Fisiologia I. Como é que se gera um potencial de repouso?

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1 Fisiologia I Data: 9 de Novembro de 2007 (8ª aula) Docente: Prof. Mário Marques Desgravado por: Micaela Caixeiro; Carla Pereira; Margarida Cunha Tema: Potencial de Membrana; Potencial de Repouso Como é que se gera um potencial de repouso? É algo que existe virtualmente em todas as células do nosso organismo. Todas as células sejam elas excitáveis ou não excitáveis, possuem um potencial de repouso. A célula excitável é a célula que tem a capacidade de responder a determinado tipo de estímulos. Ex: células nervosas e células musculares, que tipicamente respondem as estímulos, transmitindo um impulso eléctrico ou então contraindo-se. Por outro lado, algumas células são capazes de gerar transformações rápidas destes potenciais através de toda a membrana -estas células geram potenciais de acção. Existem ainda outras células em que há transformações locais do potencial de membrana, isto é, as variações são apenas num local da membrana e não em toda a célula, neste caso, comandam diversas funções da célula. Ex: células glandulares (endócrinas) face a determinados estímulos respondem libertando várias substâncias que estão armazenadas nos seus gânglios e isso faz-se através da despolarização, muitas vezes, de uma parte da membrana dessas células. Também alguns macrófagos e as células ciliadas respondem a variações do potencial em locais da membrana. As células ciliadas ao nível da árvore respiratória arrastam o muco em direcção à faringe para posteriormente se conseguir deglutir com os restos celulares. Nas células da mucosa respiratória superior, os cílios empurram o muco para baixo também para ser deglutido. 1/15

2 Para se perceber tanto o potencial de repouso como as variações do potencial, nomeadamente o potencial de acção, tem de se ter em conta um conceito básico que se designa por potencial electroquímico. Potencial electroquímico permite definir as contribuições relativas de duas vertentes fundamentais. Por um lado, é a concentração de substâncias dos dois lados de uma membrana e por outro lado, o potencial eléctrico que também existe nos dois lados de uma membrana. Quando num sistema, seja ele uma célula, que é mais complexo, ou uma tina de uma membrana semipermeável, se se puser concentrações iónicas diferentes dos dois lados, vai haver movimento iónico. No entanto, se se aplicar um potencial eléctrico dos dois lados pode potenciar-se esse movimento, inibi-lo ou anulá-lo. Isto é um conceito fundamental, pois não se deve pensar só ao nível de concentrações iónicas, mas também ao nível de potencial eléctrico. A B - + 1M - + 0,1M X X Fig.1 A concentração do ião X monovalente positivo é muito superior do lado A e cerca de 10 vezes inferior do lado B. A tendência é, se a membrana for permeável aquele ião, haver um equilíbrio de concentrações. O que acontece, é que os iões positivos vão começar a acumular-se do lado B, ou seja a porção A fica mais negativa em relação à B. Vai haver uma altura em que as cargas positivas do lado B vão evitar que mais iões positivos atravessem para esse lado e atinge-se aquilo que chamamos o estado de equilíbrio electroquímico. O estado de equilíbrio electroquímico não significa que não haja movimento de iões, existe sim um movimento aleatório dos mesmos, só que a quantidade de iões que está a passar nessa altura de um lado para o outro da membrana é basicamente semelhante por unidade de tempo ao que passa em sentido inverso, dizemos que se atingiu o estado de equilíbrio electroquímico. 2/15

3 O que é o potencial electroquímico? O potencial electroquímico de um sistema (transpondo para a membrana celular) deve ser igual ao potencial electroquímico de um lado da membrana, menos o potencial electroquímico do outro lado da membrana. Em termos de membranas, quando falamos de células e de membranas celulares, é sempre do interior para o exterior da célula. É por isso que se diz que o potencial de repouso de uma célula é de 90 mv. Isto significa que o interior da célula está carregado negativamente e o exterior positivamente. Isto é igual a: Equação de Nernst: (RT logaritmo neperiano da concentração de A sobre a concentração de B, mais zf vezes a diferença de potencial electroquímico dos dois lados da membrana) Δμ (X +) = μa (X+) μb ( X+) = RT ln [X+]A + z F (EA EB) [X+]B R constante de gás ideal T temperatura absoluta (Kelvin) T = -273,15ºC [X+]A concentração do lado A da membrana [X+]B concentração do lado B da membrana Concentração iónica do potencial electroquímico F constante de Faraday z número de iões que tem o ião em causa e com o sinal respectivo, isto é, se se fala do sódio é +1, do potássio é +1, do cloro é 1, do cálcio EA EB diferença de potencial electroquímico. Nesta porção da fórmula, joga-se com o potencial eléctrico que há dos dois lados da membrana. Quando se fala em potencial electroquímico, tem sempre de se pensar, por um lado em concentrações iónicas, por outro lado em diferença de potencial. É o conjunto disso que vai fazer com que os sistemas estejam em equilíbrio. Em equilíbrio, a diferença de potencial electroquímico é igual a zero. Portanto da equação anterior, temos : RT ln [X+]A + z F (EA EB) = 0. [X+]B 3/15

4 Resolvendo para EA EB: (EA EB) = - RT ln [X+]A zf [X+]B ou: (EA EB) = RT ln [X+]B zf [X+]A Simplificando, se se pensar que o logaritmo de base 10 é igual a 2, 303 ln, que as unidades de RT/F podem ser em mv (a unidade que normalmente se usa em potenciais de membrana), que a 30 ºC, (2,303 x R x T) /F = 60 mv então, sabendo que este valor praticamente não muda com a temperatura, pode usar-se a fórmula simplificada: ou: (EA EB) = - 60 mv log 10 [X+]A z [X+]B (no caso do potássio z =1) (EA EB) = 60 mv log 10 [X+]B z [X+]A Esta fórmula é de grande importância para se perceber a lei de Nernst, que é a base de tudo o que tem a ver com potencial de membrana, equilíbrio iónico no potencial de membrana. A lei de Nernst calcula o valor da diferença de potencial, onde determinados iões, com determinada concentração, entram em equilíbrio. Se o valor do potencial de membrana for igual a esse valor, não há movimento, fica em equilíbrio. Consoante for menor ou maior, ou mudar de sinal pode prever-se qual irá ser o movimento iónico através dos dois lados da membrana. 4/15

5 Exemplo de um estado de equilíbrio: A = B - + 0,1M - + 0,01M K K Fig.2 A concentração do lado A da membrana é 10 vezes superior ao outro lado da membrana. Se aplicar a equação de Nernst, temos: (EA EB) = - 60 mv log 10 [X+]A z [X+]B em que z = +1 do ião potássio [X+]A =10 log10 10 = 1 logo, (EA EB) = 60mV. [X+]B Nota: Também se usa muito 61 mv, porque perto dos 37ºC aumenta ligeiramente. A própria célula de momento para momento vai variando, logo é indiferente referir 60 mv ou 61 mv. Para não haver movimento iónico numa tina com estas características, com estas duas soluções, tem de se aplicar aqui uma diferença de potencial de 60mV. Se tiver essa diferença de potencial aplicada, sabe-se que o número de iões que passa para um lado, iguala o outro e está em estado de equilíbrio, sem movimento iónico significativo. 5/15

6 Exemplo de um estado de não equilíbrio: A B + - 1M + - 0,1M - - HCO HCO Fig.3 Neste caso temos o ião bicarbonato (HCO3 -) que está 10 vezes mais concentrado de um lado da membrana que do outro. Vamos calcular aqui a equação de Nernst para este sistema: (EA EB) = - 60 mv log 10 [X+]A em que z = -1 z [X+]B (EA EB) = 60 mv x 1 (EA EB) = + 60 mv Significa que se tivesse aplicado do lado A da membrana uma corrente com +60 mv, o sistema estaria em equilíbrio. Não havia passagem iónica significativa para nenhum dos lados. A) Se se aplicasse um potencial eventual de +100mV, então o sistema não ficaria em equilíbrio. O ião está mais concentrado negativamente do lado A, pelo que tem tendência a passar para o lado B, mas como se aplica uma corrente positiva do lado A da membrana, esta tende a reter o ião do lado A. Então, se tiver + 100mV, o que é que vai acontecer? Ultrapassa o valor obtido pela equação de Nernst para o estado de equilíbrio, o que se significa que vai existir movimento iónico, neste caso particular da parte menos concentrada para a mais concentrada, uma vez que o potencial aplicado é superior a +60mV. B) Se se aplicar aqui uma corrente de +20mV, também não está existe equilíbrio. Porque os +20mV não chegam aos +60mV que seriam necessários para manter o sistema em estado de equilíbrio. Assim, não há uma passagem tão grande 6/15

7 como haveria se não houvesse nenhuma corrente aplicada, mas os iões HCO3- vão passar do lado A para o lado B da membrana.. Importância da equação de Nernst: Pode dizer-se que, essencialmente, o que faz a equação de Nernst é predizer a direcção de um fluxo iónico para um determinado ião. Temos quatro hipóteses: 1) Se a diferença de potencial medida através da membrana for igual à calculada pela equação de Nernst, existe um estado de equilíbrio, em que não há movimento iónico - Exemplo de um estado de equilíbrio; 2) Se a diferença de potencial medida for do mesmo sinal mas superior à calculada, a força eléctrica é superior à das concentrações e portanto determina a direcção dos iões; 3) Se a diferença de potencial medida for do mesmo sinal mas inferior à calculada, a força de diferença de concentrações é superior à eléctrica determinando a direcção dos iões; 4) Se a diferença de potencial medida for de sinal contrário à calculada, ambas as forças têm a mesma direcção, não podendo haver equilíbrio. As duas forças vão puxar o ião exactamente para o mesmo lado da membrana e portanto vai haver um desequilíbrio iónico franco. Isto são as hipóteses que existem de movimento iónico através de uma membrana pelo que o que a equação de Nernst permite é fazer a previsão do movimento iónico através daquela membrana. Um outro conceito muito importante, o de condutância, tem a ver com permeabilidade iónica das membranas. A questão é que existem vários canais, como a bomba de sódio/potássio e variadíssimas estruturas que vão dar, principalmente os canais, a passagem iónica de um lado para o outro da membrana. Sabe-se que a permeabilidade para determinado ião em repouso pode ser uma permeabilidade muito alta ou muito baixa e muitas vezes até modificável como quando existe um potencial de acção. Os canais de sódio, por exemplo, não têm sempre a mesma permeabilidade. Em repouso têm mais ou menos a mesma permeabilidade, podendo até ser impermeáveis. Mas face a um estímulo adequado que vai desencadear um 7/15

8 potencial de acção, esses canais sofrem uma transformação mecânica e permitem a passagem de iões muito rapidamente para o interior da célula. A condutância depende das características da membrana e do ião num determinado momento, assim se num recipiente tivermos uma membrana impermeável não há passagem iónica de um lado para o outro da membrana. Dois exemplos importantes (Fig.4): Do lado A, a representação de uma membrana, isto é, a representação imaginária do interior da célula, como se fosse uma fibra nervosa em que a membrana é somente e muito permeável aos iões potássio. Os iões potássio estão em grande concentração no interior da célula. Fig.4 A concentração extracelular de potássio, valor que se obtém quando se efectua num laboratório um ionograma valor da caliémia é à volta de 4 meq/l e no interior da célula é cerca de 35 vezes mais, portanto à volta de 140 meq/l. Sendo assim, se a membrana é altamente permeável ao potássio, qual é a tendência? A tendência do potássio é sair muito rapidamente da célula. Fazendo as contas, pela equação de Nernst, conclui-se que (atenção que é uma célula hipotética, é um valor médio, nem todas as células têm o mesmo valor de potencial de repouso), a maior parte das células nervosas, tem um potencial à volta dos -90mV. Numa célula destas, se se tivesse iões potássio e uma alta permeabilidade ao potássio, este sairia, pelo que seria necessário aplicar um potencial de -94mV para que não houvesse saída de potássio. Isto porque ao existir um potencial negativo no interior da célula, há atracção dos iões positivos e, portanto, entrava em estado de equilíbrio e obtinha um valor de potencial de membrana de cerca de-94 mv. Curiosamente isto fornece uma pista -94mV já é muito próximo do valor do potencial de repouso que se mede numa célula nervosa, que é à volta dos -90 mv, ou seja, isto 8/15

9 sugere fortemente que num potencial de repouso há uma altíssima permeabilidade ao potássio. Na fig.4, do lado B, um outro exemplo, onde só há uma alta permeabilidade para os iões sódio. Com os iões sódio é exactamente ao contrário. Existe habitualmente, uma concentração plasmática, portanto extracelular de sódio que ronda os 140 meq/l. Se tiver um potencial no interior da célula de +61 mv, e se só tiver iões sódio a passar de um lado para o outro da membrana, não há passagem iónica. Ao obter aqui + 61 mv pela lei de Nernst a concentração no interior da célula teria que ser 10 vezes inferior à concentração no exterior da célula, ou seja, 14 meq/l, porque senão não obtinha o valor na lei de Nernst. Como já foi referido, estes são valores médios, há células que têm outros valores, mas a base do raciocínio é sempre a mesma. Se o potencial de repouso medido ronda os -90mV, provavelmente a permeabilidade ao sódio, não é muito grande no estado de repouso da célula, porque senão puxaria esse potencial para valores, como por exemplo -30 ou -20mV. Sendo o potencial de repouso muito próximo de -90mV, verifica-se que existe uma alta permeabilidade ao potássio e uma baixa permeabilidade ao sódio. A equação de Goldman permite calcular o potencial da membrana, relacionando concentrações iónicas no interior e exterior da célula e permeabilidades iónicas. Ou seja na lei de Nernst parte-se do princípio que a permeabilidade é total. Na lei de Goldman é aplicada também a condutância iónica a determinado ião, sendo igual a: EMF = -60 log [Na + ] i P (Na + ) + [K + ] i P (K + ) + [Cl - ] e P (Cl - ) [Na + ] e P (Na + ) + [K + ] e P (K + ) + [Cl - ] i P (Cl - ) 9/15

10 Nota: pelo facto de o cloro ter uma carga negativa, para obter esta fórmula tem que se inverter. [] concentração iónica P permeabilidade i intracelular e extracelular Condutância é o inverso da resistência, quando se fala de corrente directa. Se for corrente alterna, tem o nome de admitância. A equação de Goldman aplica-se, da mesma maneira, quando existe um potencial de acção. O que muda são, fundamentalmente, as permeabilidades quanto maior a permeabilidade a um ião mais relevo vai ter o potencial de equilíbrio para esse ião. Assim, se se aumentar muito e de repente, a permeabilidade para o sódio e se baixar a permeabilidade para o potássio o potencial no interior dessa membrana vai tender a ficar positivo. Isto porque o potencial de equilibrio para o sódio é de + 61mV. Conceito Importante No Instituto de Investigação da Faculdade trabalha-se muito em SNC (equipa chefiada pelo Prof. Silva Carvalho - regulação cardio-vascular e SNA) e algo que se faz quase diariamente, é o registo de potenciais de membrana principalmente a nível de células do SNC e das células de alguns músculos, etc. Para tal: Utilizam-se eléctrodos que são introduzidos no interior das células. Utiliza-se depois algo que meça a diferença de potencial (galvanómetro, potenciómetro ou voltâmetro). O eléctrodo (geralmente de vidro muito fino, com a ponta inferior de cerca de 0,1micron com uma solução) transmite, com uma resistência muito alta, na ordem dos 1 milhão de ohms, tornando possível registar a diferença Fig. 5 10/15

11 de potencial entre o eléctrodo que está o interior da célula (que entra pela membrana) e outro que está aplicado no liquido extracelular. Este pode ser considerado eléctrodo de referência ou neutro (termo pouco correcto). Quando os eléctrodos estão no exterior da célula, estão no mesmo local, e como os líquidos intra e extracelular são bons condutores não existe diferença de potencial. Quando o eléctrodo entra dentro da fibra (Fig.5), o voltâmetro desvia-se para -90mV (valor teórico mas que existe muitas vezes nas células nervosas). Se depois se continuar a empurrar, para ele sair novamente da célula, o eléctrodo volta novamente ao líquido extracelular e a um potencial de 0. Está representado em esquema o reequilíbrio das cargas que existem dentro da célula nervosa (Fig.6). Fig.6 Repare-se que o que está representado é uma porção muito pequena, sendo na realidade muito maior em comprimento, o que sugere que provavelmente, se precisa de muito poucas cargas (em relação ao número total de cargas que existem dentro da célula) a mudar de um lado para o outro da membrana para gerar o potencial de repouso e de acção. Que é o que efectivamente acontece. Para ter uma ideia, basta 1 para 3 milhões ou 1 para 100 milhões do total de iões positivos intracelulares atravessar a membrana do interior para o exterior para gerar o potencial de repouso da célula. Portanto, a quantidade de iões que necessita de passar é bastante escassa. De igual modo apenas é preciso uma pequena quantidade de iões positivos passar do exterior para o interior da célula para reverter o potencial de -90mV para +35mV em menos de 0,1mseg. Assim, quando se desencadeia um potencial de acção, o que ocorre é uma diferença de permeabilidade, que permite que o sódio entre facilmente para dentro da célula, levando a que o potencial se aproxime do potencial de equilíbrio para o sódio o que vai gerar um potencial que habitualmente chega aos +30 ou +35mV. 11/15

12 Conceitos Importantes: Bomba de sódio-potássio (Fig.7) É um mecanismo importante, sem o qual seria muito difícil manter diferenças de concentração iónica. Mas, como saber qual a importância da bomba sódio-potássio na génese do potencial de repouso? Fig.7 Há fármacos cuja administração inibe o funcionamento da bomba de sódio-potássio. Numa experiência, no laboratório, o que se verifica é que a contribuição desta bomba é relativamente escassa para a génese do potencial de repouso, no entanto não deixa de ser importante na manutenção do equilíbrio de concentrações entre sódio e potássio. O desequilíbrio entre esses dois iões é mantido, já que, de cada vez que há saída de 3 iões de sódio (Na + ), há entrada de apenas 2 iões de potássio (K + ), o que leva a um acréscimo de cargas positivas no exterior da membrana e um deficit de cargas positivas no interior da membrana. A bomba de sódio-potássio funciona continuamente, é electrogénica, isto é, por si só gera uma diferença de potencial entre o interior e exterior da célula e consome energia. Canais de escape sódio-potássio: Existem em todas as membranas celulares. São canais proteicos nos quais em repouso a permeabilidade ao potássio é cerca de 100 vezes superior à permeabilidade ao sódio. Este é um facto de extrema importância, já que a maior permeabilidade da membrana ao potássio, em repouso, faz com que todo o potencial da célula se aproxime do potencial de equilíbrio do potássio. É esse o factor fundamental para a génese do potencial de repouso. Assim, em resumo pode dizer-se que para a origem do potencial de repouso há uma contribuição do potencial de difusão do potássio, do sódio e do cloro o cloro, apesar de ter sido pouco falado é o terceiro ião, em quantidade, que existe dos dois lados da membrana; a contribuição da bomba sódio-potássio e dos aniões intra- 12/15

13 citoplasmáticos que não atravessam a membrana. Relativamente a estes últimos repare-se que algumas terminações principalmente proteicas são aniónicas e não atravessam a membrana, portanto é provável (e em algumas células isso acontece) que a existência de aniões inorgânicos não permeáveis na membrana tenha alguma contribuição para o potencial negativo que existe no interior da célula. Contribuições para a origem do Potencial de Repouso: Contribuição do potencial de difusão do potássio: A taxa de concentrações de potássio no interior e exterior da célula é de cerca de 35 para 1, então log 35 = 1,54 1, 54. (-61) = -94mV Este é o valor (-94mV) da contribuição do potássio para a génese do potencial de repouso. Contribuição do potencial de difusão do sódio: A taxa de concentração de sódio, interior (14mEq/L) / exterior (140mEq/L), da célula é de 0,1. A equação de Nernst, no estado de equilíbrio é de +61mV, no entanto a permeabilidade ao potássio é 100 vezes superior. Com a equação de Goldman verifica-se que o sódio tem muito pouca influência na mesma, em repouso. Isto porque a sua quantidade é muito baixa, o que faz com que o numerador e denominador pouco influenciem a equação, uma vez que são valores muito semelhantes, pois a condutância ao ião é extremamente baixa nessa altura. Se se aplicar a equação de Goldman para o sódio e potássio, esta dá geralmente um resultado conjunto de -86mV. 13/15

14 Contribuição do potencial de difusão do cloro: A razão pela qual este ião foi pouco abordado prende-se com o facto deste ter uma importância quase nula na génese do potencial de repouso. Tal ocorre, porque o potencial de equilíbrio para o cloro é praticamente sobreponível ao valor do potencial que existe em repouso. Se tiver numa célula -90mV de potencial de repouso, habitualmente o potencial de equilíbrio para o cloro é de -90mV. Há outras células em que o potencial de repouso é de cerca de -30 e -40mV e geralmente nessas células o potencial de equilíbrio para o cloro é de -30 ou -40mV. Isso quer dizer que, independentemente das variações de condutância ao ião cloro, a influência é praticamente nula na génese do potencial de repouso. É por essa razão que o ião cloro é pouco referido quando se aborda quer o potencial de repouso quer de acção. Contribuição da bomba sódio-potássio: É de cerca de -4mV. Ou seja, se se aplicar o tal fármaco que inibe completamente este mecanismo e se depois se medir o potencial de repouso numa célula que tem -90mV, esta passa a ter -86 mv de potencial (valores aproximados). A bomba sódio-potássio é importante para a manutenção do equilíbrio homeostático e iónico entre o interior e exterior da célula, mas a sua contribuição para o potencial de repouso da célula é relativamente escassa, cerca de -4mV, como já foi referido. Note-se que a avaliação das diferenças de potencial das células são apenas aproximadas, já que quando calculadas teoricamente não contam com a contribuição dos aniões inorgânicos impermeáveis da membrana, que numas células poderão ter uma contribuição maior e noutras menor. Noções importantes: Potencial electroquímico (jogar com as concentrações e diferenças de potencial); Qual a influência que a condutância vai ter para se tornar mais ou menos importante em cada momento; 14/15

15 Potencial de repouso deve-se fundamentalmente à existência de uma alta permeabilidade aos canais de potássio, em repouso, da célula e a uma baixa permeabilidade aos iões sódio, nesse mesmo momento. Notas: No ensino secundário fala-se da génese do mecanismo do potencial de repouso como sendo algo simples e que depende apenas da bomba sódio-potássio, ideia essa que é errada. As três unidades mais básicas em electricidade são tensão (V), corrente (I) e resistência (R). A tensão é medida em volts, a corrente é medida em ampères e a resistência é medida em ohms. 15/15