CURSO ON LINE INTRODUÇÃO À BIOINFORMÁTICA. Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

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1 CURSO ON LINE INTRODUÇÃO À BIOINFORMÁTICA Prof. Dr. Francisco Prosdocimi 2007

2 ÍNDICE Pág. CAPÍTULO 1 UMA VISÃO GLOBAL DA BIOINFORMÁTICA O que é a bioinformática? O surgimento da bioinformática O que preciso saber para ser um bom bioinformata? Cursos de pós-graduação em bioinformática no Brasil Conversando sobre bioinformática BIOCHAT Referências Bibliográficas e textos complementares brainstorm 12 CAPÍTULO 2 GENOMA, BIOLOGIA MOLECULAR E COMPUTAÇÃO Introdução Sequenciamento do DNA Genômica As ômicas: integrando a bioinformação O PERL e outras linguagens de programação Referências Bibliográficas e textos complementares brainstorm 17 CAPÍTULO 3 ALINHAMENTO DE SEQÜÊNCIAS Introdução Alinhamento Global Alinhamento Local Alinhamentos ótimos e heurísticos Alinhamentos simples e múltiplos Matrizes de comparação Exemplos reais de alinhamentos Referências Bibliográficas brainstorm 28 CAPÍTULO 4 MONTANDO UM GENOMA Sobre genomas eucarióticos e procarióticos Base-calling Cross-match Agrupamento de seqüências Sobre a cobertura dos genomas Referências Bibliográficas brainstorm 35 CAPÍTULO 5 ANÁLISE DE TRANSCRIPTOMAS As ESTs Histórico das ESTs Agrupamento de ESTs O genoma e o transcriptoma SAGE Serial Analysis of Gene Expression Microarrays Referências Bibliográficas brainstorm 41 CAPÍTULO 6 BANCOS DE DADOS EM BIOLOGIA MOLECULAR Histórico Bancos primários e secundários GenBank e GenPept RefSeq O banco de dados de seqüências de referência SWISSPROT O maior banco de dados secundário de seqüências de proteínas Gene Ontology Sistema de classificação de genes de acordo com suas características Referências Bibliográficas brainstorm 47 CAPÍTULO 7 ANOTAÇÃO DE GENOMAS Introdução Anotação de Nucleotídeos Anotação de Proteínas Anotação de Processos A realização da Anotação Genômica (Sociologia da Anotação) Referências Bibliográficas brainstorm 53 CAPÍTULO 8 BIOINFORMÁTICA EVOLUTIVA E GENOMAS COMPLETOS Homologia, Ortologia e Paralogia COG Trabalhando com genomas completos Referências Bibliográficas brainstorm 58 CAPÍTULO 9 BIOINFORMÁTICA ESTRUTURAL Sobre a estrutura das proteínas Protein Data Bank: o banco de dados de estruturas de proteínas Modelagem molecular por homologia Alguns programas de modelagem molecular Threading CASP Critical Assessment of Structure Prediction Estrutura de um arquivo no formato PDB Referências Bibliográficas brainstorm 68 CAPÍTULO 10 CONCLUSÕES E PENSAMENTOS FILOSÓFICOS SOBRE A BIOINFORMÁTICA Sobre bioinformática, genoma e ciência Introdução Genoma e o método científico Um conceito de bioinformática Princípios paradigmáticos em bioinformática Conclusão brainstorm 74

3 PREFÁCIO Quando em 2002 realizei, concomitantemente ao meu mestrado em genética pela UFMG, o excelente curso de especialização em Bioinformática do LNCC, ministrado por muitos dos maiores especialistas em genômica e bioinformática de nosso país, tive o privilégio de ser um dos organizadores (e o primeiro autor) de um trabalho entitulado Bioinformática: manual do usuário em que todos os cerca de 20 alunos do curso se organizaram com o objetivo de gerar uma publicação básica sobre a área de pesquisa à qual nos estamos aprofundando e formando. Esta publicação foi finalmente publicada na revista Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento alguns meses depois. Tendo mantido meu contato com a editora da revista Biotecnologia, enquanto terminava meus estudos de doutoramento em bioinformática, recebi um convite para elaborar um curso on line a ser ministrado através do portal biotecnologia da Internet ( Este documento que agora vos apresento gratuitamente pela Internet ( Bioinfo.pdf) consiste exatamente neste curso, produzido em 2006 e ministrado em 2007 para uma turma de 40 alunos. Ainda que navegando por problemas técnicos, acredito que o curso foi bastante proveitoso e produtivo, sendo que a grande maioria dos alunos saiu do mesmo tendo adquirido conteúdo e aprendido a compreender muito sobre a lógica e o pensamento em bioinformática. Hoje, passados quase 4 anos que ministrei este curso pela Internet, vejo este documento arquivado entre meus arquivos do período jurássico e tenho pena de deixar este conhecimento perdido nos meandros digitais do meu disco rígido. Assim, contatei recentemente a editora da revista que lendo o contrato que fizemos à época e dizendo serem meus os direitos autorais desta apostila ou esboço de livro, informou-me que tenho o direito de publicar o presente documento na Internet para que se torne acessível a qualquer indivíduo interessado em aprender a arte e a ciência da bioinformática. Recomendou-me ainda que eu atualizasse as informações aqui presentes e publicasse um livro de verdade, a ser vendido nas livrarias. Tenho sim planos de fazê-lo, mas sei que precisaria reestruturar boa parte do que está aqui contido e, por falta de tempo para tanto, decido publicar esta versão gratuitamente pela Internet. Assim, caso haja interesse de leitores, estudantes ou editores, estarei disposto a atualizar estas informações e produzir uma segunda edição mais completa e atualizada sobre presentes assuntos. Brasília, numa quarta-feira de cinzas. 17/02/2010 Chico Prosdocimi

4 Aos meus pais

5 3 CAPÍTULO 1 Uma visão global da bioinformática Iniciando nossa Interação Nesta primeiro capítulo apresentaremos uma visão geral da bioinformática, vamos conversar sobre as necessidades e oportunidades de capacitação para quem deseja atuar nessa área O que é a bioinformática? Podemos considerar a bioinformática como uma linha de pesquisa que envolve aspectos multidisciplinares e que surgiu a partir do momento em que se iniciou a utilização de ferramentas computacionais para a análise de dados genéticos, bioquímicos e de biologia molecular. A bioinformática envolve a união de diversas linhas de conhecimento a ciência da computação, a engenharia de softwares, a matemática, a estatística e a biologia molecular e tem como finalidade principal desvendar a grande quantidade de dados que vem sendo obtida através de seqüências de DNA e proteínas. Para o desenvolvimento de genomas completos, a informática é imprescindível e a biologia molecular moderna não estaria tão avançada hoje, não fossem os recursos computacionais existentes O surgimento da bioinformática A bioinformática, apesar de ser uma ciência nova e em desenvolvimento, já apresenta uma figura clássica que freqüentemente é mostrada em qualquer palestra ou curso que se vá sobre a área. Essa figura, mostrando o crescimento exponencial do GenBank nos últimos anos, tenta mostrar que, mais do que uma abstração possível, a bioinformática é hoje uma necessidade para a análise de dados em biologia molecular. Desde que os seqüenciadores capilares de DNA em larga escala surgiram, no fim da década de 90, a quantidade de dados biológicos produzidas simplesmente alcançou níveis que fizeram com que análises manuais de seqüências de DNA se tornassem simplesmente alternativas absurdas para o estudo de dados de genoma e transcriptoma. Dois desenvolvimentos foram importantes para permitir tanto o surgimento da bionformática quanto o rápido desenvolvimento da produção de seqüências de DNA. O primeiro deles foi o sequenciamento capilar. Enquanto no passado as seqüências eram produzidas em placas enormes que deveriam ser corridas de forma uniforme e com um grande cuidado, com o desenvolvimento da tecnologia de sequenciamento capilar, a eletroforese ocorria dentro de tubos com a espessura de um cabelo humano, contendo uma solução polimérica por onde o DNA deveria passar guiado por uma corrente elétrica, como uma eletroforese normal. O outro grande desenvolvimento foi a marcação dos didesoxinucleotídeos necessários para o sequenciamento do DNA com moléculas fluorescentes. Enquanto as reações tradicionais eram realizadas com marcadores radioativos, que tornavam a metodologia um tanto quanto trabalhosa e

6 4 até mesmo perigosa, os marcadores fluorescentes permitiam maior segurança e ainda um novo avanço. Enquanto era preciso correr diferentes reações para cada nucleotídeo na marcação radioativa, a técnica de marcação fluorescente permitia que cada base fosse marcada com um diferente fluorocromo que era capaz de emitir luz em um diferente comprimento de onda se excitado por um laser. Essa luz, lida por um detector, informava ao sistema qual nucleotídeo passava em diferentes momentos da eletroforese. E foi exatamente a reunião desses dois desenvolvimentos num só aparelho que produziu o equipamento que posteriormente ficaria conhecido como o seqüenciador que criou a bioinformática. O primeiro desses aparelhos foi produzido pela empresa Applied Biosystems e foi chamado de ABI Prism Apresentava 96 colunas (ou capilares para a eletroforese) e permitia o sequenciamento de cerca de 550 bases em cada coluna, sendo oito vezes mais rápida do que a melhor concorrente da época e possibilitando o sequenciamento de até 1 milhão de pares de bases por dia. Além de permitir o rápido desenvolvimento da bioinformática, esse seqüenciador ainda geraria brigas políticas sobre quem é que deveria sequenciar todo o genoma humano, uma empresa particular ou o consórcio público, mas isso é outra história. Figura 1.1. Crescimento do Genbank. Crescimento exponencial do número de seqüências contidas no GenBank ao longo das duas últimas décadas. Obtido em O que importa é que, desde 1998, quando o ABI Prism foi lançado, outras empresas desenvolveram também seus seqüenciadores capilares de larga escala e o custo dessas máquinas que antes chegava a trezentos mil dólares foi aos poucos caindo e permitindo que mais e mais laboratórios pudessem ter seus próprios seqüenciadores. Cada vez mais dessas máquinas são vendidas ainda hoje e o número de seqüências de DNA produzidas vem aumentando exponencialmente até o presente momento. Leitura complementar:

7 O que preciso saber para ser um bom bioinformata? O profissional em bioinformática é raro no mercado, já que ele necessita saber e ser familiar a, pelo menos, três áreas distintas do conhecimento: a biologia molecular, a ciência da computação e a bioinformática per se. Além disso, conhecimentos em estatística e matemática são altamente recomendáveis. Imagine um biólogo que não tenha conhecimento de computação: ele será capaz de bolar uma infinidade de possíveis experimentos em bioinformática que gostaria que fossem gerados, mas será incapaz de colocá-los em prática. Do outro lado, um cientista da computação sem conhecimento em biologia e com sua característica ânsia de analisar dados, será capaz de pegar uma infinidade de dados biológicos e fazer uma grande quantidade de análises computacionais sem qualquer propósito, gerando resultados de difícil interpretação, por vezes ininterpretáveis ou sem qualquer sentido biológico. O trabalho em equipe, para a produção de projetos em bioinformática, pode ser interessante, desde que os profissionais trabalhem juntos todo o tempo. Reuniões apenas esporádicas normalmente fazem com que as idéias do trabalho do biólogo e do cientista da computação se afastem dos ideais iniciais da pesquisa. Isso no caso médio. É claro que é possível conseguir bons resultados em casos isolados. Considerando isso, torna-se necessário o desenvolvimento de um novo profissional, o bioinformata. Um biólogo que tenha tido uma formação parcial como cientista da computação ou vice-versa. Além disso, é preciso que tal profissional tenha ainda uma formação em bioinformática e que conheça profundamente as diferenças e as boas e más qualidades dos principais bancos de dados públicos sobre seqüências e estruturas de biomoléculas. Como não temos a intenção de ensinar biologia molecular ou ciência da computação, no presente curso daremos ênfase exatamente a esta última parte, que consiste na formação do bioinformata per si, que deve conhecer pelo menos o básico com relação à análise de genomas e as ferramentas e bancos de dados disponíveis na internet para o estudo dessa nova ciência. Com relação aos requisitos computacionais que serão apresentados apenas de passagem no presente curso, um profissional em bioinformática deve ter um bom conhecimento algum sistema operacional baseado em UNIX, sem qualquer sombra de dúvida. Quase todos os algoritmos utilizados para a pesquisa em bioinformática apresentam código aberto e são, freqüentemente, disponíveis apenas para sistema operacionais como o LINUX e o Solaris. Os programas de código aberto são aqueles nos quais os programadores disponibilizam todo o código fonte do programa para o usuário, que pode alterá-lo de acordo com a sua aplicação de interesse. E esse é também um dos motivos pelos quais os bioinformatas devem ser familiarizados com linguagens de programação. Um bioinformata que não sabe programar em uma linguagem qualquer tem dificuldades para se desenvolver e, portanto, o profissional deve estar ao menos apto a aprender alguma linguagem de programação. Outro conhecimento que gera um salto qualitativo na atividade do bioinformata é o conhecimento de bancos de dados e linguagem SQL. A linguagem SQL é a mais comumente utilizada em uma diversidade de bancos de dados e muitos sites disponibilizam informações armazenas em tabelas e bancos de dados inteiros. Devido à sua gratuidade e eficiência, o banco de dados mais utilizado em bioinformática é o MySQL, mas quaisquer outros podem ser utilizados sem demais inconvenientes. Mas mais importante ainda do que ser capaz de obter os bancos de dados públicos é o bioinformata ser capaz de criar seus próprios bancos de dados, organizando as informações de seu projeto e permitindo tanto um bom armazenamento quanto organização e fácil acesso aos dados. Além disso, o conhecimento de plataformas para disponibilizar dados para os pesquisadores é interessante e o bioinformata deve ter algum conhecimento de linguagem HTML e, de preferência alguma linguagem de

8 6 programação para a internet, como o CGI ou o PHP, sendo que esse último ainda apresenta a vantagem de permitir fácil conexão com bancos de dados. É claro que a gama de conhecimento necessária para exercer bem uma profissão qualquer tende a ser infinita, mas é indispensável ao menos que o bioinformata seja proficiente em uma linguagem de programação e tenha bons conhecimentos de biologia molecular, dos bancos de dados e das ferramentas a serem utilizadas em cada caso. Aqui, iremos passar apenas de leve em programação e biologia molecular na próxima aula e depois passaremos direto para a parte que explica e mostra quais são as principais ferramentas utilizadas em análises genômicas e os principais bancos de dados que devem ser consultados em diferentes aplicações Cursos de pós-graduação em bioinformática no Brasil Até o presente momento parecem existir apenas três cursos de pós-graduação em bioinformática no Brasil. O primeiro e mais tradicional deles é o curso de pósgraduação Lato Sensu em Bioinformática do LNCC, cuja página oficial pode ser vista em Três turmas de alunos já graduados de todo o país já foram formadas por esta pós-graduação, inclusive o presente autor desse curso online, quem vos escreve. Consiste num ótimo curso de especialização, no qual os maiores expoentes do país na área são chamados para ministrar diferentes aulas nos campos da genômica, transcriptômica e proteômica. Além desse curso de pósgraduação, que dura cerca de três meses e meio, o LNCC também oferece cursos esporádicos com duração entre duas semanas e um mês e recomenda-se visitar a página do LNCC para mais informações ( Logo a CAPES percebeu a importância de se abrirem cursos nessa área estratégica e propôs um edital para a formação de cursos de doutorado em bioinformática. A partir daí dois novos cursos de doutorado em bioinformática foram criados, um na USP (setembro de 2002) e outro na UFMG (abril de 2003). Para mais informações, visite o site dos programas e Conversando sobre bioinformática BIOCHAT A revista biotecnologia promove esporadicamente o chamado biochat, que consiste em uma conversa com um pesquisador experimente de uma determinada área do conhecimento. Abaixo transcrevo um dos biochats realizado com o autor do presente curso, onde várias dúvidas básicas sobre o assunto podem ser sanadas. Assunto do Biochat: Conceitos e Paradigmas em Bioinformática Pesquisador entrevistado: Francisco Prosdocimi Há uma grande confusão com relação ao que seja a bioinformática, sendo que muitos ainda acreditam que qualquer aplicação da computação à biologia possa ser referenciada como "bioinformática". Ao observarmos os trabalhos recentemente publicados na área, podemos dividí-los em três correntes básicas ou princípios paradigmáticos, chamados metaforicamente de "o tijolo", "a peneira" e "a lupa". Tais princípios serão apresentados e discutidos durante o BIOCHAT. Além disso, é interessante discutirmos quais seriam os pré-requisitos básicos para formar um bioinformata, tanto na área computacional quanto na área biológica. Do que, afinal, é feito um bioinformata e o que ele precisa conhecer é tema recorrente entre os curiosos sobre a área.o conceito da bioinformática, seus princípios paradigmáticos e a formação do bioinformata serão, portanto, os temas a serem discutidos neste BIOCHAT.

9 7 Dr. Francisco Prosdocimi Vanderson: Dr. Francisco Prosdocimi Adonis: Dr. Francisco Prosdocimi Pedro: Dr. Francisco Prosdocimi Francisco: Dr. Francisco Prosdocimi Adonis: Dr. Francisco Prosdocimi Pedro: Dr. Francisco Prosdocimi Boa noite a todos! Está aberto nosso biochat sobre bioinformática. Por favor, enviem suas dúvidas para que possamos discutir e trocar idéias a respeito do assunto. Grande Francisco... Afinal, qual o conceito mais aceito para Bioinformática? Olá Vanderson. Fico agradecido pela sua presença. Na verdade existem vários conceitos para bioinformática e muita confusão é feita sobre o tema. Na minha opinião a bioinformática surgiu com o boom dos sequenciadores automáticos de DNA e ainda hoje está ligada a análises de seqüências de biomoléculas. Biologia computadorizada? Ouvi este termo e queria saber qual é a diferença disso para Bioinformática? Pois é, meu prezado Adonis. A biologia computacional diz respeito a qualquer aplicação da computação na área biológica, enquanto a bioinformática está freqüentemente associada a analise de seqüências de genoma, transcriptoma e proteoma. Esses conceitos entretanto são bastante maleáveis e modificam-se todos os anos. Boa noite Dr. Francisco. Sou estudante do curso Bacharelado em Bioquímica, na Universidade Federal de Viçosa e tenho direcionado a minha formação acadêmica para me tornar... Com relação aos cursos específicos para bioinformática, eles existem no Brasil apenas em nível de pós-graduação. Sendo que um deles é o curso de especialização lato sensu do LNCC, no qual acontece a formação de especialistas em bioinformática. Na USP e na UFMG existem cursos de doutorado em bioinformática, onde tais profissionais são formados. Eu, a propósito, fui aluno do LNCC e fui também o primeiro aluno a defender o doutorado em bioinformática na UFMG. Gostaria que vc respondesse o Pedro Marcus pq eu tenho a mesma dúvida... Com relação a cursos de graduação, meu prezado xará, ainda não existem na área e recomendo que vc faça um curso de biologia ou de computação, se pretende seguir carreira em bioinfo. então bioinfo está dentro da biologia computacional? Concordo, Adonis. Na minha opinião a bioinformática é, sim, uma parte da biologia computacional, sendo essa última uma área bastante ampla e não necessariamente relacionada com biologia molecular. Embora, repito, esses conceitos são maleáveis e modificam-se com o desenvolver das ciências. Qual a sua experiência com a Bioinformática? O senhor trabalha mais no meio acadêmico ou se relaciona diretamente com o mercado de trabalho? Trabalho com bioinformática desde 2000, tendo tido anteriormente uma formação como biólogo molecular em bancada. Fiz minha monografia de bacharelado, minha dissertação de mestrado (em genética) com análises de transcriptomas do verme Schistosoma mansoni e fui o primeiro aluno a defender o doutorado em bioinformática na UFMG trabalhando com análises de qualidade de seqüências de DNA e genômica comparativa. Sempre trabalhei mais voltado para o meio acadêmico, mas já fiz também alguns trabalhos em parceria com uma empresa de Belo Horizonte na área de bioinformática. A empresa se chama vetta technologies.

10 8 Vanderson: Dr. Francisco Prosdocimi Adonis: Dr. Francisco Prosdocimi Paulo: Dr. Francisco Prosdocimi Pedro: Dr. Francisco Prosdocimi Marx: Dr. Francisco Prosdocimi Adonis: Pegando a deixa do Pedro, você acha que há mercado de trabalho para bioinformatas no Brasil... além das instituições públicas e da Alellyx? Infelizmente, meu amigo Vanderson, não acredito que haja ainda mercado de trabalho para bioinformática fora das universidades, embora o campo na área de biotecnologia tenha crescido e venha crescendo. A existência de algumas empresas trabalhando em biotecnologia é muito pequena ainda no Brasil e apenas a Alellyx e a Scylla têm alguma representatividade no mercado. Ou seja, a bioinformática ainda é matéria para cientistas financiados pelo governo. Qual seria a dica para trabalhar com bioinfo em um lugar onde não se faça molecular? A dica é estar em parceria com pesquisadores que tenham perguntas que só possam ser respondidas através de análise computacional. Eu mesmo tenho várias colaborações com diferentes laboratórios e produzi um software recentemente, o TGFinder, que surgiu como uma necessidade de um pesquisador de encontrar genes controlados por fatores de transcrição. Além disso, o GenBank possui tantas seqüências depositadas e tanta informação a ser mineirada que nem todos os cientistas do mundo seriam capazes de tudo analisar. É claro que a pesquisa de ponta é normalmente aquele onde se produz e se analisa um novo dado em biologia molecular, mas há muito ouro a ser peneirado nos bancos de dados públicos. Olá Dr. mas como é aplicada a computação ou informática, na biologia,neste sequenciadores automáticos de DNA? A computação é aplicada, principalmente, na análise e identificação das seqüências de DNA que saem dos sequenciadores automáticos. A seqüência sai de lá como um monte de A, C, T e G... que não querem dizer nada. O que significa para você isso aqui: ACATAGGGACATTACAGAGCATTCAGA? Somente com a bioinformática conseguimos atrelar a informação codificada em informação biológica, associando A, C, T e G a algum nome de gene com alguma função especifica... Aprofundando mais a discussão, a iniciativa privada na bioinformática está... O grande problema, Pedro, é que acredito que dificilmente a bioinformática per se pode dar algum lucro. Por exemplo, a empresa Alellyx tem, além de um grande know how em bioinfo, um grande know how em biologia molecular e em genômica. A descoberta de novos genes 'apenas' por bioinfo é muito difícil e é preciso estar sempre sequenciando novos organismos. E um sequenciador de DNA é muito caro para que pequenos empresários possam comprar, o capital inicial de uma empresa de biotecnologia apresentando bioinformática é muito alto. E fora do Brasil, como estão as perspectivas? Fora do Brasil eu acredito que haja bastante espaço, sim, para bioinformatas. Assino uma lista de jobs em bioinformática e freqüentemente vejo pedidos para profissionais da área... o único problema é que normalmente exige-se grande experiência prévia, o que não temos ainda no Brasil -- profissionais qualificados. Dr. Francisco Prosdocimi, fale um pouco sobre mineração de dados já que esta é o etapa seguinte depois da geração das seqs.

11 9 Dr. Francisco Prosdocimi Pedro: Dr. Francisco Prosdocimi Paulo: Dr. Francisco Prosdocimi Vanderson: Dr. Francisco Prosdocimi Carla: Dr. Francisco Prosdocimi Adonis: Dr. Francisco Prosdocimi Bem, caro Adonis, isso me remete aos princípios paradigmáticos da bioinformática que apresentei no texto introdutório. Acredito que os trabalhos atuais em bioinformática podem ser divididos em três correntes principais, os trabalhos de tijolo -- onde ferramentas de bioinformática são produzidas para construir os edifícios genômicos, os trabalhos de peneira -- onde a mineração da grande massa de dados em genômica são analisados mais especificamente em vários contextos -- e os trabalhos de lupa, onde a genômica encontra a ciência e o método científico de observação, hipótese, experimentação e resultados são novamente retomados. Escrevi um trabalho sobre isso para a revista ciência hoje que foi publicado em Trabalho atualmente no BIOAGRO-UFV (Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária) no Laboratório de Bioinformática, desenvolvendo softwares de análise populacionais (genética de populações). Você considera válido esse tipo de iniciativa ou seria melhor eu estar trabalhando mais especificamente com a biologia molecular? Considero muito válido seu trabalho. Mas também já tentei produzir algo relacionado a genética de populações e acho muito difícil produzir algo melhor do que os já conhecidos programas PAUP, PHYLIP, MEGA, dentre outros. Boa sorte! Poderíamos ou podemos, descobrir qual a seqüência para uma determinada proteína ou característica. Ou para identificar estes pares, para saber qual proteína ela vai produzir, seria isto? Podemos sim, saber qual a seqüência de DNA é relativa a uma determinada proteína e, muitas vezes, uma característica. Existe até mesmo um projeto conhecido como FENOMA, que tenta identificar os genes responsáveis por algum fenótipo (característica). O que acontece, entretanto, é que grande parte das características são geradas através de um grande número de genes que interagem entre si e fazem da análise algo complicadíssimo! Tenho uma opinião a expressar... Um grande problema que eu percebo na maioria dessas ferramentas de bioinformática é o total descaso com usuários Concordo plenamente, Vanderson. Biólogos não estão interessados em utilizar sistemas linux, linhas de comando e outros artifícios computacionais de start-up razoavelmente complexo. Interfaces gráficas e fáceis, de preferência via web e bastante user-friendly são altamente recomendáveis. Mas é preciso dizer que há também programas com manuais completos e simples, mas o usuário parece ter preguiça de lê-los, o que definitivamente é preciso fazer. Por acaso já se pode analisar um gene pelo computador? É claro, Carla, os genes são formados por seqüências de nucleotídeos que são representadas por A, C, G e T, transformando as seqüências dos genes em letrinhas que são analisadas e comparadas entre diferentes espécies animais. É real a migração de perl para java? ou isso só tá ocorrendo no meio privado? Essa migração seria um preocupação com uma interface mais amigável? Caro Adonis, acredito que a migração de PERL para JAVA está relacionada ao fato de que a linguagem JAVA é multiplataforma, além de ser nativamente orientada a objetos, o que facilita a criação de programas mais complexos e de grande porte. Acredito que os scripts

12 10 Carla: Dr. Francisco Prosdocimi Macedo: Dr. Francisco Prosdocimi Pedro: Dr. Francisco Prosdocimi Dani: Dr. Francisco Prosdocimi Pedro: Dr. Francisco Prosdocimi freqüentemente utilizados em trabalhos de bioinformática devem continuar sendo produzidos em PERL, que é uma linguagem onde a expressão regular é nativa e rápida, sendo mais apropriada para tais trabalhos. Sim, a migração também pode estar relaciona com uma interface mais amigável, já pronta em vários objetos JAVA. Como o Brasil está em relação a outros paises, nesse desenvolvimento? O nosso país valoriza a bioinformática? O Brasil anda atrás dos países desenvolvidos quando o assunto é bioinformática e, apesar de que recentes iniciativas da CAPES e do CNPq vêm tentando buscar equiparação internacional, a bioinformática brasileira ainda está em seu berço (esplêndido). Boa noite Dr. Gostaria de saber sobre o cenário de Software Livre x Software Proprietário em bioinformática. O Sr. acredita que a adoção do software livre pode ajudar na redução de gastos em pesquisa e desenvolvimento e que isso possibilitará o estudo de doenças negligenciadas? Ou o segmento acadêmico enxerga o software livre apenas como ª... No caso da bioinformática posso assegurar que mais de 95% dos softwares são livres ou de livre acesso (pelo menos para o meio acadêmico) e cerca de 50% são de livre acesso para todos. Por isso, a bioinformática exige um custo inicial para pesquisa bem baixo e esse é mais um dos motivos pelos quais essa ciência deveria ser mais incentivada em nosso país. Com um computador razoável e boas idéias é possível fazer boa bioinformática!!! Uma empresa privada que prestasse suporte em bioinformática (desenvolvendo softwares sequenciadores para organismos específicos ou que atendessem alguma demanda de determinada pesquisa, com uma interface mais amigável com o usuário final) poderia dar certo? Não estou bem certo, Pedro. O problema é que a idéia para elaboração de softwares teria de vir da academia e não sei o pessoal das universidades estaria disposto a dar a idéia para que vc fizesse o software para eles comprarem, entende? Eles prefeririam pedir no departamento de computação para ver se algum outro aluno faria o mesmo software de graça, gerando um trabalho publicável em conjunto. A menos que vcs produzissem um pacote grande, para uma ampla gama de aplicações... aí vc poderia dar certo com sua empresa... Um profissional em bioinformática deve saber tanto trabalhar com os softwares de análises de seqüências quanto desenvolver novos programas? Quais são as linguagens de programação mais utilizadas para este fim? Ótima pergunta, Dani. É imprescindível para o profissional de bioinformática, na minha opinião, ter quatro conhecimentos básicos: (1) Ele deve entender bem biologia molecular, (2) saber trabalhar com os bancos de dados disponíveis na internet, (3) saber BEM uma linguagem de programação e (4) saber manipular bancos de dados. Estes, na minha opinião, são os principais requisitos para formar um bioinformata. Você contrataria uma empresa dessa natureza para dar suporte às suas pesquisas ou prefere, você mesmo, desenvolver os aplicativos com que trabalha? Depende do quanto de trabalho fosse necessário. Se fosse pouco trabalho, eu mesmo desenvolveria. Se necessitasse de um software

13 11 Fabio: Dr. Francisco Prosdocimi Pedro: Dr. Francisco Prosdocimi Dani: Dr. Francisco Prosdocimi Dani: Dr. Francisco Prosdocimi Ricardo: Dr. Francisco Prosdocimi amplo, talvez preferisse pagar... mas dependeria de financiamento governamental para isso... e o governo não gosta muito do assunto 'comprar softwares de empresas privadas para trabalhos científicos'. No último edital do CNPq para bioinfo, enviamos um projeto tentando comprar um software e o projeto não foi aprovado... possivelmente por este único motivo. Boa Noite Dr. Francisco, participei da primeira turma de especialização em bioinformática do LNCC, atualmente estou fazendo doutorado em microbiologia na UFRJ. Gostaria de saber na sua opinião quais são as principais diferenças dos cursos de doutorado em Bioinformatica da USP e da UFMG? Fala, Fábio. É com receber companheiros por aqui... fui seu sucessor no LNCC, participando da segunda turma. Não posso dizer muito do curso de doutorado na USP, o qual conheço pouco. Mas ao que me parece o curso da USP é muito voltado para as ciências exatas, tendo uma alta carga de disciplinas de matemática e estatística. Aqui na UFMG a carga de disciplinas é bem balanceada e leve, de forma que o aluno possa se preocupar mais com seu projeto de tese. A quantas anda o desenvolvimento das pesquisas em bioinformática aqui no estado de Minas Gerais? Aqui em Minas temos alguns grupos de bioinformática montados. Não posso dizer que conheço todos eles, mas aqui na UFMG temos ao menos uns três grupos de bioinformática, trabalhando com genoma de 'Schistosoma mansoni', genômica comparativa e genômica evolutiva, mas as coisas ainda são um pouco precárias e a infra-estrutura não é das melhores. Sou bióloga, especialista em biotecnologia - trabalho com saneamento - área ambiental - - mas tenho grande interesse em bioinformática. Quais são os conhecimentos básicos de informática que um biólogo deve ter para iniciar um mestrado em bioinformática? Bem, não conheço nenhum mestrado em bioinformática e acho que -- se houvesse algum -- o aluno deveria conhecer o básico de sistemas linux e linguagens de programação. Mas dependendo, se o mestrado for para biólogos ou para computólogos, os conhecimentos a serem exigidos são diferentes. Se for um mestrado para biólogos é possível que não seja necessário nenhum conhecimento de informática e todo o conhecimento pode ser adquirido quando da realização do curso. Qual é campo de trabalho para um pós-graduado em bioinformática, além do desenvolvimento de pesquisas em universidades, fundações de pesquisa Federais,Estaduais e a Licenciatura? Bem, essa pergunta é um tanto quanto capciosa. Se uma pessoa formou em bioinformática, imagino que ela queira fazer pesquisa ou dar aulas. É claro que ela pode também trabalhar em alguma empresa de biotecnologia ou de bioinformática per si... mas acredito que aí ela teria que ir pra fora do Brasil... Quais são os trabalhos que vc está fazendo ultimamente na área? Olá, Ricardo. Ultimamente tenho trabalhado com análises do software PHRED, com a montagem de um programa para simular a evolução em locos de microsatélites, trabalho também com a diferença na utilização de aminoácidos por proteínas de diferentes organismos, com a origem do código genético, com famílias de proteínas dedos de zinco, dentre diversas outras coisas.

14 12 Pedro: Dr. Francisco Prosdocimi Pedro: Dr. Francisco Prosdocimi Pedro: Dr. Francisco Prosdocimi Então, estarei entrando em contato com o senhor (pois estou na organização do evento). Mais uma pergunta, ainda é muito cedo para pensarmos em cursos de graduação em bioinformática no Brasil? Ok. Acho que um curso de graduação em bioinformática poderia ser bastante interessante sim, mas acho que é cedo para isso. Ainda não há, só pra vc ter uma idéia, um conceito amplo do que seja bioinformática e é preciso que esta disciplina fique mais madura ao longo dos anos para que esse conceito brote claramente. Acho que os biólogos moleculares atualmente são os principais candidatos a se tornarem bioinformatas e não há nem cursos de graduação em biologia molecular... pelo menos desconheço... A título de informação: foi criada na grade curricular do Bacharelado em Bioquímica-UFV a BQI460 (Bioinformática), onde serão abordados os principais aspectos dessa nova área do conhecimento. Bem, aqui na UFMG o prof. Miguel Ortega já ministra à mais de dois anos uma matéria de tópicos em bioquímica e biologia molecular cujo assunto é a bionformática. É bastante interessante que a universidade de Viçosa tenha proposto uma disciplina específica sobre o assunto e mostra como está atualizada com relação aos novos avanços da biologia molecular. O que você considera como maior desafio para a consolidação da Bioinformática no Brasil? Considero o maior desafio a formação dos profissionais e a montagem de infra-estrutura adequada e de computadores de alto-desempenho para as análises mais elaboradas na área Referências Bibliográficas e textos complementares 1 Davies, K. (2001). Decifrando o genoma. Companhia das letras. 2. NCBI: A Science Primer NCBI: A Science Primer Bioinformatics Chico On Line Bioinformática GenBank Stats Brainstorm 1. Dê sua opinião sobre o que entende por bioinformática e qual a importância da área. 2. Vá ao site do NCBI (National Center for Biotechnology Information, o centro americano para informação biotecnológica, leia e navegue um pouco. Encontre algum serviço interessante e reporte sua experiência.

15 13 CAPÍTULO 2 Genoma, biologia molecular e computação 2.1. Introdução Como já foi dito, o presente curso não tem como função explicar genômica, biologia molecular ou computação. Ainda assim, alguns conceitos se tornam importantes para que possamos seguir o curso e neste capítulo estaremos nos dedicando a eles Sequenciamento do DNA Figura 2.1. O dogma central da biologia molecular. Da análise de DNA temos os projetos genoma, da análise do conteúdo de RNAs mensageiros de uma célula produzimos estudos de transcriptoma e a partir da análise de conteúdo protéico geramos os projetos proteoma. A bioinformática surgiu a partir da biologia molecular e dela ainda é inseparável (figura 2.1). No capítulo anterior, aprendemos que a bioinformática se desenvolveu principalmente depois do surgimento dos seqüenciadores de DNA em larga escala, como o ABI Prism A reação de sequenciamento de DNA consiste basicamente em um processo de amplificação da molécula de DNA de interesse. Entretanto, durante essa amplificação, são utilizados tanto os nucleotídeos normais de DNA, conhecidos como desoxiribonucleotídeos quanto alguns nucleotídeos especiais, conhecidos como di-desoxiribonucleotídeos. A diferença entre eles é que os didesoxinucleotídeos apresentam, como o nome diz, uma molécula de oxigênio a menos, eles não contém uma extremidade 3 OH livre. Assim, se lembrarmos como é formado o esqueleto de uma cadeia de DNA, veremos que os nucleotídeos adjacentes são ligados entre si através de uma ligação com um grupamento fosfato exatamente na posição do carbono 3. Isso significa que, um nucleotídeo que não apresente um grupamento OH nesta posição (chamado di-desoxiribonucleotídeo ou simplesmente didesoxinucleotídeo) impede a ligação de um nucleotídeo em seguida, o que interrompe a cadeia de DNA naquela posição. Assim, durante a amplificação em que consiste a reação de sequenciamento do DNA, são produzidas moléculas de diferentes tamanhos, sendo que cada uma delas possui, na sua extremidade, um didesoxinucleotídeo que impede a ligação de outros nucleotídeos a seguir. Além disso, dependendo de qual base ele carrega, cada um desses nucleotídeos sem a extremidade 3 OH livre

16 14 apresenta um pigmento fluorescente diferente adicionado. Após a reação de sequenciamento que é realizada num termociclador, assim como um PCR --, as moléculas resultantes são submetidas a uma eletroforese. Nesse procedimento, o DNA resultante da amplificação é submetido a um gradiente elétrico dentro de uma matriz de gel, que permite uma mobilidade diferencial das moléculas. As moléculas pequenas de DNA movem mais rapidamente para o pólo positivo durante essa eletroforese. Essas moléculas pequenas foram aquelas que incorporaram didesoxinucleotídeos mais precocemente do que as outras. E assim, elas vão se movendo na matriz gelatinosa mais rapidamente, indo em direção ao pólo positivo. Quando chegam próximo ao pólo, um laser incide sobre essa molécula e, dependendo de qual didesoxinucleotídeo foi incorporado em sua extremidade final, o laser promove a incidência da fluorescência num receptor que capta, afinal, qual foi o comprimento de onda daquele fluoróforo excitado. Assim, conseguimos descobrir qual foi a última base daquela molécula já que diferentes didesoxinucleotídeos -- com diferentes bases nitrogenadas (A, C, G ou T) --, produzem fluorescência diferente a ser captada pelo laser e, dessa forma, sabemos se a última base daquela molécula é uma adenina, uma guanina, uma citosina ou uma timina. E à medida que as moléculas vão passando pelo gel, cada uma contendo a diferença de um único nucleotídeo marcado de acordo com sua base, o computador vai gerando um perfil de fluorescências que posteriormente serão transformadas nas letras que representam a seqüência de bases da molécula original por algoritmos específicos, que trataremos posteriormente neste curso. Não é tarefa fácil explicar na forma de texto como é realizado o sequenciamento do DNA e, por isso, recomendo aos alunos acessarem o seguinte site para entenderem melhor como o seqüenciamento do DNA é realizado, passo a passo: Outras animações interessantes em biologia molecular (como a da técnica de PCR de amplificação do DNA ou técnicas forenses baseadas em DNA) podem ser obtidas no mesmo site. É preciso, entretanto, fazer o download gratuito do programa macromedia shockwave Genômica Um genoma consiste no conjunto haplóide de informações presentes no DNA de um determinado organismo. O conjunto é haplóide porque, na verdade, um organismo diplóide apresenta uma dupla cópia de um mesmo segmento de DNA, presente nos cromossomos homólogos. Assim, não faz sentido ter essa redundância de informação e, por isso, considera-se o genoma como sendo o conjunto haplóide de informação genética. Para obter uma seqüência genômica devemos pegar as células de um determinado organismo, purificarmos seu DNA e realizarmos a construção da chamada biblioteca de DNA genômico. Para tal, o DNA do organismo deve ser picotado em pequenos pedacinhos e ligado nos chamados vetores de clonagem -- que podem ser plasmídeos, cosmídeos ou vetores que permitem a inserção de segmentos grandes de DNA, como os BACs ou YACs que são, respectivamente, os cromossomos artificiais de bactérias e leveduras. A partir desses vetores é que são, freqüentemente, seqüenciados os segmentos de DNA e cada reação de sequenciamento produz moléculas apresentando algo entre trezentos e mil pares de bases. Como os genomas são muito maiores do que esse tamanho, mostra-se necessária a montagem do genoma utilizando algoritmos de sobreposição de seqüências, que serão apresentados em aula posterior. E se o genoma consiste no sequenciamento da molécula de DNA de uma determinada célula, o transcriptoma consiste no sequenciamento do conteúdo de RNA mensageiro (mrna) produzido em uma determinada célula sujeita a determinada condição. Enquanto uma célula apresenta apenas um genoma estático e imutável, a

17 15 mesma pode apresentar milhares de diferentes conteúdos de transcriptoma, já que a expressão de genes depende de diversos fatores, como o grau de maturação da célula, a temperatura à qual ela está sujeita, os nutrientes presentes no meio, a presença de algum agente mutagênico específico e mais milhares de outros fatores. Assim, os estudos de transcriptoma podem mostrar a adaptação da célula a determinada condição e podemos estudar os genes que ficam ativos quando dessa condição. Na produção de um projeto transcriptoma (ou de genômica funcional, como também é freqüentemente chamado) deve-se purificar o conteúdo de mrna da célula da condição desejada. Como o RNA é uma molécula muito instável, realiza-se sua transcrição reversa, transformando este RNA numa molécula conhecida como cdna, que representa o DNA complementar à seqüência daquele mrna. Esse cdna é então clonado em vetores de clonagem para a produção da biblioteca de cdna que contém uma amostra fiel dos mrnas que foram produzidos pela célula naquela condição. Vale notar que, enquanto no genoma observa-se normalmente apenas uma cópia de cada gene, nas análises de transcriptoma, cada um dos genes pode estar amostrado dezenas de vezes, pois a célula pode estar precisando do mesmo para realizar algum tipo de processo e ele pode ter sido transcrito centenas de vezes em moléculas de mrna As ômicas: integrando a bioinformação Veja o artigo publicado na edição 32 da revista biotecnologia: O pesquisador da Embrapa Soja, Eliseu Binneck, apresenta o status atual da genômica no mundo e ainda vários conceitos importantes de biologia molecular e genômica. Binneck, Eliseu. As ômicas: integrando a bioinformação. Biotec Ci & Des 32: O PERL e outras linguagens de programação No capítulo anterior discutimos sobre os conhecimentos relevantes para um profissional na área de bioinformática. Nesse momento, portanto, gostaria de falar mais um pouco sobre a informática utilizada para a análise de seqüências. É extremamente importante que qualquer pessoa trabalhando na área de bioinformática conheça alguma linguagem de programação. E a principal linguagem utilizada por profissionais da bioinformática é o PERL. O PERL é uma linguagem de script que foi criada em 1987 por um cientista da computação chamado Larry Wall e é uma sigla para Practical Extraction and Report Language ou, em português, Linguagem Prática de Extração e Relatório. Segundo a wikipedia ( a origem do PERL remonta ao shell scripting, que é a programação em linhas de comando, ao awk, uma outra linguagem bem simples de programação shell e à linguagem C, uma das mais utilizadas pelos programadores. Essa linguagem é disponível para praticamente todos os sistemas operacionais, mas é utilizada mais freqüentemente em sistemas Unix e compatíveis. E o PERL é freqüentemente utilizado pelos bioinformatas porque é uma linguagem montada para trabalhar facilmente com o processamento de cadeias de caracteres (chamadas de strings pelos informatas), permitindo ainda uma fácil manipulação de arquivos texto e a utilização das chamadas expressões regulares, muito úteis para se realizar busca em seqüências de caracteres. Como tanto o DNA

18 16 quanto o RNA e as proteínas podem ser facilmente representados por seqüências de caracteres nucleotídeos ou aminoácidos, representados por seqüências de uma letra --, o PERL acabou por permitir, intrinsecamente, uma fácil manipulação dos dados de biologia molecular. Um exemplo simples de programa em PERL é apresentado abaixo para transformar uma seqüência de DNA de entrada em uma nova seqüência de RNA. O programa considera que a fita de DNA de entrada é a fita codificadora e, portanto, o programa apenas transforma as letras T, de timina, do DNA em letras U, de uracila, representando as bases do RNA. Pequeno script PERL para obter uma fita de RNA a partir de uma fita de DNA. #!/usr/bin/perl # Seqüência que se deseja utilizar $meudna= TTCCGAGCCAATTGTATCAGTTGCCAATAG ; # Faz com que a seqüência de RNA receba a mesma seqüência do DNA $meurna = $meudna; # Troca as bases produzindo a fita complementar $meurna =~ tr/t/u/; print Minha seqüência de RNA é: \n $meurna ; A primeira linha é obrigatória e diz ao programa o caminho onde se encontra o interpretador PERL para que o programa possa encontrá-lo na hora de sua execução. Normalmente o PERL está disponível no diretório /usr/bin das distribuições Unix. Vale notar que, ao contrário da grande maioria das outras linguagens de programação normalmente utilizadas, um programa PERL não é compilado de forma a gerar um executável em linguagem de máquina. O script PERL necessita, portanto, de que exista um interpretador PERL instalado em alguma pasta de trabalho dentro do computador e é exatamente a pasta onde esse interpretador está localizado que deve aparecer nesta primeira linha de código. As linhas do script que se começam com o sinal # representam linhas de comentário e servem apenas para facilitar o entendimento do código, não sendo realmente lidas pelo interpretador. Todas as variáveis em programação PERL são precedidas do sinal de dólar $, elas não têm um tipo prédefinido (como inteiro, booleano, real, etc.) e não precisam ser declaradas anteriormente, cabe ao programador saber como e em que contexto devem ser utilizadas. Há também as variáveis do tipo array, que são precedidas do sinal e as variáveis do tipo hash, que devem ser precedidas do sinal de %. Todos os comandos terminam sempre com um sinal de ponto-e-vírgula. Neste exemplo, a linha que realmente faz a tradução de uma seqüência de DNA para uma seqüência de RNA é a que apresenta o sinal =~. Esse sinal está relacionado à utilização de uma expressão regular que, no caso, faz a tradução de todos as letras T de uma seqüência de caracteres, transformando-as em letras U. No fundo, a bioinformática e, num sentido mais amplo, todo software -- pode ser desenvolvido utilizando-se qualquer linguagem de programação e há os que ainda preferem utilizar a linguagem C ou Java para produzir qualquer tipo de programa. No fundo, essa é uma opção pessoal e por mais que uma ou outra linguagem seja mais adaptada ou mais rápida para determinado problema, é possível fazer quase qualquer coisa com quase qualquer linguagem. Entretanto, mesmo essa simples tradução que fizemos de DNA para RNA com apenas uma linha de código, pode se tornar mais árdua quando realizada em diferentes linguagens e é exatamente por isso que o PERL é mais utilizado na área; por facilitar a programação. Para sistemas mais complexos, no

19 17 entanto, parece ser consenso que a utilização de uma linguagem de programação multi-plataforma, como é o caso do Java, seja mais adequada Referências Bibliográficas e textos complementares 1. Dolan DNA Learning Center - Biology Animation Library Binneck, Eliseu. As ômicas: integrando a bioinformação. Biotec Ci & Des 32: Perl, Wikipedia Brainstorm 1. Você viu a animação sobre como é feito o sequenciamento do DNA, descreva agora as etapas através das quais é realizada esta técnica. 2. Descreva como são feitos projetos genoma e transcriptoma. 3. Perguntas sobre o texto escrito por Binneck. a. Apesar de apresentarem um número de genes bastante similar a outros organismos, diz-se que os seres humanos apresentam uma diversidade de proteínas muito maior do que eles. A que se deve tal diversidade? b. Qual a porcentagem do genoma humano que é responsável pela produção de genes/proteínas? E o resto, qual seria o motivo se é que há algum para haver tanto DNA não codificante no genoma? c. Você acredita que genes que alteram seus padrões de expressão em conjunto possam ter funções parecidas? Por quê? d. Escolha duas das ciências ômicas e descreva-as e. Discorra sobre o papel da bioinformática na agregação de dados em biologia 4. Com relação a linguagens de programação, por que o PERL é conhecido como a linguagem dos bioinformatas? Os dados em bioinformática podem ser tratados com outras linguagens de programação? Cite outra linguagem possível.

20 18 CAPÍTULO 3 Alinhamento de Seqüências 3.1. Introdução O alinhamento de seqüências consiste no processo de comparar duas seqüências (de nucleotídeos ou proteínas) de forma a se observar seu nível de identidade. Essa técnica de comparação de seqüências é implementada segundo um conceito de desenvolvimento de programas conhecido como um algoritmo guloso e é um dos pilares de toda a bioinformática. Existem centenas de aplicações do alinhamento de seqüências, tanto na identificação de genes e proteínas desconhecidas, quanto na comparação da ordem de genes em genomas de organismos proximamente relacionados (sintenia), no mapeamento de seqüências expressas dentro de um genoma para identificação de genes, na montagem de genomas e em diversas outras aplicações. Por exemplo, podemos alinhar duas seqüências para descobrirmos o grau de similaridade entre as seqüências de forma que possamos inferir (ou não) a uma delas, alguma propriedade já conhecida da outra (Prosdocimi et al., 2003). O alinhamento entre duas seqüências pode ser feito de forma global ou local (Figura 3.1.). Figura 3.1. Alinhamento global e local. À esquerda vemos um exemplo de como é feito um alinhamento global das seqüências e à direita vemos um exemplo da realização de um alinhamento local. Retirado de Prosdocimi et al., Alinhamento Global O alinhamento global é feito quando comparamos uma seqüência de aminoácidos ou nucleotídeos com outra, ao longo de toda sua extensão ( O algoritmo Needleman-Wunsch é o mais conhecido para realizar esse tipo de alinhamento,