COMPORTAMENTO KILLER EM LEVEDURAS ASSOCIADAS À FERMENTAÇÃO ESPONTÂNEA DO MOSTO DA CANA DE AÇÚCAR DE PRODUTORES DE CACHAÇA DE ALAMBIQUE DA BAHIA.

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1 o UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA BRUNO MOTTA OLIVEIRA COMPORTAMENTO KILLER EM LEVEDURAS ASSOCIADAS À FERMENTAÇÃO ESPONTÂNEA DO MOSTO DA CANA DE AÇÚCAR DE PRODUTORES DE CACHAÇA DE ALAMBIQUE DA BAHIA. Feira de Santana, BA 2009

2 BRUNO MOTTA OLIVEIRA COMPORTAMENTO KILLER EM LEVEDURAS ASSOCIADAS À FERMENTAÇÃO ESPONTÂNEA DO MOSTO DA CANA DE AÇÚCAR DE PRODUTORES DE CACHAÇA DE ALAMBIQUE DA BAHIA. Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Orientador: Profa. Dra. Ana Paula Trovatti Uetanabaro (UESC) Co orientadores: Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa (UFMG); Profa. Dra. Ormezinda Celeste Cristo Fernandes (CPqLMD/Fiocruz AM) Feira de Santana, BA 2009

3 Aos meus pais, Leonel Marcos Oliveira e Margareth Rose Motta Oliveira, que não mediram esforços para sempre oferecer uma educação de qualidade a mim e meus irmãos. Em especial, ao meu filho Leonel Lucas, benção divina em minha vida.

4 AGRADECIMENTOS À Deus que sempre tem iluminado meus caminhos nos momentos mais difíceis, mostrando me que o amor, a paz interior e a simplicidade são a base para uma vida plena e feliz. À Profa. Dra. Ana Paula Trovatti Uetanabaro, pelos ensinamentos, orientação, confiança e por muitas vezes surpreender me com palavras de conforto e atenção capazes de me incentivar nos momentos mais difíceis, mostrando me ser muito mais que uma orientadora de pesquisa. Ao Prof. Dr. Aristóteles Góes Neto, por ter confiado em mim quando mais precisei, pelos ensinamentos em pesquisa e por ser um exemplo de cientista capaz, empreendedor, dinâmico e ao mesmo tempo simples e sempre disposto a ajudar. Ao Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), pela co orientação, cepas de leveduras cedidas e valiosas contribuições para análise do trabalho. À Profa. Dra. Ormezinda Celeste Cristo Fernandes do Centro de Pesquisa Leônidas Maria Deane (CpqLMd) da Fiocruz AM, pela co orientação e gentil cessão das nove cepas de leveduras killer correspondentes às classes K1 a K9. Aos amigos e colegas do Laboratório de Pesquisa em Microbiologia (LAPEM) da UEFS, pelo companheirismo e contribuições de ordem técnico científica: Carla Pinheiro Ribeiro, Marcielle Santos Silva, José Valadares Neto, Paulo Ricardo, Getúlio, Rita, Íris, Ivana, Fabíola, Isabella, Jacqueline Miranda, e às técnicas Berlene e Luciana. À Helton, pelos serviços de extrema eficiência prestados na secretaria do Programa de Pós Graduação em Biotecnologia UEFS/FIOCRUZ BA. Aos professores e colegas do curso de Pós Graduação em Biotecnologia, pela contribuição no meu desenvolvimento pessoal e profissional, especialmente ao Prof. Dr. Antônio Azeredo pelas excelentes aulas e aos amigos (as) Cléber Miranda Gonçalves, Alice Ferreira da Silva, Catiane Sacramento Souza, Bruno Silva Andrade e Carlos Eduardo Cordeiro. Aos meus pais Leonel e Margareth e meus irmãos Vinicius e Priscilla pelo constante apoio, incentivo, sábios conselhos de vida e por oferecer todas as condições necessárias para que eu finalizasse este estudo, principalmente, amor e aconchego de família.

5 Às minhas avós Zeza e Luzi pelo exemplo de força, honestidade, dignidade e amor a vida. À minha querida namorada, amiga, noiva e agora esposa e mãe, Aline Monteiro S.S. Oliveira, por toda a compreensão, confidências, apoio, paciência e palavras de incentivo que me deram e dão forças para seguir em frente sempre confiante. À FAPESB pela concessão da bolsa ITEC 3 (BOL0022/2008) vinculada ao projeto de pesquisa BPF e Seleção de leveduras da fermentação da cachaça visando o melhoramento biotecnológico do seu processo produtivo na Bahia e seleção de linhagens boas produtoras de bioetanol aprovado via edital sob número de outorga PET0024/2007. Aos membros da banca, Dra. Fernanda Badotti e Dra. Márcia Luciana Cazzeta, pelas sugestões e correções.

6 Deus nos fez perfeitos e não escolhe os capacitados, capacita os escolhidos. Fazer ou não fazer algo só depende de nossa vontade e perserverança. (Albert Einstein)

7 RESUMO A cachaça de alambique ou artesanal, produzida por fermentação espontânea, geralmente exibe variabilidade química e sensorial a cada produção por consequência, principalmente, do processo fermentativo ser conduzido por diversas espécies e linhagens de leveduras propagadas durante o preparo do fermento natural ou pé de cuba. A manifestação da atividade killer, caracterizada pela produção de toxinas letais a outras leveduras com ação mediada por parede celular, é uma das características desejáveis em um fermento iniciador selecionado para fermentações industriais. A utilização de leveduras killer pode evitar e inibir contaminantes, proporcionando vantagem competitiva e maior padronização e eficiência do processo fermentativo. Este trabalho teve como objetivo verificar o comportamento killer em leveduras isoladas de fermentações espontâneas para produção de cachaça de alambique no estado da Bahia e identificá las. Dentre os 324 isolados de sete destilarias, que tiveram a atividade killer investigada em meio ágar YEPD MB, 51 (16%) demonstraram atividade a 25 C e ph 4,0. Entre estes, 16 demonstraram ação letal sobre 12 de 20 leveduras isoladas da fase inicial das fermentações, com ausência de atividade killer e bioquimicamente identificadas como Saccharomyces cerevisiae. Somente um isolado identificado como S. cerevisiae apresentou atividade killer sobre uma levedura pertencente ao grupo das identificadas bioquimicamente como não S. cerevisiae. Estes 17 isolados killer foram caracterizados através da análise da sequência do domínio D1/D2 do 26S rdna como S. cerevisiae. O padrão de sensibilidade killer (KSP), obtido pela submissão de cada um dos 51 isolados de levedura killer frente à ação letal de nove distintas leveduras de referência pertencentes às classes K1 a K9, associou os isolados com a destilaria de origem e discriminou os em 13 distintos biótipos. Os 17 isolados de S. cerevisiae foram discriminados em sete distintos biótipos killer ou linhagens. Os resultados indicam que, quanto ao comportamento killer, estas linhagens são boas candidatas a culturas starter para produção de cachaça de alambique, principalmente em suas regiões de origem, pois podem evitar e inibir o crescimento de leveduras contaminantes em fermentações com temperatura controlada. Palavras chave: Cachaça de alambique. Fermentação alcoólica. Levedura killer. Aplicação biotecnológica.

8 ABSTRACT The cachaça (The Brazilian sugarcane spirit), produced by spontaneous fermentation, is a beverage that generally exhibits chemical and sensory variability in each production as a consequence, mainly, of the fermentation process being conducted by various species and strains of yeasts propagated during the preparation of natural yeast or "pé de cuba". The expression of killer activity, which is characterized by production of lethal toxins to other yeasts with action mediated by cell wall, is a desirable characteristic in selected initiator yeast for industrial fermentations. The use of yeast killer can prevent and inhibit contaminants, and it can provide competitive advantage and greater standardization and efficiency of the fermentation process. This study aimed to verify the killer behavior in yeasts isolated from spontaneous fermentation for production of cachaça in the State of Bahia and identify them. Among the 324 isolates of seven distilleries, which were investigated in the killer activity using agar YEPD MB, 51 (16%) showed activity at 25 C and ph 4.0. Among these, 16 showed lethal action on 12 of 20 yeasts isolated from the initial phase of fermentation, with no killer activity and identified biochemically as Saccharomyces cerevisiae. Only one isolate identified as S. cerevisiae showed killer activity again one yeast belonging to the group of the biochemically classified in non S. cerevisiae. These 17 killer isolates were identified by analyzing the sequence of the D1/D2 domain of 26S rdna as S. cerevisiae. The killer sensitivity pattern (KSP), obtained by the submission of each 51 isolates front lethal action of the nine killer reference yeast belonging to the classes K1 to K9, associated the isolates to the distillery of origin and distinguish them in 13 distinct biotypes. The 17 isolates of S. cerevisiae were separated into seven different killer biotypes or strains. The results indicate that, as the behavior killer, these strains are good candidates for starter cultures for production of cachaça, especially in their regions of origin, since they can prevent and inhibit the growing of contaminant yeasts in fermentations with controlled temperature. Keywor ds: Cachaça. Alcoholic fermentation. Killer yeast. Biotechnological application.

9 LISTA DE FIGURAS Figura 01 Figura 02 Figura 03 Figura 04 Expressão de toxina baseada no sistema de replicação dos vírus de RNA dupla fita em células de leveduras killer. Fonte: Magliani et al. (1997) Mecanismos genéticos, de secreção e de ação das toxinas K1, K2 e K28 de S. cerevisiae. Fonte: Magliani et al. (1997) Mecanismo de formação da toxina K1 de S. cerevisiae. Fonte: Marquina et al. (2002) Mecanismo de ação da toxina K1 de Saccharomyces cerevisiae. Fonte: Marquina et al. (2002) Figura 05 Fluxograma da metodologia geral realizada neste trabalho Figura 06 Figura 07 Figura 08 Mapa do estado da Bahia destacando suas Mesorregiões e os municípios onde estão localizadas as sete destilarias em que foram realizadas as coletas Fotos de dornas em diferentes fases da fermentação do mosto da cana deaçúcar (Tin., Tint. e Tfinal) em que as coletas das amostras foram realizadas Fotos de etapas da realização do teste para determinação da atividade killer Figura 09 Fluxograma para determinação da atividade killer Figura 10 Figura 11 Figura 12 Estrutura de DNA ribossomal (rdna). Fonte: adaptado de VILGALYS LAB, 57 Iniciadores (primers) para amplificação da subunidade maior do DNA ribossomal (LSU 25 28S) Atividade killer positiva: presença de zona clara de inibição em volta do isolado inoculado em forma de ponto, delimitada por halo adjacente de células coradas em azul Figura 13 Influência da temperatura sobre a atividade killer dos isolados D1 1 a D1 11, inoculados em forma de ponto sobre Candida glabrata Y 55 ATCC90525 previamente semeada sobre o meio ágar YEPD MB Figura 14 Dendograma gerado com o método UPGMA baseado no índice SM, utilizando os dados de sensibilidade dos 51 isolados de levedura killer às nove leveduras de referência pertencentes às classes K1 a K

10 Figura 15 Figura 16 Figura 17 Distribuição dos 13 distintos biótipos, representativos dos 51 isolados de levedura killer, ao longo das três fases do ciclo fermentativo de cada uma de suas cinco destilarias de origem Produtos da PCR referente às 38 leveduras selecionadas, submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TAE 1X, 5V/cm, 1,5 hrs, corado com brometo de etídio e fotografados pelo sistema de fotodocumentação Edas 290 (Kodak) Árvore filogenética dos 17 isolados de levedura killer identificados molecularmente como Saccharomyces cerevisiae, obtida por análise de neighbour joining (modelo de Kimura dois parâmetros) do domínio D1/D2 do gene 26S do rdna... 94

11 LISTA DE TABELAS Tabela 01 Classificação das leveduras killer, baseada nos padrões de atividade e sensibilidade às toxinas Tabela 02 Bases genéticas para a expressão de toxinas killer em leveduras Tabela 03 Correlação das bases genéticas de toxinas, seus receptores e mecanismos de ação de sistemas killer das espécies de leveduras mais estudadas. Fonte: Marquina et al. (2002) Tabela 04 Principais aplicações descritas das leveduras killer e suas respectivas toxinas. Fonte: Marquina et al. (2002) Tabela 05 Leveduras integrantes do grupo S identificadas bioquimicamente como Saccharomyces cerevisiae, isoladas da fase inicial da fermentação (T0) e que não apresentaram fenótipo killer Tabela 06 Leveduras integrantes do grupo NS identificadas bioquimicamente como não Saccharomyces cerevisiae. Dados de temperatura ( C) e Brix do mosto em fermentação no momento em que foram coletadas Tabela 07 Leveduras de referência correspondentes a nove distintas classes de leveduras killer Tabela 08 Número de isolados de leveduras, submetidas à determinação do fenótipo killer, por destilaria (DEST) e seus municípios de origem Tabela 09 Dados de coleta ( Brix, Temperatura, Horário e ph), referentes ao mosto da cana de açúcar em fermentação, em cada dorna pertencente às sete distintas destilarias (DEST 1 a DEST 7) Tabela 10 Percentual de isolados com fenótipo killer por destilaria e sua distribuição de acordo com as fases da fermentação alcoólica Tabela 11 Características do mosto da cana de açúcar ( Brix, ph e temperatura), origem de isolamento (fase da fermentação, dorna, tempo e colônia) e identificação bioquímica de cada isolado de levedura killer associado às fermentações realizadas em cinco das sete distintas destilarias investigadas Tabela 12 Influência da temperatura sobre a atividade killer dos isolados Tabela 13 Ação dos 51 isolados killer, sobre leveduras identificadas bioquimicamente como Saccharomyces cerevisiae, isoladas da fase inicial da fermentação e que não apresentaram atividade killer (Grupo S)... 77

12 Tabela 14 Ação dos 51 isolados killer, sobre leveduras identificadas bioquimicamente como não Saccharomyces cerevisiae (Grupo NS) Tabela 15 Padrão de sensibilidade killer (KSP) de cada um dos 51 isolados de levedura killer encontrados, frente às nove distintas leveduras de referência pertencentes às classes K1 a K Tabela 16 Caracterização molecular das 38 leveduras escolhidas para identificação, baseada em análises da sequência do domínio D1/D2 do gene 26S do DNA ribossomal Tabela 17 Discriminação intra específica, através dos distintos KSPs, dos 17 isolados de levedura killer identificados como S. cerevisiae por meio de análise das sequências da região D1/D2 da subunidade (26S) do rdna... 92

13 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS REVISÃO DA LITERATURA CACHAÇA DE ALAMBIQUE Importância econômica da cachaça LEVEDURAS, FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA E QUALIDADE DA 21 CACHAÇA DE ALAMBIQUE Utilização de leveduras selecionadas O FENÔMENO KILLER Toxinas killer Bases genéticas e mecanismos de ação O fenômeno killer em Saccharomyces cerevisiae Padrão de sensibilidade killer: Utilização na biotipagem de leveduras Aplicações biotecnológicas do sistema killer LEVEDURAS KILLER E A FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA MATERIAL E MÉTODOS COLETA, ISOLAMENTO, PRESERVAÇÃO E MANUTENÇÃO DAS LEVEDURAS Determinação do ph, temperatura e Brix do mosto da cana de açúcar em fermentação Preser vação das leveduras isoladas Manutenção e reativação das culturas de levedura AMOSTRAGEM PARA OS TESTES DE COMPORTAMENTO KILLER PROSPECÇÃO DE LEVEDURAS KILLER Teste para determinação das atividade killer Influência da temperatura sobre a atividade killer das leveduras AÇÃO LETAL DAS LEVEDURAS KILLER SOBRE OUTRAS LEVEDURAS ISOLADAS DOS PROCESSOS FERMENTATIVOS DETERMINAÇÃO DO PADRÃO DE SENSIBILIDADE KILLER (KILLER SENSITIVITY PATTERN KSP) DAS LEVEDURAS KILLER CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DAS LEVEDURAS Obtenção de biomassa e extração de DNA genômico Amplificação do domínio D1/D2 do gene 26S do rdna Purificação e sequênciamento dos produtos da PCR Análises das sequências Análise filogenética RESULTADOS E DISCUSSÃO COLETA, ISOLAMENTO, PRESERVAÇÃO E MANUTENÇÃO DAS LEVEDURAS... 60

14 5.2 PROSPECÇÃO DE LEVEDURAS KILLER AÇÃO LETAL DAS LEVEDURAS KILLER SOBRE OUTRAS LEVEDURAS ISOLADAS DOS PROCESSOS FERMENTATIVOS DETERMINAÇÃO DO PADRÃO DE SENSIBILIDADE KILLER (KILLER SENSITIVITY PATTERN KSP) DAS LEVEDURAS KILLER CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DAS LEVEDURAS CONCLUSÃO REFERÊNCIAS APÊNDICES APÊNDICE A Teste para determinação do Padrão de Sensibilidade Killer 109 APÊNDICE B Sequências amplificadas do domínio D1/D2 do gene 26S do rdna ANEXOS ANEXO A Meios de Cultura ANEXO B Soluções, tampões e reagentes

15 1 INTRODUÇÃO A cachaça é uma bebida alcoólica produzida pela destilação do mosto da cana deaçúcar fermentado, muito apreciada por possuir aroma e sabor característico e considerada o destilado alcoólico mais popular produzido no Brasil (CARDOSO, 2006). As leveduras e as condições de fermentação são apontadas como os fatores que mais influenciam para a característica final dessas bebidas, pois é durante a fermentação alcoólica que a maioria dos compostos responsáveis pelo sabor é formada (LEHTONEN e JOUNELA ERIKSSON, 1983). No Brasil, a produção da cachaça de alambique ou artesanal é muito frequente devido à tradição, identidade regional e também pela mesma apresentar características peculiares quanto ao sabor e aroma (AZEVEDO et al., 2003). A fabricação é caracterizada pelo preparo do fermento inicial ou pé de cuba, que consiste na propagação da microbiota natural ocorrente numa mistura geralmente composta de caldo de cana de açúcar, milho, arroz e/ou farinha de soja de forma que a fermentação alcoólica é realizada pela ação de comunidades mistas de leveduras (PATARO et al., 2002). O metabolismo fermentativo das leveduras difere entre as espécies e linhagens, e este fato influencia diretamente na composição final das bebidas (CLEMENTE JIMENEZ et al., 2005; OLIVEIRA et al. 2005; QUEROL e FLEET, 2006; GOMES et al., 2008). Dessa forma, a fermentação espontânea característica da produção da bebida, pode causar grande variabilidade sensorial no produto final obtido dentro de uma mesma safra comprometendo a padronização e qualidade (GOMES et al., 2008). Assim, a utilização de leveduras selecionadas como fermento iniciador ou culturas starter tem sido indicada como a principal maneira de padronizar e consequentemente elevar a qualidade da bebida (PATARO et al., 2002; GOMES, 2006; GOMES et al., 2008; MARINI et al., 2009). No entanto, a contaminação de culturas starter ou outras culturas selecionadas, com leveduras indesejáveis ao processo estão entre os principais responsáveis pela redução do rendimento fermentativo e da qualidade do produto final em processos fermentativos industriais de produção de bebidas alcoólicas (CHEN et al., 2000). Uma característica vantajosa em leveduras selecionadas para processos fermentativos industriais da produção de bebidas é possuir fenótipo killer (MARQUINA et al., 2002; SANGORRÍN et al., 2007): serem capazes de produzir toxinas protéicas ou glicoprotéicas letais às células sensíveis de mesma espécie ou gênero e mais raramente de gêneros diferentes, sendo imunes a mesma (MAGLIANI et al., 1997). Além de habitats naturais com

16 altas concentrações de açúcar e baixo ph, estas leveduras normalmente podem ser encontradas durante processos fermentativos para produção de bebidas sejam eles espontâneos ou induzidos por fermento comercial ou selecionado (MARQUINA et al., 2002; CECCATO ANTONINI, 2004). A manifestação deste fenótipo pode proporcionar vantagem competitiva às leveduras fermentadoras, através da inibição do crescimento de linhagens sensíveis indesejáveis minimizando as chances de contaminação externa, além de assegurar a permanência da linhagem selecionada durante todo processo e consequentemente aumentar a eficiência da fermentação. Estas vantagens normalmente contribuem para a manutenção de padrões de qualidade bem definidos a cada produção (MAGLIANI et al., 1997; MARQUINA et al., 2002; CECCATO ANTONINI et al., 2004). A presença natural de linhagens killer durante a fermentação para produção de vinho aliada as suas vantagens de utilização como culturas iniciadoras, tem contribuído para o estudo e seleção de linhagens que reúnam todas as características desejáveis para a produção da bebida (PÉREZ et al., 2001; SANGORRÍN et al., 2001; SANGORRÍN et al., 2007; LOPES et al., 2007b). A ocorrência do fenótipo killer, principalmente em Saccharomyces cerevisiae provenientes da fermentação espontânea para produção de vinho e cachaça e a utilização de algumas linhagens de forma bem sucedida como culturas iniciadoras (SANGORRÍN et al., 2001;; LOPES et al., 2005; SANGORRÍN et al., 2007; LOPES et al., 2007a; GOMES et al., 2008; MARINI et al., 2009), incentiva a detecção e identificação de leveduras killer nativas da fermentação natural do mosto da cana de açúcar durante a produção da cachaça de alambique no estado da Bahia. Os resultados deste estudo auxiliarão na seleção criteriosa de linhagens de leveduras que possam apresentar os benefícios proporcionados pelo fenótipo killer, sendo assim, boas candidatas a serem utilizadas como fermento iniciador de processos fermentativos para produção de cachaça com padrões de qualidade bem estabelecidos.

17 2 OBJ ETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Determinar o comportamento killer em leveduras associadas à fermentação espontânea do mosto da cana de açúcar de produtores de cachaça de alambique do estado da Bahia. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Determinar a atividade killer dos isolados de levedura selecionados durante as distintas fases da fermentação sobre leveduras de referência e sensíveis quanto ao fenótipo killer. Avaliar a ação letal dos isolados que apresentarem atividade killer sobre os demais isolados dos processos de fermentação. Avaliar o padrão de sensibilidade dos isolados que apresentarem atividade killer frente a um painel composto por distintas leveduras killer de referência. Realizar a identificação molecular dos isolados que apresentarem atividade killer por meio de análise das sequências do domínio D1/D2 do gene 26S do rdna.

18 3 REVISÃO DA LITERATURA 3.1 CACHAÇA DE ALAMBIQUE A origem da cachaça perpassa pelo período colonial da história do Brasil, pois seu surgimento ocorreu no século XVI, mais precisamente entre os anos de 1534 e 1549, juntamente com o desenvolvimento do ciclo da cana de açúcar. A descoberta é descrita através de um fato curioso onde, nos engenhos, as sobras da produção eram dadas aos escravos, que deixavam a borra de melaço acumular por alguns dias. A fermentação natural então acontecia, formando um líquido que os escravos bebiam e que deu origem à cachaça após a introdução do processo de destilação no Brasil colônia. Desta forma, a cachaça se tornou a primeira bebida destilada da América Latina e a aguardente de cana genuinamente brasileira (CARDOSO, 2006). Visando definir e caracterizar os termos cachaça e aguardente de cana, a legislação brasileira apresenta esta última como a bebida com graduação alcoólica variando entre 38 a 54% em volume, a 20 C, obtida de destilado alcoólico simples de cana de açúcar ou pela destilação do mosto fermentado da cana de açúcar, podendo ser adicionada de açúcares em até seis gramas por litro (BRASIL, 1997). E cachaça, como a denominação típica e exclusiva da aguardente de cana produzida no Brasil (BRASIL, 2001), com graduação alcoólica de 38 a 48% em volume, a 20 C, obtida pela destilação do mosto fermentado de cana de açúcar com características sensoriais peculiares, podendo ser adicionada de açúcares até seis gramas por litro, expressos em sacarose (BRASIL, 2002). Logo, as aguardentes de cana abrangem as cachaças, principalmente, por possuir um limite máximo de teor alcoólico mais elevado e, pelo fato de poder ser obtida também de destilado alcoólico simples de cana de açúcar. De acordo com o processo produtivo, equipamentos de produção e a certificação e registro do produto, a cachaça apresenta ainda três classificações informais: as industriais, a artesanal ou de alambique e as informais. Esta última se refere àquelas que não possuem qualquer tipo de registro ou identificação. A cachaça industrial é caracterizada, principalmente, pela produção em larga escala e adoção de métodos não convencionais como a realização de destilação contínua em colunas de destilação feitas em aço inoxidável, fermentação alcoólica utilizando leveduras prensadas e aditivos químicos e queima da canade açúcar antes da colheita e moagem. Sua produção corresponde por cerca de 70% de toda a

19 cachaça produzida no Brasil, estando os principais produtores concentrados nos estados de São Paulo, Ceará, Pernambuco e Rio de Janeiro (OLIVEIRA et al., 2005a). A cachaça artesanal ou de alambique é destilada em alambique feito em cobre. É caracterizada pela produção em pequenas destilarias com mão de obra familiar utilizando processos artesanais e/ou naturais como fermentação espontânea com fermento caipira ou pé de cuba o qual é constituído por leveduras nativas ou selvagens e destilação em alambiques de cobre com separação das frações do destilado em cabeça, coração e cauda (CARDOSO, 2006). O envelhecimento em barris de madeira também contribui para que a cachaça de alambique apresente maior aceitação pelo mercado consumidor, pois favorecem a obtenção de um produto com melhores características sensoriais quando comparado à industrial (FILHO et al., 1999). A utilização do cobre como material de confecção dos alambiques, embora em alguns casos, possa levar à contaminação do produto final por íons cúprico, favorece a melhoria da qualidade sensorial da cachaça (CARDOSO et al., 2003). LIMA NETO et al. (1994) demonstraram que cachaças obtidas por processos de destilação que fazem uso de destiladores confeccionados com outros materiais que não o cobre, apresentam maior concentração de radicais sulfetos, os quais conferem um aroma indesejável à bebida. O processo de envelhecimento em tonéis de madeiras, prática muito comum na produção da cachaça de alambique, confere à bebida coloração característica, sabor e aroma diferenciado (AQUARONE et al., 1983), por consequência agrega valor ao produto final. Os principais compostos extraídos da madeira responsáveis pela modificação das características físicas e sensoriais da cachaça são óleos voláteis, substâncias tânicas, açúcares, glicerol, ácidos orgânicos não voláteis e esteróides (CARDELLO e FARIA, 1998). Embora o carvalho seja a madeira mais utilizada e estudada para envelhecimento de bebidas destiladas em todo o mundo, no caso específico da cachaça, diversas outras madeiras como Amburana cearensis (amburana), Myroxylon balsamum (bálsamo), Cariniana estrellensis (jequitibá) e Arachis hypogea (amendoim) estão sendo empregadas e estudadas no Brasil com o objetivo de atender a demanda de consumidores cada vez mais diversificada e exigente (DIAS et al., 1998). No que se refere ao processo produtivo, o que talvez mais caracterize a cachaça de alambique, e que mais a diferencie da cachaça industrial seja a fermentação alcoólica realizada por fermento caipira, também muito conhecido entre os produtores como pé decuba. O preparo deste fermento inicial consiste na propagação da microbiota natural ocorrente numa mistura geralmente composta pelo caldo da cana de açúcar, milho, arroz e/ou

20 farinha de soja. Dessa forma, a fermentação é realizada, principalmente, pela ação de comunidades mistas de leveduras nativas da própria cana, moenda e do ambiente de fermentação (PATARO et al., 2002). Embora existam outras espécies atuantes, linhagens de Saccharomyces cerevisiae têm demonstrado ser predominante no fermento inicial e durante o ciclo fermentativo (MORAIS et al., 1997; PATARO et al., 2000). Como, não só o etanol, mas também em proporções menores, os compostos secundários que a depender das proporções podem influenciar positivamente ou negativamente a qualidade da cachaça, são derivados do metabolismo fermentativo das leveduras, grande ênfase têm sido dada a elas e às condições de fermentação quando se quer produzir uma cachaça de alambique baseada nos padrões de qualidade. Outra prática característica da produção da cachaça de alambique, é que durante o processo de destilação o destilado total é separado nas frações cabeça (fração inicial), coração (cachaça) e cauda (fração final). Este fracionamento é de fundamental importância de modo a evitar compostos indesejáveis e contaminantes orgânicos e inorgânicos na cachaça, normalmente presentes em altas concentrações nos destilados de cabeça e cauda (CARDOSO, 2006) Importância econômica da cachaça No Brasil, cerca de 15 milhões de pessoas estão diretamente ou indiretamente empregadas na produção de açúcar, álcool, cachaça, melado e rapadura, evidenciando que as atividades derivadas da industrialização da cana de açúcar consistem num ramo de grande importância econômica para o país. Somente para a fabricação de cachaça, são produzidas no Brasil 10 milhões de toneladas de cana de açúcar por ano, o equivalente a uma área plantada de 125 mil hectares (SEBRAE, 2005). O Governo Federal visando iniciar um processo de valorização da cachaça, estimular o aumento de sua produção bem como melhorar sua qualidade com vistas a ampliar o volume de exportações para o mercado externo, adotou algumas medidas importantes para este setor do agronegócio. Em novembro de 1997 foi criado o Programa Brasileiro de Desenvolvimento da Cachaça (PBDAC), que tem procurado divulgar a bebida de forma intensiva e que incluiu o produto no Programa Especial de Exportações (PEE) e no Programa dos Novos Pólos de Exportação (PNPE) do Governo Federal. Através do Decreto de janeiro de 2002 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, a cachaça passou a ser regulamentada em sua definição como uma bebida genuinamente brasileira. O reconhecimento da

21 denominação cachaça como produto tipicamente brasileiro também constituiu num importante passo para sua consolidação no exterior (OLIVEIRA et al., 2005a; ABRABE, 2009). A cachaça é a segunda bebida alcoólica mais apreciada pelos brasileiros, ficando atrás somente da cerveja (SEBRAE e SEAMA, 2001). Estima se um consumo de 70 milhões de doses diárias, o que representa, em média, aproximadamente seis litros (habitante ano 1 ). O consumo brasileiro garante a esta bebida a terceira colocação entre os destilados do mundo inteiro, atrás somente da vodca e do soju asiático (ABRABE, 2009). Estima se que a produção total de cachaça no Brasil varie entre 1,3 a 2 bilhões de litros anuais existindo mais de 5 mil marcas e 30 mil produtores. A produção ocorre em todas as regiões brasileiras e a cachaça é encontrada em mais de 960 pontos comerciais do território nacional se constituindo na bebida destilada mais consumida do país, gerando uma receita próxima de US$ 600 milhões (PBDAC, 2009). De acordo com o Programa Brasileiro de Desenvolvimento da Cachaça dentre os maiores produtores brasileiros estão os estados de São Paulo (44%), Pernambuco (12%), Ceará (12%), Rio de Janeiro (8%), Minas Gerais (8%) e Paraná (8%). Segundo dados do Ministério da Agricultura, de todo volume anual de cachaça produzida, cerca de 400 milhões de litros correspondem à cachaça de alambique e seus produtores são responsáveis pela geração de aproximadamente 1 milhão de empregos diretos e indiretos (OLIVEIRA et al., 2005a). O estado da Bahia produz anualmente cerca de 1,8 milhões de litros de cachaça de alambique se posicionando como o segundo maior produtor do Brasil, atrás apenas de Minas Gerais. Cerca de três mil pequenos estabelecimentos rurais estão envolvidos ativamente na produção de derivados de cana (melado, rapadura, açúcar mascavo, além de cachaça) empregando aproximadamente 60 mil pessoas de forma direta ou indireta. Embora a Bahia produza pouco menos de dois milhões de litros anuais, a capacidade máxima do estado é estimada em cerca de 3,5 milhões de litros de cachaça artesanal (SICM, 2009). Com relação às exportações, o Brasil desembarca 15 milhões de litros de cachaça/ano para mais de 60 países, com destaque para Alemanha, Paraguai, Itália e Portugal. Há sete anos as exportações no setor não chegavam a 970 mil litros/ano. Em 2002, possivelmente como resultados da adoção de medidas de valorização do produto pelo governo federal, o país passou a exportar mais de 14,8 milhões de litros para países como Alemanha, Japão e EUA (PBDAC, 2009). Apesar dos números, as exportações da cachaça não chegam a 1% da produção nacional e apenas cerca de 120 fabricantes exportam regularmente (SEBRAE, 2005). Apesar do alto volume de cachaça produzida pelo Brasil o que impede uma maior exportação é a negligência na observação dos padrões de identidade exigidos pelo Ministério

22 da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) e a falta de controle da qualidade da bebida (MIRANDA, 2005). 3.2 LEVEDURAS, FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA E QUALIDADE DA CACHAÇA DE ALAMBIQUE As leveduras são microrganismos eucarióticos unicelulares, que se reproduzem geralmente de forma assexuada por brotamento, e em poucos casos por fissão binária, classificados no Domínio Eukarya (WOESE et al., 1990), reino Fungi, porém, não formam um grupo taxonômico ou filogenético específico (KURTZMAN e PISKUR, 2006). Estes microrganismos possuem uma diversidade filogenética que os insere tanto na divisão Ascomycota como na Basidiomycota, e, estimativas recentes indicam que somente 1% de todas as espécies de leveduras esteja descrita (KURTZMAN e PISKUR, 2006), embora cerca de espécies já tenham sido descritas (KURTZMAN e FELL, 2006). Estes fungos unicelulares apresentam se amplamente difundidos na natureza, em diversos substratos como folhas, frutos, solo, ar, lagos, rios, mares ou habitando o interior de insetos e animais e muito estudado sob o ponto de vista tecnológico e industrial (PHAFF e STARMER, 1987). São utilizados há séculos na fabricação de bebidas alcoólicas, no crescimento de massas de panificação, e mais recentemente, na síntese de vitaminas, gorduras e proteínas sendo, portanto, bastante explorados pelo homem (MARQUES et al., 1998). O seu emprego na fermentação de açúcares é a mais antiga aplicação, sendo que, dentre as espécies de leveduras a mais utilizada é Saccharomyces cerevisiae, a qual é empregada na produção de diversos alimentos e bebidas como, por exemplo: pão, cerveja, vinho, cachaça e xilitol (SREENIVAS et al., 2004). Atualmente, sabe se que as leveduras são os principais microrganismos responsáveis por processos fermentativos, sobretudo devido a sua atividade metabólica, pois em meio apropriado, são capazes de desenvolver a fermentação espontânea, na qual os gêneros, espécies e/ou linhagens substituem se, devido a um processo de seleção natural. Neste ambiente competitivo, as espécies e/ou linhagens que mais se adaptam às condições ambientais predominam como os principais agentes responsáveis pelo processo fermentativo (ZAGORC et al., 2001). Para que a fermentação alcoólica se inicie é necessário que haja uma determinada concentração celular. Esta se multiplica gradativamente até atingir o denominado número de Brown, momento em que o açúcar é quase que totalmente convertido em álcool

23 em detrimento da via metabólica de transformação em biomassa (OLIVEIRA, 2001). Ao longo dos anos, o processo fermentativo tem sido na maioria das vezes, independente da aplicação, conduzido em batelada, em um sistema em que a formação do produto está diretamente relacionada ao crescimento do microrganismo agente. Esta relação entre crescimento e formação do produto levou a uma classificação de fermentação com crescimento associado embora existam outros sistemas independentes desta relação como, por exemplo, o de fluxo contínuo dentre outros (GOMES, 2006). A fermentação se constitui numa etapa fundamental para a produção de bebidas alcoólicas, principalmente as destiladas como a cachaça, pois é neste processo que as leveduras realizam as transformações químicas sobre os açúcares fermentescíveis produzindo os metabólitos primários, CO 2 e álcool etílico. Este álcool, após o processo de destilação, é o principal componente em termos quantitativos nestas bebidas. O processo fermentativo iniciase logo que a levedura entra em contato com o mosto e é dividido em 3 fases: (i) fase preliminar ou pré fermentação, caracterizada pela adaptação das leveduras e multiplicação celular; (ii) fase de fermentação principal ou tumultuosa, com desprendimento abundante de gás e produção de álcool e (iii) fase de fermentação complementar ou pós fermentação, onde se observa redução acentuada da atividade fermentativa (CARDOSO, 2006). Durante o metabolismo fermentativo das leveduras também são formados subprodutos, chamados de componentes secundários, os quais também compõem o produto final e cujas concentrações, influenciam diretamente na qualidade química e sensorial da cachaça de alambique (GOMES et al., 2008). De maneira geral, os principais fatores que contribuem para a grande variação da qualidade de bebidas alcoólicas destiladas como a cachaça estão intimamente relacionados com todas as etapas do processo produtivo: matéria prima, fermentação, método de condução do processo fermentativo, a destilação e o envelhecimento. Entretanto, a fermentação tem sido apontada como a mais importante, pois é a que mais influencia diretamente no aroma e sabor das bebidas alcoólicas (LEHTONEN e JOUNELA ERIKSSON, 1983). É durante esta fase que os constituintes químicos, sejam eles primários ou secundários da bebida são produzidos como produtos do metabolismo fermentativo das leveduras e/ou de outros microrganismos que possam estar atuando, como por exemplo, bactérias contaminantes (CARDOSO, 2006). A cachaça é composta principalmente por água e álcool em proporções variáveis de acordo com a graduação alcoólica e de componentes secundários em quantidades bem menores, mas responsáveis por conferir à bebida suas características peculiares de aroma e sabor (CARDOSO, 2006). Os componentes secundários responsáveis pelo aroma ou

24 bouquet das bebidas pertencem às classes dos aldeídos, alcoóis superiores, ésteres, furfural, terpenos, lactonas, furanos, pirazinas, ácidos orgânicos dentre outros (LEHTONEN e JOUNELA ERIKSSON, 1983). Como o metabolismo fermentativo das leveduras difere entre as distintas espécies e linhagens, as concentrações e proporções relativas dos compostos constituintes da cachaça sofre uma influência direta da microbiota responsável pela realização do processo fermentativo (CLEMENTE JIMENEZ et al., 2005; OLIVEIRA et al. 2005; QUEROL e FLEET, 2006; GOMES, 2006). Portanto, a utilização do fermento caipira na produção da cachaça de alambique, o qual favorece a propagação de diferentes espécies e linhagens de leveduras na fermentação e que promove uma gama de interações entre as mesmas que ainda são pouco entendidas (FLEET, 2003), está fortemente relacionada com o nível de eficiência do processo e com a variação da qualidade do produto final. Segundo trabalho realizado por Morais et al. (1997), a fermentação espontânea ou artesanal mostrou ser caracterizada por uma microbiota mista de leveduras, com predominância de linhagens de Saccharomyces cerevisae e uma certa frequência de outras espécies pertencentes aos gêneros Candida, Kluyveromyces, Kloeckera e Pichia. Foi demonstrado também que durante o processo fermentativo, as espécies apresentavam se em constante sucessão, devido à introdução de microrganismos que acompanham o caldo de cana, contaminantes e também às condições do processo. Muitos outros estudos visando caracterizar a microbiota envolvida na fermentação têm sido realizados em distintos produtores de cachaça de alambique do estado de Minas Gerais, (PATARO et al., 1998; GUERRA et al. 2001; SCHWAN et al. 2001; GOMES et al., 2008). Os resultados dos trabalhos também demonstram que, durante o ciclo fermentativo, ocorre uma sucessão de espécies de leveduras, culminando com a predominância de S. cerevisiae (PATARO et al., 2000; GUERRA et al., 2001). Oliveira (2001) avaliou as características fermentativas e formação dos principais compostos secundários produzidos por trinta linhagens de leveduras, isoladas de destilaria artesanal e industrial de cachaça e destilaria de álcool, compreendendo Saccharomyces cerevisae, Candida, Kloeckera, Pichia e Schizosaccharomyces. As linhagens de S. cerevisae e de Pichia apresentaram bom potencial fermentativo em relação ao baixo rendimento encontrado nos demais gêneros de leveduras. Também foram demonstradas diferenças nas quantidades e proporção dos compostos secundários responsáveis pelo aroma e sabor entre as cachaças obtidas pelas distintas linhagens estudadas. Tais variações foram evidenciadas principalmente quanto ao aroma, pois as linhagens de Saccharomyces obtiveram a maior

25 média neste aspecto sensorial, contrastando significativamente com a menor média da linhagem Saccharomyces pombe. Dentre as 30 linhagens estudadas, 11 pertencentes a uma mesma destilaria, apresentaram variabilidade nas características fermentativas, sugerindo falta de condições estáveis de processo e produção de uma cachaça menos padronizada ao longo da safra, com rendimentos oscilantes. Dessa forma, a fermentação alcoólica de forma espontânea, caracterizada pela ação de comunidades mistas de leveduras e utilizada na fabricação da cachaça de alambique, pode causar variabilidade sensorial no produto final de até mesmo um único produtor numa mesma safra, fato que, dificulta o estabelecimento de um padrão de produção (GOMES et al., 2008). Segundo Oliveira et al. (2004), para evitar tais variações na qualidade, a seleção criteriosa de linhagens iniciadoras de leveduras para a produção da cachaça como ocorre para a cerveja e o vinho se constitui como uma das soluções mais apropriadas, pois estudos mostram que a cada ciclo produtivo, diferentes linhagens, nem sempre adequadas, são isoladas de processos fermentativos (PATARO et al. 2000; SCHWAN et al., 2001; GOMES, 2006). Entretanto, alguns trabalhos buscando uma seleção adequada vêm analisando as características de várias linhagens de leveduras, levando em consideração, principalmente, parâmetros cinéticos e produção de metabólitos secundários (SILVA et al., 2006; GOMES et al., 2008; MARINI et al., 2009) Utilização de leveduras selecionadas O processo de seleção de leveduras para utilização em processos fermentativos vem sendo empregado com êxito em outros processos produtivos que não a cachaça, como por exemplo, para a produção de etanol combustível (CECCATO ANTONINI et al., 2004) e de bebidas alcoólicas fermentadas (LOPES et al., 2007b). Com o progresso da tecnologia de bebidas, linhagens de leveduras foram sendo selecionadas segundo características desejáveis capazes de gerar melhorias tanto ao processo como ao produto. Segundo Hammond (1995) as características ideais e altamente desejáveis em leveduras para a produção de bebidas são: alta produtividade e eficiência de fermentação; tolerância ao etanol, tolerância à temperatura elevada; resistência às altas concentrações de açúcares; produção de concentração e balanço adequado de compostos secundários desejáveis para a qualidade da bebida; habilidade de flocular e a propriedade de produzir metabólitos anticontaminantes (toxinas killer). A utilização de cepas de leveduras selecionadas é

26 determinante para a manutenção das boas características de um vinho, sendo de fundamental importância saber o potencial de produção de compostos secundários e metabólitos de cada uma delas, para que seja possível selecionar a que mais atenda a produção de uma bebida padronizada e de qualidade (LOPES et al., 2007b). É natural que no processo fermentativo espontâneo da produção de cachaça de alambique, caracterizado por culturas mistas, ocorram microrganismos contaminantes indesejáveis como principalmente, bactérias e leveduras, as quais são geralmente responsáveis pela redução do rendimento alcoólico e depreciação na qualidade do produto por contribuir para acidez elevada e sabores estranhos (OLIVEIRA, 2001). No caso específico de contaminação bacteriana, ocorre a formação de ácidos (ácido láctico, acético e succínico) e outros compostos estranhos que comprometem as características organolépticas (HAMMOND, 1995). Não somente por causa de microrganismos contaminantes, mas como já citado anteriormente, pelas frequentes variações sensoriais na cachaça de alambique, é que a utilização de leveduras selecionadas, como cultura única ou starter na fermentação, tem sido apontada como a principal maneira de padronizar e elevar a qualidade da bebida (PATARO et al., 2002; GOMES et al., 2008; MARINI et al., 2009). Entretanto, Basso et al. (1996) comprovaram que leveduras de panificação ou até mesmo linhagens de leveduras estritamente selecionadas em laboratório como adequadas à processos fermentativos industriais, não conseguem predominar ao longo de uma safra por serem substituídas no decorrer do período por cepas de leveduras da biodiversidade ambiental e que passam a ser responsáveis pela fermentação alcoólica. Com isto, diversas pesquisas visando selecionar linhagens nativas do próprio ambiente de fermentação, mas detentoras de características desejáveis para a produção e para a cachaça de alambique têm sido realizadas nos últimos anos (PATARO et al., 1998; PATARO et al., 2000; GUERRA et al., 2001; SCHWAN et al., 2001; PATARO et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2004; SILVA et al., 2006; GOMES et al., 2008; MARINI et al., 2009). Tais pesquisadores abordam que a incorporação de cepas selecionadas na fermentação espontânea contribuirá para o estabelecimento de um padrão de qualidade e identidade da cachaça, se constituindo numa medida muito importante para o sucesso da produção.

27 3.3 O FENÔMENO KILLER A ocorrência do fenômeno killer é uma das características apresentadas pelas leveduras que contribuíram para que elas se tornassem microrganismos modelos em diversos estudos de pesquisa básica (MAGLIANI et al., 1997; MARQUINA et al., 2002). A ocorrência deste fenômeno foi pela primeira vez descrita em 1963, por Bevan e Makower, a partir da observação de que alguns isolados da levedura Saccharomyces cerevisiae secretavam uma substância que era letal para outras linhagens de mesma espécie. A partir de então, uma série de estudos vem demonstrado que esta característica não é restrita a S. cerevisiae, mas que ela ocorre em mais de 90 gêneros de leveduras incluindo ascomicetos e basidiomicetos (POLONELLI e MORACE, 1986; MAGLIANI et al., 1997). A atividade killer de leveduras está fundamentada na produção de exotoxinas também conhecidas como micocinas, de natureza protéica ou glicoprotéica, com atividade mediada por receptores de parede celular específico nos microrganismos sensíveis. As leveduras killer são originalmente definidas como produtoras de exotoxinas capazes de matar células sensíveis pertencentes à mesma espécie ou gênero, sendo que, a levedura produtora é imune à sua toxina (BEVAN e MAKOWER, 1963). Quanto ao fenótipo killer, elas podem apresentar se como: killer resistentes (K + R + ) ou killer sensíveis (K + R ), quando produzem toxinas letais, podendo ser resistentes ou não às distintas classes de leveduras killer; neutras (K R + ), quando não produzem toxinas e são resistentes às diversas classes e sensíveis (K R ), sendo estas que não sintetizam toxinas e, claro, não apresentam resistência (MAGLIANI et al., 1997). Segundo Azevedo (1998), o cruzamento de linhagem killer com sensível tem como resultado toda descendência do tipo killer, do mesmo modo, linhagens neutras cruzadas com sensíveis, todos descendentes são neutros. Por sua vez, o cruzamento de killer com neutra resulta em distintas proporções entre ambas (4:0 até 0:4). Young e Yourgiu (1978) propuseram um sistema de classificação para as leveduras killer baseando se na interação entre as linhagens, através de seus padrões de sensibilidade e atividade killer (Tabela 01). De acordo com este sistema, a classe de leveduras K1 é definida por matar as de classes K2, K3 e K4 e por serem sensíveis a todas as classes, exceto a ela mesma. Zhu e Bussey (1989) incrementaram a classificação incluindo a classe K11. Portanto, tal sistema de classificação, bastante utilizado até hoje em estudos de biotipagem, é constituído por 11 distintos grupos denominados de K1 a K11. Logo após a descoberta do fenômeno, estudos sobre os efeitos da presença destas leveduras no ambiente, indicam que o fenômeno killer em leveduras representa um modelo de

28 competição biológica entre os gêneros e espécies, semelhante ao das bacteriocinas entre as bactérias (HARDY, 1975). Para Cassone et al. (1997) tal fenômeno é um sofisticado mecanismo biológico para regulação da dinâmica das populações nos ecossistemas. Além disso, alguns trabalhos também demonstram um maior espectro de ação das toxinas killer, pois, além de leveduras filogeneticamente relacionadas, elas também podem ser letais a bactérias Gram positivas e diversos fungos filamentosos de interesse clínico e ambiental (POLONELLI e MORACE, 1983; POLONELLI et al., 1986; WALKER et al., 1995). Em um estudo recente, este amplo espectro de ação foi constatado pela atividade das linhagens de Candida sp. e Dipodascus capitatus, isoladas respectivamente de solo de fazenda orgânica e da decomposição da fruta proveniente de Artocarpus heterophyllus (jaca), inibindo o crescimento do fungo causador da doença vassoura de bruxa no cacaueiro, o Moniliophthora perniciosa (syn. Crinipellis perniciosa) (CABRAL et al., 2009). As leveduras killer têm sido isoladas dos mais variados habitats de distintas regiões do mundo e, dentre os mais de 90 gêneros de leveduras que o fenótipo vem sendo encontrado, destacam se: Sacchamomyces, Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Pichia, Williopsis, Zygosacchoromyces, Hansenula, Kloeckera, Metschnikowia, Rhodothorula, Schwanniomyces, Torulopsis, Ustilago e Zigowillopsis (CHEN et al., 2000; SCHMITT e BREINING, 2002). As frutas, provavelmente, consistem no habitat de maior ocorrência, uma vez que 1/3 das linhagens de leveduras isoladas de frutas no ambiente têm apresentado o fenótipo killer. Esta alta frequência pode ser explicada pelo fato das frutas oferecerem, de modo geral, condições ideais para o desenvolvimento das leveduras e estabilidade de suas toxinas tais como: baixo ph, temperatura e concentração adequada de açúcares (MAGLIANI et al., 1997). Outro aspecto relevante, é que estão expostas ao ambiente, contribuindo para que sejam constantemente visitadas por potenciais vetores, como abelhas, besouros, pássaros ou outros animais (KURTZMAN e FELL, 2006). As vantagens que as leveduras killer possuem sobre linhagens sensíveis no ambiente podem explicar sua abundância, uma vez que a atividade de suas toxinas é considerada como importante mecanismo de competição entre gêneros e espécies (PEREZ et al., 2001; ZAGORC et al., 2001; CARREIRO et al., 2002). Portanto, quanto aos aspectos ecológicos, sabe se que a produção de toxinas killer confere às linhagens produtoras uma vantagem competitiva, em relação às células sensíveis, por nutrientes disponíveis no meio (MARQUINA et al., 2002). Pelo fato de as plantas, frutas e os alimentos representarem os habitats mais importantes para as leveduras killer, diversos estudos buscando uma maior