ESTUDO DA HIDRÓLISE ÁCIDA E ENZIMÁTICA DA BORRA DE CAFÉ COMO ALTERNATIVA DE USO DESTE RESÍDUO
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- Neuza Esteves Camilo
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1 ESTUDO DA HIDRÓLISE ÁCIDA E ENZIMÁTICA DA BORRA DE CAFÉ COMO ALTERNATIVA DE USO DESTE RESÍDUO D.S.Angeli 1, I.C.Moreira 2, A.M. Barbosa 3, C. T Ueno 4. 1-Programa de pós-graduação em Tecnologia de Alimentos Universidade tecnológica Federal do Paraná, CEP Londrina PR Brasil, Telefone (diego.sorge@gmail.com) 2-idem ao 1 (icmorerira@utfpr.edu.br) 3-Departamento de Química Universidade Estadual de Londrina-PR, CEP: Londrina PR Brasil, Telefone (43) (anelibarbosa@gmail.com) 4-idem ao 1 (takeo@utfpr.edu.br) RESUMO: A indústria de café solúvel produz uma grande quantidade de borra de café, com potencial para diversas aplicações. O objetivo deste trabalho foi verificar a eficácia da hidrólise ácida (HCl) e enzimática (Viscozyme L) da borra de café. A hidrólise ácida foi realizada em diferentes condições de temperatura e pressão utilizando-se banho-maria e autoclave. A otimização dos parâmetros da hidrólise enzimática (ph, tempo e temperatura) foram determinadas através de delineamento composto central rotacional (DCCR) utilizando-se como substrato da enzima, papel Whatman n o 1. As melhores condições obtidas para hidrólise da celulose do papel de filtro foram ph 4,0 à 45ºC/hora, equivalente a 50 FBG (Fungal β-glucanase) porém a borra de café hidrolisada enzimaticamente nessas condições, não apresentou resultados satisfatórios. Assim, optou-se pela combinação da hidrólise enzimática seguida da hidrólise ácida utilizando ácido clorídrico (120 ºC/ 2 h), obtendo-se um valor expressivo de glicose quando comparado a hidrólise ácida. ABSTRACT: The soluble coffee industry produces a large amount of coffee grounds waste with many applications. The aim of this study was to assess the effectiveness of acid hydrolysis (HCl) and enzymatic (Viscozyme L) of coffee grounds waste. The acid hydrolysis was performed in different conditions of temperature and pressure using water bath and autoclave. The optimization of the parameters of enzymatic hydrolysis (ph, time, temperature) were determined by central composite design (CCRD) using as enzyme substrate, Whatman nº1 paper. The best conditions obtained for hydrolysis of cellulose filter paper were ph 4.0 at 45 C / hour, equivalent to 50 FBG (β-glucanase fungal) but the coffee grounds enzymatically hydrolyzed under these conditions, did not provide satisfactory results. Thus, it was decided by a combination of enzymatic hydrolysis followed by acid hydrolysis using hydrochloric acid (120 C / 2 h) to yield a significant amount of glucose compared to acid hydrolysis. PALAVRAS-CHAVE: Resíduo lignocelulósico, Viscozyme L, Planejamento experimental. KEYWORDS: Lignocellulosic residue, Viscozyme L, Factorial design
2 1. INTRODUÇÃO A industrialização limpa é um tema muito discutido atualmente, cujo principal objetivo é a minimização da geração de resíduos e concomitantemente, a aplicação em recursos renováveis. A Química Verde é uma área da química que vem crescendo, tendo como foco do estudo o reaproveitamento dos resíduos industriais, proporcionando maior valor agregado e, ao mesmo tempo incentivando o uso dos mesmos como matéria-prima em outros processos industriais, desde a produção de alimentos até de medicamentos (Ferreira et al, 2013). O café é uma das bebidas mais consumidas mundialmente. A praticidade de preparo e a melhora na qualidade do café solúvel tem estimulado o consumo deste produto, somente no Brasil foram produzidas 60 mil toneladas de café solúvel em A produção de café solúvel segundo Viotto (1991) ocorre em várias etapas: primeiro a limpeza dos grãos através da retirada de impurezas, a torrefação dos grãos onde se determina o grau e a cor, a moagem ou granulação onde os grãos são triturados aumentando a superfície de contato e o rendimento da extração e em seguida, a extração. O processo de extração utiliza água à temperatura de 180 ºC removendo as substancias solúveis do café. Após esta etapa, o extrato segue para a clarificação e posteriormente por um processo de concentração e secagem por pulverização (spray drying) ou liofilização (freeze drying). A borra é o resíduo sólido obtido após a etapa de extração. Em média para cada tonelada de café verde obtêm-se 480 kg de borra, a qual é utilizada para gerar energia nas caldeiras da indústria de café solúvel (Adam e Dougan, 1985). Logo, devido a quantidade de borra de café gerada há uma necessidade de destinação adequada, bem como estudos para gerar valor agregado a partir deste resíduo. Uma alternativa de utilização da borra de café é a hidrólise ácida originando produtos fermentáveis para obtenção de biocombustíveis (etanol). Mussatto e cols. (2010) hidrolisaram a borra de café utilizando ácido sulfúrico em diferentes concentrações e relataram que os produtos obtidos são constituídos em sua maioria por carboidratos (manose, galactose e arabinose). Outra opção é a utilização de catálise enzimática, visando a hidrólise da celulose, a qual tem sido muito estudada atualmente, oferecendo boa conversão, porém são poucos os processos em fase comercial devido aos custos e eficiência (Castro e Pereira, 2010). O desenvolvimento de processos enzimáticos de hidrólise que sejam viáveis economicamente está relacionado com a abundância de material celulósico na natureza, custos de produção e a destinação dos açúcares resultantes que poderão ser utilizados para a produção de etanol, mas também para a obtenção de uma grande variedade de outros produtos químicos (Rossel e Soares, 2009). 2 MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Borra de Café A borra de café estudada foi proveniente de café torrado 100% arábica após a extração industrial de sólidos solúveis para a produção de café solúvel. A amostra de borra foi coletada após a prensagem e submetida à secagem em estufa a 65 ºC por 48 horas e cedida gentilmente pela Cia. Cacique de Café Solúvel de Londrina - PR.
3 2.2 Métodos Hidrólise ácida da borra de café com ácido clorídrico diluído em autoclave e em banho maria: A hidrólise ácida foi realizada em frascos Erlenmeyer de 250 ml contendo 0,3 ± 0,001 g de amostra em base seca e 10 ml ácido clorídrico 0,6M. Em seguida, o frasco contendo a borra e ácido foi submetido à autoclavagem (120min./121 ºC, à pressão de 1 Kgf). Após esse processo, a amostra foi resfriada até temperatura ambiente, filtrada em fibra de vidro e transferida para um balão volumétrico de 100 ml e completando-se o volume com água ultrapura Milli-Q (Millipore, MA, EUA) e homogeneizada. A solução obtida acima foi filtrada novamente em membrana de 0,22 μm (GVWP Millipore, MA, EUA), e transferida para cartucho Sep-Pak C18 (Waters, Milford, EUA) précondicionado com metanol e água para ultra filtração. As primeiras gotas foram descartadas e na sequencia coletou-se a amostra para análise cromatográfica. A hidrólise em banho-maria foi realizada a 85ºC por 180 minutos, utilizando igual quantidade de amostra e volume e concentração de ácido descrita anteriormente na hidrólise em autoclave. As etapas de extração e análise seguiram os mesmos protocolos acima descritos. Hidrólise enzimática da borra de café com a enzima comercial Viscozyme L : O processo de otimização da hidrólise enzimática foi realizada utilizando-se um planejamento experimental do tipo delineamento composto central rotacional (DCCR). O planejamento experimental foi gerado pelo programa Statistica 8.0 sendo os parâmetros selecionados: concentração da enzima Viscozyme L (10 a 50 FBG), temperatura de incubação da enzima (35 a 55 ºC), ph (3,0 a 5,0) e o tempo (0,5 a 2,5 h). Os níveis destas variáveis estudadas estão descritos na Tabela 1. Tabela 1. Níveis de variáveis independentes Variáveis Independentes Níveis [Viscozyme L ] (FBG) Tempo (horas) 0,5 1 1,5 2,0 2,5 ph 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 Temperatura (ºC) A quantidade de glicose proveniente da hidrólise enzimática foi calculada segundo o método de sacarificação com celulase proposto por Mendels e cols. (1976) in vitro, em tubo de ensaio onde foi adicionada a enzima Viscozyme L conforme descrito na Tabela 1. O volume final foi completado com água até 1 ml quando necessário e adicionado 0,5 ml de tampão citrato-fosfato. O substrato utilizado para essa reação foi uma tira de papel de filtro Whatman nº 1 de 50 mg (1 x 6 cm aproximadamente), introduzido no tubo até permanecer totalmente submerso na solução. As condições de incubação em banho-maria estão especificadas na Tabela 1. Após o tempo de reação o tubo de ensaio foi mantido em banho de gelo para interrupção da reação enzimática. Após 5 minutos, adicionou-se 3 ml de solução de DNS e os tubos foram mantidos em banho-maria fervente por 5 minutos e transferidos para um banho de água fria e interrompida a reação. Em seguida, adicionou-se 16 ml de água destilada, sendo realizada a leitura em espectrofotômetro a 550nm para determinar a quantidade de glicose, conforme o método de determinação de açúcar redutor descrito Miller e colaboradores (1959).
4 Uma vez determinadas as condições ótimas da hidrólise enzimática da borra de café com a enzima Viscozyme L, uma nova amostra de borra (0,3000 ± 0,001 g) foi hidrolisada seguindo os parâmetros definidos pelo DDCR. Outra amostra de borra (0,3000 ± 0,001 g) foi submetida a uma nova hidrólise conforme descrita anteriormente com a enzima Viscozyme L e posteriormente adicionado 10mL de ácido clorídrico 0,6M (hidrólise combinada) e autoclavadas e em seguida retiradas devidamente as amostras para análise cromatográfica e verificação do perfil de carboidratos. Sistema cromatográfico e condições analíticas utilizadas para a detecção de carboidratos: O sistema cromatográfico utilizado consistiu de bomba inerte de alta pressão (LC-10Ai - Shimadzu), válvula solenoide de baixa pressão de três vias (NResearch ), circuitos externos Labmade ; controladores de válvulas e célula; válvula de alta pressão de 10 vias (VICI-C EP); Forno Waters com controlador (CHX 650 Pickering), fonte de ± 12 V (RS570-Stanford), célula eletroquímica Au (ED-50-Dionex), interface e potenciostato Autolab (PGSTAT 30- Eco Chemie), Computador Pentium D com software (GPES Eco Chemie V.4.9). Para a execução dos experimentos foram utilizados pré-coluna e coluna CarboPac PA1 (4,0 x 250 mm, Dionex, Sunnyvale, EUA) a 28 o C, sistema em modo isocrático com fases: NaOH 1,4 mmol L -1 (como eluente: 0-45 min e como fase de reequilíbrio: 57,6-72,6 min) e NaOH 300,0 mmol L -1 (para a regeneração: 45,1-57,5 min). O fluxo foi de 1,0 ml min -1 ; com volume de injeção de 20,0 µl; forma de onda de pulso em amperimetro ED-50-Au: 0,20 V (400 ms); 0,65 V (200 ms) e -0,20 V (400 ms). O tratamento de dados foi feito com software INTEGRA. 3 RESULTADOS E DISCUSSÕES 3.1 Hidrólise Enzimática Planejamento experimental DCCR: Os gráficos de superfície de resposta obtidos a partir dos dados do planejamento DCCR estão apresentados a seguir na Figura1. Figura 1 - Gráficos de superfície de resposta: (a) glucose obtida em função do tempo de reação da hidrólise do papel Whatman n o 1 e concentração da enzima Viscozyme L, (b) glucose obtida em função do ph da solução tampão utilizada e o tempo de hidrólise do papel Whatman nº 1, (c) glucose obtida em função da temperatura e tempo de hidrólise do papel Whatman nº 1. (a) (b) (c)
5 A partir dos dados obtidos do DDCR foi deduzida a equação de regressão para o rendimento em glucose (R) descrita a seguir: R = -130, ,947E - 0,013E 2 +15,218t -7,369t 2 +3,11p - 4,363p 2 + 4,428T - 0,071T 2-0,269E.t + 0,031E.p - 0,002E.T + 5,135 t.p - 0,138t.T + 0,564p. Onde: R corresponde ao rendimento em glucose, E a concentração de enzima, t o tempo de reação, p o ph da solução tampão e T a temperatura utilizada. Após a análise dos resultados do DDCR pelo programa Statistica 8.0 foi possível determinar as condições ótimas de hidrólise da celulose do papel Whatman nº 1 em função da concentração de glucose proveniente da hidrólise enzimática: 50 FBG de Viscozyme L em ph 4,0 por 1 hora de reação à 45 ºC. Nestas condições, o valor preditivo da quantidade de glicose da hidrólise enzimática do papel Whatman nº 1 foi de 44,35 mgl -1. O valor obtido de glucose a partir da hidrólise experimental realizada nas condições acima descritas foi de 42,04 + 1,43 mgl -1 de glucose, o qual esta dentro da faixa preditiva do valor calculado pela equação. A borra de café também foi submetida a hidrólise com a Viscozyme L nas condições otimizadas pelo DCCR acima descritas, porém a enzima não hidrolisou a borra. 3.2 Análise Comparativa entre as Hidrólises A Tabela 2 apresenta os resultados das análises de carboidratos obtidos a partir das hidrólises ácida em autoclave (AA), ácida em Banho Maria (ABM) e combinada: enzimática e ácida em autoclave (E + AA) da borra de café. Tabela 2. Comparação dos carboidratos resultantes das hidrólises ácida em autoclave, banho-maria e ácidas, e combinadas: enzimática e ácida em autoclave da borra de café. Carboidratos (%) Manitol Arabinose Galactose Glucose Xilose Manose Frutose AA ** N.D.* N.D.* 0,37 + 0,12 2,06 + 0,15 N.D.* 12,16 + 0,39 N.D.* ABM *** N.D.* N.D.* 0,41 + 0,01 0,24 + 0,01 N.D.* 3,42 + 0,015 N.D.* E + AA **** N.D.* N.D.* 0,84 + 0,27 35,8 + 21,22 N.D.* 9, ,05 N.D.* * Não Detectado, ** Ácida em Autoclave, *** Ácida em Banho Maria, **** Combinada: enzimática em e a ácida em autoclave. A quantidade de glucose gerada sob as diferentes condições de hidrólise demonstrou que a combinação da hidrólise ácida, seguida da hidrólise enzimática é mais eficiente e, observando-se os valores obtidos com a hidrólise a altas temperaturas (autoclave) pode-se observar o efeito do calor. A baixa hidrólise em baixas temperaturas é devido à própria resistência desses polímeros à hidrólise, entretanto cabe ressaltar que em altas temperaturas é possível ocorrer a conversão da glucose em ácido fórmico (Yoon, et al 2014). 4 CONCLUSÕES A hidrólise ácida em autoclave foi mais eficiente do que a realizada em banho-maria, visto que há uma maior quantidade de monossacarídeos no hidrolisado.
6 Os resultados do planejamento DCCR demonstraram que as condições ótimas de hidrólise da celulose do papel Whatman nº 1 utilizando-se a Viscozyme L foram: 50 FBG de Viscozyme L em ph 4,0 por 1 hora de reação à 45ºC. O valor preditivo nestas condições, em glucose foi 43,18 mgl-1, enquanto que o resultado experimental obtido foi 42,04 + 1,43 mgl-1 de glucose, o que esta em concordância com o modelo utilizado. A hidrólise enzimática da borra de café quando empregado apenas a Viscozyme L, não foi eficiente, provavelmente devido a inativação da enzima por compostos oriundos da torra do café ainda presentes na borra. A combinação das hidrólises enzimática e ácida em autoclave da borra de café foi mais eficaz, sugerindo a possibilidade de aplicar esse processo em escalas maiores, entretanto é importante salientar o custo da enzima. A hidrólise ácida prévia da borra do café pode ser um processo interessante visto que facilita o processo de hidrólise enzimática seguinte. Tal informação é promissora, pois assim será possível estudar a hidrólise enzimática da borra do café por micro-organismos produtores de celulases e ligninases combinada com hidrólises ácidas prévias. 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS Adam, M. R.; Dougan, J. (1985) Waste Products, Coffee, VII - Technology, ed. R. J. Clarke and R Macrae, Elsevier Applied Science Publishers, London, pp Castro, Aline Machado; Pereira, Nei Jr (2010) Produção, propriedades e aplicação de celulases na hidrólise de resíduos agroindustriais. Química Nova, 33(1), Ferreira, V. F.; Da Rocha, D. R.; Da Silva, F. C. (2013); Química Verde, Economia Sustentável e Qualidade de Vida. Data de publicação na Web: 12 de outubro de Rev. Virtual Quim., Disponível em: Mandels, M.; Andreotti, R.; Roche, C (1976). Measurement of saccharifying celulase Biotechnol. Bioeng. 6., Miller, G. L.(1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar Analytical Chemistry, Washington, US, 31(3) Mussato, Solange I. ;Carneiro, Livia M.,Silva, João P.A.;Roberto, Inês C.;Teixeira, José A. (2010). A study on chemical constituents and sugars extraction from spent coffee grounds; Carbohyd. Polym.,São Paulo SP; 83, Rossell, C. E.,& Soares, P. A. (2009). Conversão da Celulose pela Tecnologia Organosolv (Vol. 3). São Paulo: Naippe. Viotto, Luiz. A.(1991) Projeto e Avaliação econômica de sistemas de Secagem de Borra de Café (Dissertação de Mestrado). Campinas: UNICAMP. Yoon, S.Y., Han S.H., Shin S. J. (2014) The effect of hemicelluloses and lignin on acid hydrolysis of cellulose. Energy (77)
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