descongelamentos devem ser evitados antes da extração do DNA. Se houver a presença de crioprecipitados (formados no descongelamento de amostras congeladas) evitar aspirá-los, pois eles poderão entupir a membrana do Tubo Spin. Vários tipos 5

6 de tubos primários, com vários tipos de anticoagulantes, exceto heparina podem ser usados para coletas amostras de sangue. O creme leucocitário é a fração do sangue total rica em células brancas. Para preparar e extrair a camada de creme leucocitário recomenda-se o seguinte processo. Usar uma amostra de sangue total (anticoagulantes: EDTA, citrato, mas não heparina) com uma fração sedimento celular proveniente de um repouso overnight a 4 C. A camada clara logo abaixo ao plasma é o creme leucocitário contendo leucócitos que podem ser facilmente distinguidos dos eritrócitos da camada inferior. Um fator de enriquecimento de 10 é esperado a partir desse processo, portanto, devido a esse enriquecimento leucocitário ficar atento para evitar uma sobrecarga no processo de extração de DNA. Fluido Cerebroespinhal (CSF) e Medula Óssea Os melhores resultados são obtidos com material fresco. As amostras podem ser estocadas a 4 C por 2 a 3 horas. Para um período maior congelar as amostras a -20 C. É comum ocorrer o ressecamento das amostras. As amostras secas devem ser armazenadas em refrigerador a 4 C em ambiente livre de umidade. Soro e plasma (e outros fluidos livres de células) Seguidos de centrifugação, plasma ou soro de sangue tratado com anticoagulantes como EDTA ou citrato, mas não heparina, podem ser armazenados de 2-8 C por até 6 horas. Para longos períodos de armazenagem congelar a -20 C ou -80 C em alíquotas. Congelamentos e descongelamentos devem ser evitados, pois desnaturam e precipitam proteínas resultando em decréscimo do título e reduzindo o rendimento do DNA viral extraído. Se os crioprecipitantes forem visíveis, eles podem ser precipitados por centrifugação aproximada de x g por 3 minutos. O sobrenadante limpo deve ser aspirado sem o precipitado e processado imediatamente. Esta etapa não reduzirá os títulos virais, excluindo algumas viroses conhecidas, por exemplo: HIV. 7. PROCEDIMENTO O BIOPUR Kit de Extração Mini Spin Vírus DNA abrange as seguintes etapas: 1) Lise de partículas de vírus; 2) Ligação do DNA viral à membrana do Tubo Spin; 3) Lavagem da membrana e eliminação do etanol; 4) Eluição do DNA viral. Lise Amostras são lisadas em condições de desnaturação, em temperaturas elevadas. Por causa das fortes condições desnaturantes de lise na presença da Proteinase K e Tampão de Lise HL as células são rapidamente quebradas e as DNases são inativadas simultaneamente. O DNA viral está seguro. A adição do Carreador RNA é necessária para o aumento da recuperação do DNA viral, desta forma, um número muito pequeno de moléculas de DNA viral também será purificado. O Carreador RNA também estabiliza os ácidos nucleicos em amostras com pouca concentração de ácidos nucleicos. 6

7 Ligação do DNA Viral Depois de adicionar a Tampão de Ligação HL para otimizar a ligação do DNA viral, coloca-se o lisado no Tubo Spin e o DNA viral liga-se à membrana por centrifugação. Remoção dos Contaminantes Residuais Os contaminantes são removidos de forma eficaz com o uso do Tampão de Lavagem I e II, enquanto o DNA viral permanece ligado à membrana do Tubo Spin. Eluição O DNA viral de alta qualidade é eluído da membrana usando o Tampão de Eluição D. O tampão de Eluição não contém EDTA. O DNA viral eluído está pronto para uso em diferentes aplicações. Para várias aplicações que requerem um pequeno volume de material inicial, o DNA viral pode ser eluído em 30µL de Tampão de Eluição D. Indicações Importantes Adição do Carreador RNA - O Carreador serve para dois propósitos: 1. Para otimizar a ligação do DNA viral à membrana do Tubo Spin por saturação de sítios de ligação não específicos especialmente quando há poucas moléculas alvo na amostra. 2. A adição de grande quantidade de Carreador de RNA reduz a chance de degradação do DNA viral em casos raros em que as moléculas de DNase não estão desnaturadas por sal caotrópico e detergentes no Tampão de Lise HL. Adição de Controle Interno de RNA - O uso de um controle interno de RNA é recomendado. O controle interno de RNA e o Carreador RNA reconstituído também podem ser adicionados ao Tampão de Lise RV e bem misturados invertendo o tubo 10 vezes. Para evitar espuma não aplique vortex ao tubo. Obs.: Verificar se o seu kit de detecção é acompanhado de controle interno. Manuseando o Tubo Spin - Devido à sensibilidade das tecnologias de amplificação de DNA viral, as seguintes precauções devem ser tomadas no manuseio do Tubo Spin para evitar a contaminação cruzada entre amostras: Cuidado ao aplicar a amostra ou solução ao Tubo Spin; pipetar a amostra no filtro sem ultrapassar a borda da coluna; Sempre trocar a ponteira durante a transferência de líquidos; é recomendado o uso de ponteiras com filtro; Evitar tocar o filtro do Tubo Spin com a ponteira. 8. EQUIPAMENTOS E REAGENTES NECESSÁRIOS, MAS NÃO FORNECIDOS Microcentrífuga; Termomixer (65-80 C); Vortex; Proveta (250 ml); Pipetas e ponteiras; 7

8 Microtubos de 1,5 ml e de 2 ml extras; Água (ultrapura, bidestilada ou de injeção); Etanol P.A.; PBS 1x. 9. PREPARANDO OS REAGENTES Kit para 10 extrações (amostra) Adicionar 250µL de água (ultrapura ou bidestilada ou de injeção) ao frasco de Proteinase K e misturar cuidadosamente. Adicionar 240µL de Água Livre de RNase ao frasco de Carreador RNA e misturar cuidadosamente. Os Tampões de Lavagem I e II estão prontos para uso. Manter os frascos bem fechados. Kit para 50 extrações Adicionar 1,1 ml de água (ultrapura ou bidestilada ou de injeção) ao frasco de Proteinase K e misturar cuidadosamente. Adicionar 1,2 ml de Água Livre de RNase ao frasco de Carreador RNA e misturar cuidadosamente. Adicionar 17 ml de etanol P.A. ao frasco do Tampão de Lavagem I. Misturar cuidadosamente e manter o frasco bem fechado. Adicionar 28 ml de etanol P.A. ao frasco do Tampão de Lavagem II. Misturar cuidadosamente e manter o frasco bem fechado. Kit para 250 extrações Adicionar 1,1 ml de água (ultrapura ou bidestilada ou de injeção) aos frascos de Proteinase K e misturar cuidadosamente. Adicionar 2 ml de Água Livre de RNase ao frasco do Carreador RNA e misturar cuidadosamente. Adicionar 83 ml de etanol P.A. ao frasco do Tampão de Lavagem I. Misturar cuidadosamente e manter o frasco bem fechado. Adicionar 140 ml de etanol P.A. ao frasco do Tampão de Lavagem II. Misturar cuidadosamente e manter o frasco bem fechado. 10. PROTOCOLOS As notas a seguir são válidas para todos os protocolos. Antes de iniciar o procedimento: Ligar o termomixer a 56 C; Aquecer a quantidade necessária do Tampão de Eluição D a 56 C para o passo final de eluição; Identificar a quantidade necessária de Tubo Spin (cada amostra: 1 tubo) Identificar a quantidade necessária de Tubo de Reação 1,5mL (cada amostra: 1 tubo) 8

9 Importante: Depois da extração, colocar o Tubo de Reação 1,5mL no gelo. Para um longo período de armazenamento coloque o DNA a -20 C. Nota: O DNA pode também ser eluído com pouco (mas não menor que 30µL) ou grande volume de Tampão de Eluição D (dependendo do rendimento esperado ou concentração necessária do DNA). Nota: As velocidades de rotação (rpm) necessárias podem variar de uma marca de centrífuga para outra. PROTOCOLO 1 Extração de DNA viral de 200µL de sangue total humano e de outros mamíferos Extração de DNA viral de 200µL de plasma e soro (e outros fluidos corpóreos livres de células) Importante: Aliquotar a quantidade de Tampão de Eluição D necessária para o número de amostras e colocar em banho seco a 56 C. 1) Transferir a amostra com 200µL para o microtubo de 1,5mL (não fornecido). Para as amostras que apresentarem um volume menor, completar o volume para 200µL com água (ultrapura ou bidestilada ou de injeção) ou PBS 1x. 2) Adicionar 200µL Tampão de Lise HL e misturar por pipetagem. Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente e em agitação constante. 3) Adicionar 20µL de Carreador RNA e 20µL de Proteinase K na amostra. Agitar no vortex. Incubar o microtubo de 1,5mL a 56 C por 15 minutos, com agitação contínua. Nota: Se estiver usando um banho-maria, homogeneizar a amostra durante a lise de 2 a 5 vezes. 4) Adicionar 200µL Tampão de Ligação HL e misturar a amostra completamente por pipetagem (5 vezes). Certifique-se que o Tubo Spin está dentro de um Tubo de Coleta RTA, e então transferir toda a mistura para o Tubo Spin. Incubar por 1 minuto a temperatura ambiente. 5) Centrifugar por 2 minutos a g ( rpm). Descartar o Tubo de Coleta RTA com o filtrado e colocar o Tubo Spin em um novo Tubo de Coleta RTA. 6) Adicionar 500µL Tampão de Lavagem I e centrifugar por 1 minuto a g ( rpm). Descartar o Tubo de Coleta RTA com o filtrado e colocar o Tubo Spin em um novo Tubo de Coleta RTA. 7) Adicionar 700µL Tampão de Lavagem II e centrifugar por 1 minuto a g ( rpm). Descartar apenas o filtrado, e colocar o Tubo Spin no mesmo Tubo de Coleta RTA. 9

10 8) Repetir o passo anterior. 9) Centrifugar por 4 minutos a velocidade máxima para remover o resíduo de etanol. 10) Colocar o Tubo Spin em um Tubo de Reação 1,5mL devidamente identificado. Adicionar 100µL do Tampão de Eluição D (pré-aquecido 56 C) diretamente no centro do Tubo Spin. Incubar por 1 minuto a temperatura ambiente. Obs.: Destacar a tampa do Tubo Spin antes da centrifugação e colocá-lo novamente no correspondente tubo de 1,5mL. 11) Centrifugar a g ( rpm) por 2 minutos. Descartar o Tubo Spin. Armazenar o DNA viral a 4 C ou a -20 por longo período. Nota: A eluição pode ser feita usando volume menor de Tampão de Eluição D. Isto pode resultar em uma maior concentração de DNA viral. Mas preste atenção no volume mínimo para a eluição que é 30µL, pois isso poderá reduzir o rendimento. Eluição de 2 x 30µL até 100µL resultará em concentrações similares. PROTOCOLO 2 Extração de DNA viral de 25µL de sangue de não mamíferos Nota: Se for usado sangue de aves (galinha, por exemplo) ou peixes que contenham eritrócitos nucleados, recomenda-se o uso de apenas 10-15µL de material inicial. Importante: Aliquotar a quantidade de Tampão de Eluição D necessária para o número de amostras e colocar em banho seco a 56 C. 1) Transferir 1-25µL de sangue total para um microtubo de 1,5mL (não fornecido) e completar o volume até 200µL com água (ultrapura ou bidestilada ou de injeção ou PBS 1X. 2) Adicionar 200µL de Tampão de Lise HL, misturar completamente por pipetagem. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente em agitação constante. 3) Adicionar 20µL de Proteinase K e 20µL de Carreador RNA. Agitar no vortex. Incubar o microtubo de 1,5mL por 15 minutos a 56 C, em agitação constante em um termomixer. Nota: Se estiver usando um banho-maria, homogeneizar a amostra durante a lise de 2 a 5 vezes. 4) Adicionar 200µL de Tampão de Ligação HL e misturar a amostra por pipetagem 5 vezes. Certifique-se que o Tubo Spin está dentro de um Tubo de Coleta RTA, e então transferir a mistura para o Tubo Spin. Incubar por 1 minuto em temperatura ambiente. 5) Centrifugar por 2 minutos a x g (10.000rpm). Descartar o Tubo de Coleta RTA com o filtrado, e colocar o Tubo Spin em um novo Tubo de Coleta RTA. 10

11 6) Adicionar 500µL de Tampão de Lavagem I e centrifugar por 1 minuto a x g (10.000rpm). Descartar o Tubo de Coleta RTA com o filtrado e colocar o Tubo Spin em um novo Tubo de Coleta RTA. 7) Adicionar 700µL de Tampão de Lavagem II e centrifugar por 1 minuto a x g (10.000rpm). Descartar apenas o filtrado e colocar o Tubo Spin de volta no mesmo Tubo de Coleta RTA. 8) Repetir o passo anterior. 9) Centrifugar por 4 minutos a velocidade máxima para remover o resíduo de etanol. 10) Colocar o Tubo Spin em um novo Tubo de Reação 1,5mL devidamente identificado. Adicionar 100µL de Tampão de Eluição D (pré-aquecido a 56 C) no centro do Tubo Spin. Incubar em temperatura ambiente por 1 minuto. Obs.: Destacar a tampa do Tubo Spin antes da centrifugação e colocá-lo novamente no correspondente tubo de 1,5mL. 11) Centrifugar a x g (10.000rpm) por 2 minutos. Descartar o Tubo Spin. Armazenar o DNA viral a 4 C ou a -20 por longo período. Nota: A eluição pode ser feita usando menor volume de Tampão de Eluição D. Isto pode resultar em uma maior concentração de DNA viral. Mas preste atenção no volume mínimo para a eluição que é 30µL, pois isso poderá reduzir o rendimento. Eluição de 2 x 30µL até 100µL resultará em concentrações similares. PROTOCOLO 3 Extração de DNA viral de 200µL de fluido cerebroespinhal Extração de DNA viral de 20µL de medula óssea Importante: Aliquotar a quantidade de Tampão de Eluição D necessária para o número de amostras e colocar em banho seco a 56 C. Preparo do material inicial Material Fresco: Usar 1-200µL de fluido cerebroespinhal fresco; Ou 1-20µL de medula óssea. Material seco (por exemplo, em lâminas hematológicas): Umedecer o material seco com uma gota de PBS 1X; Adicionar 180µL de PBS 1X em um microtubo de 1,5mL (não fornecido); Raspar o material citológico em um microtubo de 1,5mL usando a borda de uma lâmina limpa. Dissolver o material resultante por pipetagem para cima e para baixo. 11

12 1) Transferir o material inicial para um microtubo de 1,5mL (não fornecido). Para as amostras que apresentarem um volume menor, completar o volume para 200µL com água (ultrapura ou bidestilada ou de injeção) ou PBS 1X. 2) Adicionar 200µL de Tampão de Lise HL, misturar completamente por pipetagem. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente em agitação contínua. 3) Adicionar 20µL de Proteinase K e 20µL de Carreador RNA. Agitar no vortex por 10 segundos (uma mistura incompleta reduzirá a qualidade e o rendimento do DNA viral isolado). Incubar o microtubo de 1,5 ml por 15 minutos a 56 C em agitação contínua em um termomixer. Nota: Se estiver usando um banho-maria, homogeneizar a amostra durante a lise de 2 a 5 vezes. 4) Proceder como descrito no Protocolo 1, etapas de 4 a 11. PROTOCOLO 4 Extração de DNA viral a partir de esfregaço bucal (swabs) Importante: Aliquotar a quantidade de Tampão de Eluição D necessária para o número de amostras e colocar em banho seco a 56 C. 1) Adicionar 200 µl de água (ultrapura ou bidestilada ou de injeção) ou líquido de lavado de swabs (PBS), 200µL de Tampão de Lise HL em um microtubo de 1,5mL (não fornecido). Colocar o esfregaço bucal (swab) dentro. Cortar o swab e fechar o tubo. Misturar por vortex. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente. 2) Adicionar 20µL de Proteinase K e 20µL de Carreador de RNA. Agitar no vortex. Incubar o microtubo de 1,5mL por 20 minutos a 56 C em agitação contínua em um termomixer. Nota: Se estiver usando um banho-maria, homogeneizar a amostra durante a lise de 2 a 5 vezes. 3) Retirar o swab com uma pinça e o esprema na parede do tubo. 4) Proceder como descrito no Protocolo 1, etapas de 4 a 11 12

13 PROTOCOLO 5 Extração de DNA viral de 200µL de sobrenadante de cultura celular Importante: Aliquotar a quantidade de Tampão de Eluição D necessária para o número de amostras e colocar em banho seco a 56 C. 1) Transferir 200µL de sobrenadante de cultura celular (meio de cultura de células) para microtubo de 1,5mL (não fornecido). Para as amostras que apresentarem um volume menor, completar o volume para 200µL com água (ultrapura ou bidestilada ou de injeção) ou PBS 1X. 2) Adicionar 200µL de Tampão de Lise HL, misturar completamente por pipetagem. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente em agitação constante. 3) Adicionar 20µL de Proteinase K e 20µL de Carreador RNA. Agitar por no vortex. Incubar o microtubo de 1,5mL por 15 minutos a 56 C em agitação constante em um termomixer. Nota: Se estiver usando um banho-maria, homogeneizar a amostra durante a lise de 2 a 5 vezes. 4) Proceder como descrito no Protocolo 1 etapas de PROTOCOLO 6 Extração de DNA viral a partir de 1 x 10 6 células de mamíferos Importante: Aliquotar a quantidade de Tampão de Eluição D necessária para o número de amostras e colocar em banho seco a 56 C. Coleta de até 1x10 6 células de mamíferos Crescimento celular em suspensão: Centrifugar as células 1x10 6 por 5 minutos a 1.500rpm. Descartar o sobrenadante e remover o meio completamente. Crescimento celular em monocamada: Em recipientes grandes (placas de Petri > de 35mm de diâmetro, frascos > que 12,5cm2) separar as células por tripsinização. Transferir as células para o microtubo de 1,5mL e sedimentar por centrifugação a 1.500rpm por 5 minutos. Remover o sobrenadante completamente. Em recipientes pequenos (placas de 96, 24, 12 e 6 poços, placas de Petri de 35mm de diâmetro, frascos de 12,5cm2) descartar o meio completamente e continuar com a lise imediatamente. Nota: remoção incompleta do meio de cultura de células inibirá a lise e diluirá o lisado que afetará a ligação do DNA com o filtro do Tubo Spin. 13

14 Romper as células por adição de Tampão de Lise HL Para pellet celular: Flicar o tubo para soltar o pellet celular e adicionar 200µL Tampão de Lise HL, 200µL de água (ultrapura, bidestilada ou de injeção) e misturar por pipetagem por 5 vezes. Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente. Adicionar 20µL de Carreador RNA e 20µL de Proteinase K. Agitar no vortex rapidamente. As células não devem ficar visíveis para dar início à próxima etapa. Pipetar a mistura lisada em um microtubo de 2mL (não fornecido). Para células monocamadas: Adicionar 200µL de Tampão de Lise HL, 200µL de água (ultrapura, bidestilada ou de injeção), e misturar por pipetagem por 5 vezes. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente. Adicionar 20µL de Carreador RNA e 20µL de Proteinase K às células monocamadas. Coletar as células lisadas com uma espátula de borracha. Misturar bem por pipetagem. As células não devem ficar visíveis para dar início á próxima etapa. Pipetar a mistura lisada em um microtubo de 2mL (não fornecido). 1) Colocar o tubo com a amostra em um termomixer e incubar com agitação contínua por 15 minutos a 65 C. Nota: Se estiver usando um banho-maria, homogeneizar a amostra durante a lise de 2 a 5 vezes. 2) Proceder como descrito no Protocolo 1, etapas da CONTROLE DE QUALIDADE O fabricante e o distribuidor garantem a função correta do BIOPUR Kit de Extração Mini Spin Vírus DNA para as aplicações conforme descritas neste manual, assegurando um produto de consistente qualidade. 12. INFORMAÇÕES PARA PEDIDO TAMANHO DA CÓDIGO DO PRODUTO EMBALAGEM PRODUTO BIOPUR Kit de Extração Mini Spin Vírus DNA testes BP BIOPUR Kit de Extração Mini Spin Vírus DNA testes BP

15 13. INFORMAÇÕES DO FABRICANTE SR Comércio de Produtos para Laboratórios Ltda. - EPP Rua Paraíso do Norte, CEP: Pinhais - PR Tel.: (41) Fax: (41) assessoriacientifica@srprodulab.com.br Site: CNPJ: / RESPONSÁVEL TÉCNICA Franciele Camila Kimura CRF/PR: DISTRIBUIDOR Biometrix Ltda. Rua Estrada da Graciosa, 1081, Curitiba Paraná Brasil - CEP: Tel.: (41) Fax: (41) DDG: biometrix@biometrix.com.br Site: CNPJ: /