Hemograma: Novos parâmetros e recomendações para a hematoscopia

Transcrição

1 Hemograma: Novos parâmetros e recomendações para a hematoscopia Marcos Fleury mkfleury@ufrj.br Sistemas automatizados. Vantagens Coeficiente de variação entre 1 e 2%. Custo Por Exame. Tempo. Maior acurácia. Maior reprodutibilidade. 1

2 Sistemas automatizados. Manual Automatizado Hemácias ± 11% ± 1,0% Leucócitos ± 16% ± 1,5% Plaquetas ±22% ±2,0% Reticulócitos ± 34% ± 5,0% Hemoglobina 1 a 2% < 1,0% VGM 9,5% < 1,0% HGM 10,0% 0,6 a 1,2% CHGM ,0 a 1,5% Sistemas automatizados. Espectrofotometria Ótica Impedância Fluorescência Hemoglobina Leucócitos & diferencial Hemácias & VGM Viabilidade de leucócitos Plaquetas Plaquetas & VPM Eritroblastos Hemácias Leucócitos Reticulócitos Sistemas automatizados. Leucócitos Hemácias Hemoglobina VGM Reticulócitos / NRBC Plaquetas Hematócrito HGM GHGM RDW PDW IRF (H, M, L) Diferencial 2

3 Sistemas automatizados. Variações no número de hemácias Microcitose RBC Histograma de hemácias. esquizócitos Policitemia RBC Contagem coincidente Aglutininas frias RBC Falsa macrocitose. Leucocitose RBC Contagem coincidente. Sistemas automatizados. Variações no número de leucócitos e plaquetas. Leucemias WBC Fragilidade dos leucócitos Infecções virais Aglutininas Plaquetárias WBC PLAQ Agregados plaquetários. Quimioterapia PLAQ Fragmentos celulares. Sistemas automatizados. Parâmetro Linearidade Limites Aceitáveis WBC (I) 0 a 99,9 K/ml ± 3,0% (O) 0 a 250 K/ml ±4,0% RBC 0 a 8 M/ ml ±2,5% Hemoglobina 0 a 24 g/dl ± 2,0% VGM 50 a 200 fl. ±3,0% Plaquetas 0 a 2000 K/ml ± 7,0% 3

4 Parâmetros automatizados. Série vermelha Hemácias (Hm) Hemoglobina (Hb) Hematócrito (Ht) Volume Globular Médio (VGM) Hemoglobina Globular Média (HGM) Concentração de Hemoglobina Globular Média (CHGM) Red Cell Distribution Width(RDW) RDW-CV / RDW-SD Reticulócitos (Ret) % / # Fração de Reticulócitos Imaturos (IRF) Hemoglobina Globular Média dos Reticulócitos (HGM-Ret) Fração de Hemácias Hipocrômicas (Hipo%) Parâmetros automatizados Parâmetro VGM (fl) HGM (pg) CHGM (%) RDW (%) Aplicações Classificação Morfológica Determinação da hipocromia -(A. Ferropriva) Detecção de esferócitos Anemias hemolíticas Anormalidade morfológica ú l quando ( ) IntJ LabHematol May; 38 Suppl1: Índices hematimétricos. Volume Globular Médio VGM (fl) = Ht(%) RBC (x 10 6 µl) x 10 Hemoglobina Globular Média: HGM (pg) = Hb(g/dL) x 10 RBC (x 10 6 µl) Concentração de Hemoglobina Globular Média: CHGM (g/dl) = Hb(g/dL) x 100 Ht(%) 4

5 Índices hematimétricos. O VGM determinado pelo equipamento é muito mais preciso que o avaliado visualmente. πr 2 x h 3,14 x 3,75 2 x 2 = 88,3 fl Aumento de 10% no diâmetro πr 2 x h 3,14 x 4,125 2 x 2 = 117,6 fl Failace R, 2009 Índices hematimétricos. RDW Indica a homogeneidade da população eritrocitária. RDW-CV SD na posição 60,65%. Valor de referência -12 a 15% RDW-SD SD na posição 20 %. Valor de referência -37 fl Histograma de hemácias. 80 VGM Baixo VGM Normal VGM Alto

6 Índices hematimétricos. É muito importante a maneira como a hemácia atravessa a abertura de contagem. A velocidade do fluxo faz com que as hemácias normais se deformem ao atingirem a abertura de contagem. Disco bicôncavo O eritrócito deve atingir o máximo de deformação. Abertura Índices hematimétricos. A capacidade de deformação das hemácias influencia na forma que o analisador mede o tamanho da célula. Quanto maior a concentração de hemoglobina menor a deformação sofrida. Célula normal Volume =1x Esferócitos Volume =1,5 x Se atravessa em ângulo reto -Volume = 2x Índices hematimétricos. VGM= Ht (%) Hm (x106/ml) CHGM= Hb (g/dl) Ht (%) Hemácias normocrômicas se deformam adequadamente Ht exato CHGM exato. Esferócitos (hipercrômicos) não se deformam Ht superestimado CHGM subestimado. Hemácias hipocrômicas se deformam em demasia VGM subestimado Ht subestimado CHGM superestimado. 6

7 Índices hematimétricos. Os diluentes mais modernos não interferem na membrana eritrocitária e permitem uma pressão hidrodinâmica adequada durante o tempo de contagem. Hemácias hipocrômicas ou esferócitos se deformam adequadamente Ht exato CHGM exato. Índices hematimétricos. Esferotização Processo isovolumétrico Elimina os erros de deformação e de orientação Esferotização Cell-DynRuby/3200 MCV Field Guidelinev 1.0 Histograma de plaquetas. A construção é similar ao histograma de hemácias (RBC). O discriminador móvel é usado para excluir: Hemácias microcíticas. Fragmentos eritrocitários. Ruído elétrico Plaquetas Hm Plaquetas Hm Tamanho celular Tamanho celular O software busca pelo ponto mais baixo entre as curvas para posicionar o discriminador 7

8 Histograma de plaquetas. Plaquetas Hm Tamanho celular Análise do DNA/RNA Polimetina fluorescente ligação ao DNA e RNA de organelas citoplasmáticas Contagem de reticulócitos Plaquetas com RNA Eritroblastos Plaquetas óticas / IPF. Plaquetas imaturas plaquetas reticuladas % de plaquetas imaturas Determina a quantidade de plaquetas recentemente lançadas na circulação. Indica a trombocitopoiese. Plaq + IPF = Produção Plaq + IPF = Destruição 8

9 Contagem e avaliação de reticulócitos. Fração de reticulócitos Imaturos IRF % 1,6 10,5 Reticulócitos de baixa fluorescência LFR % 89,9 98,4 Reticulócitos de média fluorescência MFR % 1,6 9,5 Reticulócitos de alta fluorescência HFR % 0 1,7 HGM dos Reticulócitos & IRF. A determinação da HGM-Retpossibilita a identificação da DF em estágios iniciais quando outros métodos ainda não são informativos Reticulócitos baixos + Baixo IRF Sem produção Transfusão Reticulócitos baixos + Alto IRF Produção Sem Transfusão HGM-Ret Aplicações clínicas Quantidade real de Fe disponível para a síntese de hemoglobina Detecção precoce da deficiência de ferro quando outros marcadores bioquímicos podem sofrer interferências de infecções, inflamações ou gravidez Monitora o tratamento com eritropoietina. 9

10 Parâmetros Automatizados Parâmetro % Hipo % Hiper % Micro IRF HGM-Ret(pg) VGM-Ret(fL) Aplicações Avalia a disponibilidade de Fe funcional -Status do Fe / 3 meses Diagnóstico de esferocitose hereditária / imunológica Diagnóstico diferencial das A. Microcíticas e Hipocrômicas Classificação das Anemias e monitoração do tratamento Diagnóstico da eritropoiese Fe-deficiente monitoração das A. carenciais. (VR: 28-35pg) Diagnóstico da eritropoiese Fe-deficiente monitoração das A. carenciais. IntJ LabHematol May; 38 Suppl1: Sistemas automatizados Contagem de eritroblastos Reticulócitos Percentual de células hipocrômicas Análise ótica da hemoglobina Poiquilocitose Correção da leucometria Menor número de revisões manuais Monitoração de TMO, quimioterapia e anemias. Deficiência de ferro Disponibilidade de ferro para eritropoese. (s TfR) Reduz a inclusão de micrócitos na contagem plaquetária. Alarmes para esquizócitos, e microcitose intensa (URI) Intl Jnl Lab Hem.2009; 31: Contagem diferencial. Elimina a interferência de hemácias por meio da hemólise. Ascélulassãotratadasparaqueocitoplasmaseretraiaaoredordonúcleo. Leucócito Tratamento Célula p/contar 10

11 Contagem diferencial. Os discriminadores são posicionados entre os picos e os vales separando as células por tamanho. LD T1 T2 UD Células mistas Células grandes Células pequenas Diferencial em três partes Impedância elétrica Granulócitos - grandes células Linfócitos -pequenas células Monócitos, eosinófilos e basófilos células de médio tamanho. Funciona bem apontando as amostras que necessitam de revisão manual. Na ausência de alarmes (flags) a contagem é liberada e os percentuais de eosinófilos e basófilos considerados normais. Linfócitos Monócitos Neutrófilos Tamanho celular LabHematol.2001; 7: Contagem diferencial. Regras para a revisão de lâminas hematológicas (ISLH, 2001) VR Regra Leucometria (x 10 9 /l) 4,0 10,0 < 3,5 ou > 12,0 Hemoglobina (g/dl) 12,0 18,0 < 10,0 ou > 18,0 VGM (fl) < 80 ou > 102 CHGM (g/l) < 31 ou > 36 Plaquetas (x 10 9 /l) < 100 ou > 500 Linfócitos (%) < 16 ou > 48 População mista (%) 1 10 < 1 ou > 15 Granulócitos (%) < 45 ou > 78 Falsos negativos 1,1 a 3,8% Redução do número de lâminas contadas 30 a 45% 11

12 Contagem diferencial. Separa os leucócitos em 5 grupos: linfócitos, neutrófilos, monócitos, eosinófilos e basófilos. Mais eficiência na separação das amostras que necessitam de revisão manual. Redução da quantidade de flags em relação aos sistemas de 3 partes. Inclusão de granulócitosimaturos, eritroblastos, linfócitos variantes e, em alguns equipamentos, células blásticas. Diferencial em 5 partes. VCS volume, condutividade e dispersão da luz. (8.000 cel/ amostra) Medida da impedância volume celular Condutividade (radiofrequência) estrutura interna, relação N/C, densidade nuclear e granularidade. Dispersão da luz estrutura celular, forma e reflexibilidade. Diferencial em 5 partes. Volume Blastos, Pró mielócitos Mielócitos Metamielócitos Neutrófilos imaturos Linfócitos Reativos Eosinófilos Imaturos Restos celulares, NRBC Absorbância 12

13 Contagem diferencial. Ângulos de medição 0 indica o tamanho celular. 10 estrutura e complexidade celular. 90 polarizada lobularidade celular. 90 despolarizada diferencia eosinófilos baseado na capacidade dos grânulos em despolarizar a luz. Classificação e diferenciação. Célula Tamanho Complexidade Lobularidade Granularidade Classificação 0 o 10 o 90 o 90 o despolarizada 1ª 2ª 3ª 4ª Poli Neut Mono - - Linfo Mono - - Mono Poli Eos Mono - Baso - Contagem diferencial. Anticorpos monoclonais Imunofenotipagem de células malignas Conteúdo de DNA Contagem de plaquetas (CD61) Populações linfocitárias CD4 CD8 Fluorescência Maturidade de reticulócitos (IRF) Plaquetas reticuladas (IPF) Laser Hemácias fragmentadas Contagem de plaquetas (RBC/PLT) 13

14 Contagem diferencial. Regras para a revisão de lâminas hematológicas Diferencial em 5 partes ou estendida. Consenso Internacional em Hematologia. (2009) - 41 regras 1. Linearidade do equipamento 2. Valores de referência segundo a idade 3. Tempo de coleta 4. Status da amostra (1ª vez / internado) 5. Indicação clínica Falsos negativos 2,9% Redução do número de lâminas contadas 30% Contagem diferencial. Validação do critério de exclusão 1. Durante 30 dias (1000 amostras) examinar todas as lâminas comparandoas com os resultados automatizados. 2. Dividir os resultados em 4 grupos: Positivo Falso positivo Negativo Falso negativo - flag (+) e hematoscopia positiva - flag (+) e hematoscopia negativa - flag (-) e hematoscopia negativa - flag (-) e hematoscopia positiva 3. Estabelecer os percentuais de cada grupo em relação ao total de amostras examinadas. Contagem diferencial. Análise dos falsos negativos Granulócitos imaturos 52% Blastos 1,3% Linfócitos atípicos 3,1% Eritroblastos 6,6% Morfologia eritrocitária 18,5% Morfologia plaquetária 14,5% Morfologia leucocitária 4,0% LabHematol.2005; 11:

15 Contagem diferencial. Alarme Leucometria Células imaturas Hemácias Número de plaquetas Pedido médico Morfologia de plaquetas Falha do equipamento Concentração de hemoglobina Outras Hematoscopia positiva % de revisões 36,7 25,5 13,0 5,9 3,7 3,5 2,5 1,9 7,3 35,7 ArchPatholLabMed. 2006; 130: Contagem diferencial. Diferencial automatizada x Revisão manual Tipo celular Número Basófilos 1 0-5,4 0,3-2,3 0,5 1,8 0,8 1,3 Eosinófilos 4 1,1 9,9 2,5 6,1 2,9 5,4 3,6 4,5 Monócitos 9 4,2 16,4 6,6 11,9 7,3 10,9 8,4 9,6 Linfócitos ,3 40,6 49,5 41,9 48,1 44,0 46,0 Neutrófilos 60 49,7 69,7 55,6 64,3 56,9 63,1 59,0 61,0 LabHematol.2001; 7: Diferencial em 7 partes Citometria de fluxo Células grandes imaturas (blastos e granulócitos imaturos) Linfócitos atípicos (incluindo blastos pequenos). 15

16 Diferencial em 7 partes Granulócitos imaturos Diferencial em 7 partes Granulócitos imaturos / diferenciação mielóide Os leucócitos maduros lisados cluster azul O efeito do agente lisante é diferente nas células mielóides imaturas que não são completamente lisadas. Granulócitos imaturos (IG) Mais sensíveis / específicos para diagnóstico de infecção que a leucometria. A contagem de IG pode identificar infecção aguda ou resposta inflamatória em estágio inicial. Valores de IG > 3% em conjunto com outros testes podem compor um algoritmo para indicar infecção. IGs> 3% indicam hemoculturas positivas com 92% de especificidade. 16

17 Amostra normal Recomendações do ICSH para a Padronização da Nomenclatura e da Graduação das Alterações Morfológicas no Sangue Periférico. IntJ Lab Hematol Jun;37(3): Marcos Fleury mkfleury@ufrj.br Recomendações do ICSH O objetivo do Grupo de Trabalho foi o de proporcionar um conjunto de recomendações para o relato e quantificação de alterações em hemácias, leucócitos e plaquetas. É responsabilidade do Laboratório relatar as características morfológicas que contribuam para o diagnóstico diferencial. As alterações morfológicas devem ser informadas quando presentes em quantidade moderada ou intensa. (Exceção esquistócitos). Os valores do VGM devem ser considerados para a determinação das alterações de tamanho (Micro, macro e normocitose). Os valores da HGM devem ser utilizados para a avaliação da hipocromia ou da presença de células hipercrômicas Os laboratórios devem realizar um exame mais detalhado dos casos duvidosos. 17

18 Recomendações do ICSH As anormalidades morfológicas podem ser expressas de várias formas: Descrição simples Presença ou ausência Determinação semi-quantitativa Discreta (+) Moderada (++) Intensa (+++) Determinação quantitativa Normal (< 5%) Discreta (5 25%) Moderada (25 50%) Intensa (>50%) Recomendações do ICSH Nomenclatura Discreta (+) (%) Quantificação Moderada (++) (%) Intensa (+++) (%) HEMÁCIAS Anisocitose NA >20 Macrócitos NA >20 Micrócitos NA >20 Células hipocrômicas NA >20 Policromasia NA 5-20 >20 Acantócitos NA 5-20 >20 Eliptócitos NA 5-20 >20 Ovalócitos NA 5-20 >20 Esquistócitos < >2 Hemácias em foice NA 1-2 >2 Esferócitos NA 5-20 >20 Estomatócitos NA 5-20 >20 Hemácias em alvo NA 5-20 >20 Hemácias em lágrima NA 5-20 >20 Recomendações do ICSH SV Anormalidades no tamanho das hemácias ANISOCITOSE é definida como um aumento na variabilidade do tamanho das hemácias. Não é específica e pode ser refletida no aumento do RDW nos contadores automatizados. A recomendação é a de utilizar o valor RDW para estabelecer o grau de variação de tamanho das hemácias. A anisocitose pode ser quantificada mesmo quando o RDW não está disponível. 18

19 Recomendações do ICSH SV Anormalidades no tamanho das hemácias DIMORFISMO presença de duas populações distintas de hemácias podendo ser claramente vista na análise do histograma de hemácias com correspondente aumento do RDW. O termo é comumente utilizado quando existe uma população microcítica e hipocrômica e outra normocrômicas e normocítica. Entretanto, o termo pode também ser usado para descrever a coexistência de populações macrocítica e normocítica. Recomendações do ICSH SV Anormalidades no tamanho das hemácias MACRÓCITOS hemácias maiores com diâmetro superior a 8,5 µm (VGM > 100 fl). HGM N ou ; Prematuros e recém-nascidos; Reticulocitose pode causar macrocitose. MICRÓCITOS hemácias menores com diâmetro inferior a 7,0 µm (VGM < 80 fl). Podem estar associados à hipocromia. Interpretar o VGM de acordo com a idade. Um RDW aumentado ou um histograma de hemácias que sugira a presença de micrócitos ou de macrócitos, mesmo quando o VGM estiver normal, deve indicar a avaliação da lâmina. A recomendação é que o valor do VGM seja utilizado para balizar a variabilidade de tamanho (grau de anisocitose) preferivelmente à avaliação visual. Recomendações do ICSH SV Anormalidades na cor das hemácias HIPOCROMIA é a diminuição da coloração da hemácia com aumento do halo claro central superior a 1/3 do diâmetro celular. O HGM e o CHGM estarão diminuídos nos casos de hipocromia grave. As condições clínicas que causam a hipocromia estão sempre associadas à microcitose. A recomendação é que o valor do HGM seja utilizado para balizar a intensidade da hipocromia preferivelmente à avaliação visual. POLICROMASIA se refere a aparência mais azulada das hemácias causada pela presença de restos de RNA ribossomal. São maiores que as hemácias normais. A recomendação é quantificar a policromasia e proceder à contagem de reticulócitos. 19

20 Recomendações do ICSH SV Inclusões eritrocitárias ERITROBLASTOS -São precursores eritrocitários descritos normalmente apenas como eritroblastos quando encontrados no sangue periférico. A recomendação é a de reportar o valor absoluto de eritroblastos em 100 leucócitos contados na diferencial ou incluir sua quantidade na contagem diferencial após corrigir a leucometria. Se mais de 10 / 100 leucócitos. leucócitos x 100 = Leucometria corrigida eritroblastos J. Burthem, M. Brereton Recomendações do ICSH SB Equipamentos automatizados Os equipamentos automatizados não são capazes de enumerar ou classificar populações de células anormais ou de reconhecer anormalidades morfológicas. Essas amostras necessitam de um exame microscópico realizado em lâmina bem confeccionada e bem corada, condição imprescindível para a correta identificação celular. A diferenciação celular é um processo que envolve a identificação de características relativas ao tamanho e forma do núcleo, padrão de cromatina e tamanho e aspecto do citoplasma. A contagem diferencial de leucócitos pode ser realizada por métodos automatizados ou manuais. Recomendações do ICSH SB Equipamentos automatizados A contagem automatizada analisa alguns milhares de células em contraste com a contagem manual que identifica de 100 a 200 células. Por este motivo, na ausência de células anormais, a contagem automatizada é mais precisa. Valores muito baixos ou muito elevados de leucócitos tornam a contagem manual menos acurada e menos reprodutível. É recomendado que a contagem automatizada seja considerada sem revisão manual somente nos casos em que não existam alterações quantitativas nem a presença de alarmes (flags). A contagem automatizada também pode ser liberada depois da revisão da lâmina e da confirmação dos alarmes. 20

21 Recomendações do ICSH SB Anormalidades citoplasmáticas HIPERGRANULAÇÃO DOS NEUTRÓFILOS, GRANULAÇÕES TÓXICAS. São grânulos grosseiros de coloração roxa que ocorrem como resposta a infecções e inflamações. A recomendação é de citar e quantificar a presença da hipergranulação sempre que vista. J. Burthem, M. Brereton Recomendações do ICSH SB Anormalidades citoplasmáticas VACUOLIZAÇÃO NOS NEUTRÓFILOS A vacuolização em neutrófilos durante uma infecção é causada pela fusão entre o grânulo e o vacúolo fagocítico e a liberação do conteúdo lisossomal a fim de destruir a bactéria. Podem parecer como buracos de agulha vacúolos pequenos e discretos ou podem ser maiores. Outras causas de vacuolização pode ser a toxicidade alcoólica ou a exposição prolongada ao EDTA (artefato de conservação). A recomendação é a de relatar a presença de vacúolos sempre que presentes. LACFAR -UFRJ Recomendações do ICSH SB GRANDES LINFÓCITOS GRANULARES (GLG) São semelhantes aos linfócitos grandes, mas o citoplasma exibe alguns grânulos bem visíveis de coloração vermelho-arroxeada. Podem representar de 10 a 20% dos linfócitos em indivíduos normais. 21

22 Recomendações do ICSH SB GRANDES LINFÓCITOS GRANULARES (GLG) Os GLG não devem ser contados separadamente dos linfócitos. J. Burthem, M. Brereton Embora os GLG devam ser contados como linfócitos, quantidades aumentadas deste tipo celular devem ser descritas no laudo e a investigação por imunofenotipagem recomendada. Nota: Os linfócitos predominam nas amostras de crianças até os 4 anos. Estas células são mais pleomórficas que as encontradas em amostras de adultos normais. Recomendações do ICSH SB MONONUCLEOSE INFECCIOSA As anormalidades incluem o aumento do tamanho da célula, imaturidade do núcleo com a presença de nucléolo e cromatina sem condensação, contorno nuclear irregular ou lobulação, basofilia ou vacuolização do citoplasma e contorno irregular da célula. O citoplasma pode ser abundante com uma variação de cores desde o azul pálido até o azul intenso principalmente nos pontos de contato com as células adjacentes. A recomendação é de comentar a presença de linfócitos reativos podendo ser contados como uma população distinta na diferencial. J. Burthem, M. Brereton Recomendações do ICSH SB CÉLULAS PLASMÁTICAS A célula plasmática é maior que o pequeno linfócito, apresenta citoplasma profundamente azul, núcleo excêntrico, redondo ou oval com cromatina condensada e a zona de Golgi ou halo perinuclear adjacente ao núcleo. A recomendação é de contar as células plasmáticas como uma população distinta na diferencial. J. Burthem, M. Brereton 22

23 Recomendações do ICSH Plaquetas As plaquetas gigantes podem ser maiores que as hemácias (10 20 mm) e podem ser identificadas pelos alarmes dos equipamentos automatizados. Em indivíduos normais, de modo geral, menos de 5% das plaquetas são maiores que o normal. O tamanho das plaquetas aumenta gradualmente de acordo com o tempo de armazenamento em EDTA. J. Burthem, M. Brereton Recomendações do ICSH Plaquetas A recomendação é que as plaquetas gigantes sejam relatadas. Um comentário sobre o número de plaquetas e a presença de plaquetas grandes ou gigantes pode ser feito. J. Burthem, M. Brereton φ Fleury Obrigado Marcos Fleury mkfleury@ufrj.br 23