GERMINAÇÃO IN VITRO DE SEMENTES DE CEDRO AUSTRALIANO (Toona ciliata- MELIACEAE)

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1 GERMINAÇÃO IN VITRO DE SEMENTES DE CEDRO AUSTRALIANO (Toona ciliata- MELIACEAE) Henrique Oliveira Frank, Fernanda Campanharo Favoreto, Guilherme Andrião Trugilho, Gabriela Cavati Sena, Ester Ujiie Nogueira, Elzimar de Oliveira Gonçalves Andreia Barcelos Passos Lima Universidade Federal do Espírito Santo/Departamento de Produção Vegetal, Alto Universitário, Guararema, Caixa Postal 6, Alegre ES. Universidade Federal do Espírito Santo/Departamento de Engenharia Florestal, NEDTEC, Jerônimo Monteiro ES. Resumo - A espécie Toona ciliata é utilizada na silvicultura e técnicas de cultura de tecidos podem subsidiar seu cultivo. O objetivo deste trabalho foi avaliar a germinação in vitro de T. ciliata. As sementes foram desinfestadas e submetidas a quatro tratamentos: dois meios de cultura, MS (MURASHIGE e SKOOG, 96) e B5 (GAMBORG et al., 968) e dois sistemas de cultivo (claro e escuro). Os parâmetros avaliados foram: IVG, taxa de germinação e avaliações morfológicas da plântula (desenvolvimento da raiz, da parte aérea, dos cotilédones e, a sua coloração). Foram obtidas baixas taxas de contaminação (8, %), porém não foram encontradas diferenças significativas para Taxa de Germinação (TG), IVG e para parâmetros de desenvolvimento entre os diferentes tratamentos, com exceção para o efeito de estiolamento nos tratamentos com cultivo no escuro. Estes resultados contribuem para o desenvolvimento de trabalhos futuros de germinação in vitro de T. ciliata. Palavras-chave: Cedro australiano, germinação in vitro, meio de cultura, estiolamento Área do Conhecimento: Biotecnologia Vegetal Introdução O cedro australiano (Toona ciliata) pertence à família Meliaceae, e é originária de países da Ásia e Oceania, sendo encontrada de forma exótica em várias regiões do mundo. O seu cultivo visa à produção de madeira de qualidade para serrarias e indústrias moveleiras (PINHEIRO et al., 6). No Estado do Espírito Santo as sementes começaram a ser distribuídas para o plantio entre agricultores por volta de 99 por uma empresa agroflorestal, que começou o plantio da espécie na década de 97 (HASSE, 5). O sucesso do seu plantio no país se deve a inexistência natural da principal praga que ataca essa espécie, Hypsipyla robusta, além da resistência natural á praga Hypsipyla grandella, que ataca outras meliáceas naturais das Américas, como os gêneros Cedrella e o mogno (CUNNINGHAM et al., 6). Seu habitat natural consiste de clima subtropical e úmido. Possui seu melhor crescimento quando em savanas (protegidas do fogo), áreas de cultivo abandonadas e áreas abertas de florestas, além de solos com boa drenagem, profundos e eutróficos, regiões de a 5 m de altitude, podendo suportar temperaturas mínimas pouco abaixo de ºC (WORLD AGROFORESTRY CENTRE, 7; PINHEIRO et al., 6). Suas sementes são aladas e pequenas, e quando armazenadas em câmara fria e recipiente fechado são viáveis por até um ano (WORLD AGROFORESTRY CENTRE, 7; PINHEIRO et al., 6). Em condições ex vitro a germinação de suas sementes leva de 8 a 5 dias e sementes frescas possuem taxa de germinação de 5 a 8%. Suas sementes são do tipo ortodoxas para o armazenamento e possuem uma taxa de germinação de 9% após meses de estocagem em sacos de polietileno a 5-8ºC (WORLD AGROFORESTRY CENTRE, 7). A germinação in vitro é importante para obtenção de plântulas assépticas de espécies lenhosas, pois plantas adultas de campo apresentam alta taxa de contaminação de explantes; como observado por Couto () e Ledo et. al. (8) com mogno e nim, respectivamente. Além disto, experimentos com Toona ciliata realizados por Mroginski et al. (999) usando plantas de anos cultivadas ex vitro e plantas adultas mostraram que há um maior sucesso na regeneração de explantes retirados de plantas jovens. No presente trabalho avaliou-se a germinação in vitro de sementes de Toona ciliata em quatro condições de cultivo, onde se variou o meio de cultura e a condição de iluminação. Apesar de esta espécie ser de grande interesse comercial, não há relatos na literatura de trabalhos de

2 germinação utilizando as técnicas de cultura de tecidos, a fim de aperfeiçoar sua produção em larga escala. Portanto, este trabalho é pioneiro, servindo de base para trabalhos futuros para o aprimoramento de tais técnicas. Metodologia O experimento foi realizado no laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade Federal do Espírito Santo Centro de Ciências Agrárias (CCA-UFES), em Alegre, no período de de março a 6 de maio de 9. O trabalho foi realizado utilizando-se quatro tratamentos: meios de cultura MS e B5, ambos submetidos às condições de fotoperíodo de 6 horas (claro) e sem iluminação (escuro). As sementes foram desinfestadas em álcool 9,5% durante minuto e, posteriormente em hipoclorito de sódio % por 5 minutos, em seguida foram lavadas vezes em água destilada estéril e colocadas para secar em papel filtro. Os meios foram solidificados com ágar (6g L¹) e com o ph ajustado a 5,7. A autoclavagem foi então realizada durante minutos a O C. Com o meio de cultura em temperatura ambiente, foi inoculada uma semente em cada frasco, de modo que para cada tratamento fosse utilizado o total de 5 sementes (cinco repetições em triplicata), o que perfaz para o experimento 6 sementes. Em seguida, cada frasco foi vedado com tampa plástica e plástico PVC. Após a inoculação, as sementes foram incubadas em sala de cultivo, a 5ºC ±. Para cada meio foi testada a condição de luz e escuro, completando, portanto, quatro tratamentos. Os tratamentos foram expostos a luz fluorescente, excetuando-se o tratamento no escuro, com fotoperíodo de 6/8 horas de luz e escuro. O experimento foi observado diariamente (sempre no mesmo horário) e os registros se iniciaram ao primeiro sinal de germinação, definido pela emissão de radícula, para obtenção do Índice de velocidade de Germinação (MAGUIRE, 96). O delineamento experimental foi inteiramente casualisado. A taxa de germinação foi calculada trinta dias após a inoculação das sementes, nos quatro diferentes tratamentos, utilizando a fórmula: TG = (SG/SI)x onde TG=Taxa de germinação, SG = Número sementes germinadas e SI = Número sementes inoculadas. Após trinta dias de cultivo as plantas foram medidas e pesadas, para avaliação do comprimento da parte aérea, da maior raiz e do maior cotilédone. A massa fresca e seca foi mensurada com uma balança de precisão de, g. As plântulas também foram avaliadas morfologicamente. Para raiz foi considerado: normalidade, anormalidade (raiz bifurcada, com geotropismo negativo, retorcida) e o pouco desenvolvimento. Para a parte aérea foi observada a normalidade, a anormalidade (falta de alguma parte ou enrugamento), o pouco desenvolvimento e também o estiolamento. Para os cotilédones foi observada a normalidade, a anormalidade (com manchas, não expandido) e o o seu pouco desenvolvimento. As plantas foram classificadas segundo a coloração pouco colorofiladas e normais. Os dados foram submetidos a Análise de variância no Programa Genes (CRUZ, ). Resultados Das 6 sementes inoculadas 5 (8,%) apresentaram contaminação fúngica. O índice de velocidade de germinação apresentado no Gráfico indica que não houve diferença significativa entre os quatro tratamentos.,,,,8 IVG,6,,,,89ª,ª,ª,89 ª B5 claro MS claro B5 escuro MS escuro Tratamentos Gráfico : Índice de velocidade de germinação de T. ciliata in vitro. As letras iguais indicam que as diferenças não foram significativas. A taxa de germinação demonstrada no Gráfico indica que não houve diferenças significativas entre os quatro tratamentos avaliados. Do total de sessenta sementes inoculadas, dezenove germinaram (,66). %,,9,8,7,6,5,,,,, 6,67%ª 6,67%ª 6,67%ª,%ª B5 claro MS claro B5 escuro MS escuro Tratamentos

3 Gráfico : Taxa de germinação de T. ciliata in vitro. As letras iguais indicam que as diferenças não foram significativas. Foi observado que as plantas cultivadas no escuro apresentaram estiolamento (Figura - b e d) sendo o meio MS com cultivo no escuro o que demonstrou o maior número de plantas com esta condição. No meio MS com cultivo no claro foi encontrado o maior número de plantas com parte aérea normal. E o maior número de plantas anormais foi encontrado no meio B5 tanto no cultivo no claro quanto no escuro (gráfico ). clorofiladas. Manchas marrons foram observadas em todos os tratamentos com exceção do MS no escuro (Gráfico 5). O meio MS no claro obteve melhores resultados quanto à presença de cotilédones normais. Nos tratamentos no escuro foi obtido o maior número de cotilédones insatisfatórios - anormais ou pouco desenvolvidos, (Gráfico 6). AVALIAÇÃO DE RAIZ Nº DE INDIVÍDUOAS Anormal (raiz bifurcada, com geotropismo negativo, retorcida) desenvolvida Gráfico : Avaliação morfológica da raiz AVALIAÇÃO DA COLORAÇÃO Figura : Plântulas de T. ciliata após dias de cultivo in vitro. Tratamentos: B5 claro (a); B5 escuro (b); MS claro (c); MS escuro (d). Barra= cm. AVALIAÇÃO DE PARTE AÉREA clorofilada Normais Anormal (falta de alguma parte, enrugada) Estiolada desenvolvida Gráfico 5: Avaliação da coloração das plântulas AVALIAÇÃO DE COTILÉDONE Gráfico : Avaliação morfológica de parte aérea. Na avaliação do desenvolvimento das raízes, o meio B5 apresentou mais raízes anormais, sendo que o maior número de indivíduos com cultivo no escuro (Gráfico ). Quanto à coloração, os tratamentos no claro apresentaram plântulas mais clorofiladas e os tratamentos no escuro, plântulas menos Anormal (com manchas, não expandido) desenvolvido

4 Gráfico 6: Avaliação dos cotilédones. Ao final do experimento foram mensurados cinco parâmetros relacionados com o desenvolvimento das plântulas germinadas. Para todos os parâmetros avaliados a Análise de variância não foi significativa a 5% de probabilidade (Tabela ). Tabela : Resumo da Análise de variância Parâmetros Probabilidade Comprimento de Parte Aérea,5578 Comprimento de Raiz,869 Comprimento de Cotilédone Massa Fresca Massa Seca Discussão A porcentagem de contaminação fúngica obtida neste experimento pode ser considerada satisfatória quando comparada com outros trabalhos envolvendo germinação, como Couto () e Kalil Filho et al.() que obtiveram 8% e,8% (respectivamente) de contaminação fúngica germinando in vitro sementes de mogno. Seria esperada uma maior taxa de germinação das sementes cultivadas no escuro, pois há uma maior susceptibilidade das plantas jovens à luz direta no cultivo ex vitro (WORLD AGROFORESTRY CENTRE, 7). Porém isto não foi observado no experimento, já que não foram observadas diferenças significativas entre os tratamentos. Os valores obtidos na TG (,66% das sementes inoculadas) podem ser considerados baixos quando comparados aos 5-8 % de germinação ex vitro (WORLD AGROFORESTRY CENTRE, 7). Isto poderia ser explicado pela inviabilidade de parte das sementes utilizadas, que não foram submetidas a teste de vigor. A ausência de diferença significativa na TG e nos parâmetros de desenvolvimento permite a escolha do meio mais conveniente, podendo ser por custo (meio B5 usa menos micronutrientes) ou por finalidade do cultivo (obtenção do maior número de explantes, micropropagação etc.). Os resultados da avaliação morfológica para parte aérea das plantas germinadas no escuro mostraram um maior alongamento, menor pigmentação e pouco desenvolvimento dos cotilédones, caracterizando o estiolamento, fenômeno comum em plantas cultivadas na ausência de luz (BARBOSA; CALDAS, ; MOREIRA et al., 999). A taxa de germinação nestas condições e o alongamento permitem que se use a germinação in vitro para obtenção de um maior número de explantes sadios para outras técnicas de cultura de tecidos, como também obtido por Moura () com citros e por Schuch e Peters () com macieiras. Conclusão Conclui-se que o melhor tratamento para germinação de Toona ciliata in vitro é o meio B5 na condição escuro, pois proporciona menor custo de produção e maior quantidade de explantes, visando estudos futuros de micropropagação. Referências -BARBOZA, S. B. S. C.; CALDAS, L. S. Estiolamento e regeneração na multiplicação in vitro do abacaxizeiro híbrido PE x SC-5. Pesq. agropec. bras. [online].brasília,, vol.6, n., pp. 7-. Disponível < X&script=sci_arttext&tlng=in>. Acesso jun. 9. -COUTO, J. M.F. Germinação e morfogênese in vitro de mogno (Swietenia macrophylla King).. 6p. Dissertação (Mestrado em Ciências Florestais) Universidade Federal de Viçosa,. -CRUZ, C. D. Programa GENES: versão Windows; aplicativo computacional em genética e estatística. Viçosa, MG: UFV,, 68p. -CUNNINGHAM, Saul A.. Toona ciliata that suffer frequent height-reducing herbivore damage by a shoot-boring moth (Hypsipyla robusta) are taller. Forest Ecology and Management, Vol. 5, Issues -, 5 Abril 6, Págs. -, Disponível < eurl&_udi=b6t6x-j6xpf- &_user=&_rdoc=&_fmt=&_orig=search&_sort =d&_docanchor=&view=c&_searchstrid=96868 &_rerunorigin=google&_acct=c5&_v ersion=&_urlversion=&_userid=&md5=998 6c659fae6a577afdfca>. Acesso Jun. 9. -GAMBORG, O.L.; MILLER, R.A.; OJIMA, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell research, n.5, p.5-58, 968.

5 -HASSE, G. (5) Promessas do Cedro Australiano. Jornal Século Diário, Vitória, 7 de Junho. -KALIL FILHO, A.N., GRAÇA, M.E.C.& GRIGOLETTI JUNIOR, A. Micropropagação do mogno (Swietenia macrophylla): desinfestação e germinação. In: VI SIMPÓSIO INTERNACIONAL SOBRE ECOSSISTEMAS FLORESTAIS- FOREST. Anais... Porto Seguro,, p.. -LÉDO, A.S.; BLANK, A.F.; BARBOZA, S.B.S.C.; RANGEL, M.S.A.; LÉDO, C.A.S. Germinação in vitro de embriões zigóticos e sementes de nim indiano (Azadirachta indica A. Juss.) Revista Brasileira de plantas medicinais. 8, vol., n., p.-5. -SCHUCH, MÁRCIA WULFF and PETERS, JOSÉ ANTONIO. Regeneração de brotações de macieira (Malus domestica, Borkh.) cv. Gala. Rev. Bras. Frutic. [online]., vol., n., pp ISSN WORLD AGROFORESTRY CENTRE- AGROFORESTREE DATABASE- A Tree species Reference and Selection Guide. Disponível < dbases/af/asp/speciesinfo.asp?spid=69> Acesso 5 mai. 9. -MAGUIRE, J.D.Speed of germination-aid in selection and evaluation for seedling emergence and vigor. Crop Science, v.l., p.76-77, 96. -MOREIRA, M. A.; SOBRINHO, A. A.; PASQUAL, M. Indução ao estiolamento in vitro de brotos de abacaxi cv. Pérola. Publicação Semestral da Universidade de Alfenas. Alfenas, MG Brasil, º semestre/999 -MOURA, Thaís Lacava de; ALMEIDA, Weliton Antônio Bastos de; MENDES, Beatriz Madalena Januzzi & MOURAO FILHO, Francisco de Assis Alves. Organogênese In Vitro De Citrus Em Função De Concentrações De Bap E Seccionamento Do Explante. Rev. Bras. Frutic. [online]., vol., n., pp MROGINSKI, Erika. REY, Hebe Y. MROGINSKI, Luis A. Establecimiento in vitro de Explantes y Regeneración de Plantas de Toona ciliata. Congreso.Actas: Comunicaciones Científicas y Tecnológicas. SGCyT (UNNE) Disponível < Acesso 5 mai. 9. -MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v.5, p.7-79, 96. -PINHEIRO, A.L., LANI, J.L., COUTO, L. Cedro Australiano: cultivo e utilização (Toona ciliata M. Roem. Var. australis (F. Muell) Bahadur). Viçosa: UFV, 6. p. 5