Glicosaminoglicanos (GAGS) Introdução. heteropolissacarídeos lineares constituídos por unidades dissacarídicas repetitivas.

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1 Identificação e quantificação pela espectroscopia de massa de glicosaminoglicanos sulftados da matriz extracelular no tecido colorretal neoplásico e não neoplásico* * Departmento de Biologia Molecular, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, Brasil Departmento de Cirurgia, Hospital do Servidor Público Estadual (IAMSPE), São Paulo, Brasil Carolina Keese dos Santos¹, Ana Paula Cleto Marolla², Jaques Waisberg³, Daniel Reis Waisberg 4, Helena Bonciani Nader², Maria Aparecida da Silva Pinhal² 1. Aluna de graduação, Faculdade de Medicina do ABC, Santo André, São Paulo, Brasil. 2. Departamento de Biologia Molecular, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, Brasil. 3. Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina do ABC, Santo André, São Paulo, Brasil. 4. Aluno de graduação, Faculdade de Medicina da USP, São Paulo, São Paulo, Brasil.

2 Glicosaminoglicanos (GAGS) Introdução heteropolissacarídeos lineares constituídos por unidades dissacarídicas repetitivas.

3 Glicosaminoglicanos (GAGS) Introdução heteropolissacarídeos lineares constituídos por unidades dissacarídicas repetitivas. Condroitin sulfato (CS) Dermatan sulfato (DS)

4 Glicosaminoglicanos (GAGS) Introdução heteropolissacarídeos lineares constituídos por unidades dissacarídicas repetitivas. acetilgalactosamina Condroitin sulfato (CS) Dermatan sulfato (DS)

5 Glicosaminoglicanos (GAGS) Introdução heteropolissacarídeos lineares constituídos por unidades dissacarídicas repetitivas. Condroitin sulfato (CS) Dermatan sulfato (DS) acetilgalactosamina aumentados na matriz extracelular de tecidos neoplásicos isolado da matriz extracelular de tecidos conjuntivos: papel importante na manutenção da integridade estrutural do tecido

6 Glicosaminoglicanos (GAGS) Introdução heteropolissacarídeos lineares constituídos por unidades dissacarídicas repetitivas. Condroitin sulfato (CS) Dermatan sulfato (DS) acetilgalactosamina aumentados na matriz extracelular de tecidos neoplásicos isolado da matriz extracelular de tecidos conjuntivos: papel importante na manutenção da integridade estrutural do tecido Proteoglicanos macromoléculas de cadeias de glicosaminoglicanos ligadas ao esqueleto protéico

7 Glicosaminoglicanos (GAGS) Introdução heteropolissacarídeos lineares constituídos por unidades dissacarídicas repetitivas. Condroitin sulfato (CS) Dermatan sulfato (DS) acetilgalactosamina aumentados na matriz extracelular de tecidos neoplásicos isolado da matriz extracelular de tecidos conjuntivos: papel importante na manutenção da integridade estrutural do tecido Proteoglicanos macromoléculas de cadeias de glicosaminoglicanos ligadas ao esqueleto protéico presentes em grandes quantidades na MEC e na superfície celular - envolvidos na proliferação celular, angiogênese, morfogênese e diferenciação celular

8 Introdução Heparan Sulato (HS) proteoglicano

9 Introdução Heparan Sulato (HS) proteoglicano macromoléculas formadas por esqueleto protéico ao qual estão covalentemente ligadas cadeias de HS e de oligossacarídeos.

10 Introdução Heparan Sulato (HS) proteoglicano macromoléculas formadas por esqueleto protéico ao qual estão covalentemente ligadas cadeias de HS e de oligossacarídeos. participa no processo de divisão celular co-receptor para os fatores de crescimento agente antimitogênico no meio de cultura neutraliza a atividade mitogênica dos fatores de crescimento

11 Introdução Alterações no padrão da sulfatação dos glicosaminoglicanos sulfatados(gags) e estrutura dos dissacarídeos

12 Introdução Alterações no padrão da sulfatação dos glicosaminoglicanos sulfatados(gags) e estrutura dos dissacarídeos Infectividade viral

13 Introdução Alterações no padrão da sulfatação dos glicosaminoglicanos sulfatados(gags) e estrutura dos dissacarídeos Infectividade viral Crescimento tumoral

14 Introdução Alterações no padrão da sulfatação dos glicosaminoglicanos sulfatados(gags) e estrutura dos dissacarídeos Infectividade viral Crescimento tumoral Metástase

15 Introdução Alterações no padrão da sulfatação dos glicosaminoglicanos sulfatados(gags) e estrutura dos dissacarídeos Infectividade viral Crescimento tumoral Metástase GAGS HS CS DS Localização protéica Controle de proteólise Modulação da angiogênese Apoptose Controle do ciclo celular Ativação plaquetária Sinalização de fatores de crescimento

16 Objetivo: Introdução Descrever um método de análise de GAGS no tecido neoplásico e no tecido normal de doentes com carcinoma colorretal por meio da espectroscopia de massa

17 Objetivo: Introdução Descrever um método de análise de GAGS no tecido neoplásico e no tecido normal de doentes com carcinoma colorretal por meio da espectroscopia de massa Espectroscopia de massa É uma técnica usada para: identificar componentes desconhecidos quantificar materiais conhecidos elucidação da química e propriedades estruturais das moléculas E é baseada na geração de íons que em seguida são detectados

18 Métodos Casuística: Critérios de inclusão Critérios de exclusão Doentes adultos, ambos os sexos, carcinoma do intestino grosso confirmado pelo exame histopatológico da neoplasia ressecada. Presença de outra neoplasia maligna concomitante ou prévia em qualquer outra localizacão.

19 Métodos Casuística: Critérios de inclusão Critérios de exclusão Doentes adultos, ambos os sexos, carcinoma do intestino grosso confirmado pelo exame histopatológico da neoplasia ressecada. Presença de outra neoplasia maligna concomitante ou prévia em qualquer outra localizacão. 64 pacientes Carcinoma colorretal: revisão das lâminas coradas por hematoxilina-eosina 37(57,8%) feminino 27(42,2%) masculino Média de idade: 68,5 +/- 7,3 anos 32 (50%) Reto 32 (50%) Colo 17 (53,1%) Colo Direito 15 (46,9%) Colo Esquerdo

20 Métodos Carcinoma colorretal Duas amostras de tecido do intestino grosso Mucosa colorretal adjacente situada cranialmente a 10cm da lesão

21 Métodos Carcinoma colorretal Duas amostras de tecido do intestino grosso Mucosa colorretal adjacente situada cranialmente a 10cm da lesão A expressão de condroitin sulfato (CS), dermatan sulfato (DS) e heparan sulfato (HS) e de seus respectivos fragmentos no tecido neoplásico e não-neoplásico de doentes com carcinoma colorretal foram analisadas por espectrometria de massa, com técnicas de extração e quantificação dos glicosaminoglicanos por proteólise seguida de eletroforese.

22 Procedimentos envolvidos Métodos Extração dos Glicosaminoglicanos sulfatados (GAGS) Eletroforese em gel de agarose Degradações enzimáticas Espectroscopia de massa

23 Métodos Eletroforese em gel de agarose

24 Espectroscopia de massa Métodos O método da espectroscopia de massa empregado foi capaz de identificar os glicosaminoglicanos e seus fragmentos no tecido colorretal com carcinoma e na mucosa não neoplásica.

25 Resultados Os GAGS extraídos do tecido colorretal apresentaram três bandas eletroforéticas: duas delas correspondentes à migração do HS e de DS e a 3ª banda ficou atrasada em relação as CS padrão, o que dificultou a quantificação do condroitin e dermatan sulfatos destes compostos por meio da densitometria Os dois galactosaminoglicanos CS+DS foram quantificados em conjunto como banda única

26 Resultados

27 Resultados

28 Resultados

29 Resultados Os espectros demonstraram fragmentos característicos dos respectivos glicosaminoglicanos sulfatados (CS+DS+HS) indicando a presença de GAGS nos tecidos colorretais analisados. Percentagens de GAGS no tumor e na mucosa adjacente não neoplásica: CS, DS, HS Tecido neoplásico retal 59% Tecido de mucosa adjacente sem neoplasia 13% Tecido neoplásico do colo dir. 18% Tecido sem neoplasia do colo dir. Tecido neoplásico do colo esq. Tecido sem neoplasia do colo esq. 29% 60% 39%

30 Resultados A quantificação de condroitin sulfato, dermatan sulfato e heparan sulfato apresentou aumento significante no tecido neoplásico em comparação ao tecido não neoplásico colorretal localizado no reto (p=0,001) e no colo esquerdo (p=0,003) No colo direito, a quantidade de GAGS foi significantemente menor (p=0,02) no tecido neoplásico do que na mucosa adjacente não neoplásica

31 Conclusão Este método fornece novas oportunidades para o desenvolvimento de técnicas para o estudo da estrutura e função da condroitin sulfato (CS), heparan sulfato (HS) e dermatan sulfato (DS) no carcinoma colorretal É sensível e reprodutível e pode ser útil no diagnóstico clínicos de neoplasias

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