ANÁLISE DO PERFIL BIOQUÍMICO E HEMATOLÓGICO DA ESPÉCIE GEOCHELONE CARBONARIA DO CRIADOURO CONSERVACIONISTA DA UNIVAP, SJC SP

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1 ANÁLISE DO PERFIL BIOQUÍMICO E HEMATOLÓGICO DA ESPÉCIE GEOCHELONE CARBONARIA DO CRIADOURO CONSERVACIONISTA DA UNIVAP, SJC SP Silva TY 1, Mattos JFA 2, Merigo JE 2, Barja PR 1, Minelli PB¹, Souza BMG¹, Khouri S 1, Lima L 1 1 Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP), Faculdade de Ciências da Saúde, Núcleo de Estudos Farmacêuticos e Biomédicos (NUFABI) e 2 Criadouro Conservacionista, Av.Shishima Hifumi, 2911, São José dos Campos, SP; Fone: ; thatinha_123@hotmail.com, leobertolima@univap.br Resumo: Os jabutis são animais terrestres, de corpo compacto, membros locomotores cilíndricos e robustos, próprios para suportar o seu pesado casco e caminhar em ambientes rústicos. O estudo teve como objetivo realizar a comparação de resultados de análises laboratoriais de testes bioquímicos e hematológicos da espécie Geochelone carbonaria com resultados presentes na literatura. As análises foram realizadas no NUFABI, por meio de amostras sanguíneas, coletadas pelo veterinário do Criadouro Conservacionista. Na análise bioquímica foram dosadas as Proteínas totais e as frações Albumina e Globulina e na análise hematológica foram realizados o Hemograma e a pesquisa de Hemoparasitas. De acordo com a análise estatística realizada, observa-se que os parâmetros analisados permaneceram dentro dos limites de normalidade encontrados na literatura, embora alguns animais tenham apresentado alterações específicas em alguns parâmetros analisados. Recomenda-se que os animais continuem sendo monitorados para que possam ser transferidos para seu habitat natural com segurança. Palavras chave: Perfil bioquímico, Perfil hematológico, Geochelone carbonaria, Bioestatística. Área do Conhecimento: Ciências da saúde Introdução Os quelônios surgiram há cerca de 200 milhões de anos; compreendem os cágados, jabutis e tartarugas. Os jabutis são animais terrestres, de corpo compacto, membros locomotores cilíndricos e robustos, que são próprios para suportar o seu pesado casco e caminhar em ambientes rústicos. No Brasil as três espécies de ocorrência natural do gênero são: Geochelone carbonaria (jabutipiranga), Geochelone denticulata (jabuti-tinga) e Geochelone chilensis (GOULART, 2004). Os répteis são ectotérmicos, o que requer cuidados especiais aos quelônios em cativeiro. De modo geral, a temperatura de conforto para os quelônios está entre 25ºC a 30ºC. Diferenciam-se de outros répteis por apresentarem um casco rígido que os protege dos predadores e das variações climáticas (GOULART, 2004). Os quelônios podem ser carnívoros, onívoros ou herbívoros. Os jabutis se alimentam de folhas, frutos, gramíneas, invertebrados, carcaças e outros alimentos que encontram no solo. São primeiramente herbívoros, mas em cativeiro necessitam de proteína animal e cálcio para um bom desenvolvimento. A dieta deve ter um alto teor de fibras e baixo teor em gordura. Como os estudos sobre necessidades nutricionais de jabutis são escassos, e na ausência de rações balanceadas no mercado nacional, recomenda-se uma dieta variada composta por: 70 a 80% de vegetais, 10 a 20% de frutas, 5 a 10% de proteína animal, e cálcio que são importantes no desenvolvimento do casco (GOULART, 2004). O presente estudo teve como objetivo realizar a comparação de resultados de análises laboratoriais de testes bioquímicos e hematológicos com resultados presentes na literatura, em amostras da espécie Geochelone carbonaria, podendo assim certificar que os animais estão saudáveis antes da soltura para seu habitat natural. Figura 1: Espécie Geochelone carbonaria 1

2 Metodologia O presente trabalho foi submetido à Comissão de Ética no Uso de Animais CEUA, sendo aprovado por essa comissão no dia 12 de dezembro de 2012, sendo o número do protocolo A06/CEUA/2012, assinado pelo Prof. Dr. José Carlos Cogo, presidente da CEUA da UNIVAP. Para realização deste estudo, utilizou-se 43 amostras de sangue de jabuti-piranga, originados do Criadouro Conservacionista da UNIVAP. Estes animais foram entregues ao criadouro pela policia ambiental, para reabilitação, acompanhamento e recebimento de tratamento adequado pelo médico veterinário responsável até a data da soltura. Inicialmente os animais foram colocados em jejum alimentar em um período de 6 horas e restrição hídrica de 2 horas, a fim de não apresentar resultados influenciados pela dieta nas análises hematológicas e bioquímicas. Durante a coleta de sangue destes animais houve a necessidade de aplicar uma leve sedação pelo fato de serem animais que resistem à contenção física - por terem forte musculatura nos membros e no pescoço, os jabutis retraem com força esses apêndices para dentro do casco, o que dificulta a coleta de sangue (GOULART, 2004). O anestésico utilizado (Dopalen) é à base de ketamina injetável, aplicado pela via intramuscular, podendo ser empregado outro anestésico veterinário. A dose do anestésico variou conforme o peso do animal, pois é necessário 40mg/kg para anestesiá-los. Aguardouse cerca de 20 a 40 minutos após a aplicação para que o anestésico fizesse efeito; após este período foi possível realizar as coletas. A coleta de sangue, em espécies de quelônios, pode ser realizada nas veias jugular, braquial, coccígena ventral, coccígena dorsal, por cardiocentese, seio dorsal e nos seios orbital, postoccipital venoso (MURRAY, 1999). Sendo assim, algumas amostras de sangue foram obtidas por meio da punção da veia jugular e outras por meio da punção do seio venoso dorsal que se encontra no dorso da cabeça do animal, devido à dificuldade de puncionar a veia jugular de alguns animais. Utilizou-se seringas plásticas contendo Heparina sódica como anticoagulante em vez de EDTA como é utilizado frequentemente em exames hematológicos de mamíferos. Isto porque o EDTA provoca hemólise severa em algumas espécies de répteis e aves (eritrócitos nucleados), além de promover intumescência nuclear e induzir o aumento do tamanho das células (KNOLL, 2000). Isto levaria a valores de Hematócrito e VCM (volume corpuscular média) maiores nas amostras com EDTA e a um menor valor do CHCM (concentração de hemoglobina corpuscular média) (KNOLL, 2000). Desta forma, utilizou-se somente a Heparina como o anticoagulante de escolha e padronização para estes exames laboratoriais. As análises hematológicas foram todas realizadas manualmente devido ao fato de as hemácias desta espécie serem grandes e nucleadas, incompatíveis com os equipamentos hematológicos disponíveis no mercado. A análise hematológica foi dividida em três partes: série vermelha (análise dos glóbulos vermelhos), série branca (ou análise dos glóbulos brancos) e pesquisa de hemoparasitas (parasitas intra e/ou extracelulares). Os valores de referência para cada analito (ou exame) estão relacionados na Tabela 1. Tabela 1. Valores de referências hematológico de Geochelone carbonaria (jabuti-piranga): EXAME HEMATOLÓGICO VALORES DE REFERÊNCIAS Hemácias 1 0,47x 10 6 /mm 3 a 6,30x 10 6 /mm 3 Hematócrito 1 18% a 47% Hemoglobina 1 7,0g/dl a 18,3g/dl VCM 1 71,4fL a 468,9fL HCM 1 123,4pg a 148,9pg CHCM 1 29,3% a 49,8% Leucócitos /mm 3 a /mm 3 Diferencial dos Relativo Absoluto leucócitos 2 : (média em %): (/mm 3 ): Heterófilos 2 38,1% 90 a Eosinófilos 2 7,0% 20 a Basófilos 2 19,3% 50 a Linfócitos 2 46,6% 220 a Monócitos 2 2,5% 40 a 670 Pesquisa de Negativo Hemoparasitas: 1 São os analitos que compõem a série vermelha. 2 São os analitos que compõem a série branca. Fonte: CUBAS, e BAPTISTOTTE, C. Capítulo 9: Cheloina (Tartaruga, Cágado e Jabuti). Ed. Roca, São Paulo, 2007, p. 104 e 108. Para análise bioquímica foi utilizado equipamento automatizado LABMAX PLENNO modelo comercial Standard Labtest; em casos esporádicos, na indisponibilidade de utilização do equipamento automatizado, a análise foi realizada manualmente em espectrofotometria. A análise bioquímica concentrou-se em um dos analitos mais importante para a soltura dos jabutis, as Proteínas totais e suas frações, Albumina e Globulina. A Albumina é uma proteína sintetizada no fígado que corresponde a cerca de 50% do total de proteínas no soro (SANTOS 1999; GONZÁLEZ, SILVA 2006); desempenha 2

3 importante papel no controle da osmolaridade do plasma, no armazenamento de aminoácidos, no transporte de muitos nutrientes e no equilíbrio do ph sanguíneo (GONZÁLEZ, SILVA 2006). A Globulina é proteína produzida pelos linfócitos B cuja principal função é defender o organismo contra elementos estranhos, através de sua fração gama, sendo importante indicador da presença de processos inflamatórios (GONZÁLEZ, SILVA 2006). Nos répteis, a hipoproteinemia por queda nos níveis de Albumina está geralmente associada à má nutrição crônica, má absorção, enteropatias e doenças renais e hepáticas crônicas (DIVERS, 2000; CAMPBELL, 2006). Já a hiperproteinemia ocorre por desidratação ou hiperglobulinemia, associada à doença inflamatória crônica (CAMPBELL,2006). Tanto pela metodologia automatizada quanto pela metodologia semimanual com leitura em espectrofotometria, os kits (ou reagentes) são da mesma marca, Labtest. Os valores de referência para cada analito (ou exame) estão relacionados na Tabela 2. Tabela 2. Valores de referências bioquímico de Geochelone carbonaria (jabuti-piranga): Gráfico 1: Porcentagem do sexo dos animais analisados Para melhor compreensão dos dados obtidos, foi realizada uma tabela geral, na qual consta a média, desvio padrão e a mediana de cada parâmetro analisado (hematológico e bioquímico) comparados às referências em literatura da espécie Geochelone carbonaria (Tabela 3). Tabela 3: Resultados dos exames hematológicos e bioquímicos da espécie Geochelone carbonaria, mantidos no criadouro conservacionista na Univap de São José dos Campos SP. EXAME BIOQUÍMICO Proteínas totais Albumina Globulina VALORES DE REFERÊNCIAS de 3,8 a 6,6 g/dl de 1,2 a 2,6 g/dl de 1,9 a 4,3 g/dl Fonte: CUBAS, P.H e BAPTISTOTTE, C. Capítulo 9: Cheloina (Tartaruga, Cágado e jabuti). Ed. Roca, São Paulo, 2007, p. 104 e 108. As solturas destes animais ocorrem de julho a setembro devido às temperaturas mais amenas desta época o que facilita no transporte por trazer mais conforto ao animal que será levado ao seu habitat natural. Neste período serão liberados somente os animais que apresentarem todos os exames de acordo com a referência encontrada na literatura ou a critério do médico veterinário responsável, o que comprova que o animal está saudável e recebeu tratamento adequado durante sua estadia no criadouro conservacionista. Os que apresentarem qualquer alteração nos exames continuarão em observação até a data da próxima soltura. Resultados Neste estudo foram analisadas 43 amostras da espécie Geochelone carbonaria, sendo 24 fêmeas e 19 machos (Gráfico 1). ¹Volume Corpuscular Médio; ²Hemoglobina Corpuscular Média; ³Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média; Limite de Normalidade Fonte: CUBAS e BAPTISTOTTE (2007). De acordo com a análise estatística realizada, de um modo geral, observa-se que os parâmetros analisados para cada animal permaneceram dentro dos limites de normalidade encontrados na literatura, embora alguns animais tenham apresentado alterações em alguns parâmetros analisados, devido a interferentes como sazonalidade, salmonelose etc. Os resultados laboratoriais foram separados por estações do ano em que foram realizadas as coletas; assim, as coletas feitas nos meses de maio e junho foram consideradas como estação Outono, já a coleta realizada no mês de setembro foi definida como Primavera, uma vez que a 3

4 contagem total e relativa de células sanguíneas pode variar grandemente em função de diversos fatores, tais como: a época do ano, o tamanho da célula, a idade do animal, o sexo, além de fatores patológicos, nutricionais e ambientais (GOULART, 2004). Comparação estatística entre os parâmetros em função do sexo dos animais mostrou alteração significante somente no hematócrito (p = 0,040), com valores maiores para os machos (28 7) em relação às fêmeas (23 6); nos demais parâmetros analisados não houve alterações significantes (p 0,10). Na pesquisa de hemoparasitas, todos os resultados foram negativos para parasitas dentro ou fora das hemácias e dos leucócitos. Na série vermelha foram realizados gráficos comparando as estações Outono e Primavera, tendo como base os valores médios das análises comparadas aos valores de referência da espécie Geochelone carbonaria, comparação do número de glóbulos vermelhos (Gráfico 2), valor do hematócrito (Gráfico 3) e valor da dosagem de hemoglobina (Gráfico 4). Gráfico 4: Valor médio da hemoglobina em função da estação do ano (a barra indica desvio padrão). Na análise da série branca não houve alterações significantes comparando as estações Outono e Primavera (p 0,10). Pode-se observar na tabela 3 que o desvio padrão para a maioria dos resultados é consideravelmente alta, principalmente para os parâmetros avaliados manualmente (como Contagem diferencial de Leucócitos). O provável motivo para tal variação seria a baixa precisão dos métodos de avaliação. Ainda na análise da série branca, de modo geral houve um predomínio de heterófilos, eosinófilos e linfócitos, conforme mostrado na Tabela 3. Adicionalmente, foi feita uma comparação de resultados dos animais que apresentaram resultado positivo para Salmonela spp com resultados da série branca dos animais que apresentaram altos valores de heterófilos e eosinófilos, para observar se havia alguma relação entre ambos os exames (Gráfico 5). Gráfico 2: Valor médio de hemácias em função da estação do ano (a barra indica desvio padrão). Gráfico 3: Valor médio do hematócrito em função da estação do ano (a barra indica desvio padrão). Gráfico 5: Comparação das células diferenciais (valor percentual médio de monócitos, heterófilos e eosinófilos) de animais saudáveis e animais com Salmonella spp (a barra indica desvio padrão). 4

5 A análise do perfil bioquímico concentrou-se nas Proteínas totais e suas frações Albumina e Globulina, por estarem diretamente relacionadas com a nutrição, desidratação e doenças crônicas (DIVERS, 2000; CAMPBELL, 2006), o que pode ser relacionado com a dieta oferecida pelo criadouro conservacionista aos jabutis. Sendo assim, com esta avaliação poderia-se observar se a dieta está adequada, e se as proteínas podem sofrer alteração ao longo das estações do ano (sazonalidade). O gráfico comparativo das alterações bioquímicas (Gráfico 6) indica uma redução de proteínas na Primavera em relação ao Outono. Gráfico 6: Comparação dos analitos bioquímicos (valores médios de Proteínas totais, Albumina e Globulina) em diferentes estações (Outono e Primavera). Discussão Durante a execução da metodologia proposta por este trabalho, foi possível verificar que os exames realizados foram de muita importância para acompanhamento dos animais antes de sua soltura para natureza. A série vermelha apresentou algumas alterações nos valores médios de hemácias comparados as estações do ano, porém essas diferenças não foram significantes (p=0.088) e permaneceram dentro da normalidade. Já nas análises estatísticas para hemoglobina foram consideradas significantes (p=0.001). O mesmo ocorreu com o hematócrito, que apresentou diferença significante entre Outono e Primavera (p~0.05), permanecendo, no entanto, dentro da normalidade. Nos índices VCM, HCM e CHCM, não houve alterações estatisticamente significativas entre as estações Outono e Primavera (p 0,10). De acordo com Goulart (2004), para as análises hematológicas, é preciso considerar a época do ano, pois é normal encontrar valores de contagem total da série vermelha mais baixos no meio do inverno. Alguns exames apresentaram baixo número de hemácias devido à presença de linfa na amostra, o que causou hemodiluição, ficando a critério do veterinário repetir a análise com nova coleta. Na série branca houve alterações como aumento de alguns leucócitos diferenciais. O aumento no número de heterófilos (heterofilia) pode ser justificado devido ao fato de que alguns animais apresentavam salmonelose. De acordo com Rosskopf (1999), estas células sugerem resposta inflamatória severa à infecção especialmente bacteriana e a outros processos patológicos. As demais células diferenciais podem ter sofrido elevação devido à influência das alterações sazonais uma vez que, segundo Hawkey e Dennet (1989), o número de eosinófilos diminui durante os meses de verão e aumenta durante a hibernação. A eosinofilia também pode ser associada a infecções parasitárias e estimulações do sistema imunológico pois, de acordo com Vilar et al. (2004), em cativeiro, a parasitemia se eleva consideravelmente. Com os linfócitos ocorre o contrário, ou seja, o número de linfócitos aumenta com o verão e diminui com o inverno (ROSSKOPF, 1999). De acordo com Hawkey e Dennet (1989), a linfocitose ocorre durante a cicatrização de feridas, doenças inflamatórias, infecções parasitárias e virais. As primeiras análises realizadas apresentaram um grande número de linfócitos. Ao entrar em contato com o veterinário responsável pelo criadouro conservacionista, o mesmo informou que os jabutis estavam resfriados e já estavam sendo medicados, o que pode justificar a alteração no exame hematológico. O número de basófilos permaneceu dentro da normalidade. Segundo Rosskopf (1999), o número de basófilos aumenta com a infecção por hemoparasitas; como no número destas células não houve alterações, isso pode explicar os resultados das pesquisas de hemoparasitas, uma vez que não houve nenhum resultado positivo. Algumas espécies apresentaram resultados de monócitos alterados porém, ainda de acordo com Rosskopf (1999) o número de monócitos não é influenciado por variações sazonais; assim, os resultados sugerem doenças inflamatórias, o que pode estar relacionado com o dano causado pela Salmonella spp no organismo destes animais. Na série bioquímica, ocorreram alterações em algumas espécies, nas Proteínas totais e tanto nas frações Globulina quanto Albumina (raramente as duas, simultaneamente). Durante o Outono os valores de Proteína total e frações foram superiores aos valores de referência para a 5

6 espécie Geochelone carbonaria. As diferenças encontradas para a Albumina e Globulinas foram significantes (p=0,006 e p=0,042, respectivamente). Para as Proteínas, as diferenças também foram consideradas significantes (p=0,009). Para alguns animais podemos sugerir que os mesmos apresentavam hiperproteinemia durante o Outono. Este fato poderia estar relacionado à salmonelose, pois os animais estavam apresentando fezes diarreicas, o que pode contribuir para uma perda de água significativa. Segundo Campbell (2006), a hipoproteinemia está associada a outras etiologias; má absorção, má digestão (associada a parasitismo intestinal) e desidratação resultam em hiperproteinemia. Os resultados obtidos foram comunicados ao veterinário que iniciou a antibioticoterapia nos mesmos quando indicado, ficando a seu critério solicitar ou não novos exames complementares. Conclusão Conclui-se com este estudo que os exames hematológicos e bioquímicos formam uma ferramenta laboratorial fundamental para a avaliação das condições clínicas dos répteis. O aumento do número de leucócitos totais pode indicar processos infecciosos, entre outros, e a leucopenia indica doenças virais. A dieta oferecida aos animais pode ser considerada adequada, uma vez que os animais apresentaram valores dentro da faixa de normalidade para Albumina e Globulina com exceção dos que apresentaram salmonelose. Recomenda-se que a equipe do Criadouro Conservacionista continue monitorando os animais avaliados neste período mantendo-os isolados de futuros novos répteis que possam dar entrada ao Criadouro até a data da próxima soltura (prevista para Setembro de 2013), como medida preventiva e de controle sanitário, para que possam ser transferidos para seu habitat natural com segurança a respeito de seu estado de saúde. Agradecimentos: à Faculdade de Ciências da Saúde (FCS) da UNIVAP pelo apoio financeiro e por permitir a utilização de equipamentos de automação e estrutura do Laboratório de Análises Clínicas (NUFABI). À Profa. Dra. Karla Andressa Ruiz Lopes pela autorização na continuidade do nosso projeto iniciado em 2012 quando o Criadouro Conservacionista estava sob responsabilidade do biólogo Prof. Dr. Frederico Lencione. Referências -CAMPBELL,T.W. Clinical pathology. In: MADER, D.R.(ed.): Reptile medicine and surgery. St. Louis, Missouri: Elsevier Inc.2 nd ed Cap 28, p CUBAS, P.H e BAPTISTOTTE, C. Capítulo 9: Cheloina (Tartaruga, Cágado e jabuti). Ed. Roca, São Paulo, 2007, p. 104 e DIVERS, S.J; Reptilian renal and reproductive diseases diagnosis. In: FUDGE, A.M(Ed.). Laboratory Medicine: avian and exotic pets. Philadelphia, PA: W.B. Saunders cap. 25,p GONZÁLES, F.H.D.; SILVA, S.C. Introdução à bioquimica clinica veterinária. Porto Alegre: UFRGS. 2º ed p. -GOULART, C.E.S. Herpetologia, herpetocultura e medicina de répteis. Rio de Janeiro: LF Livros de Veterinária, p. -HAWKEY, C.M., DENNETT, T.B. Hematology of Reptiles, In Comparative veterinary haematology. London: Wolfe PublishingLimited,pp , KNOLL, J.S. Schalm sveterinaryhematology. Baltimores: Lippincott Williams and Wilkins, p. 3-11, MURRAY, M. J. Reptilian Blood Samplingand Artifact Considerations. In Fudge AM (ed): Laboratory Medicine: Avianand Exotic Pets. Philadelfia, WB Saunders. Pp , ROSSKOPF. W.J.J., Disorders of Reptilian Leukocytes and Erythrocytes, In Fudge AM (ed): Laboratory Medicine: Avianand Exotic Pets. Philadelfia, WB Saunders. Pp , SANTOS, L.C. Laboratorio ambiental. Cascavel: EDUNIOESTE p. -VILAR, T.D.; WALIM, M.P; VOLINO, W.; PIRES, J.; LOBO, R.; STELLING, W.;NASCIMENTO, M.D.; FREIRE, N.M.S.; ALMOSNY, N.R.P. Ocorrência de Hepatozoontupinambis (Aldeleina: Haemogregarinidae) em Tejus (Sáuria: teiidae) no RJ, Brasil. Série Ciências da Vida. Rio de Janeiro: v.24, n.1, p ,