KAREN ZAVARO BALASSIANO

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1 KAREN ZAVARO BALASSIANO ESTUDO COMPARATIIVO DA EXPRESSÃO IIMUNO--HIISTOQUÍÍMIICA DAS PROTEÍÍNAS Bcll--2,, p53,, CASPASE--3 E Kii--67 EM HIIPERPLASIIAS FIIBROSAS IINFLAMATÓRIIAS,, QUEIILIITES ACTÍÍNIICAS E CARCIINOMAS DE CÉLULAS ESCAMOSAS NO LÁBIIO IINFERIIOR Orientadora: Profa. Simone de Queiroz Chaves Lourenço Co-orientadores: Profa. Eliene Carvalho da Fonseca Prof. Deílson Elgui de Oliveira Universidade Federal Fluminense Niterói 2004

2 KAREN ZAVARO BALASSIANO ESTUDO COMPARATIVO DA EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS Bcl-2, p53, CASPASE-3 E Ki-67 EM HIPERPLASIAS FIBROSAS INFLAMATÓRIAS, QUEILITES ACTÍNICAS E CARCINOMAS DE CÉLULAS ESCAMOSAS NO LÁBIO INFERIOR Dissertação apresentada ao Curso de Pósgraduação em Patologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre. Área de concentração: Patologia Buco-Dental Orientadora: Profa. Simone de Queiroz Chaves Lourenço Co-orientadoras: Profa. Eliene Carvalho da Fonseca Prof. Deílson Elgui de Oliveira Niterói 2004

3 Balassiano, Karen Zavaro Estudo comparativo da expressão imuno-histoquímica das proteínas Bcl-2, p53, caspase-3 e Ki-67 em hiperplasias fibrosas inflamatórias, queilites actínicas e carcinomas de células escamosas no lábio inferior / Karen Zavaro Balassiano. Niterói, f. Dissertação de Mestrado (Patologia Buco-Dental Curso de Pós-Graduação em Patologia Universidade Federal Fluminense) I. Queilite actínica. II. Apoptose. III. Proliferação celular. 1. Universidade Federal Fluminense. 2. Título. CDD:

4 Karen Zavaro Balassiano Estudo comparativo da expressão imuno-histoquímica das proteínas Bcl-2, p53, caspase-3 e Ki-67 em hiperplasias fibrosas inflamatórias, queilites actínicas e carcinomas de células escamosas no lábio inferior ORIENTADORA: Simone de Queiroz Chaves Lourenço CO-ORIENTADORES: Eliene Carvalho da Fonseca Deilson Elgui de Oliveira Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de concentração: Patologia Buco-Dental Aprovada em 29 de março de 2004 BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Alberto Consolaro Universidade de São Paulo - Bauru Prof. Dr. Fernando Monteiro Aarestrup Universidade Federal de Juiz de Fora Universidade Federal Fluminense Profa. Dra. Mayra Carrijo Rochael Universidade Federal Fluminense Niterói 2004

5 Quem Morre? Morre lentamente quem não viaja, quem não lê, quem não ouve música, quem não encontra graça em si mesmo. Morre lentamente quem destrói o seu amor-próprio, quem não se deixa ajudar. Morre lentamente quem se transforma em escravo do hábito, repetindo todos os dias os mesmos trajetos, quem não muda de marca, não se arrisca a vestir uma nova cor ou não conversa com quem não conhece. Morre lentamente quem faz da televisão o seu guru. Morre lentamente quem evita uma paixão, quem prefere o negro sobre o branco e os pontos sobre os "is" em detrimento de um redemoinho de emoções justamente as que resgatam o brilho dos olhos, sorrisos dos bocejos, corações aos tropeços e sentimentos. Morre lentamente quem não vira a mesa quando está infeliz com o seu trabalho, quem não arrisca o certo pelo incerto para ir atrás de um sonho, quem não se permite pelo menos uma vez na vida fugir dos conselhos sensatos. Morre lentamente, quem passa os dias queixando-se da sua má sorte ou da chuva incessante. Morre lentamente, quem abandona um projeto antes de iniciá-lo, não pergunta sobre um assunto que desconhece ou não responde quando lhe indagam sobre algo que sabe. Evitemos a morte em doses suaves, recordando sempre que estar vivo exige um esforço muito maior que o simples fato de respirar. Somente a perseverança fará com que conquistemos um estágio esplêndido de felicidade. Pablo Neruda

6 Aos meus pais, Silvia e Salim, pelo amor, apoio e incentivo em mais uma etapa da minha vida.

7 AGRADECIMENTOS À minha orientadora e amiga, Simone de Queiroz Chaves Lourenço, agradeço por me mostrar o caminho do magistério e da Patologia de uma forma tão apaixonante. Por estar ao meu lado nos momentos de alegria e conquistas; e pelo incentivo nos momentos mais difíceis, pela confiança, dedicação, seriedade e pelo seu exemplo profissional. Muito obrigada!!!! Ao amigo Eduardo Lourenço, pela sua valiosa contribuição na execução deste trabalho e em outros momentos durante o curso. À coordenadora do Curso de Pós-graduação em Patologia e coordenadora do Curso de Mestrado em Patologia Buco-Dental, Eliane Pedra Dias, pelos ensinamentos passados, carinho e confiança prestada. Obrigada!!

8 Às amigas conquistadas durante o curso, Flávia Dantas Soares e Adrianna Milagres, pela amizade, apoio e carinho durante esses dois anos, pelo auxílio na elaboração deste trabalho, pelos enriquecedores momentos de discussão e é claro, pelas boas gargalhadas. Muito obrigada, adoro vocês!!!!! Aos colegas do Curso de Mestrado em Patologia Buco-Dental, por estarmos sempre juntos nessa difícil, porém gratificante jornada. Ao colega Jairo, pelo grande auxílio no difícil caminho do programa Image Pro Plus. Muito obrigada pela sua colaboração! Às amigas Rita de Cássia, Thereza Fontana e Kátia Valéria, pelos momentos de incentivo, carinho, amizade e pelas boas risadas. Aos professores do Departamento de Patologia e do curso de Pósgraduação em Patologia. À professora Mayra, pela sua indispensável colaboração para a realização deste trabalho. Obrigada! À professora Miriam, pelo carinho e gentileza e disponibilidade sempre a qualquer hora. À professora Eliene de Carvalho da Fonseca, chefe do Laboratório de Imuno-histoquímica e Hibridação, pela orientação e ajuda na parte laboratorial deste trabalho. Aos professores Deílson Elgui de Oliveira e Carlos Eduardo Bacchi, pela grande oportunidade oferecida em compartilhar conhecimentos e principalmente pelo aprendizado gerado.

9 Às secretárias da pós-graduação, Thereza Fontana e Alessandra Werneck, pela competência e atenção prestada. Aos funcionários do Departamento de Patologia e do Hospital Universitário António Pedro, especialmente ao técnico de laboratório António Carlos, por sempre atender aos meus pedidos com carinho e bom humor. Às funcionárias do arquivo de Patologia, por sempre atenderem às minhas solicitações com carinho e educação. À Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de Mestrado. À equipe de Estomatologia do curso de graduação em Odontologia da Universidade Estácio de Sá, Maria Eliza, Marília, Monica, Ruth e Ellen, obrigada pela oportunidade e confiança. À Odontoclínica Central do Exército, aos professores da equipe do Curso de Especialização em Estomatologia da OCEx; Simone, Bárbara, Damião e Maria Eduarda; e todos os alunos que fazem ou já fizeram parte do curso pelo apoio e pela enriquecedora troca de conhecimentos. Ao Hospital Central do Exército e ao Laboratório O Aleph, pela contribuição de material para execução deste trabalho. Aos meus familiares e amigos, que me apoiaram, mesmo que indiretamente, nesses dois anos e na realização deste trabalho.

10 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA QUEILITE ACTÍNICA CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS BUCAL Carcinoma de células escamosas em lábio inferior FATORES PROGNÓSTICOS APOPTOSE Proteína p Proteína Bcl Caspase PROLIFERAÇÃO CELULAR Proteína Ki OBJETIVOS MATERIAL E MÉTODOS SELEÇÃO DA AMOSTRA METODOLOGIA Técnica de imuno-histoquímica ANÁLISE DOS RESULTADOS Análise descritiva em HE Análise descritiva na imuno-histoquímica Análise quantitativa na imuno-histoquímica Análise estatística RESULTADOS FATORES DE RISCO 87

11 5.2 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA ANÁLISE DO ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO ANÁLISE ESTATÍSTICA COMPARATIVA DISCUSSÃO CONCEPÇÃO DO TRABALHO AMOSTRA FATORES DE RISCO METODOLOGIA IMUNOMARCADORES RELACIONADOS A APOPTOSE E A PROLIFERAÇÃO CELULAR p Bcl Ki PERSPECTIVAS CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS 218

12 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1: Marcação imuno-histoquímica para: A, Ki-67; B, p53; C, Bcl-2; D, p53 mutado. 82 FIGURA 2: Padronização de cores para cada marcador no programa Image Pro Plus 4.5 (objetiva 10x). 83 FIGURA 3: Contagem da área correspondente às marcações positivas dentro da delimitação. 84 FIGURA 4: Contagem da área correspondente ao epitélio dentro da delimitação efetuada. 84 FIGURA 5: Carcinoma de células escamosas bem diferenciado (HE - A, objetiva 10x; B, objetiva 40x). 97 FIGURA 6: Carcinoma de células escamosas moderadamente diferenciado (HE - A, objetiva 10x; B, objetiva 40x). 98 FIGURA 7: Queilite actínica com displasia epitelial (HE - A, objetiva 10x; B, objetiva 40x). 100 FIGURA 8: Queilite actínica sem displasia epitelial (HE - A, objetiva 10x; B, objetiva 40x). 101 FIGURA 9: Carcinoma com marcação na região suprabasal e distribuição difusa para p53 (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x). 107 FIGURA 10: Carcinoma com marcação na região suprabasal e distribuição focal para p53 mutado (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x). 110 FIGURA 11: Carcinoma com marcação na região suprabasal e distribuição difusa para Ki-67 (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x). 113 FIGURA 12: Carcinoma com marcação na região suprabasal e distribuição difusa para Bcl-2 (A, objetiva 40x; B, objetiva 40x). 116 FIGURA 13: Queilite actínica com displasia epitelial com marcação para p53 na região suprabasal e distribuição difusa (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x). 121 FIGURA 14: Queilite actínica sem displasia epitelial com marcação para p53 na região suprabasal e distribuição difusa (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x). 122 FIGURA 15: Queilite actínica com displasia epitelial com marcação para p53 mutado na região suprabasal e distribuição focal (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x). 126 FIGURA 16: Queilite actínica sem displasia epitelial com marcação para p53 mutado na região suprabasal e distribuição focal (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x). 127 FIGURA 17: Queilite actínica com displasia epitelial com marcação para Ki-67 na região suprabasal e distribuição difusa (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x). 131 FIGURA 18: Queilite actínica sem displasia epitelial com marcação para Ki-67 na região suprabasal e distribuição difusa (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x). 132

13 FIGURA 19: Queilite actínica com displasia epitelial com marcação para Bcl-2 na região suprabasal e distribuição focal (A, objetiva 40x). 136 FIGURA 20: Queilite actínica sem displasia epitelial com marcação para Bcl-2 na região suprabasal e distribuição focal (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x). 137 FIGURA 21: Hiperplasia com marcação na região suprabasal e distribuição focal para p53 (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x). 140 FIGURA 22: Hiperplasia com marcação na região suprabasal e distribuição focal para p53 mutado (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x). 143 FIGURA 23: Hiperplasia com marcação na região suprabasal e distribuição difusa para Ki-67 (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x). 146 FIGURA 24: Hiperplasia com marcação na região basal e parabasal comdistribuição focal para Bcl-2 (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x). 149

14 LISTA DE TABELAS TABELA 1: Anticorpos utilizados no trabalho e suas especificações. 72 TABELA 2: Diluições dos anticorpos utilizados no trabalho. 74 TABELA 3: Tempo de revelação com DAB para cada anticorpo utilizado no trabalho. 75 TABELA 4: Percentual entre os sexos no grupo dos carcinomas. 88 TABELA 5: Percentual das raças no grupo dos carcinomas. 89 TABELA 6: Percentual entre os sexos no grupo das queilites actínicas. 89 TABELA 7: Percentual das raças no grupo das queilites actínicas. 90 TABELA 8: Percentual entre os sexos no grupo das hiperplasias. 91 TABELA 9: Percentual das raças no grupo das hiperplasias. 92 TABELA 10: Resultado referente ao grau de diferenciação dos carcinomas. 96 TABELA 11: Resultado referente à presença de displasia epitelial nas queilites actínicas. 99 TABELA 12: Localização das marcações positivas para p53 nos carcinomas. 105 TABELA 13: Distribuição das marcações positivas para p53 nos carcinomas. 105 TABELA 14: Localização das marcações positivas para p53 mutado nos carcinomas. 108 TABELA 15: Distribuição da positividade na suprabasal para p53 mutado nos carcinomas. 108 TABELA 16: Localização das marcações positivas para Ki-67 nos carcinomas. 111 TABELA 17: Distribuição da positividade na suprabasal para Ki-67 nos carcinomas. 111 TABELA 18: Localização das marcações positivas para Bcl-2 nos carcinomas. 114 TABELA 19: Distribuição da positividade para Bcl-2 nos carcinomas. 114 TABELA 20: Localização das marcações positivas para p53 nos casos de queilite com e sem displasia epitelial. 118 TABELA 21: Distribuição da positividade para p53 nos casos de queilite com e sem displasia epitelial. 118

15 TABELA 22: Localização das marcações positivas para p53 mutado nos casos de queilite com e sem displasia epitelial. 123 TABELA 23: Distribuição das marcações positivas para p53 mutado nos casos de queilite com e sem displasia epitelial. 123 TABELA 24: Localização das marcações positivas para Ki-67 nos casos de queilite com e sem displasia epitelial. 128 TABELA 25: Distribuição da positividade para Ki-67 nos casos de queilites com e sem displasia 128 epitelial. TABELA 26: Localização das marcações positivas para Bcl-2 nos casos de queilites com e sem displasia epitelial. 133 TABELA 27: Distribuição da positividade para Bcl-2 nas queilites. 133 TABELA 28: Localização das marcações positivas para p53 nas hiperplasias. 138 TABELA 29: Distribuição da positividade para p53 nas hiperplasias. 138 TABELA 30: Localização das marcações positivas para p53 mutado nas hiperplasias. 141 TABELA 31: Distribuição da positividade para p53 mutado nas hiperplasias. 141 TABELA 32: Localização das marcações positivas para Ki-67 nas hiperplasias. 144 TABELA 33: Distribuição da positividade para Ki-67 nas hiperplasias. 144 TABELA 34: Localização das marcações positivas para Bcl-2 nas hiperplasias. 147 TABELA 35: Distribuição da positividade para Bcl-2 nas hiperplasias. 147

16 LISTA DE GRÁFICOS GRÁFICO 1: Distribuição de frequência de casos de carcinomas em relação à idade 88 GRÁFICO 2: Distribuição de frequência de casos de queilites em relação à idade. 90 GRÁFICO 3: Distribuição de frequência de casos de hiperplasias em relação à idade. 92 GRÁFICO 4: Valor da idade média nos diferentes grupos estudados em relação ao sexo. 93 GRÁFICO 5: Frequência de casos segundo o sexo para os três grupos estudados (n=60). 94 GRÁFICO 6: Número de casos em relação à raça nos diferentes grupos estudados (n=60). 95 GRÁFICO 7: Percentual médio de área positiva de cada marcador para os três grupos 103 estudados (n=60). GRÁFICO 8: Percentual médio de áreas positivas dos marcadores estudados em relação ao grau de diferenciação dos carcinomas (n=20). 104 GRÁFICO 9: Distribuição e localização do marcador p53 nos carcinomas em relação ao percentual médio de área positiva (n=20). 106 GRÁFICO 10: Distribuição e localização do marcador p53 mutado nos carcinomas em relação ao percentual médio de área positiva (n=20). 109 GRÁFICO 11: Distribuição e localização do marcador Ki-67 nos carcinomas em relação ao percentual médio de área positiva (n=20). 112 GRÁFICO 12: Distribuição e localização do marcador Bcl-2 nos carcinomas em relação ao percentual médio de área positiva (n=20). 115 GRÁFICO 13: Percentual médio de áreas positivas dos marcadores estudados em relação a presença ou ausência de displasia epitelial nas queilites (n=20). 117 GRÁFICO 14: Localização do marcador p53 em relação ao percentual médio de área positiva nos casos queilite com e sem displasia epitelial (n=20). 119 GRÁFICO 15: Distribuição do marcador p53 em relação ao percentual médio de área positiva nos casos de queilite com e sem displasia epitelial (n=20). 120 GRÁFICO 16: Localização do marcador p53 mutado em relação ao percentual médio de área positiva nos casos de queilite com e sem displasia epitelial (n=20). 124 GRÁFICO 17: Distribuição do marcador p53 mutado em relação ao percentual médio de área positiva nos casos de queilite com e sem displasia epitelial (n=20). 125 GRÁFICO 18: Localização do marcador Ki-67 em relação ao percentual médio de área positiva nos casos de queilite com e sem displasia epitelial (n=20). 129

17 GRÁFICO 19: Distribuição do marcador Ki-67 em relação ao percentual médio de área positiva nos casos de queilite com e sem displasia epitelial (n=20). 130 GRÁFICO 20: Localização do marcador Bcl-2 em relação ao percentual médio de área positiva nos casos queilite com e sem displasia epitelial (n=20). 134 GRÁFICO 21: Distribuição do marcador Bcl-2 em relação ao percentual médio de área positiva nos casos queilite com e sem displasia epitelial (n=20). 135 GRÁFICO 22: Distribuição do p53 em relação à localização da positividade nas hiperplasias (n=20). 139 GRÁFICO 23: Distribuição do p53 mutado em relação à localização da positividade nas hiperplasias (n=20). 142 GRÁFICO 24: Distribuição do Ki-67 em relação à localização da positividade nas hiperplasias (n=20). 145 GRÁFICO 25: Distribuição da Bcl-2 em relação à localização da positividade nas hiperplasias (n=20). 148 GRÁFICO 26: Expressão do marcador p53 nos três grupos estudados. 150 GRÁFICO 27: Expressão do marcador p53 nos três grupos estudados com relação à distribuição focal. 151 GRÁFICO 28: Expressão do marcador p53 nos três grupos estudados com relação à distribuição difusa. 151 GRÁFICO 29: Expressão do marcador p53 mutado nos três grupos estudados. 152 GRÁFICO 30: Expressão do marcador p53 mutado nos três grupos estudados com relação à distribuição focal. 153 GRÁFICO 31: Expressão do marcador p53 mutado nos três grupos estudados com relação à distribuição difusa. 153 GRÁFICO 32: Expressão do marcador Ki-67 nos três grupos estudados. 154 GRÁFICO 33: Expressão do marcador Ki-67 nos três grupos estudados com relação à distribuição focal. 155 GRÁFICO 34: Expressão do marcador Ki-67 nos três grupos estudados com relação à distribuição difusa. 155 GRÁFICO 35: Expressão do marcador Bcl-2 nos três grupos estudados. 156 GRÁFICO 36: Expressão do marcador Bcl-2 nos três grupos estudados com relação à distribuição focal. 157 GRÁFICO 37: Expressão do marcador Bcl-2 nos três grupos estudados com relação à distribuição difusa. 157

18 GRÁFICO 38: Comparação dos marcadores p53 e p53 mutado quanto à localização no grupo dos carcinomas 159 GRÁFICO 39: Comparação dos marcadores p53 e p53 mutado quanto à distribuição no grupo dos carcinomas 159 GRÁFICO 40: Comparação dos marcadores p53 e p53 mutado quanto à localização no grupo dos carcinomas em relação ao percentual médio de área positiva (n=20). 160 GRÁFICO 41: Comparação quanto à localização dos marcadores p53 e p53 mutado no grupo das queilites. 161 GRÁFICO 42: Comparação quanto à distribuição dos marcadores p53 e p53 mutado no grupo das queilites. 162 GRÁFICO 43: Comparação dos marcadores p53 e p53 mutado quanto à localização no grupo das queilites em relação ao percentual médio de área positiva (n=20). 162 GRÁFICO 44: Comparação dos marcadores p53 e p53 mutado quanto à localização no grupo das hiperplasias. 163 GRÁFICO 45: Comparação dos marcadores p53 e p53 mutado quanto à distribuição no grupo das hiperplasias. 164 GRÁFICO 46: Comparação dos marcadores p53 e p53 mutado quanto à localização no grupo das hiperplasias em relação ao percentual médio de área positiva (n=20). 164 GRÁFICO 47: Comparação dos marcadores p53 e p53 mutado nos três grupos estudados em relação ao percentual médio de área positiva 165

19 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 1. AIDS: acquired immunodeficiency syndrome 2. AIF: fator indutor de apoptose 3. Apaf-1: fator de ativação de apoptose 1 4. ATP: adenosinatrifosfato 5. bak: bcl-2 homologous antagonist/killer 6. bax: bcl-2 homologous antagonist bcl-x 7. baxα: bcl-2 homologous antagonist bcl-x α 8. bcl-2: B-cell lymphoma/leukemia 2 9. bcl-x: bcl-2 homologous x 10. bcl-xl: bcl-2 homologous x long 11. bcl-xs: bcl-2 homologous x short 12. CENP-F: não encontrado 13. c-myc: cell-myc 14. DAB: dimethylaminoazobenzene 15. DNA: deoxyribonucleic acid 16. EBV: Epstein Barr virus 17. Fadd: Fas associating protein with a novel death domain 18. Fas: membro da família dos receptores de TNF 19. G1: gap GADD45: growth arrest and DNA damage HIV: human immunodeficiency virus 22. HPV: human papilloma virus

20 23. kda: quilodalton 24. Ki-67: Kiel LSAB: labelled streptavidin biotin 26. NORs: nucleolar organizer regions 27. Mab: monoclonal antibody 28. mdm 2: murine double minute nm: nanômetro 30. OMS: Organização Mundial de Saúde 31. p53: protein 53kDa 32. PCNA: proliferating cell nuclear antigen 33. RNA: ribonucleic acid 34. ssdna: single strand DNA 35. SV40: simian virus TBS: Tris buffer saline 37. TNF: tumor necrosis factor 38. TRIS: hidroxi-metil-aminometano 39. TUNEL: TdT dutp - biotin Nick End Labeling 40. UVA: ultravioleta A 41. UVB: ultravioleta B 42. UVC: ultravioleta C

21 RESUMO A radiação ultravioleta natural tem sido identificada como o maior agente etiológico de lesões em pele e lábio. A ceratose actínica em lábio ou queilite actínica considerada, segundo a Organização Mundial de Saúde, como uma lesão prémaligna do câncer labial, apresenta-se, clinicamente, como o primeiro sinal de que danos foram causados ao lábio, muitas vezes irreparáveis, podendo evoluir, em sua grande maioria, para um carcinoma de células escamosas. A atuação da radiação ultravioleta no desenvolvimento de lesões malignas ocorre através da sua ação direta nas células levando ao dano em seu DNA permitindo que prossigam o ciclo mitótico com genes defeituosos. A relação desordenada entre proliferação e morte celular pode, muitas vezes, predizer a evolução e comportamento destas lesões, além de fornecer informações importantes da progressão tumoral. O objetivo deste trabalho foi avaliar através da técnica de imuno-histoquímica, a expressão de proteínas inibidoras e promotoras da apoptose e da proliferação celular como, p53, p53 mutado, Bcl-2, Ki-67 e caspase-3 em 20 casos de hiperplasias fibrosas inflamatórias, 20 de queilites actínicas, sendo quatro com displasia epitelial e 20 de carcinomas de células escamosas, todos localizados em lábio inferior. Os resultados mostraram que a identificação das proteínas p53 (DO-7) e p53 mutada (PAb-240) revelaram-se crescente com a progressão das lesões na região suprabasal com distribuição difusa, bem como a proteína Bcl-2. Observou-se diferença descritiva e quantitativa significante entre as proteínas p53 (DO-7) e p53 mutada (PAb-240) nos três grupos analisados, sendo que o anticorpo DO-7 revelou uma expressão mais elevada do que o PAb-240. A expressão da proteína Ki-67 mostrou-se elevada na

22 região suprabasal de todos os grupos embora não tenha apresentado diferença significativa entre eles. Os casos de queilite com e sem displasia epitelial revelaram diferença significativa apenas para os marcadores p53 mutado (PAb-240) e para Bcl- 2. A expressão desses marcadores e do p53 (DO-7) revelaram-se mais elevada nos casos sem displasia epitelial. A expressão detectada neste estudo para esses marcadores em todas as lesões sugere que o desequilíbrio na regulação da apoptose e da proliferação celular ocorre numa fase inicial do desenvolvimento das lesões pré-malignas, inclusive nas lesões onde morfologicamente não é possível detectar nenhuma alteração ainda. Estes dados reforçam a importância do estudo de imunomarcadores envolvidos na carcinogênese bucal para avaliação do prognóstico de lesões pré-malignas e malignas e consequentemente a indicação de procedimentos terapêuticos e preventivos mais eficazes.

23 ABSTRACT The natural ultraviolet radiation has been identified as the main aetiology of skin and lip injuries. Actinic keratosis in lip or actinic cheilitis, according to World Health Organization, as a premalignant lesion of the labial cancer, is presented, clinically, as the first signal that damages had been caused to the lip, most of the times, irreparable, being able to develop, in its great majority, in a squamous cell carcinoma. The action of the ultraviolet radiation in the development of malignant injuries occurs through its direct action in the cells leading to the damage in its DNA allowing that they continue the mitotic cycle with defective genes. The disordered relation between proliferation and cellular death can, mostly, predict the evolution and behavior of these injuries, besides supplying important information of the tumoral progression. The aim of this work was to evaluate, immunohistochemically, the inhibiting and proliferate expression of apoptosis and cellular proliferation proteins as, p53, mutate p53, Bcl-2, Ki-67 and caspase-3 in 20 cases of inflammatory fibrous hyperplasia, 20 of actinic cheilitis, being four with epithelium dysplasia and 20 of squamous cells carcinoma, all located in lower lip. The results had presented that the identification of proteins p53 (DO-7) and mutate p53 (PAb-240) had shown increasing with the progression of the injuries in the suprabasal region with diffuse distribution, as the Bcl-2 protein. Significant descriptive and quantitative difference were observed between proteins p53 (DO-7) and mutate p53 (PAb-240) in the three analyzed groups, showing that antibody DO-7 revealed a higher expression than the PAb-240. The antibody Ki-67 revealed high expression of the protein in the suprabasal region of all the groups although had not presented significant difference between them.

24 The cases of cheilitis with and without epithelium dysplasia had disclosed a significant difference only for the markers mutate p53 (PAb-240) and Bcl-2. The expression of these markers and p53 (DO-7) had shown higher in the cases without epithelium dysplasia. The expression detected in this study for these markers in all the lesions suggests that the loss of the regulation of apoptosis and the cellular proliferation also occurs in an initial phase of the development of the premalignant lesions included those where morphologically it is not possible to detect any alteration. These data show the importance of the immunomarkers study involved in bucal carcinogenesis for evaluation of the prognostic of premalignant and malignant lesions and the indication of more efficient therapeutical and preventive procedures.

25 1 INTRODUÇÃO

26 Introdução 24 1 INTRODUÇÃO A carcinogênese caracteriza-se como processo multifatorial, resultado da interação de fatores intrínsecos e extrínsecos. Os fatores externos relacionam-se ao meio ambiente e aos hábitos ou costumes próprios do ambiente social e cultural, como, por exemplo, fumo, álcool, alguns alimentos, substâncias químicas, vírus, radiação ionizante e solar entre outros. As causas internas são, na maioria das vezes, geneticamente pré-determinadas, e estão ligadas à capacidade do organismo de se defender das agressões externas. Esses fatores etiológicos podem interagir de várias formas, aumentando a probabilidade de transformações malignas nas células normais. A radiação ultravioleta natural, proveniente do sol, tem sido identificada como o maior agente etiológico das lesões de pele e lábio. De acordo com o comprimento de onda, os raios ultravioleta (raios UV) são classificados em raios UVA ( nm), raios UVB ( nm) e raios UVC ( nm) (SBD). Os raios UVB,

27 Introdução 25 responsáveis pela queimadura e escurecimento da pele, são considerados carcinogênicos devido à grande quantidade de energia que é levada ao estrato córneo e às camadas mais superficiais da epiderme. Sua presença tem aumentado progressivamente a destruição da camada de ozônio, permitindo, inclusive, que raios UVC alcancem mais a atmosfera terrestre, sendo estes potencialmente mais perigosos. Por sua vez, os raios UVA são menos danosos que os raios UVB. No entanto, independem da camada de ozônio e causam câncer de pele em quem se expõe a eles em horários de alta incidência, continuamente e ao longo de muitos anos. São responsáveis, também, pelas alterações causadas no tecido conjuntivo, devido à sua capacidade de penetração na derme (LINCOLN, 2000). Existem três padrões de exposição solar: um intermitente obtido nas atividades de recreação, principalmente em trabalhadores internos não adaptados ao sol, um crônico com exposição solar crônica, principalmente nos trabalhadores externos e um padrão cumulativo, que pode ser tanto da exposição intermitente como crônica (NETO, 2003). Com a exposição indiscriminada ao sol, seja no trabalho ou no lazer, indivíduos da raça branca apresentam maior probabilidade em desenvolver lesões relacionadas à radiação. A ceratose actínica caracteriza-se como lesão de pele causada pelos raios ultravioleta exibindo clinicamente coloração de acastanhada a vermelha ou até mesmo cor normal da pele e consistência áspera. Assim como a pele, o lábio também pode sofrer alterações causadas pelo sol. A ceratose actínica no lábio ou queilite actínica apresenta-se, clinicamente, como o primeiro sinal de que

28 Introdução 26 danos foram causados ao lábio, muitas vezes irreparáveis. Com a exposição crônica à radiação solar, a ceratose actínica que é considerada, segundo a classificação histopatológica da Organização Mundial de Saúde (OMS), como lesão cancerizável do lábio, pode evoluir, em sua grande maioria, para carcinoma de células escamosas. As mudanças clínicas iniciais na queilite actínica incluem atrofia da borda do vermelhão do lábio inferior, perda do limite entre o vermelhão e a porção cutânea. À medida que a lesão progride, áreas ásperas e escamosas desenvolvem-se nas partes mais ressecadas. Estas mesmas áreas podem parecer lesões leucoplásicas. Com o avanço da lesão, ulceração focal crônica pode se desenvolver em um ou mais locais. Histopatologicamente apresenta epitélio escamoso estratificado atrófico com freqüente presença de ceratina. O tecido conjuntivo subjacente mostra alteração nas fibras colágenas e elásticas denominada de elastose solar, aspecto característico dessas lesões. Pode estar presente também, discreto infiltrado inflamatório crônico (NEVILLE et al., 1998). Graus variados de displasia epitelial podem ser encontrados e o potencial para o desenvolvimento do carcinoma invasivo aumenta com a gravidade da displasia epitelial. Deve-se ressaltar que atipias celulares podem ser encontradas associadas a quadros inflamatórios, situação freqüentemente observada em queilites actínicas com úlceras, dificultando diagnosticar a veracidade desta displasia epitelial (PINDBORG et al., 1997). O tratamento para a queilite actínica mostra-se variado. Existem opções que variam desde a remoção cirúrgica, radiação, laser, crioterapia e acompanhamento.

29 Introdução 27 Em lesões difusas o diagnóstico histopatológico define o tratamento entre proservação ou remoção total da lesão. No entanto, as alterações moleculares não são observadas em análises morfológicas, impedindo, assim, estabelecer, com precisão, o prognóstico de evolução da lesão pré-maligna para o carcinoma. A atuação da radiação ultravioleta no desenvolvimento de lesões malignas ocorre através da ação direta nas células levando ao dano em seu DNA. Estes podem ser prontamente reparados pelo sistema de excisão-reparo e, caso isto não ocorra, desencadeia-se o processo de apoptose ou morte celular programada como proteção. Mutações genéticas frente à radiação ultravioleta permitem que as células com genes defeituosos prossigam o ciclo mitótico de divisão e, como conseqüência, acumulam-se mutações e crescimento celular indiscriminado (NETO, 2003). Diversas vias regulatórias da apoptose mostram-se alteradas em lesões prémalignas e malignas podendo ser reveladas, por exemplo, pela expressão aumentada das proteínas como Bcl-2 e p53. A relação desordenada entre proliferação e morte celular pode, muitas vezes, predizer a evolução e comportamento destas lesões, além de fornecer informações importantes da progressão tumoral e da resposta a terapias anticâncer. Atualmente, diversas áreas da patologia, utilizam a imunomarcação de proteínas e a expressão de genes relacionados à proliferação celular e a apoptose para compreender a evolução de uma lesão pré-maligna e/ou maligna direcionando seu prognóstico e tratamento.

30 Introdução 28 Os relatos de estudos com marcadores da proliferação celular e da apoptose em queilites actínicas e carcinomas de células escamosas em lábio são ainda escassos na literatura mundial. A partir do exposto, justifica-se estudar o processo de evolução da queilite actínica para carcinoma de lábio para que estes conhecimentos possam ser empregados futuramente como marcadores de fator prognóstico e tratamento na rotina da patologia bucal.

31 Introdução 29 HIPÓTESES 1. O índice de apoptose, evidenciado pela expressão da caspase-3, é menor nos carcinomas de células escamosas no lábio que nas queilites actínicas e quanto maior o grau de displasia epitelial das lesões menor o número de células em apoptose; 2. A expressão das proteínas p53, Bcl-2 e Ki-67 é maior nas áreas de displasia epitelial presente nas queilites actínicas e nas áreas de invasão nos carcinomas de células escamosas de lábio, com maior imunomarcação nos carcinomas; 3. A imunomarcação das proteínas reguladoras da apoptose - p53, caspase-3 e Bcl-2 e da proliferação celular - Ki-67 são importantes fatores prognósticos em queilites actínicas e carcinomas de células escamosas de lábio.

32 2 - REVISÃO DE LITERATURA

33 Revisão de Literatura REVISÃO DE LITERATURA 2.1 QUEILITE ACTÍNICA A exposição prolongada à luz solar pode afetar significantemente a pele e os lábios, já que a radiação ultravioleta induz a danos irreversíveis no DNA das células epiteliais (OCHSENIUS et al., 2003). Os raios ultravioleta B (UVB) causam queimaduras superficiais na pele e são considerados os responsáveis primários na indução de mudanças causadas pelo sol observadas no lábio (KAUGARS et al., 1999). Aproximadamente, 5% a 10% dos raios são refletidos na pele, porém, em torno de 70% é absorvido. Quanto maior a espessura da epiderme e maior a quantidade de melanina, melhor será a habilidade da pele em absorver esses raios sem que ocorram danos às células epiteliais. No entanto, o lábio possui menor proteção devido ao epitélio mais fino, à ausência da espessa camada de queratina, menor quantidade de melanina e à menor secreção

34 Revisão de Literatura 32 de glândulas sebáceas e sudoríparas estando, assim, mais sujeito aos danos causados pelo sol (KAUGARS et al., 1999). LINDQVIST e TEPPO, em 1978, ao revisarem 3472 casos de carcinoma em lábio na Finlândia, concluíram que, embora a radiação solar seja um fator de risco, ela não se apresenta como única responsável pelo desenvolvimento de lesões no lábio. Dentre os outros fatores relacionados estariam o tabagismo e a dieta alimentar. A queilite actínica insere-se como lesão pré-maligna localizada no vermelhão do lábio inferior, resultado de longa ou excessiva exposição ao componente ultravioleta da radiação solar. Essa entidade, análoga à ceratose actínica na pele, pode sofrer, também, transformação maligna em, aproximadamente, 10 a 20% dos casos (SANTOS et al., 2003). O lábio inferior apresenta-se, predominantemente, mais afetado que o superior devido à sua maior exposição ao sol (MAIN & PAVONE, 1994; OCHSENIUS et al., 2003). No entanto, quando houver acometimento do lábio superior, a lesão será, provavelmente, menos agressiva (MAIN & PAVONE, 1994). A queimadura solar nos lábios pode ocorrer em qualquer idade (MAIN, 1994). No entanto, as alterações clínicas são freqüentemente observadas a partir da 5ª década, visto que os danos causados pela radiação mostram-se cumulativos com o passar dos anos (OCHSENIUS et al., 2003).

35 Revisão de Literatura 33 A queilite actínica acomete, com maior freqüência, homens brancos que relatam exposição crônica aos raios solares (AWDE et al., 1996; KAUGARS et al., 1999; MOY, 2000; OCHSENIUS et al, 2003;). Porém, observa-se um aumento da incidência da lesão em mulheres devido a maior exposição solar, seja por motivos profissionais ou estéticos (KAUGARS et al., 1999) Os sinais primários dos danos causados pelo sol no lábio são sutis e o grau da aparência clínica pode não corresponder aos aspectos histopatológicos observados nos tecidos epiteliais e conjuntivos (ONOFRE et al., 1997; KAUGARS et al., 1999). Em estágios iniciais, a lesão caracteriza-se, clinicamente, como uma lesão branca, com possíveis áreas eritematosas, assintomática, de espessura variável e áspera à palpação (MAIN & PAVONE, 1994; KAUGARS et al., 1999; SANTOS et al., 2003). Descamação persistente, sensação de secura e queimação podem ser sintomas relatados pelos pacientes (MAIN & PAVONE, 1994; MOY, 2000). A linha de demarcação entre a pele e o vermelhão do lábio pode tornar-se borrada e a pele logo abaixo do lábio perde a sua concavidade natural. Com a evolução da lesão, a camada ceratótica torna-se mais espessa, as áreas eritematosas mais intensas e pequenas úlceras podem se formar, demorando um período maior para cicatrizarem (MAIN & PAVONE, 1994). As alterações histopatológicas que ocorrem no epitélio, nos estágios iniciais da lesão, são: hiperceratose, acantose e atrofia. Em estágios mais avançados, a

36 Revisão de Literatura 34 displasia epitelial pode estar presente (MAIN & PAVONE, 1994; SANTOS et al., 2003). Neste momento, dependendo do grau de displasia epitelial, sabe-se que as chances de se desenvolver um carcinoma de células escamosas são grandes (MAIN & PAVONE, 1994). O aspecto basofílico do tecido conjuntivo, denominado como elastose solar, caracteriza-se como um achado universal na queilite actínica. Essa alteração histopatológica, induzida pela exposição crônica à luz ultravioleta, resulta na substituição das fibras colágenas e elásticas por um material granular basofílico, amorfo e acelular que contém, usualmente, vasos sanguíneos dilatados (LA RIVIERE & PICKETT, 1979; MAIN & PAVONE, 1994; KAUGARS et al., 1999; SANTOS et al., 2003). Associado, observa-se, ainda, a presença de infiltrado inflamatório moderado a severo composto, predominantemente, de linfócitos (SANTOS et al., 2003). Clinicamente, a presença da elastose solar pode ser evidenciada por uma pele fina, enrugada e de coloração amarelada (LINCOLN, 2000). Diversos tratamentos podem ser indicados para queilite actínica que incluem a vermelhectomia, aplicação tópica de 5-fluoruracila, crioterapia, eletrocauterização, aplicação de laser e dermoabrasão. A vermelhectomia ainda caracteriza-se como o tratamento de escolha por ser considerada uma biópsia excisional permitindo uma revisão histopatológica de todo tecido removido. Todas as outras opções de tratamento podem falhar, pois não permitem a detecção de um tumor invasivo presente (SANCHEZ et al.,1986).

37 Revisão de Literatura CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS BUCAL O câncer de boca representa cerca de 3% de todas as neoplasias malignas nos homens e 2% nas mulheres, segundo a Sociedade Americana de Câncer, em 2002 (NEVILLE & DAY, 2002). A estimativa da incidência do câncer de boca para o ano de 2003, segundo o Instituto Nacional do Câncer, mostra-se maior nas regiões sul e sudeste, sendo representadas numericamente por 1.630/ e 7.080/ casos novos, respectivamente. No estado do Rio de Janeiro, a estimativa de casos novos pode alcançar a taxa de 19,27%/ para os homens e 7,24%/ para as mulheres (INCA). O carcinoma de células escamosas apresenta-se como o tipo histológico mais comum, chegando a cerca de 90% das neoplasias malignas na cavidade bucal (NEVILLE & DAY, 2002). O câncer bucal ocorre, mais comumente, nos homens (ZAKREWSKA, 1999; SCULLY & PORTER, 2000; NEVILLE & DAY, 2002), no entanto a proporção entre homem e mulher vem se tornando semelhante, provavelmente pelo aumento da exposição a agentes carcinógenos no sexo feminino (NEVILLE & DAY, 2002). A etiologia do câncer bucal mostra-se multifatorial (NEVILLE et al., 1998). Segundo a Organização Mundial de Saúde, o tabaco apresenta-se como a maior causa isolada. Assim como o consumo do álcool também parece contribuir para o risco de desenvolvimento do câncer de boca. A identificação do álcool como fator cancerígeno isolado tem sido difícil devido ao hábito de associar o fumo com a bebida na maioria dos portadores de câncer de boca (REGEZI & SCIUBBA, 1991;

38 Revisão de Literatura 36 ZAKREWSKA, 1999). Alguns mecanismos foram sugeridos para explicar o papel do álcool no desenvolvimento do câncer bucal, entre eles a ação como solvente facilitando a passagem do carcinógeno através da membrana celular e alteração do metabolismo das células epiteliais. O consumo do etanol pode, ainda, acentuar o metabolismo do fígado, ativando substâncias carcinogênicas (LA VECCHIA et al., 1997). A ação de microorganismos virais tem papel importante entre os carcinógenos (ZAKREWSKA, 1999; NAGPAL et al., 2003). O vírus Epstein-Barr (EBV) tem sido relacionado com o linfoma de Burkitt e o carcinoma nasofaríngeo enquanto o vírus papiloma humano (HPV), reconhecido como importante causa de câncer no trato ano-genital, encontra-se envolvido também na etiologia de cânceres do trato aerodigestivo (LA VECCHIA et al., 1997). Os subtipos 16, 18, 31, 33 são os que mais freqüentemente se associam às displasias epiteliais e ao Carcinoma de células escamosas (NEVILLE et al., 1998). Estados de imunodeficiência têm importante papel no desenvolvimento de alguns tipos de cânceres do trato aerodigestivo (ZAKREWSKA, 1999; SCULLY & PORTER, 2000). Na população imunocomprometida pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e naquela sob terapia imunossupressiva para o câncer ou transplante de órgãos há um aumento no risco para o desenvolvimento de carcinoma de células escamosas bucal (NEVILLE et al, 1998).

39 Revisão de Literatura 37 Diversos tipos de graduação histopatológica vêm sendo utilizados para descrever o comportamento biológico do câncer, entretanto, pode-se notar que as principais variantes microscópicas que possibilitam a graduação histológica permanecem inalteradas, como: grau de ceratinização, atividade mitótica, atipias celulares e nucleares, infiltrado inflamatório e padrão de invasão. Broders, em 1926, iniciou a graduação quantitativa do câncer baseando-se na proporção que a neoplasia se assemelha ao epitélio escamoso normal. Essa classificação permanece sendo utilizada pela Organização Mundial de Saúde (PINDBORG et al, 1997). O câncer bucal pode ser dividido em três categorias: carcinoma da cavidade bucal propriamente dito, carcinoma de lábio e carcinoma de orofaringe (NEVILLE & DAY, 2002) CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS NO LÁBIO A ligação entre câncer no lábio e exposição solar foi primeiramente relatada em 1923, sendo a radiação solar indicada, principalmente em pessoas de pele clara, como a principal causa do câncer labial (KAUGARS et al., 1999). Outros fatores de risco envolvidos no seu desenvolvimento compreendem o local de moradia, tipo de profissão, posição sócio-econômica, hábito de fumar e fatores relacionados ao hospedeiro, caracterizando a doença como multifatorial (LINDQVIST & TEPPO, 1978). A relação entre a exposição ao sol e o câncer labial pode ser evidenciada através da variação geográfica, irradiação solar e características étnicas

40 Revisão de Literatura 38 (LINDQVIST & TEPPO, 1978; LA RIVIERE & PICKETT, 1979; CHEN et al., 1992; SANTOS et al., 1996 VISSCHER et al., 1998). A forma histopatológica mais comum de câncer em qualquer parte do lábio é o carcinoma de células escamosas correspondendo, aproximadamente, a 90% dos casos. O carcinoma de glândula salivar e outras neoplasias malignas são observados com pouca freqüência (LINDQVIST & TEPPO, 1978; SANTOS et al., 1996). O lábio inferior caracteriza-se por ser o local preferencialmente acometido e representa 9% de todos os cânceres bucais (OCHSENIUS et al., 2003). O carcinoma de lábio acomete predominantemente indivíduos idosos do sexo masculino (VENESS et al., 2001; NEVILLE & DAY, 2002; OCHSENIUS et al., 2003). Dados da literatura demonstram considerável diferença na proporção da incidência entre os sexos. CHEN et al., em 1995, em um estudo epidemiológico sobre o câncer em lábio, em Connecticut, no período de 1935 a 1985, observaram que o sexo masculino era 18 vezes mais suscetível a adquirir a doença no lábio inferior enquanto VISSCHER et al., em 1998, ao realizar estudo epidemiológico de 1989 a 1994 do câncer de lábio na Holanda, demonstrou que os homens estariam oito vezes mais suscetíveis do que as mulheres. Dados de pesquisa realizada pelo Instituto Nacional do Câncer do Canadá, em 1995, demonstraram que homens da raça branca, com idade variando de 80 a 84 anos, teriam uma incidência de 31,3/ , enquanto mulheres do mesmo grupo de idade, apenas 3,6/ (AWDE et al., 1996).

41 Revisão de Literatura 39 Os fatores de riscos que acometem os dois sexos parecem similares, no entanto, diferenças na sua incidência sugerem divergências na duração da exposição à radiação e na interação entre vários fatores de risco relacionados a carcinogênese. Atividades profissionais menos expostas a fatores climáticos, número menor de fumantes e o uso de protetores labiais, inclusive presente em alguns batons, são dados relevantes presentes nas mulheres que podem justificar a diferença desta incidência entre os sexos.(la RIVIERE & PICKETT, 1979; VISSCHER et al., 1998; OCHSENIUS et al., 2003). A lesão, normalmente, não apresenta sintomatologia, o que pode explicar a demora de até dois anos para que o paciente procure ajuda profissional (KAUGARS et al., 1999). Clinicamente, a lesão pode manifestar-se como uma mancha leucoplásica ou eritroplásica, ter uma aparência atrófica, rachaduras persistentes com áreas de descamação ou crosta (LA RIVIERE & PICKETT, 1979; AWDE et al., 1996; MOY, 2000). Estágios ainda iniciais podem ser difíceis de serem distinguidos da queilite actínica. Em fato, a displasia epitelial e o carcinoma inicial podem co-existir em áreas de queilite actínica. E estágios avançados da doença demonstram, freqüentemente, úlcera crônica de bordos endurecidos que não cicatriza ou crescimento verrucoso exofítico (AWDE et al., 1996; NEVILLE et al., 1998). A detecção de placa leucoplásica localizada no lábio inferior requer bastante atenção, pois assim como a língua, sua presença no lábio também se identifica

42 Revisão de Literatura 40 como sítio de alto risco para transformação maligna. WALDRON e SHAFER, em 1975, ao estudarem espécimes de biópsia de leucoplasias bucais, identificaram que de 10,3% das leucoplasias localizadas no lábio, 24% mostraram displasia epitelial ou carcinoma. O comportamento do carcinoma de lábio apresenta-se variável. Grande parte das lesões permanece localizada e com crescimento lento. Sua expansão ocorre, preferencialmente, para as laterais e não para estruturas mais profundas (AWDE et al., 1996). Quando há envolvimento ganglionar, os submandibulares são os mais acometidos. O tratamento recomendado para lesões iniciais consiste em radioterapia ou cirurgia e para tumores mais invasivos, a combinação dos dois (VENESS et al., 2001). Recorrências locais da lesão são infrequentes. A taxa de recidiva relaciona-se ao tamanho do tumor primário (AWDE et al., 1996). E o prognóstico nesse tipo de lesão atinge uma taxa de 95% de sobrevivência quando comparado ao carcinoma intra-bucal (NEVILLE & DAY, 2002).

43 Revisão de Literatura FATORES PROGNÓSTICOS APOPTOSE A morte celular programada vem sendo descrita desde 1828, quando autores observaram a regressão de estruturas durante o desenvolvimento de fetos e larvas. Desde então, com o avanço técnico e a teoria celular estabelecida, foi possível a conceituação da morte celular natural através de estudos da metamorfose de anfíbios. No entanto, apenas em 1972 o termo apoptose foi introduzido para caracterizar a morte celular programada, quando o patologista australiano JOHN KERR e colaboradores observando células morrendo em diversas condições, patológicas ou não, verificaram que elas partilhavam de uma morfologia estereotipada, aplicando a este fenômeno o termo apoptose (em grego apó - para longe; ptósis - queda), palavra usada por poetas gregos para descrever flores ou folhas cadentes. Durante esse estudo, além da correlação da apoptose com eventos fisiológicos como a renovação celular, regressão de estruturas no desenvolvimento embrionário, os autores também a relacionaram com situações patológicas, que incluíam neoplasias malignas e regressão de tumores terapeuticamente induzidos ou por agentes nocivos (KERR et al., 1972; CARSON & RIBEIRO, 1993; DUKE et al., 1996). Morfologicamente, a morte celular pode ser caracterizada de duas formas: apoptose e necrose. A necrose consiste da forma patológica de morte celular sendo resultante de lesão severa na célula de um organismo vivo. Esta agressão pode

44 Revisão de Literatura 42 variar desde agentes físicos até a falta de oxigênio. Como conseqüência, a célula perde o controle da entrada e da saída de fluidos, íons e água, os quais passam somente a entrar promovendo a tumefação celular e das organelas. Por fim, a membrana celular e organelas se rompem, derramando substâncias nocivas e agressivas para o ambiente extracelular que induzem a resposta inflamatória local. Substâncias quimiotáticas liberadas neste local atraem macrófagos circulantes e outras células do sistema imune em direção às células necróticas e as digerem. As alterações morfológicas observadas durante a necrose não obedecem a um mesmo padrão e não há controle genético deste fenômeno (LORO et al., 2003; DUKE et al., 1996; BUJA et al., 1993). A apoptose caracteriza-se por apresentar evidentes e orquestradas alterações morfológicas na célula, incluindo o enrugamento celular, a condensação da cromatina e subseqüente fragmentação do DNA. Na membrana celular formam-se invaginações, o núcleo se rompe e as organelas mantêm-se intactas. A fragmentação da célula origina corpos apoptóticos circundados por membrana celular, contendo no seu interior algumas organelas e, às vezes, fragmentos de núcleo. Estes corpos apoptóticos são imediatamente reconhecidos e fagocitados por macrófagos ou células fagocitárias adjacentes. O rápido reconhecimento pelas células fagocitárias aliado à integridade das organelas não induz ao desenvolvimento de resposta inflamatória local (KERR et al., 1972; BUJA et al., 1993; LORO et al., 2003). Em cortes microscópicos corados pela hematoxilina e eosina os corpos apoptóticos são identificados como massas redondas ou ovais com

45 Revisão de Literatura 43 o citoplasma intensamente eosinofílico, mais comumente observados dentro de fagolisossomos (LOURENÇO, 1997). A morte celular programada pode ocorrer através de duas vias principais. A via extrínseca, mediada pela ativação de receptores de morte celular localizados na membrana citoplasmática, sendo o Fas e o TNF os mais conhecidos e a via intrínseca, dependente da participação da mitocôndria, onde há liberação de fatores apoptogênicos como citocromo c, o fator indutor de apoptose (AIF), ATP e proteínas de choque térmico. Proteínas pró-apoptóticas e anti-apoptóticas da família do bcl-2 regulam a via mitocondrial. Como resultado final de ambas as vias, ocorre a ativação das caspases e a quebra de substratos celulares específicos (ZIMMERMANN & GREEN, 2001; LORO et al., 2003; FISCHER, 2001). Pela via extrínseca, ocorrerá a ativação de receptores de membrana transmitindo sinais para o interior da célula e ativando, inicialmente, a caspase-8 ou a caspase-10. A via intrínseca, ativada por estresse celular, é mediada pela liberação de citocromo c pela mitocôndria, levando a ativação da caspase-9. Essas duas vias levam a ativação das caspases efetoras, as caspases-3, -6 e -7 (LORO et al., 2003). Células apoptóticas podem ser identificadas em lâminas coradas com hematoxilina e eosina ao microscópio óptico. As características observadas são compatíveis com a fase tardia da apoptose, quando o citoplasma apresenta-se

46 Revisão de Literatura 44 eosinofílico, a cromatina se condensa na membrana nuclear e há a formação de corpos apoptóticos. No entanto, a sua ocorrência em células isoladas e seu discreto aparecimento e resolução dificulta sua detecção, consumindo mais tempo além de necessitar de um observador treinado (LORO et al., 2003). Diferentes métodos de detecção para a apoptose vêm sendo amplamente utilizados, como a técnica TUNEL, as marcações imuno-histoquímicas para os diferentes tipos de caspases e para fita simples de DNA (ssdna) e a hibridação in situ. A técnica TUNEL (TdT dutp-biotin Nick End Labeling), introduzida por GAVRIELI, SHERMAN e BEN SASSON, em 1992, baseia-se na marcação direta e específica do DNA fragmentado no núcleo. Esta técnica marca células em fases iniciais da apoptose como também após sua fagocitose. No entanto, células que sofreram necrose também podem ser detectadas por esse método (LORO et al., 2003). O anticorpo monoclonal (Mab) para fita simples de DNA (ssdna) liga-se especificamente com fita única de DNA sendo ideal para detecção de células apoptóticas em cortes de tecido parafinado. O anticorpo não reconhece fita dupla de DNA e reage com deoxicitidina e requer ativação de ssdna de pelo menos bases de comprimento para ligação. Assim como o método TUNEL, o anticorpo antissdna não é específico para apoptose; a reação também pode ocorrer com células em necrose (FRANKFURT et al., 2001). A marcação da caspase-3, em imuno-

47 Revisão de Literatura 45 histoquímica, tem sido utilizada para identificar células em apoptose, revelando fácil aplicabilidade e alta sensibilidade. Nas últimas décadas, diversos avanços têm sido realizados para auxiliar no entendimento da apoptose e seus mecanismos moleculares em eventos fisiológicos e na patogênese de várias doenças, como na AIDS, nas doenças neurológicas degenerativas, nas desordens auto-imunes e no câncer (LORO et al., 2003; ZIMMERMANN & GREEN, 2001). A adequada regulação da apoptose mostra-se importante para o desenvolvimento e manutenção dos tecidos normais (DEVERAUX et al., 2001; FISCHER, 2001). Os distúrbios apoptóticos, considerados o primeiro evento em alguns tipos de câncer e leucemia, permitem que células malignas tenham maior sobrevida contribuindo para que ocorra expansão neoplásica (DEVERAUX et al., 2001). O desenvolvimento do câncer ocorre após acúmulo de mutações em genes que controlam a sobrevivência e proliferação celular. Quando a mutação apresentase irreparável, as células afetadas cometem suicídio para que não ocorra nenhum transtorno. Caso a célula não morra, ela ou a sua prole viverão o suficiente para acumular mutações e assim se dividirem incontrolavelmente. Em diversos tumores, o erro ocorre na indução da apoptose dessas células, devido à inativação do gene TP53. Além disso, a morte celular pode, também, ser inativada pela excessiva

48 Revisão de Literatura 46 produção da proteína Bcl-2 (CARSON & RIBEIRO, 1993; DUKE et al., 1996), sobre o qual será melhor detalhado no item , na pág PROTEÍNA p53 O gene TP53 1 caracteriza-se como um gene supressor de tumor, localizado no braço curto do cromossomo 17, extendendo-se do exon 1 ao exon 11 (LEVINE, 1997; OKAZAKI et al., 2002). O produto deste gene, uma fosfoproteína nuclear com peso aproximado de 53kD, e com 393 aminoácidos, atua bloqueando o ciclo celular entre as fases G1/S, permitindo a reparação de danos ocorridos no DNA. A proteína p53 pode apresentar-se na forma normal ou mutada. A alteração e/ ou estabilização da proteína pode ser resultado de alterações conformacionais no gene TP53, que se revertem em acúmulos da proteína e permite, em outro momento, sua detecção imuno-histoquímica (LEVINE, 1997). A forma normal da proteína p53 possui uma meia-vida que pode variar entre 6 a 30 minutos, dificultando sua detecção em tecidos normais. No entanto, sua meiavida pode apresentar-se aumentada devido a alterações como a mutação genética tornando sua proteína metabolicamente estável, defeitos na via de degradação e ligação com outras proteínas como as dos vírus SV40 e HPV (BONGERS et al., 1995; NYLANDER et al., 2002). 1 Segundo NYLANDER et al. (2000), o gene é identificado por letras maiúsculas e em itálico, enquanto a proteína, com letras minúsculas e regulares.

49 Revisão de Literatura 47 A proteína p53 possui a capacidade de detectar diversos tipos de estresse celular, como danos no DNA ou radiação ultravioleta. E assim, sendo ativada pela exposição ao estresse, a p53 age como condutora, ativando outros genes para produção de proteínas como p21, GADD45 e MDM2 necessárias ao processo de defesa (NYLANDER et al., 2002). Ocorre uma parada no ciclo celular na fase G1 para haver reparo do DNA lesado. Caso não ocorra reparo, a p53 induz o suicídio da célula evitando a propagação de DNA alterado para as células filhas e, como conseqüência, inibe o desenvolvimento de neoplasias. Por esta razão, o gene TP53 é também chamado de guardião do genoma. (CULOTTA et al., 1993; LANE et al., 1993; WILLIAMS et al., 1993; STELLER et al., 1995; THOMPSON et al., 1995; HALE et al., 1996; RAYBAUD-DIOGENE et al., 1996). Para que a proteína p53 possa executar sua função, é preciso que, depois de sintetizada, seja transportada para dentro do núcleo para que, junto com outra molécula de p53 formem um complexo tetramérico e, em seguida, induzam à interrupção do crescimento celular ou à apoptose (NYLANDER et al., 2002). A inativação do TP53 é atribuída, na maioria dos casos, a mutações e deleções de alelos, podendo resultar em alterações na expressão do gene ou nas funções bioquímicas de seu produto. A mutação e a superexpressão do TP53 é, freqüentemente, encontrada nos carcinomas de células escamosas da cabeça e pescoço, constituindo papel importante no desenvolvimento desses cânceres (WEINBERG, 1991; GREENBLATT et al., 1994; SHIN et al., 1994; RAVI et al., 1996; RAYBAUD-DIOGENE et al., 1996). Quase metade dos pacientes que apresentam o

50 Revisão de Literatura 48 tumor primário na cabeça e pescoço possui essa mutação, sendo reconhecido como o gene mais comumente mutado neste tipo de neoplasia (BOYLE et al., 1993). Caracterizada como potente molécula de efeito devastador, se descontrolada, os níveis normais da p53 devem ser mantidos sempre baixos. Sua rápida degradação ajuda na manutenção desse nível. Diversos genes e seus produtos estão envolvidos nessa regulação como, por exemplo, o proto-oncogene MDM2. O produto desse gene, a proteína MDM2, liga-se ao terminal N da p53 bloqueando sua atividade, exportando-a para o citoplasma com a ajuda de moléculas chamadas exportinas, para que possa ser degradada (NYLANDER et al., 2002). A expressão da MDM2 em carcinomas bucais mostra-se pequena, sugerindo a degradação da p53 pela ligação com a MDM2 em apenas alguns subtipos dessas lesões (SCHOELCH et al., 1999). A detecção da p53 vem sendo demonstrada como bom marcador imunohistoquímico em eventos iniciais da carcinogênese da cabeça e pescoço e até mesmo em locais onde não se identificam alterações histopatológicas. Estudos mostraram positividade para proteína p53 em epitélios com significante distância do sítio primário do tumor e em lesões pré-malignas (NEES et al.; 1993; SHIN et al., 1994; RAYBAUD-DIOGENE et al., 1996; CRUZ et al., 1998; CRUZ et al., 2000;). O valor prognóstico da imunopositividade da p53 também tem sido descrito em margens cirúrgicas livres de tumor, sendo correlacionada com a recorrência de neoplasias (BRENNAN et al., 1995; CRUZ et al., 2000).

51 Revisão de Literatura 49 A expressão da p53 em eventos iniciais da carcinogênese apresenta-se correlacionada com carcinomas de pele induzidos pela radiação ultravioleta B. A radiação ultravioleta A induz, clinicamente, aos mesmos carcinomas, no entanto, por outra via, pois a mutação da p53 parece não contribuir para sua gênese (DE GRUIJL, 2002). A detecção da p53 em tecidos bucais normais restringe-se à camada basal, compartimento proliferativo do epitélio. Em outros compartimentos do epitélio, onde as células perderam a capacidade de se dividir, essa marcação não é esperada. A expressão da p53 nas células suprabasais, onde não há indícios de lesão maligna, sugere alteração na p53, que estabiliza essa molécula inativando-a, levando, possivelmente, à malignização do tecido (CRUZ et al., 2000). Com o objetivo de evidenciar o potencial do marcador p53 no desenvolvimento do câncer da cabeça e pescoço, SHIN et al., em 1994, analisaram, imuno-histoquimicamente, essa proteína em 33 espécimes de carcinoma de células escamosas que continham áreas de epitélio normal adjacente ao tumor, hiperplasia e/ou displasia epitelial. Em 45% dos carcinomas, 21% do epitélio adjacente normal, 27% das amostras de hiperplasia e 45% das displasias epiteliais a expressão da proteína foi positiva. A análise de imagem quantitativa demonstrou um aumento progressivo na expressão da p53 de acordo com a evolução da lesão. E quanto à localização das marcações, os autores relataram que os casos de epitélio normal se restringiram à camada basal, enquanto, nas hiperplasias e displasias epiteliais, a expressão expandiu-se para a camada parabasal e região suprabasal, concluindo,

52 Revisão de Literatura 50 assim, que a expressão da proteína pode estar alterada em fases bem iniciais da carcinogênese da cabeça e pescoço. CROSTHWAITE et al., em 1995, estudaram, através da imuno-histoquímica, a expressão da proteína p53 em 5 amostras de carcinoma de células escamosas, queilite actínica, candidíase hiperplásica crônica e líquen plano, todos localizados no lábio. Com objetivo de comparação foram utilizados cinco casos de carcinoma de células escamosas e ceratose solar localizadas na face, lesões de líquen plano, candidíase hiperplásica crônica e carcinoma de células escamosas localizados na mucosa intra-bucal, além de cinco amostras de mucosa labial normal. Todos os casos de carcinoma de células escamosas, queilite actínica e dois de candidíase hiperplásica crônica localizados no lábio foram positivos para a p53, assim como as lesões pré-malignas e malignas da face e três dos carcinomas localizados intrabucal. Diante destes dados, os autores sugeriram que a alta expressão da p53 poderia ser considerada como evento inicial na patogenia do câncer de lábio e que as células marcadas positivamente para p53 estariam relacionadas com a formação de tumores malignos. MELO, em 1999, ao testar o anticorpo anti-p53 em lesões hiperplásicas não neoplásicas, pré-cancerizáveis e carcinomas de células escamosas bucais, demonstrou intensa marcação nas leucoplasias, queilites actínicas e carcinomas espinocelulares, 45,4%, 60% e 66,6% respectivamente, para a proteína p53, enquanto nas lesões hiperplásicas não encontrou fortes marcações em nenhum caso. Concluindo que essa imunomarcação, sugestiva da presença precoce da

53 Revisão de Literatura 51 alteração genética no p53, poderia qualificá-la como fator prognóstico para as lesões pré-cancerizáveis. DE ROSA et al., em 1999, em um estudo com 44 lesões localizadas no lábio inferior, dentre essas, 30 carcinomas de células escamosas, 10 lesões pré-malignas (sete queilites actínicas e três leucoplasias) e quatro metástases de lábio inferior em linfonodos, identificaram regiões de núcleos organizados marcados pela prata (AgNORs) e imuno-histoquimicamente as proteínas p53, PCNA e c-myc. Os autores relataram a identificação progressiva da p53 diretamente proporcional ao grau de diferenciação dos carcinomas de células escamosas observado em 20 dos 30 casos estudados, demonstrando, assim, a íntima relação entre sua superexpressão e a progressão do tumor. Eventuais grupos de células positivas localizados na camada basal de duas das sete queilites actínicas expressaram p53, conduzindo a possibilidade dessas lesões estarem apresentando sinais de ativação neoplásica, na ausência de alterações morfológicas óbvias. LIAO et al., em 2000, propuseram a investigação do gene P53 mutado, através da técnica PCR, nas células esfoliadas dos tumores encontradas na saliva de pacientes que apresentavam carcinoma de células escamosas. Para isso, recolheu a saliva de 10 pacientes com câncer bucal e de 27 voluntários saudáveis, extraiu o DNA e realizou a técnica. Como resultado obtiveram positividade para a mutação em 62,5% dos pacientes com câncer e em 18% dos pacientes saudáveis.

54 Revisão de Literatura 52 CRUZ et al., em 1998, realizaram um estudo em lesões pré-malignas (leucoplasias e eritroplasias) detectando, imuno-histoquimicamente, a expressão da proteína p53 de acordo com a evolução da lesão. Analisando os espécimes em microscópio óptico e classificando a marcação quanto à localização na camada basal e região suprabasal, nas lesões benignas e epitélio normal usados como controle negativo, a expressão da proteína, quando presente, foi obtida na camada basal. Enquanto, nas lesões pré-malignas, sete de um total de 35 casos expressaram a p53 suprabasal, sendo que seis evoluíram, mais tarde, para carcinoma onde as células neoplásicas mantiveram a expressão da proteína. Os mesmos autores, em 2000, utilizando a mesma metodologia, analisaram a expressão da mesma proteína em áreas livres de tumor, imediatamente adjacente a 42 carcinomas de células escamosas removidos cirurgicamente, encontrando em 17% desses espécimes positividade para p53 na camada suprabasal e em 63% de expressão na área do tumor. Através desses dois estudos, os autores concluíram que a detecção da p53 em estágios iniciais da carcinogênese bucal pode ser um valioso fator prognóstico. OKAZAKI et al., em 2002, realizaram um estudo experimental induzindo o desenvolvimento de carcinoma em língua de ratos através da 4NQO (4- nitroquinoline 1-oxide) com a finalidade de estudar o potencial maligno das displasias epiteliais. Em um total de 36 lesões, os autores as dividiram em três grupos de 12 lesões, sendo câncer inicial, displasia e epitélio sem alterações e avaliaram imuno-histoquimicamente a expressão da p53 mutada, usando o clone

55 Revisão de Literatura 53 PAb 240 e da Bcl-2, a identificação de apoptose pela técnica TUNEL e a confirmação da mutação do TP53 através da amplificação dos exons 5-8. A positividade para a p53 foi encontrada na camada basal e suprabasal nos três grupos, sendo a expressão nas displasias epiteliais significativamente mais alto que nos outros dois. A Bcl-2 foi localizada na camada basal e o índice mostrou-se em aumento de acordo com a progressão da doença. O índice de células positivas para a técnica TUNEL foi mais elevado no epitélio sem alterações e menos nos carcinomas iniciais. A mutação do gene TP53 foi confirmada em cinco dos nove casos de displasia epitelial (3 casos) e carcinoma inicial (2 casos) testados, sendo a mutação do exon 6 mais observada. A partir desses dados, os autores concluíram que a mutação do gene TP53 pode estar associada com uma fase inicial da carcinogênese bucal, precedendo as mudanças morfológicas do tecido e que o potencial maligno de lesões pré-cancerosas pode ser auxiliado com a detecção da p53 e bcl-2 nos tecidos, bem como o índice decrescente de células TUNELpositivas PROTEÍNA Bcl-2 A família do gene Bcl-2 exerce papel importante na regulação da apoptose. Esse gene (B-cell lymphoma/leukemia-2 gene) foi primeiramente observado translocado entre os cromossomas 14 e 18 em grandes proporções de linfomas foliculares de células B humanas (REED, 1994; PIATTELLI et al., 2002; LORO et al., 2003). Essa translocação resulta na transferência do gene Bcl-2 da posição 18q21

56 Revisão de Literatura 54 para 14q32. O gene translocado causa uma superexpressão de suas proteínas (LORO et al., 2003), podendo resultar na alteração da morte programada de células e conseqüente permanência dessas células que não morreram (PIATTELLI et al., 2002). A família Bcl-2 consiste em dois grupos de proteínas: as anti-apoptóticas e as pró-apoptóticas (SCHOELCH et al., 1999; LORO et al., 2003). Essas proteínas estão localizadas no lado externo da membrana mitocondrial, no envelope nuclear e no retículo endoplasmático das células (LORO et al., 2003). As proteínas Bcl-2, Mcl-1 e A1 apresentam comportamento inibitório da apoptose enquanto a Bax, Bak e a Bad agem como promotora da morte celular programada (SCHOELCH et al., 1999). O gene Bcl-x, que apresenta seqüência molecular similar ao Bcl-2, sintetiza também dois produtos, as proteínas Bcl-X s e Bcl-X L que funcionam como indutora e inibidora da apoptose, respectivamente (HALE et al., 1996; SCHOELCH et al., 1999;). O gene bax humano sintetiza uma proteína que se une a Bcl-2. O principal produto do gene bax, a Baxα, atua em oposição ao gene Bcl-2 e a sua superexpressão permite a morte das células. A proteína Bak, expressa em muitos tecidos, como a Bax, acelera a apoptose em células sem fatores de crescimento e bloqueia parcialmente a inibição promovida pelo gene Bcl-2 (HALE et al., 1996).

57 Revisão de Literatura 55 Tradicionalmente, a expressão da Bcl-2 é referida na literatura como exclusivamente citoplasmática. No entanto, PAPADIMITRIOU et al., em 1996, descreveram ser possível também a expressão nuclear da proteína, mais em tumores malignos que em condições reacionais ou pré-malignas. Isso deve-se à associação da proteína com cromossomos de núcleos em mitose de células epiteliais onde, provavelmente, exerce proteção do DNA contra endonucleases. Em epitélios com proliferação normal, a proteína Bcl-2 é expressa em células tronco (indiferenciadas), como as da camada basal, onde as previne de morrer. A superexpressão da Bcl-2 também tem sido encontrada na fase inicial da carcinogênese epitelial e na progressão do tumor (RAVI et al., 1996; PIATTELLI et al., 2002). Os melanócitos produzem quantidades exageradas de Bcl-2 para mantê-los vivos e executando sua função. Quando essas células são lesadas geneticamente, elas têm menor capacidade de iniciar o processo de apoptose do que as células do epitélio, podendo assim originar tumores mais agressivos (DUKE et al., 1996). Relatos na literatura mostram controvérsia na expressão da Bcl-2 durante a progressão do carcinoma de células escamosas bucais. Enquanto alguns demonstraram seu aumento em lesões displásicas e em carcinomas, outros detectaram pouca ou ausência da expressão nessas lesões (RAVI et al., 1996;

58 Revisão de Literatura 56 SINGH et al., 1998; SCHOELCH et al., 1999; YAO et al., 1999; OKASAKI et al., 2002; PIATELLI et al., 2002). RAVI et al., em 1996, examinaram, imuno-histoquimicamente, a expressão das proteínas Bcl-2 e p53 nas várias fases da progressão tumoral bucal em 46 pacientes com carcinoma bucal e 42 com leucoplasia com (11 casos) e sem (31 casos) displasia epitelial. Todos os pacientes tinham história prévia de mascar fumo de betel. Os 46 carcinomas foram positivos para os dois marcadores. E apenas as leucoplasias com displasia epitelial mostraram significante expressão tanto para a p53 quanto para a Bcl-2. SINGH et al., em 1998, demonstraram o importante papel exercido pela proteína Bcl-2 em estágios iniciais do desenvolvimento e progressão de neoplasias malignas bucais através de estudo no qual utilizaram lesões pré-malignas incluindo displasia epitelial leve (25 casos), displasia epitelial moderada (25 casos) e displasia epitelial severa (25 casos); e carcinoma de células escamosas (60 casos). A expressão da proteína mostrou-se diretamente relacionada à evolução das lesões. A localização das marcações apresentou-se no terço inferior do epitélio para as displasias epiteliais leves, aumentando progressivamente nas displasias moderada e severa, enquanto os carcinomas mostraram expressão mais heterogênea e difusa. As ilhas epiteliais apresentaram-se intensamente marcadas na periferia decrescendo para a parte central.

59 Revisão de Literatura 57 YAO et al., em 1999, ao estudarem a correlação das proteínas Bcl-2 e p53 em 52 carcinomas de células escamosas de língua, demostraram suas expressões em 50% e 60% dos casos, respectivamente e a associação da Bcl-2 com o grau de diferenciação tumoral e a p53 com o modo de invasão tumoral. Estatisticamente, esse estudo comprovou que a expressão das duas proteínas analisadas isoladamente ou combinadas não apresentam significante relação com a taxa de sobrevida desses pacientes. SHOELSCH et al., em 1999, ao estudarem, imuno-histoquimicamente, a expressão de proteínas associadas a apoptose (Bcl-2, Bcl-X, Bax, Bak, p53, MDM-2) em 90 espécimes de lesões pré-malignas e malignas de 25 pacientes, detectaram importante expressão para a p53, Bak e Bcl-X enquanto para a Bcl-2, Bax e MDM-2 obtiveram marcações ocasionais, sugerindo a presença de alteração na função apoptótica normal dessas lesões. Nesse estudo, os autores também concluíram que a baixa expressão da Bcl-2 poderia sugerir a ação de outras proteínas inibidoras da apoptose no desenvolvimento dos carcinomas bucais. PIATTELLI et al., em 2002, com o objetivo de investigar, imunohistoquimicamente, a expressão entre Bcl-2, p53, MIB1 e o índice de apoptose, os autores analisaram 70 espécimes, sendo 10 casos de mucosa bucal normal de gengiva de terceiros molares removidos cirurgicamente, 12 de leucoplasia, 12 de

60 Revisão de Literatura 58 displasia epitelial e 36 de carcinoma de células escamosas. Nos casos de mucosa bucal normal, todos os marcadores foram observados apenas na camada basal; para as leucoplasias e displasias epiteliais, tanto o p53 quanto o MIB1 foram observados na camada basal e parabasal e a Bcl-2, somente na basal, com marcações nas displasias epiteliais ocasionais na camada parabasal. Os carcinomas obtiveram positividade para todos os marcadores nas regiões central e periférica da área de invasão tumoral. O índice de apoptose foi progressivo com a evolução das lesões. Nesse estudo os autores encontraram significante correlação positiva entre o índice de apoptose e MIB1 e correlação inversa entre p53 e Bcl-2 e entre Bcl-2 e MIB CASPASE 3 A família das caspases caracteriza-se como a principal via de regulação da morte celular programada. Diferentes tipos de caspases são expressos na maioria das células vivas, localizados no citosol, na sua forma inativa. Acredita-se que as caspases causem a apoptose quebrando ou degradando diversos substratos celulares considerados importantes na homeostasia da célula (ZIMMERMANN & GREEN, 2001). As caspases pertencem à família de proteases cisteínas que quebram, especificamente, seus substratos na presença do ácido aspártico, por isso

61 Revisão de Literatura 59 receberam esse nome (c - proteases cisteínas; aspase - quebra do ácido aspártico). Quatorze tipos distintos de caspases já foram identificados e associados a diferentes aspectos da morte celular. Elas são sintetizadas como pró-enzimas de 30 a 50 kda que necessitam de um processo proteolítico para serem ativadas (LORO et al., 2003; ALNEMRI et al., 1996). As caspases podem ser caracterizadas em iniciadoras e efetoras. As iniciadoras, representadas pelas caspases 8 e 9, caracterizam a primeira caspase a ser ativada durante a sinalização para a execução da apoptose. A ativação proteolítica das iniciadoras, geralmente, envolve a autoclivagem e autoativação, seguida da clivagem e ativação das caspases efetoras (FISCHER, 2001). A liberação do citocromo c pela mitocôndria caracteriza uma importante via para ativação das caspases. O citocromo c liga-se ao Apaf-1, formando complexo citosólico que recruta a pró-caspase 9, clivando-a em caspase 9. Essa, então, quando liberada do complexo apresenta capacidade de clivar e ativar as caspases efetoras, como a 3 e a 7 (FISCHER, 2001). Além da via mitocondrial, a apoptose também pode ser iniciada por receptores de morte celular localizados na membrana citoplasmática, dentre eles o Fas e o fator de necrose tumoral, o TNF. A proteína Fadd liga-se a esses receptores e recruta a pró-caspase 8 para esse complexo de proteínas. A alta concentração da

62 Revisão de Literatura 60 pró-caspase produz fraca, porém considerável atividade proteolítica intrínseca resultando na ativação da caspase 8. Embora essa caspase iniciadora tenha capacidade para ativar as caspases executoras, como a pró-caspase 3, uma via alternativa amplifica esse sinal até a mitocôndria levando à liberação do citocromo c (FISCHER, 2001). A caspase-3, considerada a mais prevalente nas células, caracteriza-se como responsável pela maioria dos efeitos apoptóticos, como a quebra de muitas proteínas importantes tais como as enzimas nucleares poli (ADP-ribose) polimerase (PARP). No entanto, recebe suporte de outras, como a caspase-6 e caspase-7. Juntas, referidas como as caspases de execução ou efetoras, possuem importante função na coordenação da morte celular (ZIMMERMANN & GREEN, 2001) PROLIFERAÇÃO CELULAR A proliferação celular caracteriza-se como processo biológico de vital importância para o organismo. Pode-se defini-la como aumento do número de células que tenham completado seu ciclo celular. Sabe-se que o controle desse processo é perdido nas lesões cancerosas (TUMULURI et al., 2002). A proliferação celular anormal aparece como fator precursor na origem de tumores malignos, segundo BACCHI & GOWN, em Os dois marcadores imuno-histoquímicos mais usados para estudar a proliferação são o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e o antígeno Ki-67.

63 Revisão de Literatura PROTEÍNA Ki-67 O anticorpo monoclonal Ki-67 foi produzido por GERDES et al., em 1983, inicialmente contra a linhagem de células de Hodgkin e Reed-Sternberg. No entanto, observaram a identificação de um antígeno nuclear presente nas células em proliferação dos tecidos estudados, assim como nas células tumorais de algumas neoplasias malignas selecionadas. Em contraste, essa marcação não foi observada em células normais no estágio de latência. Concluiram, assim, que a identificação do Ki-67 se tornaria uma valiosa ferramenta para uma segura e rápida determinação do índice de proliferação das neoplasias malignas, já que o percentual de células em proliferação representa grande valor prognóstico, além de dar ao paciente a chance de receber o tratamento apropriado. Além disso, os autores ainda testaram a reatividade desse anticorpo em diversos tecidos humanos normais, dentre eles a mucosa bucal normal que mostrou expressão apenas no núcleo das células localizadas na camada basal do epitélio. O anticorpo monoclonal anti-ki-67, descrito inicialmente por GERDES et al., em 1983, era utilizado apenas em cortes histológicos congelados ou centrifugados. A pesquisa da proteína Ki-67 em tecidos fixados em formol e incluídos em parafina começou a ser realizada com a introdução do anticorpo monoclonal MIB1, que reconhece o epítopo do antígeno Ki-67 (BACCHI & GOWN, 1993).

64 Revisão de Literatura 62 A proteína Ki-67, definida como um complexo de proteínas de kda, aparece expressa em todas as fases do ciclo celular, exceto na fase G 0, onde as células apresentam-se em repouso (GERDES et al., 1983; TUMULURI et al., 2002). Sua expressão aumenta com a progressão do ciclo celular, atingindo seu maior pico nas fases G 2 e mitótica, sendo rapidamente degrada após a mitose. A meia-vida para detecção do antígeno dura 1 hora ou menos (LIU & KLEIN-SZANTO, 2000; VICENTE et al., 2002). No entanto, sua função ainda permanece desconhecida (ENDL & GERDES, 2000). A imunopositividade para o Ki-67 aparece localizada no núcleo ou em regiões perinucleares (BACCHI & GOWN, 1993). Alguns estudos sugerem que as células presentes nas áreas de invasão dos carcinomas teriam diferentes características moleculares comparadas com as das camadas mais superficiais do tumor, tornando essa área de invasividade um importante fator prognóstico (BRYNE, 1998; BANKFALVI & PIFFKO, 2000). TULUMURI et al., em 2002, ao pesquisar a proliferação celular em cortes histológicos obtidos de 47 blocos de parafina contendo fragmentos de carcinomas de células escamosas bucais, através da imunomarcação da proteína Ki-67, observaram que o índice de positividade era cinco vezes maior nas áreas de invasividade dos tumores do que nas áreas de limite cirúrgico da lesão. E que quanto mais pobre a diferenciação do tumor, maior era a quantidade de imunopositividade para a proteína Ki-67 nas áreas de invasão tumoral. SITTEL et al., em 1999, estudaram o valor prognóstico da proteína Ki-67 em dois grupos de 28 pacientes com carcinoma bucal e de orofaringe, sendo que um

65 Revisão de Literatura 63 grupo apresentava recorrência da doença e o outro não. Esses pacientes receberam tratamento cirúrgico e radiação pós-operatória. O índice de expressão da proteína foi significantemente maior naqueles tumores onde o tratamento não trouxe a cura para o paciente mostrando que o alto índice da Ki-67 pode ser um indicador de falhas no tratamento, sendo considerado como um fator prognóstico desfavorável para esses tumores. MACLUSKEY et al., em 1999, examinaram a possível associação entre a proliferação epitelial e a progressão de tumores na mucosa bucal. Para isso utilizaram como metodologia a imuno-histoquímica para o anticorpo Ki-67 em espécimes de mucosa bucal normal (12), displasia epitelial (17) e carcinoma de células escamosas (18). A quantificação do índice de proliferação foi obtida por dois métodos através de 10 campos com objetiva de 40x. No primeiro método obtiveram um percentual através do número total de núcleos epiteliais e núcleos positivos e no segundo método, com os mesmos campos, utilizaram uma grade pontilhada onde apenas os núcleos coincidentes com esses pontos eram contados, obtendo um percentual como no primeiro método. Os valores do índice de proliferação encontrados foram significantes entre os três grupos; no entanto, a correlação entre o grupo de tecido normal e o da displasia epitelial mostraram-se mais fortes do que com o do carcinoma. Com esses resultados, os autores concluíram que expressão da Ki-67 poderia ser considerada com marcador inicial na progressão de tumores na mucosa bucal.

66 Revisão de Literatura 64 LIU & KLEIN-SZANTO, em 2000, analisaram, imuno-histoquimicamente, a expressão de três marcadores de proliferação celular no epitélio bucal normal e em leucoplasias para a prevenção do câncer. A análise da positividade dos marcadores MIB1, ciclina D1 e CENP-F foi realizada pela distribuição da positividade na camada epitelial. Todos os três marcadores mostraram positividade nos tecidos normais limitada nas camadas basal e parabasal, sendo para o anticorpo MIB1 a mais alta marcação dentre os três marcadores. Já nas leucoplasias, as marcações para os três marcadores não só aumentaram nas camadas basal e parabasal, mas também na camada mais superficial do epitélio. Ao avaliar os três anticorpos, os autores concluíram que o uso do anticorpo MIB1 forneceria maiores informações quanto ao comportamento de lesões pré-malignas para a prevenção do câncer por mostrar-se expresso em quase todos os estágios do ciclo celular e assim detectar as células em divisão celular. Com o objetivo de investigar a influência da ciclina D1 e da Ki-67 no prognóstico de carcinomas, VICENTE et al., em 2002, analisaram, imunohistoquimicamente, essas proteínas em carcinomas de células escamosas intrabucal. Dos 35 pacientes, 14 morreram devido a recorrência da doença e 20 apresentaram-se livres da doença até o final do acompanhamento. A superexpressão da ciclina D1 foi correlacionada positivamente com a metástase em linfonodo e o tumor primário. Enquanto a Ki-67, com um valor médio de marcação de 34,1%, não obteve associação com o acompanhamento clínico dos pacientes. Apenas a ciclina D1 foi considerada como possível marcador de fator prognóstico.

67 3 OBJETIVOS

68 Objetivos 66 3 OBJETIVOS 3 1 OBJETIVO GERAL Avaliar a imunomarcação de proteínas inibidoras e promotoras da apoptose e da proliferação celular em hiperplasias fibrosas inflamatórias, queilites actínicas e em carcinomas de células escamosas localizados no lábio inferior. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Identificar os fatores de risco dos grupos de queilite actínica e carcinoma de células escamosas de lábio inferior com dados obtidos nos prontuários dos pacientes selecionados;

69 Objetivos Avaliar a imunomarcação dos anticorpos anti-p53, p53 mutado e Bcl-2 em hiperplasias fibrosas inflamatórias, queilites actínicas e carcinomas de células escamosas no lábio inferior; 3. Detectar o índice de proliferação celular através da imunomarcação com o anticorpo anti-ki-67 em hiperplasias fibrosas inflamatórias, queilites actínicas e carcinomas de células escamosas do lábio inferior; 4. Identificar, imuno-histoquimicamente, células apoptóticas através da expressão do anticorpo anti-caspase-3 em hiperplasias fibrosas inflamatórias, queilites actínicas e carcinomas de células escamosas do lábio inferior; 5. Comparar a imunomarcação dos anticorpos anti-p53, p53 mutado, Bcl-2, caspase-3 e Ki-67 entre hiperplasias fibrosas inflamatórias, queilites actínicas e carcinomas de células escamosas do lábio inferior; 6. Comparar a imunomarcação dos anticorpos anti-p53, p53 mutado, Bcl-2, caspase-3 e Ki-67 nos casos de queilite actínica com e sem displasia epitelial; 7. Comparar a imunomarcação dos anticorpos anti-p53 e p53 mutado nos grupos dos carcinomas, das queilites actínicas e das hiperplasias. 8. Validar os marcadores p53, p53 mutado, Bcl-2, Ki-67 e caspase-3 como fatores prognósticos nas queilites actínicas e nos carcinomas de células escamosas no lábio inferior.

70 4 MATERIAL E MÉTODOS

71 Material e Métodos 69 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 SELEÇÃO DA AMOSTRA A amostra foi obtida no arquivo do Serviço de Anatomia Patológica do HUAP, do Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Central do Exército (HCE) e do laboratório particular O Aleph, sendo composta por 20 blocos de parafina contendo fragmentos de cada uma das seguintes lesões: hiperplasia fibrosa inflamatória da mucosa do lábio inferior, queilite actínica e carcinoma de células escamosas do lábio inferior. De cada amostra foram resgatados do prontuário ou da ficha de requisição de exame histopatológico os seguintes dados do paciente: sexo, idade, raça, profissão e tabagismo. Estes dados foram inseridos em um quadro de identificação de cada amostra para futura correlação com os resultados histopatológicos e imunohistoquímicos para análise de risco.

72 Material e Métodos 70 Os critérios avaliados para inclusão dos blocos neste trabalho foram: - Inclusão adequada da peça cirúrgica; - Quantidade de material presente no bloco de parafina; - Biópsia exibindo histopatologia característica; - Boa qualidade e preservação do material. O grupo representativo das hiperplasias fibrosas inflamatórias foi utilizado como grupo controle negativo por se tratarem de lesões proliferativas não neoplásicas e os carcinomas de células escamosas no lábio como controle positivo.

73 Material e Métodos METODOLOGIA Todo trabalho foi realizado na histotécnica e no laboratório de Imunohistoquímica e Hibridação do Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP) - Departamento de Patologia - Universidade Federal Fluminense (UFF). A partir da seleção dos blocos de parafina, foram obtidos 10 cortes histológicos de cada bloco, com 4µm de espessura os quais foram distribuídos da seguinte forma: o primeiro foi testado imuno-histoquimicamente para o anticorpo anti-ki-67, o segundo para o anticorpo anti-caspase-3, o terceiro foi corado com hematoxilina e eosina, o quarto para o anticorpo anti-p53, o quinto para o anticorpo anti-p53 mutado e o sexto para o anticorpo anti-bcl-2. Os demais cortes ficaram como reserva. Os cortes processados para a imuno-histoquímica foram colocados em lâminas de vidro, previamente limpas, desengorduradas e tratadas com o adesivo poly-d-lisine, processado segundo instruções do fabricante. Optou-se pela técnica de cortes seriados para que não houvesse uma distância muito grande entre as áreas a serem analisadas em cada lâmina. Com isso a área analisada nos cortes histológicos da lâmina 1 seria aproximadamente igual à área analisada nos cortes histológicos das lâminas seguintes.

74 Material e Métodos TÉCNICA DE IMUNO-HISTOQUÍMICA Todos os casos foram submetidos à técnica da imuno-histoquímica para a investigação da presença das proteínas Ki-67, caspase-3, p53, p53 mutado e Bcl-2, utilizando o protocolo do laboratório de Imuno-histoquímica e Hibridação do Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Universitário Antônio Pedro. Antes da realização das reações com os cortes histológicos do presente trabalho, foram efetuados testes com todos os marcadores em lesões semelhantes às estudadas para definição da melhor recuperação antigênica, necessidade do uso de inibidor de ligações inespecíficas, diluição do anticorpo primário, melhor anticorpo secundário e tempo de revelação para o DAB. Os anticorpos utilizados neste trabalho com suas especificações seguem abaixo, na TABELA 1: TABELA 1: Anticorpos utilizados no trabalho e suas especificações. Anticorpo Clone Código de catálogo Fornecedor Anti-Ki-67 MIB-1 M7240 DAKOCytomation USA Anti-Caspase-3 3CSPO3 MS-1123-P Neomarkers USA Anti- p53 DO-7 M7001 DAKOCytomation USA Anti-p53 mutado PAb-240 M3566 DAKOCytomation USA Anti-Bcl M0887 DAKOCytomation USA A desparafinização iniciou-se colocando as lâminas em estufa a 60ºC por aproximadamente 10 minutos, em seguida mantidas na estufa mergulhadas em xilol,

75 Material e Métodos 73 por mais 10 minutos. Após essa etapa, as lâminas foram colocadas em quatro banhos de xilol em temperatura ambiente por 20 minutos divididos em quatro banhos de cinco minutos cada. Posteriormente, os cortes foram hidratados em álcool absoluto com dois banhos de cinco minutos, álcool 90% com dois banhos de cinco minutos e um banho de dois minutos em água destilada. As lâminas foram mergulhadas em solução de peróxido de hidrogênio (30%) e água destilada (70%) com agitação magnética por 30 minutos para bloqueio da peroxidase endógena. Seguindo-se, então, a lavagem em água destilada. Para a recuperação antigênica utilizou-se o tampão citrato (3,84g de ácido cítrico, 48ml de hidróxido de sódio 1M, completando para 2000ml de água destilada, ph 6,0) para os anticorpos Ki-67, p53 e caspase-3 e solução comercial de ph alto (Target retrieval solution 10x concentrate, high ph; código S3307; DAKOCytomation Carpinteria USA) para os anticorpos Bcl-2 e p53 mutado. As soluções foram aquecidas durante 20 minutos a 96ºC em banho-maria e atingindo a temperatura desejada, as lâminas foram imersas no líquido, permanecendo por 30 minutos. Após essa etapa, o conjunto foi colocado em temperatura ambiente por 20 minutos para resfriamento. Com o objetivo de inibir ligações inespecíficas para o anticorpo p53, as lâminas foram tratadas com leite e incubadas em câmara úmida na estufa à 37ºC por 30 minutos. A solução de leite foi preparada no dia, utilizando-se 30ml de TRIS

76 Material e Métodos 74 cloreto de sódio + 0,30g de albumina bovina. Homogeneizou-se esta solução e adicionou-se 0,30g de Leite desnatado em pó Nestlé. Em seguida esta solução foi filtrada em filtro de milipore. Essa etapa foi realizada apenas para esse anticorpo devido à dificuldade de padronização ideal. Diversos testes foram realizados para inibir as ligações inespecíficas sem a utilização do leite, porém sem atingir o resultado final esperado. Os anticorpos primários utilizados foram diluídos em solução comercial para inibir ligações inespecíficas (Antibody diluent, with background reducing components, código: S3022, DAKOCytomation Carpinteria USA) nas seguintes concentrações (TAB. 2): TABELA 2: Diluições dos anticorpos utilizados no trabalho. Anticorpo Diluição Anti-Ki-67 1:100 Anti-caspase-3 1:200 Anti-p53 1:200 Anti-p53 mutado 1:300 Anti-Bcl-2 1:200 As lâminas foram incubadas no anticorpo primário em câmara úmida a 4º C por aproximadamente 16 horas. No dia seguinte, as lâminas foram imersas em tampão de lavagem TBS (800ml de ácido clorídrico 1N, 116g de cloreto de sódio, 122g de TRIS, 10ml de

77 Material e Métodos 75 tween 20, completar para 20l de água destilada) em dois banhos de cinco minutos cada e em seguida foi adicionado o anticorpo secundário (LSAB + System, HRP, código K0690, DAKOCytomation Carpinteria USA). As lâminas receberam, inicialmente, o anticorpo secundário de porco anti-camundongo, cabra e coelho (LINK) por 30 minutos e depois a Streptavidina ligada a peroxidases por mais 30 minutos na câmara umidificada em temperatura ambiente. Após cada etapa realizaram-se dois banhos de cinco minutos cada com tampão de lavagem TBS. A revelação das lâminas realizou-se com o substrato cromógeno diaminobenzidina (Liquid DAB + substrate, Chromogen System, código: K3468, DAKOCytomation Carpinteria USA), preparado conforme intruções do fabricante e com tempos estabelecidos previamente para cada anticorpo, como descrito na TABELA 3. TABELA 3: Tempo de revelação com DAB para cada anticorpo utilizado no trabalho. Anticorpo Tempo de revelação Anti-Ki Anti-caspase Anti-p53 1 Anti-p53 mutado 1 Anti-Bcl Após lavagens em água destilada para retirada do excesso de cromógeno, os cortes foram contra-corados com hematoxilina de Harris por 30 segundos e em

78 Material e Métodos 76 seguida lavados em cinco banhos de água destilada, sendo que o terceiro continha três gotas de hidróxido de amônia para azular a hematoxilina. Finalmente seguiu-se a desidratação dos cortes em dois banhos de álcool a 90% (um minuto cada); dois banhos de álcool absoluto (um minuto cada) seguido por quatro banhos de xilol (um minuto cada). As lâminas foram montadas com Entellan (código: , MERCK - Alemanha) para fixação das lamínulas e posterior observação ao microscópio óptico. Como controle positivo para os anticorpos p53 e Bcl-2 foi utilizada biópsia de carcinoma de mama, para o p53 mutado, carcinoma de células escamosas intra bucal, para o Ki-67, fragmento de pele normal e para caspase-3, linfonodo compatível com a normalidade.

79 Material e Métodos ANÁLISE DOS RESULTADOS ANÁLISE DESCRITIVA EM HE Todas as lâminas coradas em HE foram avaliadas ao microscópio óptico Labophot-2 Nikon quanto aos critérios morfológicos característicos de cada lesão descritos a seguir. Para o grupo das hiperplasias fibrosas inflamatórias, foram observados na mucosa: presença, tipo e grau de ceratose, grau de hiperplasia epitelial, presença de hiperplasia da camada basal, e na submucosa: presença, tipo e localização de infiltrado inflamatório, grau de celularidade e grau de colagenização do tecido conjuntivo. No grupo das queilites actínicas foram analisados na mucosa: presença, tipo e grau de ceratose, grau de hiperplasia epitelial, tipo de crescimento epitelial e grau de displasia epitelial e na submucosa: presença da elastose solar e presença, tipo e localização de infiltrado inflamatório. O grau de displasia epitelial foi avaliado somente quanto a sua presença ou ausência. A presença de displasia epitelial foi caracterizada pelas seguintes alterações do epitélio: hiperplasia e perda da polaridade das células da camada basal, aumento da proporção núcleo-citoplasma, perda da estratificação epitelial e aderência intercelular, aumento do número de mitoses, presença de figuras de mitoses atípicas e localizadas nas camadas mais

80 Material e Métodos 78 superficiais do epitélio, pleomorfismo celular, hipercromatismo e aumento do tamanho do núcleo (PINDBORG et al, 1997). Os critérios investigados para o grupo de carcinomas de células escamosas foram, na mucosa: presença, tipo e grau de ceratose, grau de invasividade epitelial e grau de diferenciação celular e na submucosa: existência de elastose solar e presença, tipo e localização de infiltrado inflamatório. O grau de diferenciação celular foi classificado em bem diferenciado, moderadamente diferenciado e pouco diferenciado, de acordo com classificação proposta por Broders e recomendada pela Organização Mundial de Saúde (PINDBORG et al., 1997).

81 Material e Métodos ANÁLISE DESCRITIVA NA IMUNO-HISTOQUÍMICA A avaliação imuno-histoquímica dos anticorpos anti-ki-67, p53, p53 mutado, Bcl-2 e caspase-3 nos espécimes de carcinoma de células escamosas, queilite actínica e hiperplasia fibrosa inflamatória foi realizada individualmente quanto à expressão, localização e distribuição das células com imunomarcação positiva. A avaliação da expressão dos anticorpos anti-ki-67, p53 e p53 mutado foi determinada pela forte coloração acastanhada dos núcleos e para os anticorpos anti-bcl-2 e caspase-3, uma forte marcação acastanhada por todo o citoplasma da célula. Através do microscópio óptico Labophot-2 Nikon, todas as lâminas foram analisadas nas objetivas de 10x e 40x, com maior concentração na área do epitélio, sendo no grupo dos carcinomas a ênfase nas áreas de invasão tumoral. As marcações imuno-histoquímicas foram caracterizadas como ausentes ou presentes; quando presentes, se localizadas na camada basal, nas camadas basal e parabasal ou na região suprabasal (correspondendo à positividade nas outras camadas epiteliais). A expressão dos anticorpos foi ainda classificada como focal, quando a marcação apresentava-se em alguns pontos do epitélio, e difusa, quando aproximadamente toda a extensão do epitélio mostrava-se marcada. Na análise dos resultados, as marcações localizadas na região suprabasal foram destacadas devido à importância da identificação de positividade nessa área. A marcação nesta área

82 Material e Métodos 80 não é esperada normalmente e quando localizada, cogita-se a idéia da presença de alterações genéticas nas células (CRUZ et al., 1998) ANÁLISE QUANTITATIVA NA IMUNO-HISTOQUÍMICA Três campos microscópicos com objetiva de 10x foram capturados de cada espécime, para cada anticorpo analisado a partir de uma câmera CCD-IRIS modelo DXC-107A, marca SONY, acoplada ao microscópio óptico Labophot-2 NIKON e conectada ao microcomputador PENTIUM II, 192 MB RAM com placa de vídeo All- In-Wonder PRO-PCI. As imagens digitalizadas foram transferidas para o programa Image Pro Plus 4.5 para análise das áreas positivas. Para cada anticorpo a ser analisado foi realizada padronização de cores, utilizando-se um caso representativo marcado positivamente para Ki-67, p53 e p53 mutado com fortes marcações de coloração acastanhada no núcleo e para Bcl-2 e caspase-3, com fortes marcações de coloração acastanhada por todo o citoplasma (FIG. 1 e 2). Com as imagens digitalizadas delimitou-se, inicialmente, a área em µm 2 correspondente ao epitélio de cada campo capturado. Neste momento, através de uma tecla de atalho identificada para cada marcador, o programa realizava a contagem da área correspondente às marcações positivas dentro da delimitação efetuada (FIG. 3). Logo após, realizava-se a contagem total da área delimitada correspondente ao epitélio (FIG. 4).

83 Material e Métodos 81 De cada caso foi obtido o percentual médio de área positiva correspondente aos marcadores. Esse valor foi encontrado através da proporcionalidade entre os três campos de área total do epitélio e os três campos de área total de positividade, fornecidos pelo programa Image Pro Plus 4.5.

84 Material e Métodos 82

85 Material e Métodos 83

86 Material e Métodos 84

87 Material e Métodos ANÁLISE ESTATÍSTICA Os dados dos estudos histopatológicos realizados no presente trabalho foram analisados utilizando-se o nível de significância de 0,05% e os seguintes testes: Teste t para amostras independentes foi utilizado para comparar a diferença entre as médias percentuais de área positiva dos diferentes marcadores nos casos de queilite com e sem displasia epitelial e para analisar a diferença da média percentual de área positiva entre p53 e p53 mutado em cada grupo analisado. O ANOVA foi utilizado para comparar percentual médio de área positiva de cada marcador nos três diferentes grupos. O teste Qui-quadrado foi utilizado para avaliar a diferença percentual dos marcadores expressos na região suprabasal com distribuição difusa e focal em todos os grupos estudados.

88 5 RESULTADOS

89 Resultados 87 5 RESULTADOS 5.1 FATORES DE RISCO Os fatores de risco analisados foram o sexo, a idade, a raça, a profissão e o tabagismo. No entanto, os dois últimos não puderam ser incluídos nos resultados por apresentarem-se, predominantemente, ausentes nas fichas de requisição de exame histopatológico e prontuários dos pacientes, inviabilizando, assim, a análise estatística desses dados. A tabela descritiva com o resultado geral dos fatores de risco pode ser conferida nos ANEXOS 19 ao CARCINOMAS DE CÉLULAS ESCAMOSAS NO LÁBIO No grupo dos carcinomas, a ocorrência mais comum foi no sexo masculino, representando 84, 21% dos casos (TAB. 4). A faixa etária variou de 23 a 88 anos,

90 Resultados 88 sendo a média de idade 54,1 anos (GRAF. 1). A raça predominante foi a branca, sendo representada por 86,6% dos casos (TAB. 5). TABELA 4: Percentual entre os sexos no grupo dos carcinomas. Sexo N o de casos Percentual Feminino 3 15,79% Masculino 16 84,21% Total 19* 100% *Em um dos 20 casos analisados o sexo não estava identificado. 7 IDADE Frequência Std. Dev = Mean = 54.1 N = IDADE GRÁFICO 1: Distribuição de frequência de casos de carcinomas em relação à idade.

91 Resultados 89 TABELA 5: Percentual das raças no grupo dos carcinomas. Raça N o de casos Percentual Branca 13 86,6% Parda 2 13,4% Preta - - Total 15* 100% *Em cinco dos 20 casos analisados a raça não estava identificada QUEILITES ACTÍNICAS No grupo das queilites actínicas, a diferença entre os sexos mostrou-se pouco relevante (TAB. 6). A faixa etária variou de 25 a 71 anos, sendo a média de idade 49,7 anos (GRAF. 2). A raça predominante foi a branca, sendo representada por 80% dos casos (TAB. 7). TABELA 6: Percentual entre os sexos no grupo das queilites actínicas. Sexo N o de casos Percentual Feminino 9 52,9% Masculino 8 47,1% Total 17* 100% *Em três dos 20 casos analisados o sexo não estava identificado.

92 Resultados Frequência Std. Dev = Mean = 49.7 N = IDADE GRÁFICO 2: Distribuição de frequência de casos de queilites em relação à idade. TABELA 7: Percentual das raças no grupo das queilites actínicas. Raça N o de casos Percentual Branca 8 80% Parda 2 20% Preta - - Total 10* 100% *Em 10 dos 20 casos analisados a raça não estava identificada.

93 Resultados HIPERPLASIAS FIBROSAS INFLAMATÓRIAS No grupo das hiperplasias fibrosas inflamatórias, houve predomínio do sexo feminino, representado por 66,6% dos casos (TAB. 8). A faixa etária variou de 23 a 70 anos, sendo a média de idade 50,9 anos (GRAF. 3). Assim como nos outros grupos, a raça predominante foi a branca, sendo representada por 66,6% dos casos (TAB. 9). TABELA 8: Percentual entre os sexos no grupo das hiperplasias. Sexo N o de casos Percentual Feminino 12 66,6% Masculino 6 33,4% Total 18* 100% *Em dois dos 20 casos analisados o sexo não estava identificado.

94 Resultados Frequência Std. Dev = Mean = 50.9 N = IDADE GRÁFICO 3: Distribuição de frequência de casos de hiperplasias em relação à idade. TABELA 9: Percentual das raças no grupo das hiperplasias. Raça N o de casos Percentual Branca 10 66,6% Parda % Preta 1 6,8% Total 15* 100% *Em cinco dos 20 casos analisados a raça não estava identificada.

95 Resultados ANÁLISE COMPARATIVA DOS FATORES DE RISCO O GRÁFICO 4 mostra que não ocorreram diferenças entre as médias de idade para o sexo masculino, enquanto para o sexo feminino os casos de carcinoma atingiram pacientes com idade média mais elevada Idade média 50 Grupos carcinoma queilite 40 feminino masculino hiperplasia Sexo GRÁFICO 4: Valor da idade média nos diferentes grupos estudados em relação ao sexo.

96 Resultados 94 O GRÁFICO 5 mostra que a frequência de casos no sexo masculino foi maior para o grupo dos carcinomas, enquanto para o sexo feminino a maior frequência ocorreu no grupo das hiperplasias. No grupo das queilites, a ocorrência maior foi no sexo feminino. 20 Freqüência 10 Grupos carcinoma queilite 0 Ausentes Feminino Masculino hiperplasia Sexo GRÁFICO 5: Frequência de casos segundo o sexo para os três grupos estudados (n=60).

97 Resultados 95 O GRÁFICO 6 mostra que a raça branca foi a mais acometida nos três grupos estudados. No entanto em muitos casos este dado não pôde ser identificado, como no grupo das queilites, onde na metade dos casos a raça não estava referida Número de casos Grupos 2 carcinoma queilite 0 Ausentes Branca Parda Negra hiperplasia Raça GRÁFICO 6: Número de casos em relação à raça nos diferentes grupos estudados (n=60).

98 Resultados ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA A análise morfológica detalhada de toda a amostra está contida nos ANEXOS 1 ao 3. Neste item foram avaliados apenas o grau de diferenciação nos carcinomas e a presença ou ausência de displasia epitelial nas queilites actínicas CARCINOMAS DE CÉLULAS ESCAMOSAS NO LÁBIO Dos 20 casos estudados, 75% foi classificado como moderadamente diferenciado, enquanto o restante, 25%, foi classificado como bem diferenciado (TAB. 10). TABELA 10: Resultado referente ao grau de diferenciação dos carcinomas. Diferenciação N o de Casos Percentual BD* 5 25% MD* 15 75% PD* - - Total % *BD = bem diferenciado; MD = moderadamente diferenciado; PD = pouco diferenciado.

99 Resultados 97 FIGURA 5: Carcinoma de células escamosas bem diferenciado - Caso B (HE A, objetiva 10x; B, objetiva 40x)

100 Resultados 98 FIGURA 6: Carcinoma de células escamosas moderadamente diferenciado Caso B (HE A, objetiva 10x; B, objetiva 40x)

101 Resultados QUEILITES ACTÍNICAS No grupo das queilites actínicas, apenas 20% dos 20 casos estudados apresentaram displasia epitelial (TAB. 11). TABELA 11: Resultado referente à presença de displasia epitelial nas queilites actínicas. Displasia N o de Casos Percentual Presente 4 20% Ausente 16 80% Total %

102 Resultados 100 FIGURA 7: Queilite actínica com displasia epitelial Caso B (HE A, objetiva 10x; B, objetiva 40x).

103 Resultados 101 FIGURA 8: Queilite actínica sem displasia epitelial Caso (HE A, objetiva 10x; B, objetiva 40x).

104 Resultados ANÁLISE DO ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO As lâminas testadas para o anticorpo anti-caspase-3 apresentaram um forte background, o que impossibilitou uma análise segura das marcações positivas. Adequações à reação foram realizadas, porém sem apresentar resultados satisfatórios. Assim, optou-se por não incluir este marcador na análise dos resultados. O GRÁFICO 7 mostra um panorama geral do percentual médio de área positiva de cada marcador nos três grupos analisados. Esse valor foi encontrado através da proporcionalidade entre os três campos de área total do epitélio e os três campos de área total de positividade, fornecidos pelo programa Image Pro Plus 4.5. O resultado dessa proporção pode ser conferido nas tabelas dos ANEXOS 7 ao 18, na coluna entitulada com o nome do marcador+final. Os marcadores p53 e p53m mostraram um crescente valor numérico de acordo com a progressão das lesões, onde o grupo das hiperplasias obteve o índice mais baixo e os carcinomas, o mais alto. Os marcadores Ki-67 e Bcl-2 não obedeceram a essa ordem, mostrando-se mais elevados no grupo das queilites.

105 Resultados Percentual médio de área posit iva p53 p53m Ki67 0 Carcinoma Queilite Hiperplasia Bcl-2 Grupos GRÁFICO 7: Percentual médio de área positiva de cada marcador para os três grupos estudados (n=60).

106 Resultados CARCINOMAS A análise imuno-histoquímica descritiva e quantitativa dos carcinomas pode ser conferida nos ANEXOS 6, 15 ao 18. No grupo dos carcinomas, o percentual médio de áreas positivas dos marcadores nos locais de invasão tumoral mostrou-se mais elevado nos casos classificados como moderadamente diferenciados, exceto o marcador Ki-67, que mostrou-se ligeiramente mais expresso nos casos bem diferenciados (GRAF. 8). 5 Percentual médio de área positiva Marcadores p53 p53m ki67 0 bem moderado bcl-2 Grau de diferenciação GRÁFICO 8: Percentual médio de áreas positivas dos marcadores estudados em relação ao grau de diferenciação dos carcinomas (n=20).

107 Resultados p53 (DO-7) A expressão do marcador p53 no grupo dos carcinomas mostrou-se, em 80% dos 20 casos estudados, localizada na região suprabasal (TAB. 12), sendo que desses, 81,25% apresentaram marcação difusa por toda a área de invasão tumoral (TAB. 13). Em apenas um caso não houve marcação para o p53 e em nenhum dos casos de carcinoma foi observada marcação apenas na camada basal. TABELA 12: Localização das marcações positivas para p53 nos carcinomas. Localização p53 N o de Casos Percentual Ausente 1 5% Basal - - Basal e parabasal 3 15% Suprabasal 16 80% Total % TABELA 13: Distribuição da positividade na suprabasal das marcações positivas para p53 nos carcinomas. Distribuição p53 Suprabasal N o de Casos Percentual Focal 3 18,75% Difuso 13 81,25% Total %

108 Resultados 106 O GRÁFICO 9 mostra a distribuição e a localização do p53 em relação ao percentual médio de área positiva para esse marcador. Nota-se a presença de maior expressão do marcador na região suprabasal, com distribuição difusa. 6 Percentual médio de área positiva - p p53 - Distribuição ausente focal 0 ausente basal e parabasal suprabasal difuso p53 - Localização GRÁFICO 9: Distribuição e localização do marcador p53 nos carcinomas em relação ao percentual médio de área positiva (n=20).

109 Resultados 107 FIGURA 9: Carcinoma com marcação para p53 na região suprabasal e distribuição difusa Caso B (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x).

110 Resultados p53 MUTADO (PAb-240) Em 12 (60%) dos 20 casos estudados, a localização da expressão do p53 mutado mostrou-se na região suprabasal (TAB. 14), sendo que em sete (58,3%) a distribuição da marcação apresentou-se focal (TAB. 15). Em cinco casos (25%) não se observou imunomarcação para esse marcador, sendo que um desses casos também se apresentou negativo para o p53. TABELA 14: Localização das marcações positivas para p53 mutado nos carcinomas. Localização p53 mutado No de Casos Percentual Ausente 5 25% Basal - - Basal e parabasal 3 15% Suprabasal 12 60% Total % TABELA 15: Distribuição da positividade na suprabasal para p53 mutado nos carcinomas. Distribuição p53 mutado Suprabasal N o de Casos Percentual Focal 7 58,3% Difuso 5 41,7% Total %

111 Resultados 109 O GRÁFICO 10, relacionado com o percentual médio de área positiva e localização e distribuição do p53 mutado, demonstra que no resultado da proporcionalidade entre os três campos do epitélio e da área de positividade houve maior expressão do marcador nas camadas basal e parabasal, com distribuição difusa. 6 Percentual médio de área positiva - p53m p53m - Distribuição ausente focal 0 ausente basal e parabasal suprabasal difuso p53m - Localização GRÁFICO 10: Distribuição e localização do marcador p53 mutado nos carcinomas em relação ao percentual médio de área positiva (n=20).

112 Resultados 110 FIGURA 10: Carcinoma com marcação para p53 mutado na região suprabasal, com distribuição focal Caso B (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x).

113 Resultados Ki-67 A marcação do Ki-67 mostrou-se expressa em 14 (70%) dos 20 casos, localizada na região suprabasal do epitélio (TAB. 16) sendo cinco casos (42,8%) e seis casos (57,2%) com distribuição focal e difusa, respectivamente (TAB. 17). TABELA 16: Localização das marcações positivas para Ki-67 nos carcinomas. Localização Ki-67 N o de Casos Percentual Ausente 1 5% Basal 1 5% Basal e parabasal 4 20% Suprabasal 14 70% Total % TABELA 17: Distribuição da positividade na suprabasal para Ki-67 nos carcinomas. Distribuição Ki-67 Suprabasal N o de Casos Percentual Focal 6 42,8% Difuso 8 57,2% Total %

114 Resultados 112 O GRÁFICO 11 revela que, numericamente, os casos que obtiveram maior expressão foram aqueles com localização nas camadas basal e parabasal com distribuição difusa. 3.0 Percentual médio de área positiva - Ki ausente basal basal e parabasal suprabasal Ki67 - Distribuição ausente focal difuso Ki67 - Localização GRÁFICO 11: Distribuição e localização do marcador Ki-67 nos carcinomas em relação ao percentual médio de área positiva (n=20).

115 Resultados 113 FIGURA 11: Carcinoma com marcação para Ki-67 na região suprabasal, com distribuição difusa Caso B (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x).

116 Resultados Bcl-2 A expressão do marcador Bcl-2 mostrou-se em 18 (90%) dos 20 casos analisados localizada na região suprabasal (TAB. 18). Apenas dois casos (10%) não obtiveram nenhuma marcação para Bcl-2. Dos casos positivos, 10 (55,5%) obtiveram uma distribuição difusa pelo epitélio (TAB. 19). TABELA 18: Localização das marcações positivas para Bcl-2 nos carcinomas. Localização Bcl-2 N o de Casos Percentual Ausente 2 10% Basal - - Basal e parabasal - - Suprabasal 18 90% Total % TABELA 19: Distribuição da positividade na suprabasal para Bcl-2 nos carcinomas. Distribuição Bcl-2 Suprabasal N o de Casos Percentual Focal 8 44,5% Difuso 10 55,5% Total %

117 Resultados 115 O GRÁFICO 12 mostra o valor numérico da distribuição do marcador Bcl-2 mais elevado na distribuição difusa, em relação à localização suprabasal..07 Percentual médio de área positiva - Bcl Bcl-2 - Distribuição ausente focal 0.00 ausente suprabasal difuso Bcl-2 - Localização GRÁFICO 12: Distribuição e localização do marcador Bcl-2 nos carcinomas em relação ao percentual médio de área positiva (n=20).

118 Resultados 116 FIGURA 12: Carcinoma com marcação para Bcl-2 na região suprabasal, com distribuição difusa Caso B (A, objetiva 40x; B, objetiva 40x).

119 Resultados QUEILITES ACTÍNICAS A análise imuno-histoquímica descritiva e quantitativa das queilites actínicas pode ser visualizada nos ANEXOS 5, 11 ao 14. Com relação ao grupo das queilites actínicas, o percentual médio das áreas positivas dos marcadores mostrou-se mais elevado nos casos onde havia não displasia epitelial. Assim como no grupo dos carcinomas, o marcador Ki-67 mostrou-se contrário aos outros marcadores, estando mais expresso nos casos com displasia epitelial (GRAF. 13). 4 Percentual médio de área positiva Marcadores p53 p53 mutado ki67 0 ausente presente bcl-2 Displasia GRÁFICO 13: Percentual médio de áreas positivas dos marcadores estudados em relação à presença ou ausência de displasia epitelial nas queilites (n=20).

120 Resultados p53 (DO-7) Em todos (100%) os casos de queilite actínica estudados foi possível identificar positividade para o marcador p53. Nos casos com displasia epitelial, 100% dos casos apresentou expressão na região suprabasal assim como 93,75% dos casos sem displasia epitelial (TAB. 20). Tanto as queilites com displasia epitelial (75%) quanto sem displasia epitelial (60%) mostraram distribuição difusa do marcador na maioria dos casos (TAB. 21) TABELA 20: Localização das marcações positivas para p53 nos casos de queilite com e sem displasia epitelial. Localização p53 Casos com Casos sem Percentual displasia displasia Percentual Ausente Basal Basal e parabasal ,25% Suprabasal 4 100% 15 93,75% Total 4 100% % TABELA 21: Distribuição da positividade na suprabasal para p53 nos casos de queilite com e sem displasia epitelial. Distribuição p53 Casos com Casos sem Percentual Suprabasal displasia displasia Percentual Focal 1 25% 6 40% Difuso 3 75% 9 60% Total 4 100% %

121 Resultados 119 O GRÁFICO 14 mostra a relação da localização do p53 em relação ao percentual médio de áreas positivas nos casos de queilite actínica em que a displasia epitelial estava presente ou ausente. Nos casos com e sem displasia epitelial observou-se maior índice numérico na região suprabasal. A relação do percentual médio de áreas positivas com a distribuição do marcador mostrou-se mais elevada nos casos sem displasia epitelial com distribuição difusa (GRAF. 15). 5 Percentual médio de área positiva - p p53 - Localização basal e parabasal 0 ausente presente suprabasal Displasia GRÁFICO 14: Localização do marcador p53 em relação ao percentual médio de área positiva nos casos de queilite actínica com e sem displasia epitelial (n=20).

122 Resultados Percentual médio de área positiva - p p53 - Distribuição focal 1 ausente presente difuso Displasia GRÁFICO 15: Distribuição do marcador p53 em relação ao percentualmédio de área positiva nos casos de queilite actínica com e sem displasia epitelial (n=20).

123 Resultados 121 FIGURA 13: Queilite actínica com displasia epitelial com marcação para p53 na região suprabasal e distribuição difusa Caso B (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x).

124 Resultados 122 FIGURA 14: Queilite actínica sem displasia epitelial com marcação para p53 na região suprabasal, com distribuição difusa Caso M (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x).

125 Resultados p53 MUTADO (PAb-240) Todos os casos apresentaram marcação para o p53 mutado. A metade dos casos com displasia epitelial (50%) apresentaram marcação na região suprabasal com distribuição focal, enquanto a maioria dos casos sem displasia epitelial (93,75%) apresentou expressão na região suprabasal, sendo desses, 80% com distribuição focal (TAB. 22 e 23). TABELA 22: Localização das marcações positivas para p53 mutado nos casos de queilite com e sem displasia epitelial. Localização p53 Casos com Casos sem Percentual mutado displasia displasia Percentual Ausente Basal Basal e parabasal 2 50% 1 6,25% Suprabasal 2 50% 15 93,75% Total 4 100% % TABELA 23: Distribuição das marcações positivas para p53 mutado nos casos de queilite com e sem displasia. Distribuição Casos com Casos sem p53 mutado Percentual displasia displasia Suprabasal Percentual Focal 2 100% 12 80% Difuso % Total 2 100% %

126 Resultados 124 Numericamente, como demonstrado no GRÁFICO 16, os casos sem displasia epitelial obtiveram resultado final, dentro do percentual médio de área total, mais expressivo na região suprabasal do que os casos com displasia epitelial. O percentual médio de área positiva para a distribuição difusa mostrou-se mais elevado nos casos sem displasia epitelial (GRAF. 17)..5 Percentual médio de área positiva - p53m p53m - Localização basal e parabasal 0.0 ausente presente suprabasal Displasia GRÁFICO 16: Localização do marcador p53 mutado em relação ao percentual médio de área positiva nos casos com e sem displasia epitelial (n=20).

127 Resultados Percentual médio de área positiva - p53m p53m - Distribuição focal 0 ausente presente difuso Displasia GRÁFICO 17: Distribuição do marcador p53 mutado em relação ao percentual médio de área positiva nos casos de queilite actínica com e sem displasia epitelial (n=20).

128 Resultados 126 FIGURA 15: Queilite actínica com displasia epitelial com marcação para p53 mutado na região suprabasal, com distribuição focal Caso (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x).

129 Resultados 127 FIGURA 16: Queilite actínica sem displasia epitelial com marcação para p53 mutado na região suprabasal, com distribuição focal Caso B (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x).

130 Resultados Ki-67 A maioria dos casos apresentou marcação na região suprabasal, sendo 100% para os casos com displasia epitelial e 93,75% para os sem displasia epitelial (TAB. 24). A maioria dos casos sem displasia epitelial (80%) e a metade dos com displasia epitelial apresentaram distribuição difusa para o Ki-67 (TAB. 25). TABELA 24: Localização das marcações positivas para Ki-67 nos casos de queilite com e sem displasia epitelial. Localização Ki-67 Casos com Casos sem Percentual displasia displasia Percentual Ausente Basal Basal e parabasal ,25% Suprabasal 4 100% 15 93,75% Total 4 100% % TABELA 25: Distribuição da positividade para Ki-67 nos casos de queilites com e sem displasia. Distribuição Ki-67 Casos com Casos sem Percentual Suprabasal displasia displasia Percentual Focal 2 50% 3 20% Difuso 2 50% 12 80% Total 4 100% %

131 Resultados 129 O GRÁFICO 18 mostra um maior valor numérico do percentual médio de área positiva na região suprabasal nos casos com displasia epitelial. Com relação à distribuição do marcador, os casos com displasia epitelial mostraram um maior valor do percentual médio de área positiva para a distribuição difusa (GRAF. 19). 1.1 Percentual médio de área positiva - Ki Ki67 - Localização basal e parabasal.3 ausente presente suprabasal Displasia GRÁFICO 18: Localização do marcador Ki-67 em relação ao percentual médio de área positiva nos casos de queilite actínica com e sem displasia epitelial (n=20).

132 Resultados Percentual médio de área positiva - Ki Ki67 - Distribuição focal 0.0 ausente presente difuso Displasia GRÁFICO 19: Distribuição do marcador Ki-67 em relação ao percentual médio de área positiva nos casos de queilite actínica com e sem displasia epitelial (n=20).

133 Resultados 131 FIGURA 17: Queilite actínica com displasia epitelial com marcação para Ki-67 na região suprabasal, com distribuição difusa Caso (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x).

134 Resultados 132 FIGURA 18: Queilite actínica sem displasia epitelial com marcação para Ki-67 na região suprabasal, com distribuição difusa Caso B (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x).

135 Resultados Bcl-2 Dos quatro casos com displasia epitelial estudados, 75% apresentou marcação na região suprabasal assim como 31,25% dos sem displasia epitelial (TAB. 26). Quanto à distribuição na região suprabasal, 66,7% dos casos com displasia epitelial e 60% dos sem displasia epitelial mostraram marcações focais (TAB. 27). TABELA 26: Localização das marcações positivas para Bcl-2 nos casos de queilites com e sem displasia epitelial. Localização Bcl-2 Casos com Casos sem Percentual displasia displasia Percentual Ausente Basal 1 25% 2 12,5% Basal e parabasal ,25% Suprabasal 3 75% 5 31,25% Total 4 100% % TABELA 27: Distribuição da positividade para Bcl-2 nas queilites. Distribuição Bcl-2 Casos com Casos sem Percentual Suprabasal displasia displasia Percentual Focal 2 66,7% 3 60% Difuso 1 33,3% 2 40% Total 3 100% 5 100%

136 Resultados 134 O GRÁFICO 20 mostra que o valor numérico do percentual médio de área positiva em todas as localizações apresenta maior expressividade nos casos sem displasia epitelial, o que ocorre também para as distribuições (GRAF. 21)..10 Percentual médio de área positiva Bcl Bcl-2 - Localização basal basal e parabasal 0.00 ausente presente suprabasal Displasia GRÁFICO 20: Localização do marcador Bcl-2 em relação ao percentual médio de área positiva nos casos de queilite com e sem displasia epitelial (n=20).

137 Resultados Percentual médio de área positiva - Bcl Bcl-2 - Distribuição focal 0.00 ausente presente difuso Displasia GRÁFICO 21: Distribuição do marcador Bcl-2 em relação ao percentual médio de área positiva nos casos de queilite com e sem displasia epitelial (n=20).

138 Resultados 136 FIGURA 19: Queilite actínica com displasia epitelial com marcação para Bcl-2 na região suprabasal, com distribuição focal Caso (A, objetiva 40x).

139 Resultados 137 FIGURA 20: Queilite actínica sem displasia epitelial com marcação para Bcl-2 na região basal e parabasal, com distribuição focal Caso B (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x).

140 Resultados HIPERPLASIAS FIBROSAS INFLAMATÓRIAS A análise imuno-histoquímica descritiva e quantitativa das hiperplasias pode ser visualizada nos ANEXOS 4, 7 ao p53 (DO-7) No grupo das hiperplasias, todos os 20 casos estudados (100%) apresentaram marcação para o p53 na região suprabasal (TAB. 28). A distribuição focal na região suprabasal para esse marcador foi observada em 70% dos casos (TAB. 29) TABELA 28: Localização das marcações positivas para p53 nas hiperplasias. Localização p53 N o de Casos Percentual Ausente - - Basal - - Basal e parabasal - - Suprabasal % Total % TABELA 29: Distribuição da positividade para p53 nas hiperplasias. Distribuição p53 Suprabasal N o de Casos Percentual Focal 14 70% Difuso 6 30% Total %

141 Resultados 139 O GRÁFICO 22 mostra maior percentual médio de área positiva apenas para a localização na região suprabasal, sendo maior nos casos com distribuição difusa..7 Percentual médio de área positiva - p p53 - Localização 0.0 focal difuso suprabasal p53 - Distribuição GRÁFICO 22: Distribuição do p53 em relação à localização da positividade nas hiperplasias (n=20).

142 Resultados 140 FIGURA 21: Hiperplasia com marcação para p53 na região suprabasal, com distribuição focal Caso (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x).

143 Resultados p53 MUTADO O marcador p53 mutado mostrou-se expresso em 11 (55%) casos de hiperplasias, sendo que nove casos (45%) dos 20 analisados obtiveram expressão na região suprabasal, a mesma quantidade de casos (45%) que não obtiveram marcação para esse marcador (TAB. 30). Todos os casos positivos com localização na suprabasal obtiveram distribuição focal pelo epitélio (TAB. 31). TABELA 30: Localização das marcações positivas para p53 mutado nas hiperplasias. Localização p53 mutado N o de Casos Percentual Ausente 9 45% Basal - - Basal e parabasal 2 10% Suprabasal 9 45% Total % TABELA 31: Distribuição da positividade para p53 mutado nas hiperplasias. Distribuição p53 mutado Suprabasal N o de Casos Percentual Focal 9 100% Difuso - - Total 9 100%

144 Resultados 142 O GRÁFICO 23 mostra que os casos que obtiveram valor numérico mais expressivo no percentual médio de área positiva para o p53 mutado foram aqueles com localização de marcação na região suprabasal com distribuição focal..02 Percentual médio de área positiva - p53m.01 p53m - Distribuição ausente 0.00 ausente basal e parabasal suprabasal focal p53m - Localização GRÁFICO 23: Distribuição do p53 mutado em relação à localização da positividade nas hiperplasias (n=20).

145 Resultados 143 FIGURA 22: Hiperplasia com marcação para p53 mutado na região suprabasal, com distribuição focal Caso B (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x).

146 Resultados Ki-67 A maioria dos casos (85%) mostrou positividade na região suprabasal (TAB. 32), sendo que desses casos 64,8% apresentaram distribuição difusa (TAB. 33). TABELA 32: Localização das marcações positivas para Ki-67 nas hiperplasias. Localização Ki-67 N o de Casos Percentual Ausente 3 15% Basal - - Basal e parabasal - - Suprabasal 17 85% Total % TABELA 33: Distribuição da positividade para Ki-67 nas hiperplasias. Distribuição Ki-67 Suprabasal N o de Casos Percentual Focal 6 35,2% Difuso 11 64,8% Total %

147 Resultados 145 O GRÁFICO 24 revela que o percentual médio de área positiva para o Ki-67 foi obtido apenas na região suprabasal, mostrando-se mais expressivo na distribuição difusa..7 Percentual médio de área positiva - Ki Ki67 - Distribuição ausente focal 0.0 ausente suprabasal difuso Ki67 - Localização GRÁFICO 24: Distribuição do Ki-67 em relação à localização da positividade nas hiperplasias (n=20).

148 Resultados 146 FIGURA 23: Hiperplasia com marcação para Ki-67 na região suprabasal, com distribuição difusa Caso B (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x).

149 Resultados Bcl-2 A maioria dos casos de hiperplasias (45%) apresentou marcação para Bcl-2 na camada basal e parabasal, enquanto somente três (15%) casos marcaram na região suprabasal (TAB. 34). Dos 18 casos com positividade, 12 (66,7%) apresentaram distribuição focal (TAB. 35). TABELA 34: Localização das marcações positivas para Ki-67 nas hiperplasias. Localização Bcl-2 N o de Casos Percentual Ausente 2 10% Basal 6 30% Basal e parabasal 9 45% Suprabasal 3 15% Total % TABELA 35: Distribuição da positividade para Ki-67 nas hiperplasias. Distribuição Bcl-2 N o de Casos Percentual Focal 12 66,7% Difuso 6 33,3% Total %

150 Resultados 148 Os valores numéricos de percentual médio de área positiva mostraram-se mais expressivos na camada basal e parabasal, tanto para distribuição focal quanto para a difusa (GRAF. 25)..08 Percentual médio de área positiva Bcl-2 - Distribuição ausente focal 0.00 ausente basal basal e parabasal suprabasal difuso Bcl-2 - Localização GRÁFICO 25: Distribuição da Bcl-2 em relação à localização da positividade nas hiperplasias (n=20).

151 Resultados 149 FIGURA 24: Hiperplasia com marcação na região basal e parabasal, com distribuição focal para Bcl-2 Caso B (A, objetiva 10x; B, objetiva 40x).

152 Resultados ANÁLISE COMPARATIVA ENTRE OS TRÊS GRUPOS p53 (DO-7) O marcador p53 mostrou expressão em um número maior de casos na região suprabasal em todos os três grupos analisados. A ausência do marcador ocorreu apenas em um caso no grupo dos carcinomas. O grupo das hiperplasias foi o único que obteve marcação apenas na região suprabasal (GRAF. 26). Com relação à distribuição, o GRÁFICO 27 mostra que a quantidade de casos com distribuição focal para o p53 foi menor nos carcinomas e maior nas hiperplasias e o GRÁFICO 28 mostra que com relação à distribuição difusa ocorreu o contrário, a quantidade de casos foi maior para os carcinomas e menor para as hiperplasias Número de casos Grupos estudados 5 carcinoma queilite 0 ausente basal e parabasal suprabasal hiperplasia p53 - Localização GRÁFICO 26: Expressão do marcador p53 nos três grupos estudados.

153 Resultados p53 - Distribuição focal Número de casos Grupos 4 2 carcinoma queilite 0 basal e parabas al suprabasal hiperplasia p53 - Localização GRÁFICO 27: Expressão do marcador p53 nos três grupos estudados com relação à distribuição focal. 14 p53 - Distribuição difusa 12 Número de casos Grupos carcinoma 2 queilite 0 basal e parabasal suprabasal hiperplasia p53 - Localização GRÁFICO 28: Expressão do marcador p53 nos três grupos estudados com relação à distribuição difusa.

154 Resultados p53 MUTADO (PAb-240) O p53 mutado mostrou-se localizado na região suprabasal em uma maior quantidade de casos no grupo das queilites. Esse grupo obteve expressão para esse marcador em todos os casos. Enquanto o grupo das hiperplasias foi o que obteve mais casos com ausência do p53 mutado (GRAF. 29). Com relação à distribuição focal na região suprabasal desse marcador, o grupo das queilites obteve maior número de casos, enquanto o carcinoma obteve um menor número de casos (GRAF. 30). Já com relação à distribuição difusa na mesma região, o grupo das hiperplasias não obteve nenhum caso. E o grupo dos carcinomas obteve mais casos localizados na região suprabasal com distribuição difusa do que o das queilites (GRAF. 31). 20 Número de casos 10 Grupos estudados carcinoma queilite 0 ausente basal e parabas al suprabasal hiperplasia p53m - Localização GRÁFICO 29: Expressão do marcador p53 mutado nos três grupos estudados.

155 Resultados p53m - Distribuição focal Número de casos Grupos carcinoma 2 queilite 0 basal e parabas al suprabasal hiperplasia p53m - Localização GRÁFICO 30: Expressão do marcador p53 mutado nos três grupos estudados com relação à distribuição focal. 6 p53m - Distribuição difusa 5 Número de casos Grupos 1 carcinoma 0 basal e parabas al suprabasal queilite p53m - Localização GRÁFICO 31: Expressão do marcador p53 mutado nos três grupos estudados com relação à distribuição difusa.

156 Resultados Ki-67 O marcador Ki-67 obteve expressão em um número maior de casos para todos os grupos na localização suprabasal, sendo que o grupo das queilites obteve um número maior e o dos carcinomas, menor (GRAF. 32). O grupo dos carcinomas obteve um número maior de casos marcados para o Ki-67 na região suprabasal com distribuição focal (GRAF. 33), enquanto o grupo das queilites e logo após o das hiperplasias, para a distribuição difusa (GRAF. 34). 20 Número de casos 10 Grupos estudados carcinoma queilite 0 ausente basal basal e parabas al suprabasal hiperplasia Ki67 - Localiz ação GRÁFICO 32: Expressão do marcador Ki-67 nos três grupos estudados.

157 Resultados Ki67 - Distribuição focal 7 6 Número de casos Grupos carcinoma 1 queilite 0 basal basal e parabas al suprabasal hiperplasia Ki67 - Localiz ação GRÁFICO 33: Expressão do marcador Ki-67 nos três grupos estudados com relação à distribuição focal. 14 Ki67 - Distribuição difusa 12 Número de casos Grupos carcinoma 2 queilite 0 basal e parabasal suprabasal hiperplasia Ki67 - Localiz ação GRÁFICO 34: Expressão do marcador Ki-67 nos três grupos estudados com relação à distribuição difusa.

158 Resultados Bcl-2 A expressão do marcador Bcl-2 foi decrescente na região suprabasal, onde o grupo dos carcinomas obteve um maior número de casos e o das hiperplasias, um menor número. Apenas o grupo das queilites obteve marcação em todos os casos (GRAF. 35). A mesma ordem decrescente ocorreu na região suprabasal em relação à distribuição focal e difusa (GRAF. 36 e 37). 20 Número de casos 10 Grupos estudados carcinoma queilite 0 ausente basal basal e parabasal suprabasal hiperplasia Bcl-2 - Localização GRÁFICO 35: Expressão do marcador Bcl-2 nos três grupos estudados.

159 Resultados Bcl-2 - Distribuição focal 8 Número de casos Grupos carcinoma queilite 0 basal basal e parabasal suprabasal hiperplasia Bcl-2 - Localização GRÁFICO 36: Expressão do marcador Bcl-2 nos três grupos estudados com relação à distribuição focal. 12 Bcl-2 - Distribuição difusa 10 Número de casos Grupos carcinoma queilite 0 basal e parabas al suprabasal hiperplasia Bcl-2 - Localização GRÁFICO 37: Expressão do marcador Bcl-2 nos três grupos estudados com relação à distribuição difusa.

160 Resultados COMPARAÇÃO ENTRE p53 (DO-7) E p53 MUTADO (PAb-240) Os GRÁFICOS 38 ao 47 fazem uma comparação em relação à expressão dos marcadores p53 e p53 mutado em todos os grupos estudados CARCINOMAS DE CÉLULAS ESCAMOSAS NO LÁBIO No grupo dos carcinomas observa-se que, tanto para o p53 quanto para o p53 mutado, uma maior quantidade de casos obteve marcação localizada na região suprabasal. O p53 mutado mostrou-se ausente em um maior número de casos do que o p53 (GRAF. 38). Com relação à distribuição, o p53 mostrou-se marcado mais difusamente, enquanto o p53 mutado mais focal (GRAF. 39). O percentual médio de área positiva em relação à localização dos marcadores mostrou-se mais expressivo para o p53 na região suprabasal. No entanto, em relação à camada basal e parabasal que obteve o mesmo número de casos para os dois marcadores, o valor numérico mostrou-se mais expressivo para o p53 mutado (GRAF. 40) Ao comparar os GRÁFICOS 38 e 40, ou seja, o percentual médio de área positiva e o número de casos em relação à localização do p53 e p53m, percebe-se semelhança entre o resultado observado para a região suprabasal.

161 Resultados Carcinoma Número de casos 10 Marcador p53 0 ausente basal e parabasal suprabasal p53m Localização GRÁFICO 38: Comparação dos marcadores p53 e p53 mutado quanto à localização no grupo dos carcinomas 14 Carcinoma 12 Número de casos Marcador 2 p53 0 ausente focal difuso p53m Distribuição GRÁFICO 39: Comparação dos marcadores p53 e p53 mutado quanto à distribuição no grupo dos carcinomas

162 Resultados Carcinoma Percentual médio de área positiva Marcador p53 0 ausente basal e parabasal suprabasal p53m Localização GRÁFICO 40: Comparação dos marcadores p53 e p53 mutado quanto à localização no grupo dos carcinomas em relação ao percentual médio de área positiva (n=20).

163 Resultados QUEILITES ACTÍNICAS No grupo das queilites, todos os casos obtiveram marcação para os dois marcadores. Para a localização suprabasal, o p53 marcou em um número maior de casos do que o p53 mutado, ocorrendo o contrário com relação a camada basal e parabasal (GRAF. 41). Assim como no grupo dos carcinomas, o p53 mostrou uma distribuição mais difusa e o p53 mutado, mais focal (GRAF. 42). O percentual médio de área positiva em relação à localização dos marcadores mostrou-se mais expressiva para o p53 tanto na camada basal e parabasal quanto para a região suprabasal (GRAF. 43). Ao comparar os GRÁFICOS 41 e 43, percebe-se que, assim como o grupo dos carcinomas, o p53 mostrou-se mais elevado na região suprabasal, tanto em número de casos quanto no percentual médio de área positiva. 20 Queilite Número de casos 10 Marcador p53 0 basal e parabasal suprabasal p53m Localização GRÁFICO 41: Comparação quanto à localização dos marcadores p53 e p53 mutado no grupo das queilites actínicas.

164 Resultados Queilite Número de casos Marcador 4 p53 2 focal difuso p53m Distribuição GRÁFICO 42: Comparação quanto à distribuição dos marcadores p53 e p53 mutado no grupo das queilites actínicas. 4 Queilite Percentual médio de área positiva Marcador p53 0 basal e parabasal suprabasal p53m Localização GRÁFICO 43: Comparação dos marcadores p53 e p53 mutado quanto à localização no grupo das queilites actínicas em relação ao percentual médio de área positiva (n=20).

165 Resultados HIPERPLASIAS FIBROSAS INFLAMATÓRIAS No grupo das hiperplasias, o p53 mutado mostrou-se ausente em alguns casos. O p53 apresentou-se marcado em todos os casos na região suprabasal (GRAF. 44). Enquanto o p53 obteve marcação difusa e focal, o p53 mutado foi expresso apenas focalmente nos casos com marcação (GRAF. 45). O percentual médio de área positiva em relação à localização dos marcadores mostrou-se mais expressiva para o p53 na localização suprabasal. O marcador p53 mutado obteve pouca expressão numérica em todas as localizações onde houve marcação (GRAF. 46). Ao comparar as GRÁFICOS 44 e 46, observou-se o mesmo padrão ocorrido no grupo dos carcinomas e das queilites em relação à região suprabasal, onde o p53 obteve maior índice numérico e maior número de casos. 30 Hiperplasia Número de casos Marcador p53 0 ausente basal e parabasal suprabasal p53m Localização GRÁFICO 44: Comparação dos marcadores p53 e p53 mutado quanto à localização no grupo das hiperplasias.

166 Resultados Hiperplasia Número de casos Marcador 2 p53 0 ausente focal difuso p53m Distribuição GRÁFICO 45: Comparação dos marcadores p53 e p53 mutado quanto à distribuição no grupo das hiperplasias..3 Hiperplasia Percentual médio de área positiva.2.1 Marcador p ausente basal e parabasal suprabasal p53m Localização GRÁFICO 46: Comparação dos marcadores p53 e p53 mutado quanto à localização no grupo das hiperplasias em relação ao percentual médio de área positiva (n=20).

167 Resultados COMPARAÇÃO ENTRE O p53 (DO-7) E p53 MUTADO (PAb-240) NOS TRÊS GRUPOS ESTUDADOS O GRÁFICO 47 faz uma comparação entre o p53 e o p53 mutado nos três grupos estudados em relação ao percentual médio de área positiva. O p53 mostrouse mais expressivo do que o p53 mutado em todos os grupos analisados. Foi possível observar, também, que os dois marcadores mostram-se decrescentes na ordem: carcinoma, queilite e hiperplasia. 4 Percentual médio de área positiva Marcador p53 0 carcinoma queilite hiperplasia p53m Grupos estudados GRÁFICO 47: Comparação dos marcadores p53 e p53 mutado nos três grupos estudados em relação ao percentual médio de área positiva

168 Resultados ANÁLISE ESTATÍSTICA COMPARATIVA CASOS DE QUEILITE ACTÍNICA COM E SEM DISPLASIA EPITELIAL O teste t foi utilizado para analisar a diferença do percentual médio de área positiva de cada marcador entre os casos de queilite com e sem displasia epitelial. Estatisticamente, a diferença foi apenas significativa para o marcador p53 mutado, onde p=0,035 e para o marcador Bcl-2, onde p=0,019. O resultado geral pode ser visualizado no ANEXO ANÁLISE ENTRE OS TRÊS GRUPOS ESTUDADOS p53 e p53 MUTADO O teste T independente foi utilizado para analisar a diferença entre o percentual médio de área positiva do p53 e p53 mutado em cada um dos três grupos estudados. Estatisticamente, a diferença entre os marcadores foi significativa em todos os grupos, sendo p=0,007 para o grupo dos carcinomas, p=0,004 para o grupo das queilites e p=0,013 para o grupo das hiperplasias. O resultado geral pode ser visualizado no ANEXO 23.

169 Resultados PERCENTUAL MÉDIO DE ÁREA POSITIVA O ANOVA foi utilizado para comparar o percentual médio de área positiva de cada marcador nos três diferentes grupos. Estatisticamente, houve significância para os marcadores p53 e p53m. Para o primeiro marcador a significância foi entre os grupos dos carcinomas e das hiperplasias, onde p=0,006 e entre os grupos das queilites e das hiperplasias, onde p=0,012. E para o segundo marcador a significância foi entre os grupos dos carcinomas e das hiperplasias, onde p=0,005. O resultado geral pode ser visualizado no ANEXO MARCAÇÃO SUPRABASAL O teste Qui-quadrado foi utilizado para avaliar a diferença percentual dos marcadores expressos na região suprabasal com distribuição difusa e focal em todos os grupos estudados. Marcação suprabasal para p53 com distribuição difusa: estatisticamente, observou-se significância entre o grupo das queilites e hiperplasias, onde p=0,0412; e entre o grupo dos carcinomas e hiperplasias, onde p=0,023. Marcação suprabasal para p53 com distribuição focal: estatisticamente, observou-se significância entre o grupo das queilites e hiperplasias, onde p=0,0233; e entre o grupo dos carcinomas e hiperplasias, onde p=0,0026.

170 Resultados 168 Marcação suprabasal para p53 mutado com distribuição difusa: estatisticamente, não se observou significância entre os grupos. Marcação suprabasal para p53 mutado com distribuição focal: estatisticamente, observou-se significância entre o grupo dos carcinomas e das queilites, onde p= 0,0133; e entre o grupo das queilites e hiperplasias, onde p=0,0412. Marcação suprabasal para Ki-67 com distribuição difusa: estatisticamente, não se observou significância entre os grupos. Marcação suprabasal para Ki-67 com distribuição focal: estatisticamente, não se observou significância entre os grupos. Marcação suprabasal para Bcl-2 com distribuição difusa: estatisticamente, observou-se significância entre o grupo dos carcinomas e das queilites, onde p=0,0412; e entre o grupo dos carcinomas e hiperplasias, onde p=0,0133. Marcação suprabasal para Bcl-2 com distribuição focal: estatisticamente, observou-se significância entre o grupo dos carcinomas e hiperplasias, onde p=0,023.

171 6 DISCUSSÃO

172 Discussão DISCUSSÃO 6.1 CONCEPÇÃO DO TRABALHO A leucoplasia, eritroplasia e ceratose solar em lábio inferior, definidas em 1997 pela Organização Mundial de Saúde como lesões pré-malignas bucais são descritas como um tecido benigno, morfologicamente alterado, que apresenta um risco maior do que o normal de transformação maligna. Diversos estudos são realizados nessa área objetivando definir os critérios histopatológicos, como nas leucoplasias e eritroplasias, além de obter informações mais precisas sobre a evolução e o prognóstico dessas lesões. Muitas vezes, somente a análise morfológica não revela o verdadeiro comportamento dessas lesões, podendo ser subestimadas clinicamente quanto ao seu tratamento e acompanhamento.

173 Discussão 171 Em diversas situações clínicas, essas lesões pré-malignas mostram-se difusas e múltiplas proporcionando dificuldades na escolha do tratamento. Não raro, pacientes procuram os profissionais com um carcinoma de células escamosas já instalado, podendo oferecer, neste momento, o único tratamento que dará a perspectiva de cura total: a exérese da lesão e possíveis transtornos estéticos, funcionais e psico-sociais. A partir de todas estas constatações formulou-se o seguinte pensamento: quais as alterações moleculares que acontecem nas lesões pré-malignas que não podem ser ainda visualizadas morfologicamente, provocando a silenciosa evolução dessas lesões para o carcinoma de células escamosas? Embora a etiologia do câncer bucal se apresente multifatorial, fato já definido na literatura, sabe-se que a mais conhecida, senão a principal, etiologia do carcinoma em lábio é a radiação ultravioleta. Com isso o câncer labial, bem como a queilite actínica devem ser estudadas separadamente das lesões intra-bucais, como as leucoplasias, eritroplasias e carcinoma de células escamosas. A partir dessa consideração, foi proposta a realização de dois trabalhos que avaliassem o comportamento das lesões pré-malignas intra e extra-bucais individualmente. Inserido na linha de pesquisa sobre a carcinogênese bucal do curso de Mestrado em Patologia Bucodental, da Universidade Federal Fluminense, a proposta inicial do presente trabalho foi estudar histopatologica e imino-histoquimicamente as queilites actínicas e correlacioná-las com lesões benignas e malignas localizadas em lábio inferior.

174 Discussão 172 A atuação da radiação ultravioleta no desenvolvimento de lesões malignas ocorre através da ação direta nas células levando a danos no DNA. E por essas transformações ocorrerem molecularmente mostra-se importante o conhecimento desses eventos e quem sabe a predição da malignidade de lesões, como a queilite actínica. Esse estudo contribui no conhecimento dessas alterações moleculares para empregar, futuramente, imunomarcadores na rotina anatomopatológica como fatores prognósticos para estas lesões. 6.2 AMOSTRA O presente estudo apresenta-se como um trabalho retrospectivo, onde foram utilizados três diferentes grupos de lesões em blocos de parafina de arquivo. O foco de interesse, o grupo das queilites actínicas, limitou-se às lesões localizadas em lábio inferior devido a maior incidência dos raios UV nessa localidade do que no lábio superior. Já as lesões proliferativas benignas, mais especificamente as hiperplasias fibrosas inflamatórias, foram utilizadas como um grupo controle negativo, onde se esperava que a expressão dos marcadores fosse compatível com o padrão de lesões de comportamento reacional benigno. A maior preocupação em relação a este grupo foi restringir a amostra às lesões localizadas em mucosa interna de lábio inferior. Primeiro pela proximidade do local de interesse e depois por, justamente, não estar exposta a radiação solar possibilitando seu uso como grupo controle negativo. No entanto, a literatura não define um grupo controle negativo para esses estudos. Alguns autores utilizam o epitélio adjacente à lesão

175 Discussão 173 estudada (NEES et al., 1993; SANTOS et al., 2003), enquanto outros fazem uso de tecido removido da gengiva de terceiros molares extraídos (CRUZ et al., 1998; PIATTELLI et al., 2002). Porém acredita-se que estes locais não sejam adequados para a pesquisa proposta, visto que o primeiro devido à proximidade com o epitélio de interesse poderia já estar sofrendo alterações moleculares levando, assim, a questionamentos quanto a veracidade dos resultados. Já tecidos removidos de gengiva de terceiros molares, normalmente, apresentam-se associados ao fator traumático e contaminação microbiana local induzindo graus diferentes de inflamação, fornecendo dificuldade na avaliação das marcações imunohistoquímicas. O último grupo estudado, dos carcinomas de células escamosas em lábio inferior, foi utilizado como grupo controle positivo, principalmente por ser a evolução da queilite actínica, onde se esperava que obtivessem mais expressão dos marcadores do que os outros grupos. Não há na literatura uma definição quanto ao número ideal da amostra. Diversas vezes detêm-se ao que seria estatisticamente significativo. Na prática, esse número pode se apresentar restrito devido a inúmeros fatores. A apresentação clínica inicial da queilite actínica pode ser sutil, sob a forma de ressecamento, descamação e vermelhidão da mucosa labial, fazendo com que profissionais não utilizem a biópsia como meio de diagnóstico, conseqüentemente a quantidade de material nestes casos mostra-se escassa. Como revela a literatura, o número de casos de câncer em lábio vem reduzindo ao longo dos anos (CHEN et al., 1992), sendo outra questão relevante quanto à casuística. Além disso, os critérios de inclusão do material de biópsias utilizados neste trabalho, como a quantidade e

176 Discussão 174 qualidade do tecido presente no bloco são outros fatores que ajudam a reduzir o número da amostra. Uma das principais limitações encontradas na realização desse estudo foi o uso somente de biópsias incisionais, material disponível no Arquivo do Serviço de Anatomia Patológica do HUAP UFF e nos laboratórios particulares. Estas não revelam com fidedignidade o verdadeiro grau de diferenciação dos carcinomas e nas queilites actínicas, o fragmento removido, nem sempre representa o padrão de comportamento predominante da lesão. As amostras pequenas das lesões impossibilitam também a realização de diversas análises, como a limitação do número de marcadores no estudo imuno-histoquímico, variações morfológicas nos cortes seriados impedindo correlações diretas entre os imunomarcadores, além da análise de tecido sadio adjacente à lesão utilizado em inúmeros trabalhos da literatura. As biópsias incisionais selecionadas para este trabalho foram as de melhor qualidade e quantidade de tecido para possibilitar a análise dos resultados sem prejuízos para a proposta deste estudo. 6.3 FATORES DE RISCO Pacientes de pele clara, cabelos loiros ou ruivos e com tendência para se queimar ao invés de bronzear quando expostos ao sol, são tidos como pacientes de risco para o desenvolvimento de qualquer lesão em pele causada pela radiação

177 Discussão 175 ultravioleta, como a queratose solar, a queilite actínica, o carcinoma de células basais em pele e de células escamosas em lábio (KAUGARS et al., 1999; LINDKVIST & TEPPO, 1978; LA RIVIERE & PICKETT, 1979; MAIN & PAVONE, 1994; AWDE et al., 1996; SANTOS et al., 1996). Quanto maior a quantidade de melanina, maior a proteção contra os raios UV (KAUGARS et al., 1999). Pacientes da raça preta, além de possuírem maior quantidade de melanina, ainda mostram uma distribuição mais uniforme pelo epitélio, sendo uma proteção adicional para a penetração de raios (LA RIVIERE & PICKETT, 1979). Em concordância com a literatura, os grupos de queilites actínicas e de carcinoma, selecionados no presente trabalho, mostraram maior acometimento na raça branca, respectivamente 80% e 86,6% (ver TAB. 5, pág. 89 e 7, pág. 90). Embora a incidência no sexo feminino venha aumentando ao longo dos anos, os homens continuam sendo o sexo mais afetado (LINDQVIST & TEPPO, 1978; LINDQVIST, 1979; CHEN et al., 1992; SANTOS et al., 1996; VISSCHER et al., 1998; KAUGARS et al., 1999; VENESS et al., 2001; OCHSENIUS et al., 2003). As mulheres, por apresentarem maiores preocupações estéticas, procuram orientação profissional mais rapidamente quando percebem algo de errado não só na boca como em qualquer outro lugar do corpo. Outras particularidades do sexo feminino, como uso de batons com proteção solar (LA RIVIERE & PICKETT, 1979; MAIN & PAVONE, 1994; OCHSENIUS, 2003) e o fato de muitas ainda não trabalharem fora de casa para cuidar dos filhos, podem justificar a incidência menor das lesões em lábio (LA RIVIERE & PICKETT, 1979).

178 Discussão 176 No presente estudo, o grupo dos carcinomas obteve 84,21% de ocorrência no sexo masculino, porém o grupo das queilites não mostrou grande diferença entre os sexos feminino e masculino, com 47,1% e 52,9%, respectivamente (ver TAB. 4, pág. 88 e 6, pág. 89). Deve-se levar em consideração que dados referentes ao sexo estavam ausentes em uma das 20 fichas do grupo dos carcinomas e em três do grupo das queilites. Porém, esse leve aumento em relação ao sexo feminino pode ser real, já que, atualmente, a mulher está mais exposta aos danos da radiação UV. Donas de casa começaram a trabalhar fora, seja na cidade ou no campo, passando a ter menos tempo para se cuidar e mais expostas a ambientes externos sem proteção. Além disso, os parâmetros estéticos mudaram ao longo dos anos, especialmente no Brasil, onde a mulher bonita para a sociedade deve ser bronzeada de sol, aumentando o uso de câmaras de bronzeamento artificial. Com o efeito cumulativo da radiação solar, os danos causados raramente são evidenciados em pacientes jovens (MAIN & PAVONE, 1994). Assim como relatado por diversos autores (LINDQVIST & TEPPO, 1978; LA RIVIERE & PICKETT, 1979; SANTOS et al., 1996; VISSCHER et al., 1998; KAUGARS et al., 1999; VENESS et al., 2001; OCHSENIUS et al., 2003), obteve-se no presente estudo a idade média dos pacientes entre a 5ª e 6ª década de vida. Embora o uso de tabaco tenha associação com o câncer de lábio, estudos epidemiológicos identificam a radiação UV como o principal fator etiológico iniciador para essa lesão (CHEN et al., 1992; AWDE et al., 1996). A interação do fumo ocorre pela produção de calor, trauma principalmente relacionado a cachimbos e a própria

179 Discussão 177 combustão focal dos produtos do tabaco (CHEN et al., 1992). Diferentemente dos carcinomas intra-bucais, os localizados no lábio recebem bastante influência da profissão e de hábitos do paciente, visto que trabalhadores em área rural ou urbana e pessoas com atividades de lazer expostas ao sol são mais acometidos por essa doença (LA RIVIERE & PICKETT, 1979; CHEN et al., 1992; MAIN & PAVONE, 1994; SANTOS et al., 1996; VISSCHER et al., 1998;). O fator de risco inicial é o dano pela radiação solar crônica (AWDE, 1996). O tempo necessário para as mudanças induzidas pelo sol levar ao desenvolvimento do câncer no lábio varia aproximadamente entre 20 e 30 anos, podendo ocorrer em menor tempo em alguns pacientes (KAUGARS et al., 1999), justificando sua incidência maior na população da 5ª década em diante. A queilite actínica pode contribuir diretamente na prevenção do câncer de lábio, principalmente pela lenta evolução e ocorrência, na sua grande maioria, em pacientes mais jovens. 6.4 METODOLOGIA Diversas classificações são utilizadas para diferenciar o grau dos carcinomas de células escamosas. A classificação de Broders que utiliza como critério à morfologia das células tumorais, recomendada pela OMS, mostrou-se de acordo com os objetivos propostos no presente estudo. O grau de diferenciação celular foi classificado em bem diferenciado, onde as células do tumor são semelhantes ao local de origem; moderadamente diferenciado e pouco diferenciado, neste último, as células apresentam pouca semelhança com o local de origem (PINDBORG et al, 1997). No presente trabalho, dos 20 casos selecionados de carcinoma de células

180 Discussão 178 escamosas de lábio, 25% foram classificados em bem diferenciados e 75% em moderadamente diferenciados (ver TAB. 10, pág. 96). Não foi encontrado nenhum caso classificado como pouco diferenciado. O câncer de lábio em comparação com os cânceres intra-bucais possui evolução mais lenta e tardia com um comportamento menos agressivo, sendo observado mais os padrões bem e moderadamente diferenciado e mais raramente o pouco diferenciado. No grupo da queilites actínicas, dos 20 casos selecionados, apenas 20% foram classificados com presença de displasia epitelial (ver TAB. 11, pág.99). Inicialmente, esses casos seriam classificados quanto ao grau dessa displasia epitelial, como recomendado pela OMS (PINDBORG et al., 1997), porém, todos mostraram um grau leve de displasia epitelial. Por estes motivos optou-se por somente diferenciá-las com ou sem displasia epitelial, sem fazer uso da classificação do grau. A classificação morfológica de todos os casos desse estudo foi realizada em lâminas com cortes histológicos corados em hematoxilina e eosina. A técnica de imuno-histoquímica consiste em uma reação que compreende um conjunto de procedimentos utilizando anticorpos como reagentes específicos para a detecção de antígenos presentes em células e tecidos (POLAK & VAN NOORDEN, 1997). Essa técnica caracteriza-se como de fácil aplicabilidade e baixo custo, por isso amplamente utilizada na maioria dos trabalhos com proposta de avaliar a expressão de proteínas. Porém sua aplicação deve ser cautelosa e bem empregada, além de serem reconhecidas suas limitações.

181 Discussão 179 Inicialmente deve-se fazer a escolha da utilização de anticorpos monoclonais ou policlonais. A grande vantagem da utilização dos anticorpos monoclonais é a especificidade para uma seqüência simples ou um epítopo na molécula do antígeno. Esta especificidade é relativa, uma vez que os anticorpos monoclonais estarão mais expostos a fatores ambientais como o ph das soluções e a reação cruzada caso o anticorpo seja direcionado a uma seqüência comum a várias substâncias ou superfícies celulares (POLAK & VAN NOORDEN, 1997; BOENISCH, 2001). Os materiais de arquivos, como os blocos de parafina utilizados neste trabalho apresentam algumas limitações durante as reações de imuno-histoquímica. O tipo e o tempo da fixação, a inclusão do tecido, presença de necrose, as condições dos locais onde estão arquivados e outros fatores podem dificultar desde a visualização das marcações até a desnaturação de proteínas do tecido. A realização de testes previamente a pesquisa, auxilia na eliminação do maior número de fatores que possam vir a interferir na reação, além de definir para cada marcador os ajustes e protocolo ideal para o material em estudo. Durante a execução desses testes, alguns pontos devem ser estabelecidos para o sucesso da reação, são eles: a diluição do anticorpo primário, o tipo de recuperação antigênica e o tempo de revelação das lâminas. A determinação da melhor diluição do anticorpo primário evita o seu uso em concentrações altas, a ponto de causarem background, impossibilitando, muitas vezes, a localização da positividade e introduzindo, na reação, soluções para diminuir essas ligações inespecíficas.

182 Discussão 180 A recuperação antigênica baseia-se, predominantemente, no aquecimento dos tecidos em altas temperaturas. É utilizada como um pré-tratamento em tecidos parafinados, fixados em formol que tem como objetivo permitir melhor penetração do anticorpo e conseqüentemente melhor acesso aos epítopos. A solução ideal deve ser determinada através de testes, pois diferentes antígenos podem requerer diferentes condições para a recuperação (MIGHELL et al., 1998; BOENISCH, 2001). No presente trabalho, a recuperação antigênica utilizada foi determinada através de protocolos já estabelecidos pelo laboratório e confirmada nos novos testes realizados, optando-se pelo uso do tampão citrato ph 6,0 para p53 e ki67 e solução de ph alto comercial da DAKO em banho-maria para p53 mutado e bcl-2. O tempo de revelação das lâminas, neste trabalho utilizando o cromógeno diaminobenzidina, deve ser ajustado juntamente com os outros pontos descritos acima. Através dos testes realizados, esse tempo foi estabelecido revelando as lâminas separadamente ao microscópio óptico, levando-se em consideração o tipo de marcador e o tecido estudado. Alguns marcadores, como p53, Ki-67 e Bcl-2, já eram usados na rotina do laboratório de Imuno-histoquímica e Hibridação do HUAP UFF e os testes realizados com eles tiveram como objetivo apenas ajustar o protocolo para o material do presente estudo. O p53 mutado e a caspase-3 foram marcadores adquiridos recentemente e por isso foi necessário estabelecer um protocolo com base na literatura e na bula do próprio anticorpo.

183 Discussão 181 Durante a realização dos testes, observou-se um resultado pouco satisfatório para o marcador p53 e caspase-3 onde ambos apresentaram um intenso background dificultando a vizualização da positividade. Com isso, foi necessária a introdução de uma solução inibidora de ligações inespecíficas para o marcador p53, obtendo um melhor resultado, com pouco ou ausente background. A não utilização dos resultados obtidos com a caspase-3 neste trabalho foi optada, pelos resultados inadequados, mesmo após a realização de inúmeros testes com variações na diluição do anticorpo primário, na recuperação antigênica, no anticorpo secundário e com a utilização de solução inibidora de ligações inespecíficas. O mesmo não ocorreu com o marcador Bcl-2, que durante a realização dos primeiros testes apresentou muito background e com ajustes na diluição do anticorpo e a retirada da solução inibidora de ligações inespecíficas os resultados foram excelentes. A inclusão desses cinco anticorpos neste trabalho foi baseada na questão destes imunomarcadores estarem envolvidos na regulação da apoptose e da proliferação celular e diretamente relacionados no processo de carcinogênese bucal conforme revela a literatura (NEES et al., 1993; SHIN et al., 1994; RAVI et al., 1996; CRUZ et al., 1998; MACLUSKEY et al., 1999; CRUZ et al., 2000; LIU & KLEIN- SZANTO, 2000; OKAZAKI et al., 2002; PIATTELLI et al., 2002). Há na literatura diversos trabalhos que utilizam outros marcadores, no entanto o p53, Ki-67 e Bcl-2 são amplamente explorados nesta linha de pesquisa. Além disso, esses marcadores já eram utilizados pelo laboratório de Imuno-histoquímica e Hibridação do HUAP UFF apresentando bons resultados em biópsias de outros locais. O marcador p53 mutado (PAb 240) foi incluído no trabalho pelo do fato do gene TP53 ser o mais

184 Discussão 182 alterado na carcinôgenese e pelo anticorpo p53 (DO-7) marcar tanto a proteína nativa quanto a mutada. Assim, pretendia-se identificar diferenças entre as marcações dos dois anticorpos, selecionando o mais adequado para este tipo de estudo. A técnica TUNEL descrita por GRAVIELE et al, em 1992, utilizada para identificar células em apoptose tem sido amplamente utilizada no estudo da apoptose como revela a literatura. Seu uso é realizado na forma de kit fornecido pelo mercado, permitindo a realização de poucas reações e sendo de alto custo. Mais recentemente foram introduzidos outros marcadores na imuno-histoquímica para identificar células em apoptose como o anticorpo monoclonal (Mab) anti-ssdna (single strand DNA) e a caspase-3. O anticorpo monoclonal para fita simples de DNA (ssdna) liga-se especificamente com uma fita única de DNA sendo ideal para detecção de células apoptóticas em cortes de tecido parafinado. Assim como método TUNEL, esse anticorpo não é específico para apoptose, a reação também pode ocorrer com células em necrose (FRANKFURT & KRISHAN, 2001). A marcação da caspase-3, em imuno-histoquímica, tem sido utilizada para identificar células em apoptose. O baixo custo, fácil aplicabilidade, alta sensibilidade e melhores resultados obtidos em material retrospectivo em relação ao kit TUNEL mostraram ser dados relevantes para a escolha desse método de identificação da apoptose. Após a realização das reações e análise das lâminas, foi possível identificar que em uma mesma bateria havia cortes histológicos com imunomarcações mais

185 Discussão 183 fortes e outros mais fracos. Provavelmente, justifica-se essa diferença pelas divergências no tratamento prévio desses tecidos, como a qualidade e tempo de uso do fixador, forma de remoção cirúrgica destes tecidos e armazenamento dos blocos de parafina. Os casos em que a marcação apresentou-se ausente foram repetidos e na maioria, obtido o mesmo resultado. Nenhum caso foi excluído desse estudo pela ausência de marcação, pois sempre houve a marcação positiva para pelo menos um marcador testado. A técnica de imuno-histoquímica apresentou-se com sensibilidade e especificidade adequada para a proposta do presente trabalho. Apesar de requerer bastante atenção e cuidados em todos os passos, inclusive na sua interpretação, a imuno-histoquímica apresenta-se como uma técnica fácil que vem evoluindo e superando dificuldades encontradas no passado. A análise dos resultados de todos os grupos deste trabalho foi avaliada por dois observadores e em caso de dúvida, um terceiro avaliador foi consultado. A análise imuno-histoquímica foi realizada de duas formas complementares, onde na primeira descreveu-se em que área do epitélio as imunomarcações estavam presentes identificando a localização com ênfase àquelas na região suprabasal e a distribuição focal ou difusa. Esta análise mostra-se muito importante para este estudo, considerando que a expressão de algumas proteínas na camada basal e parabasal são consideradas normais e a expressão dessas proteínas além dessas camadas, consideradas como indício de alterações moleculares (CRUZ et al., 1998; LIU & KLEIN-SZANTO, 2000; PIATTELLI et al., 2002). O enfoque para a distribuição

186 Discussão 184 difusa da positividade foi pela presença de maior quantidade de células marcadas ao longo do epitélio das lesões estudadas. A segunda avaliação foi realizada através de um estudo histomorfométrico, quantificando através do software Image Pro Plus 4.5 o µm 2 de área de positividade em relação à área total do epitélio delimitada obtendo um percentual médio de áreas positivas nos diferentes grupos de lesões para cada marcador e posterior comparação. Optou-se por analisar a área e não o número de células, pois foi a forma pela qual o programa utilizado conseguia fornecer a área total somente do epitélio em análise, delimitado manualmente, para que pudesse comparar com área positiva, estes valores não conseguiram ser obtidos quanto ao número de células positivas. Esta dificuldade pode ser pela própria limitação do programa empregado ou mesmo pela inabilidade e domínio dos operadores. Acreditava-se que a metodologia empregada para esta quantificação ainda não era a ideal, mas verdadeira e correta histomorfometricamente. Outra dificuldade encontrada na análise histomorfométrica foi à padronização da escala de cores no software, pois como já relatado mais acima, os cortes histológicos não apresentavam marcação com apenas uma intensidade de coloração marrom, no entanto, ao microscópio óptico, observava-se nitidamente a marcação positiva dessas células com coloração mais fraca. Com isso, perdia-se a identificação de algumas dessas células pelo programa Image Pro Plus 4.5. Ao mesmo tempo, nos cortes histopatológicos que apresentaram um leve background, o

187 Discussão 185 programa identificou essas áreas como positividade, mesmo calibrando esta análise para cada marcador. A análise estatística foi realizada com a finalidade de avaliar a existência de resultados significantes entre a expressão dos marcadores p53 e p53 mutado, entre todos os marcadores nos três grupos analisados e ainda entre a expressão deles nos casos de queilite actínica com e sem displasia epitelial. Com isso, foi possível identificar algumas diferenças detalhadas no item a seguir. 6.5 IMUNOMARCADORES RELACIONADOS A APOPTOSE E PROLIFERAÇÃO CELULAR p53 A mutação e a superexpressão do gene TP53 apresenta um papel importante no desenvolvimento do carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (WEINBERG, 1991; GREENBLATT et al., 1994; SHIN et al., 1994; RAVI et al., 1996; RAYBAUD-DIOGENE et al., 1996). Sua detecção vem sendo bastante estudada não só em lesões malignas, como também nas lesões precursoras, no intuito de prever a evolução e o comportamento dessas alterações (NEES et al., 1993; SHIN et al., 1994; CRUZ et al., 1998; CRUZ et al., 2000), sendo considerada por alguns autores como um bom fator prognóstico para essas lesões (SHIN et al., 1994; CROSTHWAITE et al. 1996; DE ROSA et al., 1996; MELO, 1999; CRUZ et al., 2000).

188 Discussão 186 Em tecidos normais, a proteína selvagem está expressa em baixas concentrações, fato que pode ser justificado pela sua meia-vida muito curta e por isso, imuno-histoquimicamente, sua presença é raramente detectada. A identificação ocorrerá quando altos níveis dessa proteína estiverem sendo expressos e isso pode ocorrer devido a um dano no DNA, onde a proteína provocará uma parada no ciclo celular, limitando a replicação e possibilitando reparos nos danos ocorridos ao DNA. Outra possibilidade pode ocorrer quando a proteína estiver mutada, perdendo sua função natural, permitindo que células anormais proliferem e acumulem a proteína alterada (RAYBAUD-DIOGENE et al., 1996; OKAZAKI et al., 2002). A localização da proteína quando detectada em epitélio normal restringe-se à camada basal (CRUZ et al., 1998), enquanto a expressão nas células suprabasais onde não há indícios de lesão maligna sugere uma alteração na p53, podendo levar a uma possível malignização do tecido (CRUZ et al., 2000). O grupo controle negativo, das hiperplasias, no presente estudo obteve marcação na região suprabasal para o anticorpo DO-7 em 100% dos casos estudados sendo desses, 70% com distribuição focal (ver TAB. 28 e 29, pág. 138), diferentemente do observado por CROSTHWAITE et al. em 1996; CRUZ et al., em 1998 e PIATTELLI et al. em 2002, onde a expressão imuno-histoquímica para a p53, seja em lesões benignas ou em epitélio bucal normal, foi observada apenas na camada basal ou ausente. No entanto, essa expressão além da camada basal pode não estar relacionada com a malignização desse tecido.

189 Discussão 187 A expressão do anticorpo p53 (DO-7) no grupo das queilites do presente estudo mostrou-se positiva em 100% dos casos. Todos os casos com displasia epitelial e 93,75% dos casos sem displasia epitelial obtiveram expressão na região suprabasal, sendo a distribuição difusa 75% e 60%, respectivamente (ver TAB. 20 e 21, pág. 118). Já no grupo dos carcinomas, um número menor des casos (80%) obteve positividade na região suprabasal, sendo desses, 81,25% com distribuição difusa (ver TAB. 12 e 13, pág 105). Por ser a proteína mais comumente alterada no câncer de cabeça e pescoço (RAYBAUD-DIOGENE et al., 1996), diversos estudos vem sendo realizados para avaliar a expressão da proteína p53 mutada no comportamento dessas lesões. Em concordância com algumas pesquisas onde mais de 50% dos carcinomas de células escamosas analisados apresentaram positividade para a p53 (CROSTHWAITE et al., 1996; DE ROSA et al., 1999; MELO, 1999; CRUZ et al., 2000; PIATTELLI et al., 2002), este grupo do presente estudo apresentou positividade em 95% dos carcinomas estudados independente da sua localização. A detecção da proteína nativa não parece ser um evento comum sendo rapidamente degrada pela MDM2, porém em condições especiais, a proteína nativa pode ficar retida no tecido não apresentando atividade seja por ligação com outras proteínas ou por deficiência na via de degradação (NYLANDER et al., 2000). Além disso, as proteínas mutantes podem ainda agir como feedbacks negativos, se ligando às proteínas nativas, bloqueando sua função (RAYBAUD-DIOGENE et al.,

190 Discussão ). Assim sendo, é possível suspeitar que a maioria das células detectadas esteja sem função, seja mutadas ou inativas. Ao comparar a quantidade de número de casos com expressão na região suprabasal (ver GRAF. 26, pág. 150), observou-se que o grupo das hiperplasias obteve um número mais elevado e dos carcinomas em número menor. No entanto, avaliando separadamente com relação à distribuição da expressão da p53 (DO-7), observou-se um padrão difuso em ordem decrescente de diferenciação das lesões (carcinomas, queilites e hiperplasias) (ver GRAFS. 27 e 28, pág. 151). Estatisticamente, foi possível observar diferença significante da marcação suprabasal para p53 com distribuição difusa entre o grupo das queilites e hiperplasias (p=0,0412); e entre o grupo dos carcinomas e hiperplasias (p=0,023). O mesmo ocorreu para a distribuição focal entre o grupo das queilites e hiperplasias (p=0,0233) e entre o grupo dos carcinomas e hiperplasias (p=0,0026). Quantitativamente a distribuição do percentual médio para o p53 (DO-7) mais elevado nos carcinomas e menor nas hiperplasias conforme observado também por BOYLE et al., em 1993; NEES, et al. em 1993; SHIN et al., em 1994; PIATTELLI et al., em 2002; CROSTHWAITE et al., em 1996; RAVI et al., em 1996; CRUZ et al., em 1998; DE ROSA et al., em 1999; SCHOELCH et al., em 1999 e CRUZ et al., em Apesar do conhecimento dos danos da radiação solar sobre o DNA, pouco se sabe sobre as alterações moleculares ocorridas nas lesões precursoras e malignas

191 Discussão 189 de lábio causadas pelos raios UV. CROSTHWAITE et al., em 1996, demonstraram alta expressão para a p53 nos cinco casos de queilite actínica analisados, enquanto DE ROSA et al., em 1999, de sete queilites actínicas, obtiveram expressão em apenas duas, com fraca marcação. No presente estudo, 100% das queilites actínicas mostraram marcação para o p53, sendo 95% na região suprabasal (ver TAB. 20 e 21, pág. 118). A mutação nas bases pirimidínicas CC para TT apresenta-se como uma característica absolutamente específica das alterações causadas pela radiação UV, sendo freqüentemente encontrada no gene TP53, quando mutado por indução dos raios solares. A mutação desse gene parece, também, estar associada a eventos iniciais da carcinogênese induzida por esses raios (ICHIHASHI et al., 2003). 90% das mutações no gene parecem ser missense, onde ocorre uma mudança nas características dos aminoácidos. Esse fenômeno pode alterar a conformação e aumentar a instabilidade da proteína p53 (PARK et al., 1996). PARK et al., em 1996, detectaram mutação neste gene em 28% de 25 pacientes analisados com lesões de pele causadas pela radiação UV com displasia epitelial leve, moderada e severa, sugerindo o envolvimento da mutação do TP53 em eventos iniciais da carcinogênese iniciada pela radiação solar. O anticorpo monoclonal anti-p53 (DO-7) utilizado no presente estudo marca tanto a proteína nativa quanto a mutada se ligando a seqüência 20-25aa da proteína. Por ter essa ligação específica é possível que mutações em outros pontos não sejam detectadas (ICHIHASHI et al., 2003). Com a finalidade de buscar outros

192 Discussão 190 pontos de mutação do TP53 nas lesões provocadas pela radiação UV, propôs-se avaliar a expressão do anticorpo monoclonal anti-p53 (PAb-240), que foi identificado neste trabalho como p53 mutado. Esse anticorpo se liga a outra seqüência da proteína, aa, diferentemente do clone DO-7. Dos 20 casos de hiperplasia estudados, 55% obtiveram marcação para a proteína p53 mutada, sendo 45% localizado na região suprabasal e com distribuição focal (ver TAB. 30 e 31, pág. 141). O grupo das queilites actínicas também revelou alta expressão para essa proteína na mesma localização, sendo 50% dos casos com displasia epitelial e 93,75% dos sem displasia epitelial positivos, desses 100% dos casos com displasia epitelial e 80% dos sem displasia epitelial obtiveram distribuição focal (ver TAB. 22 e 23, pág. 123). Em 75% dos carcinomas houve expressão da proteína, sendo 60% na região suprabasal e desse 58,3% com marcação focal (ver TAB. 14 e 15, pág. 108). A expressão dessa proteína, independente da localização e distribuição, não descarta a alteração molecular nesses tecidos, já que se trata de um marcador para a proteína mutada. Estatisticamente, não foi possível observar significância da marcação suprabasal para p53 mutado com distribuição difusa entre os grupos. Enquanto para a marcação suprabasal com distribuição focal, observou-se significância entre o grupo dos carcinomas e das queilites (p= 0,0133); e entre o grupo das queilites e hiperplasias (p=0,0412).

193 Discussão 191 Ao comparar o percentual médio do p53 mutado (PAb-240) entre os três grupos, foi possível observar o mesmo resultado que o p53 (DO-7), onde o índice numérico foi crescente de acordo com a evolução das lesões (ver GRAF. 7, pág. 103). Na análise da comparação entre o p53 (DO-7) e o p53 mutado (PAb-240) nos três grupos observou-se que no grupo dos carcinomas o anticorpo DO-7 obteve marcação em maior número de casos tanto na localização suprabasal quanto para a distribuição difusa. O mesmo ocorreu nos outros dois grupos com relação à mesma localização e distribução. A ausência de marcação para o PAb-240 mostrou-se mais elevado no grupo das hiperplasias (45%) e depois no dos carcinomas (25%), enquanto o grupo das queilites mostrou marcação em todos os casos. Estatisticamente, observou-se significância para o marcador p53 mutado no grupo das queilites entre os casos com e sem displasia epitelial (p=0,035). E comparando os três grupos, os dados do marcador p53 foram significantes entre o grupo dos carcinomas e hiperplasias (p=0,006) e entre o grupo das queilites e hiperplasias (p=0,012). Para o marcador p53 mutado, a diferença foi significativa entre os carcinomas e as hiperplasias (p=0,005). Em relação à comparação do percentual médio de área positiva do p53 e p53 mutado entre os grupos, a diferença foi significativa para os três grupos (carcinomas, p=0,007; queilites, p=0,004; hiperplasias, p=0,013). A marcação concomitante dos dois anticorpos, DO-7 e PAb-240, podem mostrar um acúmulo de proteínas mutadas. Aqueles casos marcados positivamente para o DO-7 e negativamente para o PAb-240 não indicam ausência de mutação. O

194 Discussão 192 primeiro, embora em uma região mais conservada, também detecta mutação além da proteína nativa, enquanto o segundo reconhece uma conformação tridimensional alterada da p53, que aparentemente pode ser resultado de diferentes tipos de mutação em pontos do gene (GANNON et al., 1990) Bcl-2 A proteína Bcl-2, da família do oncogene Bcl-2, juntamente com outras proteínas como a Mcl-1 e A1 apresentam um comportamento inibitório da apoptose, enquanto a Bax, Bad, e Bak, agem como promotoras da morte celular programada (SCHOELCH et al., 1999). A superexpressão da Bcl-2 está relacionada com a diminuição da morte celular programada e subsequente carcinogênese (RAVI et al., 1996). A expressão imuno-histoquímica da proteína Bcl-2 no grupo dos carcinomas deste estudo mostrou-se em 90% dos 20 casos analisados localizados na região suprabasal, apenas dois casos não apresentaram expressão para esse marcador. Dos 18 casos positivos, 55,5% mostraram marcação difusa (ver TAB. 18 e 19, pág. 114). No grupo das queilites actínicas, dos quatro casos com displasia epitelial, 75% apresentaram marcação suprabasal, sendo desses, 50% com distribuição difusa. Já nos casos sem displasia epitelial, em apenas 31,25% a marcação foi suprabasal, com 40% desses com distribuição focal (ver TAB. 26 e 27, pág. 133). E finalmente no grupo das hiperplasias, apenas 15% dos 20 casos obtiveram marcação na suprabasal, sendo desse 66,7% com distribuição difusa (ver TAB. 34 e 35, pág.

195 Discussão ). Foi possível observar, diante desses dados, que o aumento do número de casos com marcação para a Bcl-2 na suprabasal e com distribuição difusa ocorreu proporcionalmente com a evolução das lesões (ver GRAF. 35, pág. 156 e 37, pág. 157), assim como para a distribuição focal (ver GRAF. 36, pág. 157). O mesmo resultado foi observado por RAVI et al., em 1996, OKAZAKI et al., em 2002, PIATTELLI et al., em 2002 mostrando a relação do aumento da expressão da Bcl-2 com o desenvolvimento de neoplasias malignas. Ao contrário do observado no presente estudo, SINGH et al., em 1998, observaram um aumento da expressão da proteína na progressão de displasias epiteliais e diminuição na diferenciação de carcinomas, sugerindo, assim, a relação dessa oncoproteína com eventos iniciais no desenvolvimento e progressão da neoplasia. Quantitativamente não foi observado o mesmo padrão da análise descritiva entre os grupos. O percentual médio de área positiva mais elevado foi o do grupo das queilites e o menor o das hiperplasias. Estatisticamente, não houve significância para esse marcador entre os três grupos. Porém no grupo das queilites foi possível encontrar significância entre os casos com e sem displasia epitelial (p=0,019) (ver GRAF. 20, pág. 134 e 21, pág. 135). PIATTELLI et al., em 2002, também encontraram significância entre os casos de leucoplasia sem dispalsia e displasia epitelial leve e entre leucoplasia sem displasia epitelial e displasia epitelial severa. O aumento progressivo na expressão da Bcl-2 nas lesões pré-malignas e malignas pode estar relacionado com a perda da função da p53, seja por inativação ou por mutação (SCHOELCH et al., 1999; OKAZAKI et al., 2002; LORO et al., 2003).

196 Discussão 194 RAVI et al., em 1996 ao observarem a não expressão significativa da Bcl-2 em hiperplasias bucais p53 positivo, sugeriram que a superexpressão da Bcl-2 pode ocorrer secundariamente à inativação ou mutação da p53, tendo seu maior significado em uma fase tardia da progressão tumoral. Por outro lado, a p53 tem se mostrado como inibidora da Bcl-2 se ligando a um elemento regulador negativo localizado fora do gene Bcl-2 (PIATTELLI et al., 2002). A relação entre p53 e Bcl-2 pode ter um valioso significado para o desenvolvimento e progressão de tumores malignos (RAVI et al., 1996; OKAZAKI et al., 2002), assim como mostrado por PIATTELLI et al., em 2002 que encontrou uma significante relação inversa entre as duas proteínas Ki-67 As mudanças na capacidade proliferativa de lesões bucais pré-malignas podem revelar seus riscos iniciais de malignização mesmo antes de mudanças morfológicas perceptíveis no tecido (LIU & KLEIN-SZANTO, 2000). Diversos marcadores para a proliferação celular vêm sendo estudados com o objetivo de prever o comportamento e a evolução de lesões precursoras e malignas. Um dos marcadores mais estudados, principalmente para a carcinogênese bucal, é o anticorpo monoclonal MIB1 (MACLUSKEY et al., 1999), que reconhece em tecidos fixados em formol e incluídos em blocos de parafina, o epítopo do antígeno Ki-67 (BACCHI & GOWN, 1993; LIU & KLEIN-SZANTO, 2000).

197 Discussão 195 O antígeno Ki-67 começa a ser expresso na fase S, elevando seu nível durante as fases S e G 2, alcançando o seu nível mais elevado durante a mitose. Após a divisão as células retornam a fase G 1, quando o nível desse antígeno decresce progressivamente (LIU & KLEIN-SZANTO, 2000; VICENTE et al., 2002). Sua expressão ocorre em quase todas as fases do ciclo celular, exceto pela fase G 0 em que as células estão em repouso. No presente estudo, o grupo das hiperplasias mostrou expressão para a proteína Ki-67 em 85% dos 20 casos analisados enquanto no restante não foi observada marcação em nenhuma camada. Em todos os casos positivos essas marcações foram observadas na região suprabasal, sendo que 64,8% com distribuição difusa e 35,2% focal (ver TAB. 32 e 33, pág. 144). PIATTELLI et al., em 2002, encontraram marcação apenas na camada basal em 100% dos 10 casos de mucosa bucais normais analisados, enquanto LIU & KLEIN-SZANTO, em 2000, além da camada basal, observou também em todos os casos de tecido normal, marcação na camada parabasal. O reconhecimento de alterações moleculares e possíveis transformações malignas quando a positividade da proteína Ki-67 encontra-se além da camada parabasal tem sido descrito (CRUZ et al., 1998), porém não se acredita que o resultado encontrado no presente trabalho seja sinônimo destas alterações em todos os casos de lesões hiperplásicas. Os trabalhos de LIU & KLEIN-SZANTO, em 2000 e PIATTELLI et al., em 2002 utilizaram epitélio normal e evidenciaram imunomarcação de Ki-67 nas camadas basal e parabasal, respectivamente, no presente trabalho o grupo utilizado como controle negativo de malignidade foram às hiperplasias fibrosas inflamatórias, lesões reacionais provocadas por traumas locais

198 Discussão 196 induzindo aumento de fibroblastos e fibras colágenas na submucosa, associada normalmente à hiperplasia do epitélio. Esta hiperplasia do epitélio estava presente em todos os casos deste grupo, além de observar a hiperplasia também da camada basal, podendo justificar a expressão da proteína Ki-67 além da área parabasal. LIU & KLEIN-SZANTO, no seu estudo em 2000, afirmam ainda que a atividade proliferativa no epitélio normal ocorre predominantemente na camada parabasal e não na basal. Sendo assim, células marcadas positivamente na parabasal estariam de acordo com a proliferação normal do epitélio. Não foram localizados estudos na literatura que utilizassem o anticorpo MIB1 ou Ki-67 para pesquisar o comportamento e a evolução das queilites actínicas, somente trabalhos relacionados a lesões pré-malignas intrabucais, No grupo das lesões pré-malignas, a expressão do anticorpo Ki-67 foi semelhante ao encontrado no grupo das hiperplasias. Todos os casos com displasia epitelial e 93,75% dos casos sem displasia epitelial apresentaram marcação na região suprabasal, sendo 50% dos casos com displasia epitelial e 80% dos casos sem, obtiveram distribuição difusa para esse marcador (ver TAB. 24 e 25, pág. 128). LIU & KLEIN-SZANTO, em 2000 e PIATTELLI et al., em 2002 também encontraram o mesmo resultado obtido neste estudo quanto à localização da marcação nos casos de lesão pré-maligna com e sem displasia epitelial. Embora não tenha sido encontrada significância estatística entre o grupo das queilites e das hiperplasias para Ki-67 neste estudo, houve uma pequena diferença do número de casos com marcação localizada na região suprabasal e distribuição difusa entre esses grupos, sendo 14 casos de queilite e 11 de hiperplasias (ver GRAF. 32, pág. 154 e 34, pág. 155), assim como o percentual

199 Discussão 197 médio das queilites mostrou-se ligeiramente mais elevado do que o das hiperplasias (ver GRAF. 7, pág, 103). Em todos os espécimes de carcinoma bucal pesquisados, PIATTELLI et al., em 2002, encontraram positividade para MIB1 nas regiões central e periférica da área de invasão tumoral. No presente estudo, 70% dos espécimes de carcinoma de lábio inferior expressaram positividade suprabasal e desses 57,2% com distribuição difusa (ver TAB. 16 e 17, pág. 111). Uma hipótese para essa diferença pode ser devido ao comportamento menos agressivo e evolução lenta do câncer localizado em lábio. VICENTE et al., em 2002, observaram maior índice proliferativo nos casos de carcinoma bucal classificados como moderadamente e pouco diferenciados, enquanto o índice de baixa proliferação foi mais elevado nos casos bem diferenciados. Assim como TULUMURI et al., em 2002, em uma análise quantitativa, mostraram que o índice médio de positividade para Ki-67 aumentou de acordo com o grau de diferenciação do tumor. No presente estudo, quantitativamente, dois casos classificados como bem diferenciados mostraram um percentual médio de área positiva mais elevado que os casos moderadamente diferenciados (ver ANEXOS 3 e 17). Esses dois casos obtiveram uma expressão para Ki-67 com distribuição difusa, embora um com localização basal e parabasal e o outro com suprabasal. Nesses dois casos, embora classificados como bem diferenciado no segmento avaliado, a biópsia incisional pode não ter refletido o verdadeiro comportamento das lesões, com isso faz-se necessário ressaltar a importância de se trabalhar preferencialmente com biópsias excisionais.

200 Discussão 198 Neste trabalho, não houve, entre nenhum dos três grupos estudados significância estatística do percentual médio de área positiva para o marcador Ki-67. O GRÁFICO 7 (pág. 103) mostra essa leve diferença entre os percentuais médio dos três grupos. O aumento da expressão desse marcador de acordo com a evolução da lesão não ocorreu neste estudo. Para a localização na região suprabasal com distribuição difusa, o grupo das queilites obteve o maior número de casos, enquanto o dos carcinomas o menor (ver GRAF. 34, pág. 155) e para a mesma localização com distribuição focal, os carcinomas obtiveram mais casos e as queilites e hiperplasias, o mesmo número de casos (ver GRAF. 33, pág. 155). De acordo com a TABELA 26 (pág. 133), embora o número de casos de queilite actínica sem displasia epitelial com expressão na região suprabasal e distribuição difusa seja maior do que nos casos com displasia epitelial, o percentual médio de área positiva das queilites com displasia epitelial apresentou-se mais elevado do que nos casos sem displasia epitelial (ver GRAF. 19, pág. 130). No entanto não houve significância estatística desse marcador entre os casos com e sem displasia epitelial do grupo das queilites actínicas. Em 1983, ao produzirem um anticorpo monoclonal designado como Ki-67 contra as células de Hodgkin e Reed-Stemberg, GERDES et al., no entanto, observaram que este anticorpo marcava positivamente o antígeno nuclear restrito ás células sabidamente em proliferação. Após o estudo desse marcador em diversos tecidos normais que continham números variados de células em proliferação, dentre eles a mucosa bucal e em neoplasias malignas, os autores concluíram que este marcador determina o índice de proliferação celular, podendo se tornar um

201 Discussão 199 importante fator prognóstico e auxiliar na escolha de tratamentos apropriados para os tumores malignos. Além disso, sugeriram que este anticorpo poderia auxiliar na detecção de tecidos com proliferação celular atípica, onde poderia se desenvolver uma transformação maligna. O valor prognóstico da identificação da proteína Ki-67 na carcinogênese bucal vem sendo demonstrada em alguns trabalhos na literatura (MACLUSKEY et al., 1999; LIU & KLEIN-SZANTO, 2000; VICENTE et al., 2002; TULUMURI et al., 2002). No entanto, outros marcadores para a proliferação celular são amplamente estudados, como o PCNA, ciclina D 1 e NORs e por isso há uma dificuldade na escolha do melhor marcador para prever o comportamento e evolução de lesões pré-malignas e malignas bucais (SCHILIEPHAKE, 2003). Assim como na sua expressão, esses marcadores também possuem diferenças quanto a sua técnica. A positividade para o MIB1 apresenta-se mais fácil de ser interpretada do que a do PCNA, isso devido ao menor grau de background, mais contraste e intensidade na sua marcação. Apesar do PCNA parecer detectar um número mais elevado de células em proliferação, sua utilização com essa finalidade não é indicada por este marcador detectar duas formas intracelulares distintas de PCNA. Além disso, o antígeno Ki-67 é expresso em quase todas as fases da divisão celular e por isso capaz de também detectar um alto número de células em proliferação (LIU & KLEIN-SZANTO, 2000). LIU & KLEIN-SZANTO, em 2000, ao estudarem a expressão do MIB1, PCNA, cicilna D1 e CENP-F em

202 Discussão 200 leucoplasias e em epitélio bucal normal, concluíram que o MIB1 seria o marcador imuno-histoquímico mais confiável para avaliação de progressão do câncer. 6.6 PERSPECTIVAS O desequilíbrio entre a proliferação e morte celular está diretamente relacionado com a evolução e comportamento das lesões pré-malignas. Muitas vezes, a falta de alterações morfológicas faz com que essas lesões sejam subestimadas mostrando cada vez mais a necessidade da identificação de fatores prognóstico que possam fornecer informações importantes da progressão tumoral dessas lesões. A identificação de marcadores imuno-histoquímicos e a expressão de genes relacionados com a proliferação celular e regulação da apoptose tem se tornado alvo de muitos estudos na linha de pesquisa da carcinogênese bucal objetivando sua aplicabilidade na rotina clínica. A identificação da expressão da proteína p53 mostra-se bastante relevante na pesquisa de fatores prognósticos para lesões pré-malignas, sejam elas intra ou extra-bucais, já que o gene TP53 vem sendo identificado como um dos genes mais alterados no desenvolvimento de tumores malignos. A detecção do anticorpo p53 (DO-7) mostrou-se praticamente positiva em todos os casos dos três grupos estudados com uma distribuição difusa, porém quantitativamente com padrões diferentes. O seu valor como fator prognóstico pode ser questionado já que identifica a proteína nativa e a mutada. A especificidade de um anticorpo que se ligue apenas

203 Discussão 201 a uma proteína mutada faz-se necessária nesses casos. O anticorpo p53 mutado (PAb-240) obteve expressão em todos os grupos porém em um número menor de casos e com uma distribuição focal, revelando assim uma marcação mais fidedigna de mutações nesta proteína. A importância da análise de outros fatores prognósticos foi revelada com a detecção da proteína Bcl-2, relacionada com a inibição da apoptose, que quando localizada na região suprabasal com uma distribuição difusa mostrou-se crescente com a progressão das lesões, expressando uma diminuição na morte celular nas lesões pré e malignas e uma proliferação desenfreada dessas células alteradas. Embora a proliferação celular identificada pelo anticorpo MIB1 não tenha revelado aumento progressivo com a evolução das lesões, em todos os grupos a expressão mais evidente foi em relação à região suprabasal tanto para a distribuição difusa quanto para a focal. A escolha do anticorpo MIB1 para o antígeno Ki-67 revelou-se importante na evidenciação da proliferação celular mais acentuada nas queilites e hiperplasias do que nos carcinomas. A expressão da proteína Ki-67 ocorre em todas as fases de divisão celular, sendo em qualquer momento do ciclo celular alvo para esse anticorpo. A indicação para utilização dos imunomarcadores avaliados neste trabalho na rotina da patologia bucal para avaliar o prognóstico de lesões pré-malignas bucais necessita ainda de mais pesquisas com uma amostra maior, preferencialmente com o uso de biópsias excisionais que revelem o verdadeiro grau ou diferenciação das

204 Discussão 202 lesões e talvez a avaliação de outros imunomarcadores envolvidos na carcinogênese bucal como o Bcl-X, Bax, ciclina D1, telomerase e outros. A associação da imuno-histoquímica com a biologia molecular pode esclarecer algumas dúvidas quanto a expressão de proteínas nos tecidos em estudo, evidenciando o verdadeiro valor prognóstico desses marcadores. Acredita-se que em um futuro breve, a partir de vários trabalhos que vem sendo desenvolvidos na busca de marcadores prognósticos de lesões pré-malignas e malignas bucais, a utilização desses faça parte da rotina da antomia patológica oral como já utilizado em várias áreas da patologia médica para câncer de mama, cólon, linfomas e outros. A incorporação desses procedimentos direcionará a conduta clínica dos profissionais desta área bem como propiciará uma atuação mais preventiva nos pacientes.

205 7 CONCLUSÕES

206 Conclusões CONCLUSÕES Os dados relacionados aos fatores de risco revelam que o carcinoma de células escamosas no lábio inferior e a queilite actínica se manifestam em adultos idosos indicando evolução lenta e progressiva da doença e alta vulnerabilidade da raça branca aos efeitos da radiação UV. A expressão das proteínas p53 e p53 mutada na região suprabasal com distribuição difusa maior no grupo dos carcinomas seguido pelas queilites pode revelar um possível aumento da quantidade de proteínas inativas ou mutadas nas lesões cancerizáveis e malignas. A elevada expressão da proteína Ki-67 na região suprabasal em todos os grupos analisados revela o alto índice proliferativo em todas as lesões estudadas.

207 Conclusões 205 A inibição da morte celular programada revelada possivelmente pela expressão da proteína Bcl-2 mostra-se maior no grupo dos carcinomas, onde provavelmente existe desequilíbrio maior na regulação da apoptose e da proliferação celular. A diferença na análise descritiva e quantitativa entre os marcadores DO-7 e PAb-240 confirma a possibilidade do primeiro se ligar não só à proteínas mutadas, mas também à proteína selvagem, inativadas ou não. Enquanto o segundo parece revelar uma maior especificidade na identificação de proteínas mutadas A expressão mais elevada para os marcadores p53, p53 mutado e Bcl-2 nos casos de queilites actínicas sem displasia revelam a possibilidade que nesses casos já estejam ocorrendo alterações moleculares morfologicamente imperceptíveis.

208 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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219 7 ANEXOS

220 ANEXO 1 Anexos 218

221 ANEXO 2 Anexos 219

222 ANEXO 3 Anexos 220

223 Anexos 221 ANEXO 4 Análise descritiva da marcação imuno-histoquímica no grupo das hiperplasias. Ident p53 - loc p53 - dist p53m - loc p53m - dist Ki67 - loc Ki67 - dist Bcl-2 - loc Bcl-2 - dist SB focal AU ausente SB focal B/BP focal SB focal SB focal SB difuso SB focal B SB difuso B/PB focal SB difuso SB difuso B SB focal AU ausente SB difuso B/BP focal B SB focal SB focal SB focal B/BP difuso B01 35 SB focal SB focal SB difuso B/BP difuso B SB difuso AU ausente SB difuso SB difuso B SB focal AU ausente AU ausente B focal B SB focal B/PB focal SB difuso B/BP focal SB difuso AU ausente AU ausente AU ausente SB difuso SB focal SB difuso B/BP difuso SB difuso SB focal SB difuso B/BP difuso B SB focal AU ausente SB focal AU ausente B SB focal AU ausente SB focal B focal B SB focal SB focal SB difuso B focal B SB focal SB focal SB difuso B focal B SB focal SB focal SB focal B/BP focal B SB focal AU ausente AU ausente B focal B SB focal AU ausente SB focal B focal B SB difuso SB focal SB difuso B/BP focal loc localização; dist distribuição; AU ausente; B basal; B/PB basal e parabasal; SB - suprabasal

224 Anexos 222 ANEXO 5 Análise descritiva da marcação imuno-histoquímica no grupo das queilites actínicas. ident p53 - loc p53 - dist p53m - loc p53m - dist Ki-67 - loc Ki-67 - dist Bcl-2 - loc Bcl-2 - dist M SB difuso SB focal SB difuso SB difuso SB focal SB focal SB difuso SB focal B SB difuso SB focal SB difuso B/BP focal B SB difuso SB difuso SB difuso B/BP difuso B SB focal B/BP focal SB difuso B/BP focal B SB focal SB focal SB difuso B/BP focal M SB difuso SB focal SB focal B/BP focal B SB difuso SB focal SB difuso SB difuso B B/BP difuso SB focal SB difuso B/BP difuso SB difuso SB focal SB focal SB focal SB difuso SB focal SB difuso B/BP difuso B SB focal B/BP focal SB focal B focal B SB focal SB focal SB difuso SB focal B SB focal SB focal SB focal B/BP difuso SB difuso SB focal SB focal B focal SB focal SB focal SB difuso B/BP focal SB difuso SB focal SB difuso SB difuso M SB difuso SB difuso SB difuso SB focal B SB difuso SB difuso B/BP difuso B focal B SB difuso B/BP difuso SB difuso SB difuso loc localização; dist distribuição; AU ausente; B basal; B/PB basal e parabasal; SB - suprabasal

225 Anexos 223 ANEXO 6 Análise descritiva da marcação imuno-histoquímica no grupo dos carcinomas. ident p53 - loc p53 - dist p53m - loc p53m - dist Ki-67 - loc Ki-67 - dist Bcl-2 - loc Bcl-2 - dist B SB focal AU ausente SB focal SB focal B SB difuso AU ausente AU ausente SB focal B SB difuso B/PB focal B/PB focal AU ausente B SB difuso SB focal SB focal SB focal B B/PB focal SB focal B focal SB focal B SB difuso SB difuso B/PB focal SB focal B SB difuso SB difuso SB focal SB difuso B SB difuso SB difuso SB focal SB difuso B SB difuso SB focal B/PB focal SB focal B SB difuso SB difuso SB difuso SB difuso B B/PB focal AU ausente SB difuso SB focal B SB focal SB focal SB focal SB difuso B SB difuso SB focal SB focal SB difuso B SB difuso B/PB difuso SB difuso SB difuso B SB difuso SB difuso SB difuso AU ausente B AU ausente AU ausente SB difuso SB difuso B SB difuso SB focal SB difuso SB difuso B SB difuso SB focal SB difuso SB focal B B/PB focal AU ausente B/PB difuso SB difuso SB focal B/PB focal SB focal SB difuso loc localização; dist distribuição; AU ausente; B basal; B/PB basal e parabasal; SB - suprabasal

226 Anexos 224 ANEXO 7 Análise quantitativa do marcador p53 no grupo das hiperplasias realizada pelo programa Image Pro Plus ident p53 ae p53 ap p53 be p53 bp p53 ce p53 cp p53 final B B B B B B B B B B B B B B B ae, be, ce área total do epitéio nos campos A, B e C; ap, bp, cp - área total da positividade nos campos A, B e C.

227 Anexos 225 ANEXO 8 Análise quantitativa do marcador p53 mutado no grupo das hiperplasias realizada pelo programa Image Pro Plus ident p53m ae p53m ap p53m be p53m bp p53m ce p53m cp p53m final B B B B B B B B B B B B B B B ae, be, ce área total do epitéio nos campos A, B e C; ap, bp, cp - área total da positividade nos campos A, B e C.

228 Anexos 226 ANEXO 9 Análise quantitativa do marcador Ki-67 no grupo das hiperplasias realizada pelo programa Image Pro Plus ident Ki-67 ae Ki-67 ap Ki-67 be Ki-67 bp Ki-67 ce Ki-67 cp Ki-67 final B B B B B B B B B B B B B B B ae, be, ce área total do epitéio nos campos A, B e C; ap, bp, cp - área total da positividade nos campos A, B e C.

229 Anexos 227 ANEXO 10 Análise quantitativa do marcador Bcl-2 no grupo das hiperplasias realizada pelo programa Image Pro Plus ident Bcl-2 ae Bcl-2 ap Bcl-2 be Bcl-2 bp Bcl-2 ce Bcl-2 cp Bcl-2 final B B B B B B B B B B B B B B B ae, be, ce área total do epitéio nos campos A, B e C; ap, bp, cp - área total da positividade nos campos A, B e C.

230 Anexos 228 ANEXO 11 Análise quantitativa do marcador p53 no grupo das queilites actínicas realizada pelo programa Image Pro Plus ident p53 ae p53 ap p53 be p53 bp p53 ce p53 cp p53 final M B B B B M B B B B B M B B E ae, be, ce área total do epitéio nos campos A, B e C; ap, bp, cp - área total da positividade nos campos A, B e C.

231 Anexos 229 ANEXO 12 Análise quantitativa do marcador p53 mutado no grupo das queilites actínicas realizada pelo programa Image Pro Plus ident p53m ae p53m ap p53m be p53m bp p53m ce p53m cp p53m final M B B B B M B B B B B M B B E ae, be, ce área total do epitéio nos campos A, B e C; ap, bp, cp - área total da positividade nos campos A, B e C.

232 Anexos 230 ANEXO 13 Análise quantitativa do marcador Ki-67 no grupo das queilites actínicas realizada pelo programa Image Pro Plus ident Ki-67 ae Ki-67 ap Ki-67 be Ki-67 bp Ki-67 ce Ki-67 cp Ki-67 final M B B B B M B B B B B M B B E ae, be, ce área total do epitéio nos campos A, B e C; ap, bp, cp - área total da positividade nos campos A, B e C.

233 Anexos 231 ANEXO 14 Análise quantitativa do marcador Bcl-2 no grupo das queilites actínicas realizada pelo programa Image Pro Plus ident Bcl-2 ae Bcl-2 ap Bcl-2 be Bcl-2 bp Bcl-2 ce Bcl-2 cp Bcl-2 final M B B B B M B B B B B M B B E ae, be, ce área total do epitéio nos campos A, B e C; ap, bp, cp - área total da positividade nos campos A, B e C.

234 Anexos 232 ANEXO 15 Análise quantitativa do marcador p53 no grupo dos carcinomas realizada pelo programa Image Pro Plus ident p53 ae p53 ap p53 be p53 bp p53 ce p53 cp p53 final B B B B B B B B B B B B B B B B B B B ae, be, ce área total do epitéio nos campos A, B e C; ap, bp, cp - área total da positividade nos campos A, B e C.

235 Anexos 233 ANEXO 16 Análise quantitativa do marcador p53 mutado no grupo dos carcinomas realizada pelo programa Image Pro Plus ident p53m ae p53m ap p53m be p53m bp p53m ce p53m cp p53m final B B B B B B B B B B B B B B B B B B B ae, be, ce área total do epitéio nos campos A, B e C; ap, bp, cp - área total da positividade nos campos A, B e C.

236 Anexos 234 ANEXO 17 Análise quantitativa do marcador Ki-67 no grupo dos carcinomas realizada pelo programa Image Pro Plus ident Ki-67 ae Ki-67 ap Ki-67 be Ki-67 bp Ki-67 ce Ki-67 cp Ki-67 final B B B B B B B B B B B B B B B B B B B ae, be, ce área total do epitéio nos campos A, B e C; ap, bp, cp - área total da positividade nos campos A, B e C.

237 Anexos 235 ANEXO 18 Análise quantitativa do marcador Bcl-2 no grupo dos carcinomas realizada pelo programa Image Pro Plus ident Bcl-2 ae Bcl-2 ap Bcl-2 be Bcl-2 bp Bcl-2 ce Bcl-2 cp Bcl-2 final B B B B B B B B B B B B B B B B B B B ae, be, ce área total do epitéio nos campos A, B e C; ap, bp, cp - área total da positividade nos campos A, B e C.

238 Anexos 236 ANEXO 19 Fatores de risco do grupo das hiperplasias. identificação sexo Idade raça feminino 41 branca B feminino 23 branca B feminino 68 branca B feminino 42 parda B01 35 masculino 61 branca B B masculino 22 branca B feminino 50 branca feminino feminino feminino 49 - B feminino 61 negra B feminino 70 branca B masculino 57 parda B feminino 61 branca B masculino - branca B masculino 48 branca B feminino 49 parda B masculino 63 parda

239 Anexos 237 ANEXO 20 Fatores de risco do grupo das queilites actínicas. Identificação sexo idade raça M B feminino 41 branca B feminino 35 branca B feminino 43 parda B feminino 64 branca M feminino 55 - B feminino 54 branca B feminino feminino feminino 59 - B masculino 48 parda B masculino 55 branca B masculino 25 branca masculino masculino masculino 32 - M B masculino 69 branca B masculino 71 branca

240 Anexos 238 ANEXO 21 Fatores de risco do grupo das queilites actínicas. Identificação Sexo Idade raça B B feminino 51 - B masculino 32 branco B masculino 49 parda B masculino 69 - B masculino 50 branco B masculino 43 branco B masculino 41 branco B masculino 61 branco B masculino 44 branco B feminino 77 branco B masculino 44 branco B masculino 52 branco B masculino 23 branco B masculino 46 branco B feminino 69 branco B masculino 47 branco B masculino 72 parda B masculino masculino 69 -

241 Anexos 239 ANEXO 22 Análise da diferença do percentual médio de área positiva de cada marcador entre os casos de queilite com e sem displasia. Marcador Significância p53 Equal variances assumed,640 Equal variances not assumed,554 p53m Equal variances assumed,220 Equal variances not assumed,035 Ki67 Equal variances assumed,579 Equal variances not assumed,759 Bcl-2 Equal variances assumed,190 Equal variances not assumed,019

242 Anexos 240 ANEXO 23 Análise da diferença entre o percentual médio de área positiva do p53 e p53 mutado em cada um dos três grupos estudados. Grupos Significância Carcinoma Equal variances assumed,006 Equal variances not assumed,007 Queilite Equal variances assumed,002 Equal variances not assumed,004 Hiperplasia Equal variances assumed,010 Equal variances not assumed,013

243 Anexos 241 ANEXO 24 Comparação do percentual médio de área positiva de cada marcador nos três diferentes grupos. Variável (I) Grupos (J) Grupos Mean Difference (I-J) Std. Error Significância p53 carcinoma queilite,2717 1,064 1,000 hiperplasia 3,4745 1, queilite carcinoma -,2717 1,064 1,000 hiperplasia 3,2028 1, hiperplasia carcinoma -3,4745 1, queilite -3,2028 1, p53m carcinoma queilite,5998,288,124 hiperplasia,9507, queilite carcinoma -,5998,288,124 hiperplasia,3509,288,682 hiperplasia carcinoma -,9507, queilite -,3509,288,682 Ki67 carcinoma queilite -,1528,228 1,000 hiperplasia,2105,228 1,000 queilite carcinoma,1528,228 1,000 hiperplasia,3633,228,348 hiperplasia carcinoma -,2105,228 1,000 queilite -,3633,228,348 Bcl-2 carcinoma queilite E-02,021,238 hiperplasia 5.409E-03,021 1,000 queilite carcinoma 3.717E-02,021,238 hiperplasia 4.257E-02,021,136 hiperplasia carcinoma E-03,021 1,000 queilite E-02,021,136 * The mean difference is significant at the.05 level.

244 ANEXO 25 Anexos 242

245 Carcinoma de células escamosas em lábio inferior B85 B90 B91 B95 B97 B98 B99 B99 B00 B00 B00 B01 B01 B01 B02 B02 B03 B02 B Ce Hiper x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x re Para x x x x x x x x x x x x x x x to Orto x x x x x x x x x se Au M u Ti Normal c po Atrófico o Hiperplás. x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x s Ulcerado x x x x x x x x x x x x x x x a Dife Bem x x x x x renci Moderado x x x x x x x x x x x x x x x ação Pouco Elas Presente x x x x x x x x x x x x x x S tose Ausente x x x x x u b Mono x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x m PMN x x xúlcera x x x x x xúlcera x x x xúlcera x x x x xúlcera u In c fil Localizado x o tra Difuso x x x x x x x x x x x x x x x x x x x s do a Leve Moderado x x x x x x Intenso x x x x x x x x x x x x x x

246 Hiperplasia Fibrosa Inflamatória em lábio inferior B97 B99 B99 OCEx OCEx B00 B00 B01 OCEx B02 B03 B03 B03 B03 B03 B03 B O87 Normal Hiper x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x M Ceratose Para x x x x x x x x x x x x x x x x x u Orto x x x c Ausente o Normal x x x s Tipo Atrófico a Hiperplás. x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x Ulcerado x Hiperplasia Presente x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x da basal Ausente Pouco x x x x x x x Celularidade Média x x x x x x x x S Muito x x x x x u Grau Pouco x b colágeno Médio x x x x x x x x x x m Bem x x x x x x x x x u Mono x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x c PMN x o Localiz. x xpmn x x s Infiltrado Difuso x x x x x x x x x x x x x x x x x a Leve x x x x x x x x x x x x x x x x x Moderado x x x Intenso

247 Queilite actínica no lábio inferior Normal B95 B98 B98 B99 M00 M00 B00 B00 OCEx01 B02 B02 B02 M03 B03 B03 B Hiper x x x x x x x x x x x x x x x x x x x Ceratose Para x x x x x x x x x x x x Orto x x x x x x x x x x x x M Ausente u Normal x x x c Tipo Atrófico x x x x x x o de epitélio Hiperplásico x x x x x x x x x x x x x x x x x x s Ulcerado x x x a Tipo de Cristas afiladas x x x x x x x crescim. Cristas rombóides x x x x x Difuso(s/cristas) x x x x x x x x x x x x x x x x x Ausente x x x x x x x x x x x x x x x x Displasia Leve x x x x Moderado Intenso S Elastose Presente x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x u Ausente b Mono x x x x x x x x x x x x x x x x x x x m PMN xúlcera xúlcera xúlcera u Localizado c Infiltrado Difuso x x x x x x x x x x x x x x x x x x x o Leve x x x x x x x x x x x x x s Moderado x x x a Intenso x x x

248 Material e métodos 82 A B C D FIGURA 1: Marcação imuno-histoquímica para: A, Ki-67; B, p53; C, Bcl-2; D, p53 mutado (objetiva 10x).

249 Material e métodos 83 FIGURA 2: Padronização de cores para cada marcador no programa Image Pro Plus 4.1 (objetiva 10x)

250 Material e métodos 84 * *Valor numérico correspondente à área estudada. FIGURA 3: Contagem da área correspondente às marcações positivas dentro da delimitação efetuada. * *Valor numérico correspondente à área estudada. FIGURA 4: Contagem da área correspondente ao epitélio dentro da delimitação efetuada.

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