MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO EM PLANTAS

Transcrição

1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA SUPERIOR DE AGRICULTURA LUIZ DE QUEIROZ DEPARTAMENTO DE GENÉTICA MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO EM PLANTAS Dra. MARIZA MONTEIRO

2 CONTEÚDO 1- INTRODUÇÃO 2- ISOLAMENTO DO GENE E CONSTRUÇÃO DO CASSETE DE EXPRESSÃO 3- MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO 3.1- Agrobacterium 3.2- Biobalística 3.3- Eletroporação 4- CULTURA DE TECIDOS COMO PRÉ-REQUISITO PARA TRANSFORMAÇÃO 5- CULTIVO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS NO MUNDO 6- EXEMPLOS DE PLANTAS TRANSGÊNICAS 7 CONSIDERAÇÕES FINAIS

3 1- INTRODUÇÃO MELHORAMENTO DE PLANTAS CULTIVADAS MÉTODOS MELHORAMENTO CLÁSSICO MÉTODOS BIOTECNOLÓGICOS TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA

4 Plantas Transgênicas São plantas que tiveram sua constituição genética alterada pela introdução de gene(s) de um outro organismo, em geral de outra espécie. (Torres et al., 1999) Importância da técnica de transformação: Obter plantas com características agronômicas desejáveis, as quais não são possíveis por polinização. Fonte adicional de variabilidade genética para ser incorporada em um programa de melhoramento.

5 TÉCNICAS DE ENGENHARIA GENÉTICA Genes de interesse isolados e clonados em um vetor Limitação: Número limitado de genes isolados que regulam caracteres agronômicos relevantes. Utilização - Plantas resistentes a herbicidas e patógenos - Melhor qualidade do produto - Produção de proteínas animais - Fitorremediação - detoxificação de metais pesados - Alteração das vias metabólicas - produtos mais vantajosos

6 2- ISOLAMENTO DO GENE

7 Gene: Sequência de nucleotídeos que compreende um segmento de DNA cujo produto é um polipeptídeo. Unidade básica da herança. Estrutura do gene: Promotor Éxon 1 Íntron 1 Éxon 2 Terminador

8 Núcleo Filamento não molde Filamento molde Processo de transcrição do DNA Sítio de iniciação da Transcrição Transcrição Códon de finalização da tradução UGA, UAA ou UAG hnrna Cap 5 3 AAAAA Splicing ou processamento 5 AAAAA 3 mrna

9 Isolamento do gene de interesse por Differential display Plantas resistentes Ex. Gene de resistência a uma doença (bacteriose) Planta inoculada com bacteriose Planta não inoculada com bacteriose

10 Extração do mrna total Planta inoculada com bacteriose mrna Planta não inoculada com bacteriose Extração do mrna total da planta inoculada e da planta não inoculada com a bacteriose

11 Formação do cdna 5 3 mrna AAAAA Transcriptase reversa Tratamento com alcali AAAAA 3 Alça DNA polimerase TTTTTT Primer oligo (dt)

12 Isolando o gene 5 3 mrna AAAAA Transcriptase reversa AAAAA Alça DNA polimerase TTTTTT Primer oligo (dt)

13 Isolando o gene 5 3 mrna AAAAA Transcriptase reversa AAAAA Alça Nuclease S1 (específica unifilamentar) DNA polimerase TTTTTT Primer oligo (dt) cdna bifilamentar

14 Identificação do cdna correspondente ao gene de interesse Planta inoculada com bacteriose cdna Planta não inoculada com bacteriose cdna Extrai o cdna do gel Isolamento do cdna correspondente ao gene de resistência a bacteriose por Differential Display

15 Clonagem do cdna em um vetor cdna Plasmídeo

16 Amplificação e identificação do cdna Bactéria Vetor Introdução do vetor contendo o cdna em uma bactéria

17 Construção do Cassete de expressão Inserção de um promotor e um terminador Promotor: Região de DNA envolvida na ligação da RNA-polimerase para iniciar a transcrição Promotor

18 Promotores constitutivos: Dicotiledôneas - 35S vírus do mosaico da couve-flor Monocotiledôneas - Adh1 - álcool desidrogenase do milho - Act1 - actina do arroz - Ubi1 - ubiquitina do milho Promotores induzidos - expresso quando submetidos a fatores de indução ats1a - subunidade menor da ribose 1,6-bifosfato carboxilase oxigenase da Arabidopsis thaliana induzido pela luz

19 Terminador: Sequencia de DNA, presente na extremidade do transcrito, que leva a RNA-polimerase a terminar a transcrição Promotor Terminador

20 Clonando o gene em um vetor Promotor Terminador Plasmídeo

21 Hind III (11076) Sph I (11074) Pst I (11068) Sal I (11058) Xba I (11052) BamH I (11046) Sma I (11043) Kpn I (11041) Sac I (11035) EcoR I (11025) Bst XI (10782) CaMV35S promoter Xho I (9995) hygromycin (R) Xho I (8901) CaMV35S polya T-Border (left) Sac II (8383) kanamycin (R) lacz alpha CaMV 35S promoter pcambia bp Gus first exon Nco I (1) Bgl II (8) Catalase intron Gus second exon Nhe I (2014) Histidine tag Bst EII (2050) Nos poly-a T-Border (right) Sph I (2455) pvs1 sta pbr322 ori pbr322 bom Nhe I (5458) pvs1 rep Plasmídeo pcambia 1301

22 3- MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO

23 INDIRETO Agrobacterium DIRETOS Biobalística Eletroporação - Protoplastos e Tecidos íntegros

24 3.1- TRANSFORMAÇÃO POR Agrobacterium Agrobacterium - microorganismos tipicamente de solo - induzem doenças em tecidos injuriados de dicotiledôneas Agrobacterium tumefaciens - galha-da-coroa

25 Formação de galha-da-coroa por Agrobacterium tumefaciens ( haa/gen/gmo.html)

26 Indução do tumor - Plasmídeo Ti Plasmídeo: - DNA circular, extracromossômico de replicação autônoma, presente em bactérias. - Geralmente ligado a patogenicidade ou virulência

27 plasmideo Ti Agrobacterium tumefaciens (

28 Esquema de organização estrutural do plasmídeo Ti (Sluys, 1999)

29 Processo biológico da infecção Interação Planta-Agrobacterium (Sheng e Citovsky, 1996).

30 Processo biológico da infecção Interação Planta-Agrobacterium (Sheng e Citovsky, 1996).

31 TRANSFORMAÇÃO POR Agrobacterium VETORES UTILIZADOS PARA Agrobacterium Esquema dos sistemas de vetores de Agrobacterium para transformação de plantas - a) Co-integrados - cis - b) Vetores binários - trans (Brasileiro e Dusi, 1999).

32 vetor binario Hind III (11076) Sph I (11074) Pst I (11068) Sal I (11058) Xba I (11052) BamH I (11046) Sma I (11043) Kpn I (11041) Sac I (11035) EcoR I (11025) Bst XI (10782) CaMV35S promoter Xho I (9995) hygromycin (R) Xho I (8901) CaMV35S polya T-Border (left) Sac II (8383) kanamycin (R) lacz alpha CaMV 35S promoter pcambia bp Gus first exon Nco I (1) Bgl II (8) Catalase intron Gus second exon Nhe I (2014) Histidine tag Bst EII (2050) Nos poly-a T-Border (right) Sph I (2455) pvs1 sta pbr322 ori pbr322 bom Nhe I (5458) pvs1 rep Agrobacterium tumefaciens (

33 Hind III (11076) Sph I (11074) Pst I (11068) Sal I (11058) Xba I (11052) BamH I (11046) Sma I (11043) Kpn I (11041) Sac I (11035) EcoR I (11025) Bst XI (10782) CaMV35S promoter Xho I (9995) hygromycin (R) Xho I (8901) CaMV35S polya T-Border (left) Sac II (8383) kanamycin (R) lacz alpha CaMV 35S promoter pcambia bp Gus first exon Nco I (1) Bgl II (8) Catalase intron Gus second exon Nhe I (2014) Histidine tag Bst EII (2050) Nos poly-a T-Border (right) Sph I (2455) pvs1 sta pbr322 ori pbr322 bom Nhe I (5458) pvs1 rep Mapa de restrição do plasmídeo pcambia 1301

34 Co-cultivo MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO VIA Agrobacterium tumefaciens Método de co-cultivo (Brasileiro et al., 1998)

35 MÉTODOS DIRETOS TRANSFORMAÇÃO POR BIOBALÍSTICA

36 3.2- TRANSFORMAÇÃO POR BIOBALÍSTICA - Consiste na aceleração, a velocidade supersônica, de micropartículas carregando as moléculas de interesse em direção a um alvo biológico.

37 Micropartículas - ouro ou tungstênio - 0,4 a 1,5 µm Partículas de ouro Partículas de tungstênio

38 Acelerador de partículas com alta pressão de gás hélio (Biorad).

39 Esquema de funcionamento.

40 Vetores - não requerem seqüências especiais Utilização: - transformar meristemas e tecidos com alto potencial de regeneração. - transformação de organelas e pólens - transformação de cereais, leguminosas e espécies arbóreas recalcitrantes a outros métodos.

41 3.3 - TRANSFORMAÇÃO POR ELETROPORAÇÃO DE PROTOPLASTOS

42 protoplastos: - células desprovidas de sua parede vegetal mediante tratamento enzimático. enzimas são capazes de degradar: - Celulose - Pectina - Hemicelulose - Outros polissacarídeos que compõem a parede celular.

43 Técnica de eletroporação de protoplastos: -Consiste em submeter os protoplastos e DNA a um campo elétrico de intensidade controlada Choque elétrico: - formação de poros reversíveis na membrana plasmática permitindo a entrada do DNA - Fatores importantes - Duração do pulso - Voltagem aplicada

44 Esquema de eletroporação

45 Cubetas para eletroporação

46 Eletroporador

47 Vantagem Aumento da freqüência de plantas transformadas Ex. (Quecini, 1999) - 36% - eficiência de transformação por eletroporação - 3,47% - de eficiência de transformação por biobalística Desvantagem - A regeneração a partir de protoplastos é um processo longo, podendo induzir variação somaclonal.

48 4- CULTURA DE TECIDOS COMO PRÉ- REQUISITO PARA TRANSFORMAÇÃO

49 - CULTURA DE TECIDOS: É o processo pelo qual pequenos pedaços de tecido vivo (explantes) são isolados da planta e crescem assepticamente em meio de cultura nutritivo. - TOTIPOTÊNCIA CELULAR = toda célula tem a capacidade de se dividir e regenerar um novo indivíduo (Schleiden e Schwann, 1938 e 1939), desde que devidamente estimulados.

50 - Estímulos - meio nutritivo - sais minerais, vitaminas, fonte de carbono - condições ambientais - adequadas para o crescimento e desenvolvimento. - fitorreguladores

51 - fitorreguladores Auxínas AIA - ácido indol-3-acético AIB - ácido indol-3-butirico 2,4-D - ácido 2,4-Diclorofenóxiacético ANA - ácido 1-Naftalenoacético Citocininas K - Cinetina BAP - 6-Benzilaminopurina ZEA Zeatina * Induzem a desdiferenciação e respostas morfogênicas em tecidos diferenciados

52 Balanço hormonal Explantes: discos foliares de tabaco CONCENTRAÇÃO DE AIA (mg/l) CONCENTRAÇÃO DE CINETINA (mg/l) 0 0,02 1,0 0 0,005 0,03 0,18 1,08 3,0 (Raven, 1998)

53 - Protocolos eficientes de regeneração de plantas Aumenta e eficiência de plantas transformadas Agrobacterium Regeneração na extremidade do explante Biobalística - Regeneração na superfície do explante - Acompanhamento histológico da formação dos meristemóides Eletroporação de protoplastos - Protocolo eficiente de isolamento, cultura e regeneração de plantas

54 5- Cultivo de plantas transgênicas no mundo

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56 Area Global de Plantas Transgênicas Cultivadas em 2008: por Paises (Milhões de Hectares)

57 6- Exemplos de plantas transgênicas

58 Flavr savr Tradicional Tomate Longa Vida Etileno http//

59 Síntese do gene poligalacturonase (pg) Síntese do gene e do antisense Transcrição Transcrição Tradução Enzima Enzima não produzida http//

60 Batata resistente a larva de Lacanobia oleracea (mariposa do tomate) Transgênico Controle http//

61 Mamão resistente ao PRSV (Vírus da mancha anelar do mamão) Transgênico Controle http//

62 Arroz Dourado apresentando betacaroteno http//

63 Esquema do processo de transformação do Arroz Dourado apresentando betacaroteno http//

64 Soja resistente ao herbicida imazapyr Detalhe de linhas transgênicas (direita) e não-transgênicas (esquerda) após a aplicação do herdicida (Abud,S. et al., 2003)

65 Alimentos Transgênicos

66 7- CONSIDERAÇÕES FINAIS -A técnica de transformação nos permite: - a obtenção de inúmeras espécies vegetais, com diferentes características: - resistência ou tolerância a estresse biótico e abiótico - melhor capacidade nutricional ou capaz de produzir fármacos (biorreatores). - estudos básicos nas áreas de Genética, Fisiologia, Biologia Celular e Biologia Molecular. -Superar as barreiras reprodutiva -Transferir apenas genes de interesse

67 -Desafios a serem superados: - Adequação dos processos de cultivo in vitro para várias espécies recalcitrantes. - Compreensão das funções da grande maioria de genes. - Manipulação de características complexas que são governadas por vários genes e que freqüentemente estão associados a produtividade.