INVESTIGAÇÃO DE MUTAÇÃO NOS GENES DO FATOR V, DA PROTROMBINA E DA METILENOTETRAHIDROFOLATO REDUTASE (MTHFR) EM PACIENTES COM HISTÓRIA DE TROMBOSE
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- Carolina Olivares Costa
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1 INVESTIGAÇÃO DE MUTAÇÃO NOS GENES DO FATOR V, DA PROTROMBINA E DA METILENOTETRAHIDROFOLATO REDUTASE (MTHFR) EM PACIENTES COM HISTÓRIA DE TROMBOSE INVESTIGATION OF MUTATION IN GENE FACTOR V, PROTHROMBIN AND METHYLENETETRAHYDROFOLATE REDUCTASE (MTHFR) IN PATIENTS WITH HISTORY OF THROMBOSIS Bonfim, Ariane da Silva 1 ; Favoreto, Núbia Mara de Sousa 1 ; Silva, Rívia Mara Morais 2 ; Brum, Carla de Aredes 3 ; Valadão, Analina Furtado 4 RESUMO A trombose é reconhecidamente uma doença de caráter multifatorial e sua ocorrência está intimamente relacionada com a presença de fatores genéticos e/ou adquiridos. Os fatores genéticos envolvidos no estudo consistem em mutações em diferentes genes, podendo ocorrer isolados ou combinados entre si. O presente estudo investigou mutações no gene do Fator V de Leiden, Fator II (Protrombina) e Metilenotetrahidrofolato Redutase (MTHFR), em seis indivíduos que apresentaram evento trombótico sem causa diagnosticada. Os participantes do estudo eram do sexo feminino, faziam uso de anticoncepcional oral ou reposição hormonal. Para a detecção da mutação no Fator V de Leiden e MTHFR foi utilizada a técnica de PCR RFLP, já para o Protrombina PCR ASO. Neste estudo houve uma prevalência de mutação no gene do Fator V de Leiden, sendo que dos seis casos analisados, quatro apresentaram mutação em heterozigose para o mesmo. Dois apresentaram mutação em heterozigose para MTHFR. Para Protrombina não foi identificada mutação. Vale ressaltar que a população analisada neste estudo foi relativamente pequena. Este estudo demonstrou a influência de mutações, mas como destacado na literatura foi visto que, além dos fatores genéticos, a soma dos fatores adquiridos potencializa ainda mais o risco para ocorrência do evento, bem como o fato de que a ausência das principais mutações descritas na literatura não exclui a possibilidade de ocorrência de trombose. Palavras Chave: Trombofilia, Fatores de risco, Reação em Cadeia Polimerase (PCR). ABSTRACT Thrombosis is recognized as a multifactorial disease and its occurrence is closely related to the presence of genetic factors and / or acquired. Genetic factors involved in the study consist of mutations in different genes, may occur alone or in combination with each other. The present study investigated mutations in Factor V Leiden, Factor II (Prothrombin) and methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) in six subjects who had diagnosed thrombotic event without a cause. The study participants were female, were using oral contraceptives or hormone replacement. 1 Graduandos pelo Curso de Farmácia do Centro Universitário do Leste de Minas Gerais UnilesteMG; 2 Farmacêutica mestre; Docente do Curso de Farmácia do Centro Universitário do Leste de Minas Gerais UnilesteMG 3 Farmacêutica mestre; Docente do Curso de Farmácia do Centro Universitário do Leste de Minas Gerais UnilesteMG; 4 Farmacêutica doutora pela Universidade Federal de Minas gerais; Docente do Curso de Farmácia do Centro Universitário do Leste de Minas Gerais UnilesteMG
2 To detect the mutation in Factor V Leiden and MTHFR was used the PCR - RFLP, PCR has to Prothrombin - ASO. In this study there was a prevalence of mutation in the gene for Factor V Leiden, and the six cases examined, four had heterozygous mutation for the same. Two were heterozygous for MTHFR mutation. For Prothrombin mutation was not identified. It is noteworthy that the population analyzed in this study was relatively small. This study demonstrated the influence of mutations, but as noted in the literature was seen that in addition to genetic factors, the sum of acquired factors further enhances the risk for the event, and the fact that the absence of major mutations described in literature does not exclude the possibility of thrombosis. Keywords: Thrombophilia, Risk factors, Polymerase Chain Reaction (PCR). INTRODUÇÃO A trombose é reconhecidamente uma doença de caráter multifatorial, atingindo em média 1/1000 indivíduos adultos por ano. Essa incidência varia de acordo com a idade, sendo dez vezes menor em indivíduos com idade entre 20 a 40 anos em comparação a faixas etárias mais avançadas (KONOPKA et al., 2010). Trata-se de um processo patológico relacionado à ativação inadequada dos mecanismos hemostáticos nos vasos não lesados. Sua ocorrência está intimamente relacionada à presença de fatores genéticos e adquiridos (utilização de anticoncepcional oral, gravidez, imobilização após cirurgias, traumatismo ou doenças malignas) que concorrem isoladamente ou em associação para o seu desencadeamento (GUIMARÃES et al., 2009). Na maioria das doenças tromboembólicas, a principal anormalidade não está na coagulabilidade, mas sim no sítio onde ela é ativada. Tanto para executar a hemostasia quanto para formar o trombo, o mecanismo de coagulação segue os mesmos passos, cujo conhecimento permite reconhecer anormalidades geradoras de tromboses (FUCHS et al., 2004). Os fatores de risco para trombose incluem a hipertensão arterial, o tabagismo, dislipidemias e o diabetes mellitus. Entre os fatores adquiridos clássicos que contribuem para a trombose podemos citar a idade, o uso de certos medicamentos como os anticoncepcionais orais e a terapia de reposição hormonal, gravidez e puerpério, imobilização de membros ou de parte do corpo, traumas locais, câncer, presença de anticorpos antifosfolípides, cirurgias de grande porte, infecções e síndrome nefrótica (GUIMARÃES et al., 2009).
3 Trombofilias hereditárias são condições genéticas que aumentam o risco de doença tromboembólica e podem ser causadas por inibição insuficiente da cascata de coagulação, por mutações com perda funcional ou por atividade coagulante aumentada através de mutações com ganho de função (ALMEIDA, 2010). Os fatores genéticos envolvidos no estudo consistem em mutações em diferentes genes que codificam fatores hemostáticos, podendo ocorrer isolados ou combinados entre si. As principais desordens genéticas incluem: resistência à ação da proteína C ativada (Fator V de Leiden), mutação do gene do Fator II (Protrombina), mutação na enzima MTHFR entre outras (ORRA, 2002). O Fator V de Leiden é o mais importante fator de risco genético da trombose. Trata-se de uma alteração hereditária, autossômica dominante, que interfere na atuação da proteína C, na sua forma ativada, que é um dos fatores reguladores do sistema de coagulação e que atua na inativação proteolítica do fator V e do fator VIII. Esta alteração é decorrente de uma transição G->A na posição 1691 do gene, resultando na substituição de Arginina (R) por Glutamina (Q) na posição 506 na proteína (que constitui sítio de clivagem da PC ativada na molécula do fator V), induzindo à resistência da proteína C ativada, na qual a clivagem e inativação do fator V são feitas de forma insatisfatória, levando-o ao acúmulo e conseqüentemente aumentando o risco de trombose (GODOY, 2005). O Fator II (Protrombina), sintetizada no fígado na presença de vitamina K, é a precursora da trombina, que ao final da cascata de coagulação induz a formação da fibrina. A trombina participa da cascata de coagulação e ao se ligar à trombomodulina ativa o sistema da proteína C, tendo papel crucial no equilíbrio pró coagulante ou anticoagulante (BARROS et al., s.d). O gene do fator II esta localizado no cromossomo 11 próximo ao centrômero, contem aproximadamente pares de bases (pb) e é composto de 14 exons e 13 introns. Em 1996 foi descrita a variante alélica protrombina G20210A, uma mutação na região 3 não traduzida do gene da protrombina, que consiste na substituição de guanina por adenina no nucleotídeo localizada próximo ao sitio de clivagem do precursor do RNA mensageiro (RNAm) em que a cauda poli-a e adicionada. Essa mutação se associa a aumento da estabilidade do seu RNAm e concentração plasmática da protrombina, o que parece ser o mecanismo pelo qual predispõe a ocorrência de trombose (RAMOS et al., 2008)
4 A Metilenotetrahidrofolato Redutase (MTHFR) é uma enzima envolvida na remetilação de homocisteína em metionina. Nesta enzima ocorre a substituição de uma Alanina por Valina (transição C->T no nucleotídeo 677). Uma deficiência na enzima MTHFR acarreta aumento da concentração plasmática de homocisteína, conhecida como hiper-homocisteinemia, que além de favorecer a instalação de placas de ateroma nas artérias elásticas e musculares, também pode acometer vasos de todos os calibres com tromboses tanto arteriais quanto venosas (BONINI- DOMINGOS et al., 2005). A detecção de mutação em pacientes portadores de eventos trombóticos é recomendada para esclarecimento das causas e para efetuar o rastreamento em membros de sua família, ainda sem o aparecimento de eventos trombóticos, de forma a avaliar os riscos associados e assim determinar um acompanhamento médico preventivo. Dada a importância de polimorfismos genéticos, este estudo teve como objetivo investigar a presença da mutação G1691A no gene do Fator V (Fator V Leiden), G20210A no gene do Fator II (Protrombina) e C677T no gene Metilenotetrahidrofolato Redutase (MTHFR) em pacientes com história de trombose pregressa. METODOLOGIA 1. Seleção dos pacientes e Coleta do material biológico A capacitação e triagem dos pacientes foram feita por parte da clínica médica (hematologista). Os pacientes selecionados apresentavam evento trombótico, sendo os mesmos do sexo feminino e maiores de 18 anos, estes foram encaminhados ao laboratório de Biologia Molecular/UNILESTE-MG para coleta do material biológico (sangue). Amostras de sangue de veia periférica foram coletadas pelo sistema de venóclise, com aparato descartável a vácuo (Vacutainer) e colocadas em tubos contendo EDTA 0,1% (volume final em concentração 1mg/dl) e 5mL de sangue. O material coletado foi mantido a 4ºC por no máximo 24h entre a coleta e a extração do DNA. Os dados pessoais dos pacientes foram mantidos em sigilo. As interessadas assinaram o Termo de consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), responderam a um questionário e em seguida foi feita a coleta de material biológico (sangue).
5 2. Extração de DNA genômico de leucócitos O protocolo geral da extração seguiu as seguintes etapas: Foram coletadas amostras de sangue (sangue total) de 5 ml; 1- As amostras foram colocadas em tubo falcon de 15 ml; 2- Em seguida, adicionou-se 1 volume de tampão TKM1 (10 mm Tris-HCl ph 7,6; 10 mm KCl; 10 mm MgCl2; 2 mm EDTA), e 300µl de Triton X-100; 3- As amostras foram centrifugadas a uma velocidade de rpm por 15 minutos; 4- Em seguida, o sobrenadante foi desprezado e o pellet foi lavado com 5 ml de tampão TKM1; 5- As amostras foram centrifugadas novamente em uma velocidade de 1600 rpm por 10 minutos; 6- Após a centrifugação o sobrenadante foi desprezado; 7- Ao pellet foram adicionados 1,6 ml de tampão TKM2 (10 mm Tris-HCl ph 7,6; 10 mm KCl; 10 mm MgCl2; 2 mm EDTA; 0,4 M NaCl) e 100µl de SDS 10%, seguido de incubação a 55ºC por 20 minutos; 8- Após o período de incubação adicionou-se 0,9 ml de NaCl saturado sob agitação e posteriormente foi centrifugado a rpm por 15 minutos; 9- Após a centrifugação o sobrenadante foi transferido para um tubo falcon e em seguida foi adicionado 6ml de etanol gelado para que ocorra a precipitação do DNA; 10- Após a precipitação do DNA este foi lavado em 500 ml de etanol 70% por aproximadamente 10 minutos. Em seguida o álcool foi removido e o tubo foi deixado aberto para total evaporação do álcool na temperatura ambiente; 11- O DNA foi solubilizado em tampão TE (Tris-HCl 10 mm (ph 8,0); EDTA 0,1 mm) e mantido a -20ºC para posterior utilização. 3. Quantificação e amplificação do DNA Após a extração, a concentração (ng/ µl) e pureza do DNA genômico obtido foi avaliada por ensaio espectrofotométrico, absorção máxima no comprimento de onda de 260 nm.
6 4. PCR-RFLP (digestão do produto de PCR por enzima de restrição) e PCR- ASO (PCR alelo específico) A escolha da região a ser amplificada foi feita com base em dados obtidos de artigos científicos disponíveis. A amplificação da região gênica avaliada foi feita pela reação em cadeia da polimerase (PCR), uma técnica in vitro que permite a amplificação de sequências específicas de ácido desoxirribonucléico (DNA). Neste estudo foram utilizadas as técnicas de PCR-RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphysm) e PCR-ASO (Allele Specific Oligonucleotide Amplification). A reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada em um termociclador (TECHNE TC- 412) United Kingdom. A mistura da reação (20 µl total), consistiu de ng de DNA alvo, tampão (1,5 mm MgCl2, 50 mm KCl, 10mM Tris-HCl, ph 8,5), 200 µm de cada dntp, 0,5 U de Taq-DNA polimerase (DNA polimerase termoestável da bactéria Thermus aquaticus) e 2,0 pmoles de cada iniciador. O polimorfismo G1691A no gene do Fator V de Leiden e C677T no gene da MTHFR foi determinado pelo uso da técnica de PCR-RFLP (digestão do produto de PCR por enzima de restrição), sendo a sequência dos primers para Fator V: Direto (5 -TCAGGCAGGAACAACAACAT-3 ) e Reverso (5 - GGTTACTTCAAGGACAAAATACCTGTAAAGCT-3 ) (SOARES, et al., 2005) e para Metilenotetrahidrofolato Redutase (MTHFR): Direto (5 - TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3 ) e Reverso 677R - (5 - AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3 ) (ALVARENGA M.P.S, 2006). O programa de amplificação utilizado para o Fator V de Leiden constituiu em uma desnaturação inicial 95 C por 10 min., seguido de 40 ciclos: 94ºC por 1min.; 55ºC por 1min.; 72ºC por 1min. e 72ºC por 5min. A presença do fragmento amplificado de 241pb foi confirmada por eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. Em seguida, 5µL do produto amplificado foram submetidos à digestão com a enzima de restrição HindIII (Promega), em temperatura ótima de 37 C, BSA (Soro Albumina Bovina), água livre de nucleases e tampão indicado pelo fornecedor. Após a digestão os fragmentos foram visualizados por eletroforese em gel de acrilamida 6% corado pela prata e o tamanho dos fragmentos confirmados por comparação com padrão de peso molecular 100 pb (Promega). A presença da
7 mutação cria uma sequência que a enzima HindIII reconhece e leva à quebra do fragmento em duas partes, uma de 209 pb e outra de 32 pb. Indivíduos homozigotos normais apresentam um fragmento de 241 pb, indivíduos heterozigotos para a mutação apresentam três fragmentos (241, 209 e 32 pb) e indivíduos homozigotos mutados apresentam dois fragmentos (209 e 32 pb) (FIGURA I). FIGURA I Gel de Acrilamida 6%, corado por nitrato de prata. Resultados referentes à mutação para Fator V de Leiden. As canaletas 1, 2, 3 e 4 representam pacientes homozigoto normal (241 pb); a canaleta 5 representa controle positivo (homozigoto mutado 209 e 32 pb); 6 controle negativo (homozigoto normal - 241pb); a canaleta 7 mostra controle positivo para heterozigoto (241, 209 e 32 pb). A canaleta PM representa o padrão de peso molecular (100 pb) Para a Metilenotetrahidrofolato Redutase (MTHFR), foi utilizado o programa de amplificação que constitui em uma desnaturação inicial 94 C por 3 min., seguido de 35 ciclos: 94 C por 1 min.; 58 C por 1 min.; 72 C por 1 min. e 72 C por 5 min. A presença do fragmento amplificado de 198 pb foi confirmada por eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. Em seguida, 5µL do produto amplificado foram submetidos à digestão com a enzima de restrição HinfI (Promega), em temperatura ótima de 37 C, BSA (Soro Albumina Bovina), água livre de nucleases e tampão indicado pelo fornecedor. Após a digestão os fragmentos foram visualizados por eletroforese em gel de acrilamida 6% corado pela prata e o tamanho dos fragmentos confirmados por comparação com padrão de peso molecular 100 pb (Promega). A presença da mutação cria uma seqüência que a
8 enzima HinfI reconhece e leva à quebra do fragmento em duas partes, uma de 175 pb e outra de 23 pb. Indivíduos homozigotos normais apresentam um fragmento de 198 pb, indivíduos heterozigotos para a mutação apresentam três fragmentos (198, 175 e 23 pb) e indivíduos homozigotos mutados apresentam dois fragmentos (175 e 23 pb) (FIGURA II). FIGURA II Gel de Acrilamida corado por nitrato de prata. A canaleta PM corresponde ao padrão de peso molecular (100 pb); As canaletas 1 e 2 correspondem aos resultados dos pacientes, sendo esses heterozigotos ( 198, 175 e 23 pb); A canaleta 3 representa controle positivo (heterozigoto-198,175 e 23 pb); A canaleta 4 mostra controle negativo (homozigoto normal-198 pb). PM O alelo G20210A no Fator II foi determinado pela técnica de PCR-ASO (PCR alelo específico), neste sistema, foi utilizado um par de oligonucleotídeos com seqüência específica na extremidade 3 para cada alelo presente no lócus gênico (HIRATA et al., 2006). Foram utilizados três primers: Comum PTB*C (5 - ATGTGTTCCGCCTGAAGAAGTGGA-3 ), Reverso normal PTB*RGL (5 - CACTGGGAGCATTGAGGCGC-3 ) e Reverso mutado PTB*RAL (5 - ATGAATAGTCTTGGGAGCATTGAGGATT-3 ) (RAMOS, 2008). Para realização do procedimento PCR-ASO, foram realizadas duas reações, onde em eppendorf diferentes colocou-se, respectivamente os primers
9 PTB*C/PTB*RGL (alelo normal) e PTB*C/PTB*RAL (alelo mutado), além dos outros reagentes necessários á PCR. Essas duas reações permitem identificar cada paciente como homozigoto normal (sem a mutação G20210A em ambos os alelos), heterozigoto ou homozigoto para essa mutação (com a mutação em um alelo apenas ou em ambos, respectivamente). Em seguida foi feito o PCR, sendo que o programa de amplificação utilizado para o Fator II (Protrombina) constituiu em uma desnaturação inicial 95 C por 6 min., seguido de 35 ciclos: 94ºC por 1min.; 54ºC 1min.; 72 ºC por 45 seg. e 72ºC por 5min. A amplificação do alelo normal gera um fragmento de 176 pb, e o alelo mutado gera fragmento de 184 pb. A presença desses fragmentos foi confirmada por comparação com padrão de peso molecular 100 pb (Promega) em gel de acrilamida 6% corado por nitrato de prata (FIGURA III). FIGURA III Fragmentos da digestão de eletroforese em gel de poliacrilamida a 6%, seguido de coloração pela prata. Canaletas 1a, 2a, 3a e 4a: primer direto (comum) e reverso normal; canaletas 1b, 2b, 3b, 4b: primer direto (comum) e reverso mutado. Canaletas 1 a 3: pacientes normais, apresentam fragmentos de 176 pb na canaleta 1a, 2a e 3a. Canaleta 4: controle positivo heterozigoto para a mutação do gene da protrombina (G20210A), apresentando na canaleta 4a 176 pb e na canaleta 4b 184 pb. Padrão de peso molecular com 100pb (Promega )
10 Todos os experimentos foram realizados em duplicata, acrescidos de um controle negativo, sem adição de DNA e controle positivo (indivíduos com a mutação em questão). RESULTADOS E DISCUSSÃO Caso 1: Paciente T.B.M.S., sexo feminino, 57 anos, apresentou evento trombótico aos 57 anos de idade, durante o uso de medicamento para reposição hormonal, a mesma possui histórico familiar de trombose. A paciente apresentou mutação no gene do Fator V de Leiden e no gene Metilenotetrahidrofolato Redutase (MTHFR), sendo heterozigoto para ambos. Já no gene do Fator II (Protrombina) a paciente não apresentou mutação. Caso 2: Paciente C.M.C.C., sexo feminino, 23 anos, apresentou evento trombótico no membro inferior aos 23 anos de idade, durante o uso anticoncepcional oral, a mesma possuía vida sedentária e histórico familiar de trombose. A paciente não apresentou mutação no gene do Fator V de Leiden, no gene do Fator II (Protrombina) e no gene da Metilenotetrahidrofolato Redutase (MTHRF). Caso 3: Paciente E.M.G.D., sexo feminino, 31 anos, apresentou evento trombótico no membro inferior esquerdo aos 29 anos de idade, durante o uso de anticoncepcional oral, a mesma possuía vida sedentária e histórico familiar de trombose. A paciente apresentou mutação no gene do Fator V de Leiden e no gene Metilenotetrahidrofolato Redutase, sendo heterozigoto para ambos. Já no gene do Fator II (Protrombina) a paciente não apresentou mutação. Caso 4: Paciente V.L.F.G., sexo feminino, 51 anos, apresentou evento trombótico aos 48 anos de idade após 20 dias de reposição hormonal e viagem com mais ou menos 14 horas de duração, a mesma é diabética e possui caso de hipertensão na família. A paciente apresentou mutação no gene do Fator V de Leiden, sendo heterozigoto. Já no gene do Fator II (Protrombina) e no gene da Metilenotetrahidrofolato Redutase, a paciente não apresentou mutação. Caso 5: Paciente M.G.B., sexo feminino, 42 anos, apresentou evento trombótico aos 38 anos de idade, durante o uso de anticoncepcional oral. A paciente não apresentou mutação no gene do Fator V de Leiden, no gene do Fator II (Protrombina) e no gene da Metilenotetrahidrofolato Redutase (MTHRF).
11 Caso 6: Paciente N.R.P., sexo Feminino, 31 anos, apresentou evento trombótico aos 30 anos de idade, durante o uso de anticoncepcional oral e possui vida sedentária (costureira). A paciente apresentou mutação no gene do Fator V de Leiden, sendo heterozigoto. Já no gene do Fator II (Protrombina) e no gene da Metilenotetrahidrofolato Redutase, a paciente não apresentou mutação. As características e resultados dos indivíduos participantes do estudo estão listados na tabela I. Tabela I Características e resultados dos pacientes PACIENTES EVENTO TROMBÓTICO CASO 1 Trombose IDADE QUE OCORREU O EVENTO 57 anos HISTÓRICO FAMILIAR DE TROMBOSE Sim FATOR V DE LEIDEN (G > A) AG FATOR II PROTROMBINA (G > A) GG MTHFR (C > T) CT CASO 2 CASO 3 CASO 4 CASO 5 Trombose Membro Inferior Trombose Membro Inferior Trombose Membro Inferior Trombose 23 anos 29 anos 48 anos 38 anos Sim Sim Não Não GG AG AG GG GG GG GG GG CC CT CC CC CASO 6 Trombose 30 anos Não AG GG à Homozigoto normal; AA à Homozigoto mutado; AG à Heterozigoto. CC à Homozigoto normal; TT à Homozigoto mutado; CT à Heterozigoto. GG CC Notou-se neste estudo uma prevalência de mutação no gene do Fator V de Leiden, sendo que dos seis casos analisados, quatro apresentaram mutação em heterozigose para o mesmo. Segundo Guimarães et al., (2009), a presença da mutação no Fator V de Leiden, é observada de 20 a 40% em pacientes com trombose, cujo a prevalência em heterozigose varia de 2 a 13%. Dois apresentaram mutação no estado heterozigoto para Metilenotetrahidrofolato Redutase. Dados da literatura mostram que a mutação na MTHFR é encontrada de 5% a 15% em indivíduos da população geral (DUQUE & MELLO, 2003). Desses, aproximadamente 40% são heterozigotos, enquanto 8-10% são homozigotos para a mutação (ULRICH, 2002). Para o Fator II (Protrombina) não foi identificada mutação. A mutação Fator II (Protrombina) pode facilitar a incidência de trombose venosa. Nos indivíduos que apresentam um gene normal e o outro mutante (heterozigotos), a incidência do
12 distúrbio é entre 1% e 4% (DUQUE & MELLO, 2003). A baixa incidência da mutação na população, somada ao pequeno número de participantes da pesquisa, pode justificar a ausência de detecção da mutação do gene da protrombina (G20210A) nos indivíduos estudados. Nos casos 2 e 5 as pacientes apresentaram evento trombótico, porém não houve presença das mutações investigadas neste estudo, o que não descarta a possibilidade de ocorrência de outras mutações ou a influência de fatores adquiridos, por exemplo, anticoncepcionais orais e sedentarismo, para desenvolvimento da mesma. Este estudo demonstra que a ausência de mutação não exclui a possibilidade de ocorrência de trombose. Dados da literatura mostram que além das mutações analisadas no estudo, outras podem estar associadas ao desencadeamento de trombofilias, pode-se citar deficiência de Proteína C e Proteína S, Antitrombina III, Fator XIII, Fibrinogênio (fator I), entre outras (BRAZÃO et al., 2010). Em doenças multigênicas, como a trombose, diferentes mutações em genes distintos interagem para ocasionar o evento. Desta forma, a predisposição à trombose associada com cada alteração genética isolada é relativamente baixa, porém a presença de mutações em vários genes aumenta significativamente o risco de desenvolvimento da doença (GUIMARÃES et al., 2009). Isso foi observado nos casos 1 e 3, os quais as pacientes apresentaram mutação no Fator V de Leiden e na MTHFR. De acordo com a literatura foi visto que, além dos fatores genéticos, a soma dos fatores adquiridos potencializa ainda mais o risco para ocorrência do evento tromboembólico. Todas as pacientes estudadas convergem para um ponto em comum: apresentaram evento trombótico, faziam uso de anticoncepcional oral e eram sedentárias, sendo que quatro possuem mutação, confirmando o que a literatura relata. Vale destacar o caso 4, além dos fatores adquiridos citados, antes de apresentar o evento trombótico a paciente fez uma viagem de longo percurso, com imobilização prolongada, o que pode ter precipitado o evento. Estudos mostram que em mulheres a incidência de trombose aumenta de 3 a 5 vezes nas usuárias de anticoncepcional oral e reposição hormonal. O risco trombótico relaciona-se com a dose do estrógeno e com o tipo de progesterona (JUNQUEIRA et al., s.d).
13 O exato mecanismo através do qual os estrógenos atuam promovendo ativação da coagulação ainda não está esclarecido. Ações sobre fatores da coagulação, inibidores da coagulação e fibrinólise foram observadas. Os estrógenos ocasionam aumento da trombina e da fibrina, redução do fibrinogênio, redução de inibidores da coagulação (como antitrombina, proteína C e inibidor do fator tecidual) e também ações sobre a fibrinólise, como a redução do inibidor do ativador do plasminogênio (SANTOS, 2003). A influência do uso de anticoncepcional oral foi relatada por Franco 2001, tabela II, que constatou uma incidência aumentada para mutação no Fator V de Leiden, em mulheres que apresentaram evento trombótico associado ao uso do anticoncepcional oral. Tabela II Interação entre o Fator V de Leiden e o uso de anticoncepcional oral (ACO), determinando o risco de trombose. Fator V de ACO Risco Incidência Leiden relativo de TEV* - - 1,0 0, ,7 3, ,9 5, ,7 28,5 Incidência por mulheres por ano (-) refere-se à ausência e (+) à presença do fator de risco Fonte: Adaptado FRANCO, A incidência de trombose, em indivíduos que possuem defeitos genéticos, é altamente variável e alguns indivíduos nunca desenvolvem trombose; entretanto, outros desenvolvem eventos trombóticos recorrentes e graves, ainda quando jovens (caso 3 e 6). Isso depende particularmente do genótipo, da coexistência de outros defeitos genéticos e da influência de fatores adquiridos (DAHLBACK, 2008). Cumpre mencionar que na literatura o fator idade é de grande importância para análise do desencadeamento da trombose, visto que sua incidência aumenta espontaneamente com a idade; todavia, pacientes jovens, com idade inferior a 45 anos, quando apresentam uma disfunção genética, tem maior probabilidade de desenvolver o evento trombótico. Como observado no estudo, dentre as seis
14 pacientes analisadas, duas apresentaram mutação, sendo essas com idade inferior aos 45 anos de idade, o que condiz com que a literatura mostra. CONCLUSÕES O presente estudo constatou uma freqüência aumentada da mutação do fator V Leiden semelhante ao descrito na literatura científica para indivíduos com história de trombose. Já para Metilenotetrahidrofolato Redutase (MTHFR), houve presença de mutação, porém com menor incidência quando comparada ao Fator V de Leiden. Em todos os casos analisados, não foi identificada a mutação no gene do Fator II (Protrombina). Vale ressaltar que a população analisada neste estudo foi relativamente pequena, podendo justificar a ausência de detecção de mutação no Fator II (Protrombina). A maioria dos estudos científicos relata que a interação dos fatores genéticos com adquiridos aumenta potencialmente o risco para o desencadeamento de trombose, como observado no estudo. Finalmente, deve-se considerar que, por ser uma doença de caráter hereditário, a identificação precoce destas mutações possibilita a identificação de portadores assintomáticos que poderão receber orientação adequada em situações de risco, visando evitar a recorrência de eventos trombóticos. REFERÊNCIAS ALMEIDA, J.M.F. Trombofilia Hereditária e Gravidez: controvérsias Actuais. Monografia (Mestrado em Medicina) Faculdade de Medicina Universidade do Porto, ALVARENGA, M.P.S. Polimorfismos dos Genes MTHFR Metilenotetrahidrofolato Redutase) e ECA (Enzima Conversora da Angiotensina) em Pacientes Submetidos a Transplante Renal p. Tese (Doutorado) Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto. São José do Rio Preto. BARROS, S.M.; SILVA, R.M.M.; VALADAO, A.F. Fatores adquiridos e genéticos associados à hipercoagulabilidade em mulheres: uma revisão. Monografia (Graduação em Farmácia) Faculdade de Farmácia, Centro Universitário do Leste de Minas Gerais, Ipatinga, s.d. BONINI-DOMINGOS, C.R. et al. Freqüência da mutação 844ins68 do gene da
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