MICRORGANISMOS ASSOCIADOS A SEMENTES DE SOJA SUBMETIDAS AO ARMAZENAMENTO, À ASSEPSIA E À RETIRADA DE TEGUMENTO

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1 MICRORGANISMOS ASSOCIADOS A SEMENTES DE SOJA SUBMETIDAS AO ARMAZENAMENTO, À ASSEPSIA E À RETIRADA DE TEGUMENTO RESUMO - Determinou-se a presença de microrganismos associados a sementes de soja (Glycine max (L.) Merrill), armazenadas durante oito meses nas temperaturas de 18 o C e 22 o C. As avaliações foram realizadas bimestralmente, sendo as sementes submetidas ou não ao processo de assepsia com hipoclorito de sódio, e retirada ou não do tegumento. Foram incubadas em papel de filtro e avaliadas no sétimo dia. Os microrganismos detectados foram: Fusarium spp., bactérias, Colletotrichum dematium var. ADILSON BIZZETTO 1 MARTIN HOMECHIN 2 truncata e Aspergillus spp.. Fusarium spp. teve sua incidência inalterada durante o período da avaliação, independente do tratamento adotado. Para bactérias, a assepsia com hipoclorito ou fungicidas favoreceu o desenvolvimento na superfície das sementes. Apesar do pequeno número de sementes infectadas por Colletotrichum dematium var. truncata e Aspergillus spp., esses foram considerados, devido à importância que ultimamente vêm adquirindo nas sementes de soja. TERMOS PARA INDEXAÇÃO: Colletotrichum spp., fungicida, Fusarium spp., Glycine max, microrganismos, soja. MICROORGANISMS ASSOCIATED TO SOYBEAN SEEDS SUBMITED TO STORAGE, ASSEPTIC TREATMENT AND TEGUMENT RETREAT ABSTRACT - In soybean seeds (Glycine max (L.) Merrill), kept in storaging during eight months under the temperature of 18 o C and 22 o C, it was determinated the presence of associated microorganisms. The evaluations were done each two months, with the seeds with or without the tegument and to sodium hipoclorine treatment. The seeds were incubated in filter paper and evaluated on the 7 th day. The microorganisms detected were: Fusarium spp., bacteria, Colletotrichum dematium var. truncata and Aspergillus spp. The Fusarium spp. incidence was inalterated during the evaluation period. For bacteria, the asseptic treatment with hipochlorine or fungicides favored its presence and development on the tegument surface. Although the number of seeds infected by Colletotrichum dematium var. truncata and Aspergillus spp. was reduced, these seeds were considered, due to its importance which has been related lately in soybean seeds. INDEX TERMS: Colletotrichum spp., fungicide, Fusarium spp., Glycine max, microorganisms, soybean. INTRODUÇÃO A soja (Glycine max (L.) Merrill) é afetada no campo por amplo número de doenças fúngicas, algumas bacterianas, além de viroses e nematóides (Henning, 1996). Grande número desses organismos utilizam a semente como principal veículo de disseminação e introdução em novas áreas de cultivo. Os patógenos Fusarium semitectum (seca da vagem), Colletotrichum truncatum (antracnose da soja), Peronospora manshurica (míldio), Rhizoctonia solani (rizoctoniose), Phomopsis sojae (queima da haste e da vagem) são disseminados pelas sementes (Henning, 1984 e Yorinori, 1986a). Temperatura e umidade elevadas durante a maturação e a colheita das sementes de soja podem favorecer a infecção de fungos, como Phomopsis spp. e Fusarium spp., principalmente F. semitectum (França Neto e Henning, 1984). Segundo Yorinori (1986b), a ocorrência de percevejos-sugadores (Euchistus heros, Nezara viridula e Piezodorus güildini) responsáveis por picadas e retardamento da colheita, auxiliam a infecção por Phomopsis spp., Fusarium spp. e Colletotrichum dematium var. truncata. De acordo com Menten e Bueno (1987), há relação entre a época de inoculação e a localização do patógeno nas diferentes partes das 1. Aluno do Curso de Agronomia da Universidade Estadual de Londrina (UEL), bolsista de Iniciação Científica do CNPq. 2. Eng. Agr.,Dr.,Prof. Adjunto do Departamento de Fitopatologia da UEL e orientador do trabalho, Caixa Postal 6001, CEP Londrina, PR, Brasil.

2 131 sementes, bem como da flora fúngica existente. Após a maturação, também há possibilidade de infecções durante os processos de secagem, trilha e armazenamento. Na avaliação sanitária de sementes, é recomendada a utilização de soluções desinfestantes, como de hipoclorito de sódio, para eliminar microrganismos saprofíticos que possam eventualmente influenciar o desenvolvimento de patógenos nas sementes. Saver e Burroughs (1984) verificaram aumento da eficiência de controle de Aspergillus spp. em sementes de trigo, com a redução do ph da solução de NaOCl de para 8, apesar da maior instabilidade da molécula. No método de papel de filtro, Henning (1996) postula a utilização de solução de hipoclorito de sódio a 1,05% (20 % do produto comercial QBoa ), com o objetivo de notificar os patógenos existentes nas sementes, sem a ocorrência de saprófitos. Henning e França Neto (1980) verificaram a erradicação de patógenos localizados internamente em sementes com elevados índices de danos mecânicos, provavelmente resultante da penetração do hipoclorito nas rachaduras existentes no tegumento. O presente trabalho visa a determinar a incidência de microrganismos em sementes com ou sem tegumento, submetidas ou não à assepsia superficial, no período de oito meses de armazenamento a 18 e 22 o C. MATERIAL E MÉTODOS Sementes da cultivar de soja Br-16, colhidas na safra agrícola 95/96 na região da Warta, Distrito de Londrina - PR, pela EMBRAPA-Soja, foram avaliadas bimestralmente quanto à sanidade, durante oito meses, sob duas temperaturas de armazenamento (18 e 22 o C), sendo a análise sanitária realizada no Laboratório de Fitopatologia da Universidade Estadual de Londrina. As sementes de soja foram acondicionadas em sacos de polipropileno. Quatro tratamentos, diferenciados pela adoção ou não de assepsia e/ou retirada de tegumento, foram representados por quatro repetições de 50 sementes, amostradas de frações armazenadas sob ambas temperaturas consideradas. O método de papel de filtro (Brasil, 1980) modificado foi adotado. Dez caixas plásticas previamente desinfestadas com solução de hipoclorito de sódio a 1,02 %, munidas de quatro folhas de papel de filtro umedecidas com água autoclavada, receberam 20 sementes cada, totalizando 200 sementes por tratamento em cada período de avaliação. As folhas de papel de filtro e água foram esterilizadas em autoclave a 120 o C por 20 e 60 minutos, respectivamente. Dispostas nos recipientes, as sementes foram incubadas por sete dias (Costa et al., 1992) em temperatura ambiente e ciclos alternativos de 12 horas de luz e 12 horas de escuro. Decorrido esse período, a leitura de microrganismos foi efetuada com auxílio de microscópio estereoscópico e binocular. Nos tratamentos com assepsia, as sementes foram imersas em solução de hipoclorito de sódio a 0,51 % durante um minuto. Nos tratamentos com sementes sem tegumento, a retirada manual dessa estrutura foi facilitada pela embebição daquelas em água esterilizada por 180 minutos. No oitavo mês de armazenamento, uma amostra adicional de 200 sementes foi tratada com fungicida thiabendazole na dosagem de 0,2 g i.a./kg de sementes, visando a determinar o controle do fungicida sobre os distintos microrganismos em relação à amostra não tratada. A influência isolada e das interações dos fatores: temperatura de armazenamento, assepsia e retirada de tegumento sobre o desenvolvimento de microrganismos nas sementes de soja, foram determinadas pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade. RESULTADOS E DISCUSSÃO Aos dois e seis meses de armazenamento, a redução significativa do número médio de sementes infectadas por Fusarium spp. nas sementes com assepsia, em relação às sem assepsia e nas sementes sem tegumento em relação às com tegumento (Tabela 1), ocorreu devido a menor infecção das sementes sem tegumento e com assepsia (Tabela 2), em relação aos demais tratamentos. O gênero Fusarium destacou-se pela infecção de grande número de sementes de soja (Tabela 1 e 2). Goulart, Paiva e Andrade (1995b) também detectaram alta freqüência, verificando Fusarium semitectum em 96,5 % dos lotes de sementes de soja amostrados e incidência média de 17,2 %. De acordo com esses autores, os locais de produção de sementes interferem na incidência de F. semitectum na soja. As temperaturas de armazenamento não reduziram significativamente Fusarium spp. nas sementes, apesar da menor freqüência no lote armazenado à temperatura de 22 o C (Tabela 1). A assepsia associada à retirada de tegumento e ao armazenamento em temperatura de 22 o C, proporcionaram menores infecções por Fusarium spp., principalmente nos seis primeiros meses. Nos demais tratamentos, a freqüência do fungo nas sementes manteve-se estável, sem diferenças estatísticas no decorrer do armazenamento (Tabela 2). Segundo Sisterna e Lori (1990), a manutenção da viabilidade do Fusarium spp. durante o armazenamento é influenciada pela localização interna nas sementes, sendo sua penetração facilitada por danos causados por percevejos. Para Henning e França Neto (1980), apesar de alguns autores o considerarem como parasita fraco ou saprófita, esse microrganismo pode promover diminuição nos percentuais de germinação em laboratório.

3 132 TABELA 1 - Número médio de sementes de soja da cv. Br-16 infectadas por Fusarium spp., armazenadas durante oito meses a 18 e 22 o C, em diferentes períodos de armazenamento, submetidas ou não à assepsia e retirada de tegumento, considerando-se a influência isolada dos diferentes fatores. UEL, Londrina - PR, Repetições Período de armazenamento(meses) 2 4 s 6 8 Com assepsia ab 1 89,5 aa 60,25 ab 62,5 aa Sem assepsia 4 122,25 aa 106,25 aa 97 aa 89,25 aa C.V. = 22,85 % Com tegumento aa 104 aa 98,25 aa 91,5 aa Sem tegumento 4 84,25 ab 91,75 aa 59 ab 60,25 ab C.V.= 20,52 % 18 0 C 4 104,25 aa 103,25 aa 96 aa 81 aa 22 0 C 4 92 aa 92,5 aa 61 ab 70,75 aa C.V.= 16,50 % 1 Letras maiúsculas de uma mesma coluna e letras minúsculas iguais de uma mesma linha, nos diferentes fatores considerados isoladamente, não apresentam diferenças estatísticas (Tukey, 5 %). 2 Número total médio de sementes infectadas de um total de 200 sementes. O tratamento com fungicida aplicado nas sementes reduziu esse patógeno, sem, entretanto, eliminar completamente o inóculo (Tabela 2). Resultados obtidos por Goulart, Paiva e Andrade (1995a) indicaram alta eficiência do fungicida thiabendazole no controle de Fusarium semitectum em sementes de soja, erradicando o patógeno. Os processos de assepsia e principalmente de retirada do tegumento favoreceram o desenvolvimento médio de bactérias, ao contrário das temperaturas de armazenamento, nas quais a população bacteriana não variou significativamente nos diferentes períodos considerados (Tabela 3). Na interação dos fatores assepsia, temperatura de armazenamento e retirada de tegumento, verificouse favorecimento do desenvolvimento das bactérias nas sementes sem tegumento, em ambas temperaturas. Isso ocorreu provavelmente não pela localização, mas em função das condições existentes. Na retirada do tegumento, quando as sementes foram imersas em água durante três horas, houve condições ideais para desenvolvimento desses organismos em relação aos fungos. Situação idêntica ocorreu nas sementes tratadas com fungicidas aos oito meses de armazenamento. A eliminação de competidores da bactéria promoveu aumento em relação às sementes não tratadas, independentemente das temperaturas de armazenamento (Tabela 4). Apesar de não observar diferenças significativas nos diferentes tratamentos, menor número de sementes foram infectadas por Colletotrichum dematium var. truncata, quando efetuada a assepsia e retirada de tegumento (Tabela 5). Para Ito e Tanaka (1993), a infecção das sementes por C. dematium var. truncata se restringe ao tegumento, localizando-se na camada intermediária da semente, que é rica em amido. O embrião normalmente não é colonizado, mas quando infectado, garante a sobrevivência do patógeno por período prolongado de tempo, principalmente nas sementes armazenadas a baixas temperaturas. Segundo Henning (1984), devido à baixa incidência desse agente em sementes, pouco se conhece a respeito das implicações que um lote com elevada incidência de Colletotrichum spp. pode causar, se fosse aprovado no teste de germinação. Sisterna e Lori (1990) destacaram que a manutenção de C. dematium var. truncata durante o armazenamento pode levar à redução do poder germinativo das

4 133 sementes. Esse fator é agravado pela constatação de Goulart (1991), que observou em condições de campo, percentagem de plântulas com sintomas de antracnose superior à percentagem de sementes infectadas com Colletotrichum dematium var. truncata, provavelmente atribuído a outras fontes de inóculo, como restos culturais. Poucas sementes foram afetadas por Colletotrichum dematium var. truncata, comparativamente aos demais microrganismos (Tabela 5). Em 142 amostras de lotes de sementes de soja, produzidas no Estado do Mato Grosso na safra 1992/93, Goulart, Paiva e Andrade (1995b) verificaram que a espécie Colletotrichum truncatum ocorreu em 45,1 % dos lotes, mas com incidência média de 1,8 %. TABELA 2 - Número de sementes de soja da cv. Br-16 infectadas por Fusarium spp., submetidas ao armazenamento a 18 e 22 o C, com ou sem tegumento e assepsia, a quatro períodos de armazenamento. UEL, Londrina - PR, Temperatura Média Fungicida 3 93 aa aa 90 aa 105 aa 97 A C 22 0 C c/tegumento 2 c/tegumento 68 aba 100 aa 61 aba 22 bb 62,75 A aa 112 aa 139 aa 105 aa 120 A aa 101 aa 94 aa 92 aa 104,75 A aa 111 aa 70 aa 70 aa 88 A 3 34 ab 47 ab 20 aa 53 aa 38,5 B aa 93 aa 94 aa 86 aa 100,75 A aa 119 aa 61 aa 74 aa 89,25 A 0 C. V. = 21,15 % 1 Letras maiúsculas de uma mesma coluna e letras minúsculas iguais de uma mesma linha, nos diferentes tratamentos das respectivas temperaturas, não apresentam diferenças estatísticas (Tukey, 5 %). 2 Número de sementes infectadas num total de 200 sementes. 3 de sementes com thiabendazole (0,2 g i.a./ Kg semente)

5 134 TABELA 3 - Número médio de sementes de soja da cv. Br-16 infectadas por Bactérias sp., armazenadas durante oito meses a 18 e 22 o C, submetidas ou não à assepsia e à retirada de tegumento, considerando a influência isolada dos diferentes fatores. UEL, Londrina - PR, Repetições Com assepsia 4 69,5 2 aa 1 81 aa 79,75 aa 64,5 aa Sem assepsia 4 60,75 aba 69 aa 59,75 abb 45,75 bb C.V.= 16,13 % Com tegumento 4 33,75 ab 32,5 ab 21 ab 19,25 ab Sem tegumento 4 96,5 bca 117,5 aba 118 aa 91 ca C.V.= 61,56 % 18 0 C 4 64,75 aba 75,25 aa 67,5 aba 53 ba 22 0 C 4 65,5 aa 74,75 aa 72 aa 57,25 aa C.V.= 11,28 % 1 Letras maiúsculas de uma mesma coluna e letras minúsculas de uma mesma linha iguais nos diferentes fatores considerados isoladamente, não apresentam diferenças estatísticas (Tukey, 5 %). 2 Número total médio de sementes infectadas num total de 200 sementes. O thiabendazole eliminou completamente Colletotrichum dematium var. truncata nos diferentes tratamentos, para sementes armazenadas a 22 o C, o mesmo não ocorrendo nas armazenadas a 18 o C (Tabela 5). Segundo França Neto e Henning (1992), o thiabendazole é eficiente no controle de Fusarium semitectum e Phomopsis spp., mas não para C. truncatum, e recomendam a utilização de outros fungicidas para lotes com incidência superior a 5 %. Goulart (1991) observou que os fungicidas tolyfluanid, benomyl, pencycuron + tolyfluanid foram eficientes no controle de Colletotrichum dematium var. truncata nas sementes de soja, apesar de não erradicá-lo. A baixa infecção de Aspergillus spp. nas sementes e a alta variação estatística limitaram a determinação da influência dos fatores considerados isoladamente (Tabela 06). Segundo Dhingra, Nicholson e Sinclair (1967), a presença de Aspergillus spp., notadamente de A. flavus é melhor notificada quando as sementes de soja são submetidas a temperatura que oscilam de 30 o C a 35 o C de incubação. Em ambas as temperaturas de armazenamento, o número de sementes infectadas com Aspergillus spp. aumentou ao longo dos meses (Tabela 6). Christensen e Dorworth (1966) notificaram maior ocorrência de Aspergillus spp. nas sementes armazenadas a 25 o C, em comparação às armazenadas a 20 o C e a 5 o C. Quanto à localização, Pereira et al. (1994) detectaram pelo método de papel de filtro, maior percentual de Aspergillus spp. em relação ao método de incubação em meio ágarsalino, sendo este mais eficiente na detecção de microrganismos localizados internamente nas sementes, sugerindo a localização nas camadas mais superficiais. Em sementes de soja com 10,9 % de incidência de A. flavus, Dhingra, Nicholson e Sinclair (1967) verificaram que 1,4 % estavam localizados internamente e 9,5 % externamente. Maior número de sementes infectadas por Aspergillus spp. foi verificado após oito meses de armazenamento, entretanto, o tratamento com thiabendazole proporcionou eficiente controle (Tabela 7). Embora em baixa incidência, Aspergillus spp., principalmente

6 135 Aspergillus flavus, tem provocado deterioração das sementes com perda de matéria seca e de coloração (É verão, 1995), além de produzir micotoxinas, responsáveis por alterações histológicas em animais e de efeito teratogênico (Wogan, 1966). Dhingra, Nicholson e Sinclair (1967) verificaram que Aspergillus flavus reduz a viabilidade da soja, principalmente em temperaturas de incubação mais elevadas (30 o C- 35 o C), nas quais as reduções de germinação e tamanho dos cotilédones das plântulas são mais evidentes. Lotes de sementes de soja descartados e amostrados por Pereira et al. (1994) atingiram índices de infecção de 81% com Aspergillus flavus. Apesar da estreita relação observada entre os fungos de armazenamento e a baixa germinação dos lotes, foi constatado que Aspergillus spp. não foi a causa principal da baixa qualidade das sementes. TABELA 4 - Número de sementes de soja da cv. Br-16 infectadas por Bactérias sp., com ou sem tegumento e assepsia, em quatro períodos de armazenamento nas temperaturas de 18 e 22 o C. UEL, Londrina - PR, Temperatura Média Fungicida 3 c/tegumento 2 27 b 1 32 b 35 b 16 b 27,5 B C 22 0 C c/tegumento 105 a 130 a 119 a 104 a 114,5 A b 27 b 9 b 11 b 19 B a 112 a 107 a 81 a 99,5 A b 38 b 32 b 40 b 36,5 B a 124 a 133 a 98 a 116,25 A a 33 b 10 b 10 b 24 B a 104 a 113 a 81 a 92,75 A 137 C. V. = 16,19 % 1 Letras minúsculas e maiúsculas iguais, nas colunas nos diferentes tratamentos, não apresentam diferenças estatísticas (Tukey, 5 %). 2 Número de sementes infectadas num total de 200 sementes. 3 de sementes com thiabendazole (0,2 g i.a./ Kg semente)

7 136 TABELA 5 - Número de sementes de soja da cv. Br-16 infectadas por Colletotrichum dematium var. truncata, com ou sem tegumento e assepsia, em quatro períodos de armazenamento nas temperaturas de 18 e 22 o C. UEL, Londrina - PR, Temperatura Média Fungicida 3 c/tegumento aa 3 aa 4 aa 1 aa 4,25 A C 1 aa 1 aa 1 aa 0 aa 0,75 A 0 13 aa 17 aa 5 aa 5 aa 10 A 3 4 aa 1 aa 8 aa 10 aa 5,75 A 1 c/tegumento 7 aa 2 aa 4 aa 4 aa 4,25 A C 0 aa 0 aa 0 aa 0 aa 0 A 0 5 aa 12 aa 8 aa 5 aa 9,25 A 0 2 ba 30 aa 2 ba 3 ba 7,5 A 0 C. V. = 10,53 % 1 Letras maiúsculas de uma mesma coluna e letras minúsculas iguais de uma mesma linha, nos diferentes tratamentos das respectivas temperaturas, não apresentam diferenças estatísticas (Tukey, 5 %). 2 Número de sementes infectadas num total de 200 sementes. 3 de sementes com thiabendazole (0,2 g i.a./ Kg semente)

8 137 TABELA 6 - Número médio de sementes de soja da cv. Br-16 infectadas por Aspergillus spp., armazenadas durante oito meses a 18 e 22 o C, submetidas ou não à assepsia e à retirada de tegumento, considerando-se a influência isolada dos diferentes fatores. UEL, Londrina - PR, Repetições Com assepsia 4 0,5 2 ba 1 0,5 ba 1 bb 16,25 aa Sem assepsia 4 1,25 ba 1,75 ba 9,25 aba 15,5 aa C.V.= 112 % Com tegumento 4 1 ba 2 ba 3,75 ba 14 aa Sem tegumento 4 0,75 ba 0,25 ba 6,5 ba 17,75 aa C.V.= 108 % 18 0 C 4 1 ba 1,75 ba 3,25 ba 13,5 aa 22 0 C 4 0,75 ba 0,50 ba 7 ba 18,25 aa C.V.= 109,2 % 1 Letras maiúsculas de uma mesma coluna e letras minúsculas iguais de uma mesma linha, nos diferentes fatores considerados isoladamente, não apresentam diferenças estatísticas (Tukey, 5 %). 2 Número total médio de sementes infectadas num total de 200 sementes. CONCLUSÕES a) Em sementes desprovidas do tegumento, a assepsia reduz a incidência de Fusarium spp; b) O fungicida thiabendazole, aplicado em sementes de soja, controla eficientemente Fusarium spp. e Aspergillus spp., porém com pouca eficiência no controle de Colletotrichum dematium var. truncata; c) A retirada de tegumento e/ou o tratamento das sementes com o fungicida thiabendazole favorece o desenvolvimento das bactérias em sementes de soja; d) Temperaturas de armazenamento de 18 O C e 22 O C não interferem significativamente no número de sementes infectadas com Fusarium spp., Colletotrichum dematium var. truncata, Bactérias sp. e Aspergillus spp. e) A assepsia e retirada de tegumento não reduz o número de sementes infectadas com Colletotrichum dematium var. truncata. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BRASIL. Ministério da Agricultura. Departamento Nacional de Produção Vegetal. Regras para análise de sementes. Brasília, p. CHRISTENSEN, C.M.; DORWORTH, C.E.. Influence of moisture content, and time on invasion of soybeans by storage fungi. Phytopathology, St. Paul, v.56, p , 1966.

9 138 TABELA 7 - Número médio de sementes de soja da cv. Br-16 infectadas com Aspergillus spp., com ou sem tegumento e assepsia, a quatro períodos de armazenamento, nas temperaturas de 18 e 22 o C. UEL, Londrina- PR, Temperatura Média Fungicida 3 c/tegumento aa 1 aa 0 aa 9 aa 2,5 A C 1 ba 1 ba 1 ba 24 aa 6,75 A 0 2 aa 5 aa 6 aa 11 aa 6 A 2 1 aa 0 aa 6 aa 10 ab 4,25 A 0 c/tegumento 0 ba 0 ba 2 ba 19 aa 5,25 A C 1 aa 0 aa 1 aa 13 aa 3,75 A 0 2 aa 2 aa 7 aa 17 aa 7 A 4 0 ba 0 ba 18 aa 24 aa 10,5 A 2 C. V. = 73,27 % 1 Letras maiúsculas de uma mesma coluna e letras minúsculas iguais uma mesma linha, nos diferentes tratamentos das respectivas temperaturas, não apresentam diferenças estatísticas (Tukey, 5 %). 2 Número de sementes infectadas num total de 200 sementes. 3 de sementes com thiabendazole (0,2 g i.a./ Kg semente)

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