UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS FACULDADE DE MEDICINA CHRISTINE MIRANDA CORRÊA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS FACULDADE DE MEDICINA CHRISTINE MIRANDA CORRÊA PREVALÊNCIA E MULTIPLICIDADE DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) NA CÉRVICE UTERINA DE MULHERES INFECTADAS PELO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA (HIV), EM ESTUDO MULTICÊNTRICO Belo Horizonte-MG 2007

2 CHRISTINE MIRANDA CORRÊA PREVALÊNCIA E MULTIPLICIDADE DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) NA CÉRVICE UTERINA DE MULHERES INFECTADAS PELO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA (HIV), EM ESTUDO MULTICÊNTRICO Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre. Programa: Saúde da Mulher Área de Concentração: Ginecologia Orientador: Prof. Dr. Victor Hugo de Melo UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS Faculdade de Medicina Belo Horizonte 2007

3 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS Reitor Ronaldo Tadêu Pena Vice-Reitora Heloisa Maria Murgel Starling Pró-Reitor de Pós-Graduação Jaime Arturo Ramirez Pró-Reitor de Pesquisa Prof. Carlos Alberto Pereira Tavares FACULDADE DE MEDICINA Diretor: Prof. Francisco José Penna Vice-Diretor: Prof. Tarcizo Afonso Nunes Coordenador do Centro de Pós-Graduação: Prof. Carlos Faria Santos Amaral Subcoordenador do Centro de Pós-Graduação: Prof. Dr. João Lúcio dos Santos Jr DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA E OBSTETRÍCIA Chefe: Prof.João Gilberto de Castro e Silva Vice-chefe: Roberto Lana Peixoto CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA - ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM GINECOLOGIA E OBSTETRÍCIA Colegiado Prof. João Lúcio dos Santos Júnior (Coordenador) Prof. Marcos Mendonça (Subcoordenador) Prof. Antônio Carlos Vieira Cabral Prof. Aroldo Fernando Camargos Prof. Henrique Vitor Leite Prof. Victor Hugo de Melo João Vaz da Silva (Rep. Discente)

4 A Deus, por estar sempre junto de mim. Ao meu pai, Arlindo, luz no meu caminho, alicerce das minhas construções, quão nobres lições... meu eterno agradecimento. A minha mãe, Maria Cândida, pelo amor, apoio e cumplicidade sem fim e por ser tão presente na minha vida. Ao meu irmão, Felipe, pela amizade e por compreender minha ausência em alguns momentos da sua vida. Aos meus avós, pelo conforto espiritual nos dias de cansaço e muito trabalho.

5 AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Victor Hugo de Melo, pelo incentivo e confiança no meu trabalho. Seu estímulo para que eu percorresse todos os caminhos necessários, com sabedoria e segurança, foi marcante na minha formação, não só na pós-graduação, mas como reflexo em tudo que tenho conquistado na minha vida profissional. Sua participação ativa em cada etapa da construção deste trabalho é percebida no cuidado com que cada página foi escrita. Ao meu orientador, meu eterno agradecimento. Ao Dr. Frederico Amedée Peret, pelo marcante papel na minha formação na residência médica e por me colocar no caminho da pós-graduação. Ao Prof. Dr. Vicente Rozauro e a todos os professores do Serviço de Ginecologia da UFJF, pela contribuição na minha formação acadêmica e por acreditarem no meu trabalho. À gerência e a todos os funcionários do CTR-DIP Orestes Diniz, pela receptividade, trabalho e colaboração. À equipe do NUPAD, que tanto contribuiu para nosso trabalho, em especial Dora Mendez del Castilho e Nara de Oliveira Carvalho.

6 Aos meus colegas, Dr. Iwens Meira de Faria e Dr. Homero Caporalli de Oliveira, pela parceria no trabalho durante todo o período que passamos juntos no CTR- DIP Orestes Diniz. À Dra. Angela Cristina Labanca de Araújo, pelo trabalho na construção do nosso banco de dados. Às acadêmicas Cristiana Rodrigues e Tatiana Souza, pelas tarefas desempenhadas no nosso banco de dados. À Dra. Juliana Barroso Zimmermmann, pelo fornecimento de artigos e fotos, que enriqueceram este trabalho. À professora Annamaria Ravara Vago, pela pronta ajuda na revisão de Pacientes e Métodos. Ao engenheiro Jônatas José de Oliveira Melo, pela incontestável contribuição e orientação no processo de análise estatística. Às pacientes e a todos que colaboraram, direta ou indiretamente, na elaboração desta dissertação.

7 "A mente que se abre a uma nova idéia jamais retorna ao seu tamanho original". Albert Einsten

8 RESUMO Objetivos: determinar a prevalência do papilomavírus humano e identificar os seus genótipos em pacientes infectadas pelo HIV, de algumas cidades do estado de Minas Gerais; investigar nessas pacientes a multiplicidade de genótipos do papilomavírus humano e estabelecer possíveis associações que possam justificar a maior prevalência e multiplicidade do HPV nas mulheres infectadas pelo HIV. Pacientes e métodos: foram avaliadas 288 pacientes atendidas no Ambulatório de Ginecologia do CTR-DIP Orestes Diniz da Prefeitura Municipal de Belo Horizonte, em convênio com a UFMG, e no sistema público de saúde das demais cidades mineiras: Betim, Barbacena, Conselheiro Lafaiete e Divinópolis. O período de estudo foi de agosto de 2003 a agosto de Todas as pacientes foram submetidas a questionário padrão durante atendimento ginecológico no ambulatório. Realizaram-se anamnese, exame ginecológico completo com coleta de material para detecção do HPV pela PCR, coleta de material para colpocitologia oncótica, colposcopia e biópsia dirigida, quando indicada. Os dados foram armazenados e analisados no programa Epi-Info, versão 3.3.2, de fevereiro de Para análise de dados também foi utilizado o programa EXCEL 2003 e para análise das variáveis categóricas foi empregado o teste do qui-quadrado. Foi considerado o valor de 5% (p<0,05) como limiar de significância estatística. Resultados: a prevalência do HPV foi alta nas amostras de todas as cinco cidades de Minas Gerais (78,8%). Os genótipos mais prevalentes foram o HPV-6 (63,9%) e o HPV-16 (48,5%). A taxa de pacientes com HPV detectado, mas não genotipado, variou de 0% (Barbacena) a 11,1% (Belo Horizonte), exceto em Conselheiro Lafaiete, cuja taxa foi de 48%. A presença do HPV de alto risco (pacientes com pelo menos um tipo de HPV de alto risco) foi observada em 160 (70,5%) casos, do HPV de baixo risco em 162 (71,4%) e do HPV de alto e baixo risco concomitante em 125 (55,1%). A infecção por múltiplos genótipos do HPV manifestou-se em 64,8% das pacientes, com predomínio de dois tipos (23,8%) e três tipos (18,9%). Não houve associação significante entre a prevalência do HPV e o uso de preservativo, número de parceiros sexuais, contagem de linfócitos T CD4 e quantificação da carga viral do HIV. Pacientes com carga viral mais alta (> cópias/ml) tiveram mais prevalência (41,4%) de mais de três tipos de HPV. Conclusão: a prevalência de HPV em mulheres infectadas pelo HIV é muito alta. A infecção por múltiplos genótipos foi o padrão predominante de infecção pelo HPV. A presença de HPV não está associada aos marcadores da progressão do HIV. A multiplicidade do HPV parece estar associada a níveis de carga viral do HIV mais altas. Palavras-chave: Papilomavírus humano; vírus da imunodeficiência humana; reação em cadeia de polimerase; cérvice uterina; infecção múltipla.

9 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AIDS CDC CTR-DIP DNA dntp DST ELISA FEBRASGO FUNED HAART HIV HPV IBGE IC ISH LSIL HSIL NIC NUPAD OMS OR PCAP-BR PCR RFLP RNA rpm Síndrome da imunodeficiência adquirida Centro de Controle e Prevenção de Doenças Centro de Treinamento e Referência em Doenças Infecciosas e Parasitárias Ácido desoxirribonucléico Desoxirribonucleotídeo trifosfato Doença sexualmente transmissível Enzyme-linked immunoabsorbent assay Federação Brasileira das Associações de Ginecologia e Obstetrícia Fundação Ezequiel Dias Terapia anti-retroviral potente Vírus da imunodeficiência humana Papilomavírus humano Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística Intervalo de confiança Hibridização in situ Lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau Lesão intra-epitelial escamosa de alto grau Neoplasia intra-epitelial cervical Núcleo de Pesquisa e Apoio em Diagnóstico Organização Mundial de Saúde Odds ratio Pesquisa de Conhecimento, Atitudes e Práticas na População Brasileira Reação em cadeia da polimerase Polimorfismo de tamanho do fragmento gerado para enzimas de restrição Ácido ribonucléico Rotação por minuto

10 SIL Lesão intra-epitelial escamosa TARV Tratamento anti-retroviral UFMG Universidade Federal de Minas Gerais WHO/ISGYP World Health Organization and International Society of Gynecological Pathologists

11 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figuras FIGURA 1 - Kary Mullis, inventor da PCR, em foto de 1994 (Nobel Academy) FIGURA 2 - Etapas da reação em cadeia da polimerase: preparação do mix para a realização da reação FIGURA 3 - Amostras sendo colocadas no termociclador onde ocorrerão as etapas da PCR: desnaturação, anelamento e extensão FIGURA 4 - Montagem de gel de agarose FIGURA 5 - Esquema ilustrativo das etapas da PCR Gráficos GRÁFICO 1 - Detecção do DNA-HPV pela PCR, nas cinco cidades mineiras GRÁFICO 2 - Prevalência do HPV de acordo com a quantificação da carga viral do HIV GRÁFICO 3 - Prevalência do HPV de acordo com a contagem de linfócitos T CD GRÁFICO 4 - Associação entre a multiplicidade do HPV e a média da quantificação da carga viral do HIV... 83

12 LISTA DE QUADROS E TABELAS Quadros QUADRO 1 - Interpretação dos resultados do procedimento da PCR QUADRO 2 - Esquema de iniciadores utilizados pelo NUPAD Tabelas TABELA 1 - Prevalência do HPV em mulheres portadoras do HIV na literatura TABELA 2 - Número e percentual de pacientes avaliadas, com a respectiva cidade de origem TABELA 3 - Distribuição da mediana das variáveis quantitativas nas cinco cidades de Minas Gerais TABELA 4 - Características sociais e comportamentais das pacientes infectadas pelo HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais TABELA 5 - Características clínicas e laboratoriais das pacientes infectadas pelo HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais TABELA 6 - Freqüência e multiplicidade dos genótipos do HPV, pela PCR, nas pacientes infectadas pelo HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais TABELA 7 - Associação entre a infecção pelo HPV detectado pela PCR e o uso de preservativo, nas cinco cidades de Minas Gerais TABELA 8 - Associação entre a infecção pelo HPV detectado pela PCR e o número de parceiros sexuais de portadoras do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais TABELA 9 - Associação entre a infecção pelo HPV detectado pela PCR e a quantificação da carga viral do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais TABELA 10 - Associação entre a infecção pelo HPV detectado pela PCR e a média da quantificação da carga viral do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais... 75

13 TABELA 11 - Associação entre a infecção pelo HPV detectado pela PCR e a contagem de linfócitos T CD4+ em mulheres portadoras do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais TABELA 12 - Associação entre a infecção pelo HPV detectado pela PCR e a média da contagem de linfócitos T CD4+ em mulheres portadoras do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais TABELA 13 - Associação entre multiplicidade do HPV e uso do preservativo pelas portadoras do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais TABELA 14 - Associação entre multiplicidade do HPV e número de parceiros sexuais de mulheres portadoras do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais TABELA 15 - Associação entre a multiplicidade do HPV e a quantificação da carga viral do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais TABELA 16 - Associação entre a multiplicidade do HPV e a média da quantificação da carga viral do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais TABELA 17 - Associação entre a multiplicidade do HPV e a contagem de linfócitos T CD4+, nas cinco cidades de Minas Gerais TABELA 18 - Associação entre a multiplicidade do HPV e a média da contagem de linfócitos T CD4+, nas cinco cidades de Minas Gerais.. 85 TABELA 19 - Contagem de linfócitos T CD4+ das pacientes infectadas pelo HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais TABELA 20 - Prevalência do HPV em pacientes portadoras do HIV TABELA 21 - Multiplicidade do HPV em pacientes portadoras do HIV TABELA 22 - Idade (em anos) das pacientes infectadas pelo HIV ao entrarem no estudo, nas cinco cidades de Minas Gerais TABELA 23 - Idade (em anos) de início de atividade sexual das pacientes infectadas pelo HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais TABELA 24 - Número de parceiros sexuais das pacientes infectadas pelo HIV, ao entrarem no estudo, nas cinco cidades de Minas Gerais

14 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA O papilomavírus humano Classificação do papilomavírus humano quanto ao potencial oncogênico Métodos de detecção do DNA-HPV O papilomavírus humano e o câncer cervical HIV/AIDS Aspectos epidemiológicos Transmissão do vírus Co-infecção HPV/HIV HIV e papilomavírus humano (HPV) HIV e neoplasias intra-epiteliais cervicais (NIC) A multiplicidade dos genótipos do HPV Multiplicidade x persistência do HPV Multiplicidade x imunidade Multiplicidade x alteração citológica Multiplicidade x lesões intra-epiteliais cervicais OBJETIVOS PACIENTES E MÉTODOS Considerações éticas Pacientes Critérios de inclusão Critérios de exclusão Cálculo amostral Métodos Exame físico Coleta de material para detecção do HPV e seus genótipos Coleta de material para citologia oncótica... 43

15 Colposcopia Biópsia dirigida do colo uterino Exames laboratoriais PCR (reação em cadeia de polimerase) Estudo histopatológico do colo uterino A citometria de fluxo para a contagem de linfócitos T CD Método de quantificação da carga viral do HIV Coleta dos dados Presença ou ausência de HPV Cortes na dosagem da carga viral Cortes na contagem dos linfócitos T CD Método estatístico Método bibliográfico RESULTADOS Características da amostra Prevalência do HPV Genotipagem: freqüência e multiplicidade Análises dos fatores de risco associados à prevalência do HPV Uso de preservativo Número de parceiros sexuais Carga viral do HIV Linfócitos T CD Análise dos fatores de risco associados à multiplicidade do HPV Uso de preservativo Número de parceiros sexuais Carga viral do HIV Linfócitos T CD DISCUSSÃO Características da amostra Prevalência do HPV Multiplicidade do HPV... 92

16 7 CONCLUSÕES REFERÊNCIAS ANEXOS E APÊNDICES

17 17 1 INTRODUÇÃO A associação entre câncer cervical e vírus da imunodeficiência humana (HIV) é bem estabelecida na literatura. A prevalência de neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) tem se mostrado mais alta entre mulheres infectadas pelo HIV (20 a 60%), quando comparadas com as não infectadas. A associação entre câncer cervical e papilomavírus humano (HPV) é claramente demonstrada 1, mas a contribuição etiológica da co-infecção com o HIV na gênese do tumor cervical está em estudo. Dados atuais sugerem que a exposição à infecção pelo HIV pode aumentar a incidência da persistência do HPV e das lesões intra-epiteliais escamosas cervicais, provavelmente pela fraca resposta do sistema imune. Indivíduos que praticam atividade sexual desprotegida têm risco combinado de se infectarem pelo HIV e HPV porque esses vírus têm forma de aquisição comum. Recentemente, o desenvolvimento de métodos baseados em reação em cadeia de polimerase (PCR), que são mais sensíveis e capazes de identificar mais de 20 tipos específicos de HPV simultaneamente, tem permitido a investigação sistemática de infecções múltiplas. A finalidade deste trabalho é determinar a prevalência das infecções pelo HPV em um grupo de mulheres infectadas pelo HIV em diferentes cidades do estado de Minas Gerais e investigar a presença de genótipos de HPV e sua multiplicidade, por meio do método mais sensível e específico.

18 18 2 REVISÃO DA LITERATURA O câncer cervical é o segundo câncer mais comum em mulheres de todo o mundo e é o tipo principal entre elas na maioria dos países em desenvolvimento, onde 80% dos casos ocorrem. Estudos epidemiológicos indicam que a presença de certos tipos de HPV no colo uterino é a principal causa de câncer cervical invasivo e neoplasia intra-epitelial cervical 2. Em 1993, o papilomavírus humano (HPV) associado à neoplasia intraepitelial cervical de alto grau foi classificado como estágio B e o câncer cervical invasivo como condição definidora de síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), de acordo com o sistema de classificação do Centro de Controle e Prevenção de Doenças 3. Acredita-se que o HIV pode influenciar o prognóstico clínico da infecção por HPV, principalmente por reduzir a resposta imune sistêmica e local, embora interações vírus-vírus também possam interferir O papilomavírus humano Classificação do papilomavírus humano quanto ao potencial oncogênico Os tipos de HPV genitais têm sido subdivididos em baixo e alto risco, os últimos freqüentemente associados ao câncer cervical invasivo. O número de tipos de HPV de alto risco varia de 13 a 19 e apenas 11 (16, 18, 31,33, 35, 39, 45,

19 19 51, 52, 56 e 58) são consistentemente classificados como de alto risco. O tipo 16 é o mais freqüente nas lesões cervicais, independentemente da presença ou gravidade da neoplasia intra-epitelial cervical. O tipo 18 predomina nos adenocarcinomas 5,6. São classificados como de baixo risco os tipos: 6, 11, 30, 40, 42, 43 e 44, que estão usualmente associados à lesão genital exofítica benigna e/ou lesão intra-epitelial de baixo grau (LSIL). Os tipos 6 e 11 estão presentes em 90 a 95% dos condilomas. Por essas razões, são necessários critérios para classificar os tipos de HPV em grupos de baixo e alto riscos, os quais devem ser baseados em estudos epidemiológicos moleculares que forneçam risco estimado e evidência funcional do potencial oncogênico dos vários tipos diferentes de HPV Métodos de detecção do DNA-HPV A detecção direta do ácido desoxirribonucléico (DNA) do HPV constitui o método mais confiável para identificar o vírus. Os procedimentos moleculares disponíveis são os seguintes 7 : Hibridização com sondas (Southern blot, Dot blot e Captura Híbrida) Todos esses métodos são baseados na análise do DNA celular total. A técnica denominada Southern blot foi o primeiro método adotado. Durante muitos anos foi considerado padrão ouro para a identificação do HPV, já que sua especificidade e sensibilidade são elevadas. A sensibilidade da técnica de Dot blot

20 20 é menor que a de Southern blot. Os testes disponíveis comercialmente (ViraPap e ViraType) são procedimentos de Dot blot modificados. Atualmente, os kits para captura híbrida I e II, produzidos pela Digene, demonstram boa acurácia, sendo os utilizados na prática clínica 8. Teste de hibridização in situ (ISH) Tem como objetivo investigar a presença do DNA de HPV incluído em núcleos das células infectadas, em um corte histológico standard fixado por parafina. Apesar de o ISH ser menos sensível do que o teste Blot, ele permite investigar amostras histológicas e realizar estudos retrospectivos. Assim, o ISH é técnica morfológica e molecular mista, que possibilita avaliação quantitativa, assim como a demonstração do vírus nas células neoplásicas ou normais. Por isso, poderia ser considerada a técnica de escolha para a detecção do DNA viral, mas seu elevado custo faz com que seja desaconselhada em grandes estudos. Reação em cadeia de polimerase (PCR) FIGURA 1 - Kary Mullis, inventor da PCR, em foto de 1994 (Nobel Academy). Fonte: (acessado em dez/2006)

21 21 Esse método foi desenvolvido por Mullis, em É técnica enzimática sofisticada possibilita a amplificação pelo menos um milhão de vezes de seqüências de DNA na amostra do exame. Pode ser aplicada em DNA extraído de tecido fresco ou fixado. Atualmente, é a mais sensível de que se dispõe. Pode ser processada rapidamente (2-3 horas), porém requer notável habilidade e deve ser realizada em laboratórios que disponham de meios especializados de contenção, a fim de prevenir-se a contaminação da amostra previamente amplificada. Tal contaminação pode levar a resultados falso-positivos. A tecnologia da reação em cadeia da polimerase também é bastante flexível, permitindo uma série de modificações que possibilitam seu emprego na análise de uma grande variedade de amostras. Entre as principais técnicas resultantes de modificações da reação em cadeia da polimerase, pode-se citar o RT-PCR, nested PCR, multiplex PCR, PCR a partir de primers randômicos e PCR em tempo real. O RT-PCR utiliza a enzima transcriptase reversa para converter uma amostra de ácido ribonucléico (RNA) em cdna antes da etapa de amplificação por PCR, permitindo o estudo de vírus de RNA e análises de expressão gênica. O nested PCR visa a aumentar a sensibilidade e especificidade do método. O segmento genômico é amplificado primeiro de forma abrangente e, depois, utilizando-se esse primeiro produto, é realizada a amplificação da real seqüência-alvo. Já a PCR multiplex é uma reação de amplificação desenhada para detectar múltiplas seqüências-alvo numa mesma amostra. A PCR a partir de primers randômicos utiliza seqüências curtas de oligonucleotídeos para amplificar regiões repetitivas do DNA genômico e é bastante empregada em estudos epidemiológicos. Finalmente, a PCR em tempo real permite que a amplificação e a detecção ocorram simultaneamente,

22 22 num sistema fechado, sendo necessário para isto um termociclador que possua sistema de monitoramento de emissão de fluorescência. Essa técnica é empregada tanto para quantificação de amostras como para testes de carga viral e monitoramento de doença residual mínima O papilomavírus humano e o câncer cervical No estudo do carcinoma cervical, o interesse pelo HPV cresceu desde que foi sugerida 10, na década de 70, a associação entre o HPV e o câncer cervical. Vários estudos epidemiológicos, clínico-patológicos e moleculares se seguiram, confirmando o papel do HPV na patogênese do câncer cervical e em suas lesões precursoras. Fatores de risco de câncer cervical incluem vários aspectos do comportamento sexual (como número de parceiros e idade da primeira relação sexual), tabagismo, uso de contraceptivos orais, presença e tipo do papilomavírus humano e outras doenças sexualmente transmissíveis 11. A existência de neoplasia cervical em mulheres com o vírus da imunodeficiência humana representa um dos mais sérios desafios no cuidado a pacientes imunossuprimidas. A associação entre lesões intra-epiteliais cervicais e a positividade para o HIV foi sugerida desde Tem sido demonstrado que quase todos os casos de câncer cervical são causados por um ou mais tipos de HPV oncogênicos (de alto risco), a maioria associada aos tipos 16 e

23 23 O câncer invasivo nas pacientes infectadas pelo HIV tem comportamento mais agressivo, responde mal às terapias preconizadas e, na recorrência, é de pior prognóstico Vírus da imunodeficiência humana e síndrome da imunodeficiência adquirida Aspectos epidemiológicos Estima-se que dos casos notificados de AIDS até junho de 2006, 62,3% ( casos) se concentravam na região Sudeste, 17,9% ( casos) na região Sul, 11% (47.751) no Nordeste, 5,6% (24.086) no Centro-Oeste e 3,2% (13.681) no Norte. Segundo parâmetros da Organização Mundial de Saúde (OMS), o Brasil mantém sua posição entre os países com epidemia concentrada (quando o número de casos, novos ou antigos, em qualquer população de risco é maior que 5%, mas menor que 5% nas populações que não apresentam condutas de risco), com prevalência da infecção pelo HIV de 0,61% entre a população de 15 a 49 anos, sendo 0,42% entre as mulheres e 0,80% entre os homens 15. Entre os principais fatores de vulnerabilidade ao HIV, estão: a falta de conhecimento sobre as formas de transmissão e proteção; o uso inconsistente ou a falta de uso de preservativos; e a multiplicidade de parceiros sexuais. Dados da Pesquisa de Conhecimento, Atitudes e Práticas na População Brasileira (PCAP- BR) realizada em 2004 mostram que quase 91% da população brasileira com idade entre 15 e 54 anos citaram espontaneamente a relação sexual como forma

24 24 de transmissão do HIV e 94% referiram o uso de preservativo como forma de prevenção da infecção 16. Tendências da epidemia no Brasil durante os últimos anos 17 : a interiorização: ou seja, a expansão da AIDS em municípios com menos de 50 mil habitantes, com pouca capacidade de mobilização de recursos humanos e materiais; a feminização: fenômeno pelo qual o ritmo de contaminação na população feminina cresceu vertiginosamente e, em conseqüência, a transmissão do HIV de mãe para filho também se elevou; a pauperização: que atinge populações particularmente vulneráveis devido ao seu difícil acesso a informações, a serviços públicos e a práticas preventivas. O país acumulou cerca de óbitos devidos à AIDS de 1980 a 2005, sendo as taxas de mortalidade crescentes até meados da década de 90, estabilizando-se em cerca de 11 mil óbitos anuais desde Após a introdução da política de acesso universal ao tratamento anti-retroviral (TARV), que combina drogas com diferentes formas de ação (HAART), observou-se importante queda na mortalidade. A partir do ano 2000, essa taxa estabilizou-se em cerca de 6,4 óbitos por 100 mil habitantes, principalmente em São Paulo e no Distrito Federal 18.

25 Transmissão do vírus Estudos epidemiológicos têm demonstrado que o HIV é transmitido de três formas: sexual, parenteral e perinatal. Geralmente, todos os casos de transmissão de HIV podem ser atribuídos a essas categorias de exposição. O vírus não é transmitido por meio de contato casual (abraço, aperto de mãos), contato de superfície (vaso sanitário) ou picada de inseto 19. A transmissão nas relações sexuais é bidirecional, tanto nas relações heterossexuais como nas homossexuais. O risco de transmissão aumenta com a prática do intercurso anal, na presença de úlceras genitais e quando o estado de imunodeficiência do transmissor é mais avançado. A presença de doenças sexualmente transmissíveis, a ausência de circuncisão e relações sexuais durante o período menstrual também aumentam a possibilidade de transmissão do HIV Co-infecção HPV/HIV Vários estudos na literatura referenciam a forte associação existente entre a oncogênese e a progressão neoplásica relacionada ao HPV e ao sistema imunológico. Mulheres imunossuprimidas apresentam risco elevado de desenvolvimento de neoplasia intra-epitelial escamosa e câncer invasivo do trato genital inferior. O elo entre doenças relacionadas ao HPV e HIV é forte porque ambas as condições - infecções por HIV e HPV - são transmitidas sexualmente e suas populações de risco apresentam várias características demográficas em comum 21.

26 26 Embora não haja dúvidas de que pacientes infectadas pelo HIV estejam sob risco aumentado de infecção pelo HPV associada à neoplasia anogenital, os mecanismos da interação HPV-HIV estão pouco esclarecidos 22. Enquanto há relação entre níveis baixos de linfócitos T CD4+ e aumento da incidência de neoplasia intra-epitelial de baixo e alto grau e neoplasia intraepitelial anal, a relação entre imunossupressão e incidência de câncer anogenital é menos clara. Dados registrados sobre AIDS e câncer não mostram associação de níveis baixos de linfócitos T CD4+ (abaixo de 500 células/mm³ ou até mesmo menor que 200 células/mm³) e câncer anal ou cervical em homens e mulheres diagnosticados com AIDS, como também não há aumento claro na incidência desses cânceres com o tempo após o diagnóstico da síndrome 22. Estudos epidemiológicos e experimentais têm descrito a estreita correlação entre a infecção pelo HIV e todas as demais doenças de transmissão sexual. Assim, o tratamento e diagnóstico precoces das infecções do trato reprodutivo constituem-se em arma importante no combate ao avanço da epidemia da infecção pelo HIV/AIDS 17. A seguir, serão abordados aspectos do vírus da imunodeficiência humana relacionados ao papilomavírus humano e às lesões intra-epiteliais escamosas cervicais, com enfoque nos estudos de prevalência.

27 Vírus da imunodeficiência humana (HIV) e papilomavírus humano (HPV) A infecção pelo HPV é extremamente comum. Estudos relatam que 50% dos adultos sexualmente ativos têm sido infectados com um ou mais tipos de HPV, mas a maioria das infecções por esse vírus é transitória 23. Alguns autores têm afirmado que mulheres infectadas por HIV têm mais prevalência de HPV 24-26, de múltiplos tipos de HPV 27 e prevalência mais elevada de subtipos oncogênicos 24,28 que mulheres não infectadas pelo HIV. Indivíduos imunossuprimidos por infecção pelo HIV ou transplantados estão sob risco aumentado de infecção pelo HPV associado a câncer anogenital, comparados com os imunocompetentes da mesma idade 22. Em investigação que relacionou 344 portadoras do vírus da imunodeficiência humana e 325 mulheres não portadoras, nas quais foram utilizados colposcopia e teste do DNA do HPV, Sun et al. (1995) 29 verificaram significativa prevalência de infecção pelo HPV nas mulheres do primeiro grupo. Enquanto a taxa de infecção pelo papilomavírus humano foi de 60% entre as mulheres infectadas pelo HIV, a encontrada entre as integrantes do grupo-controle foi de 36%. Um estudo desenvolvido na Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) 14, Belo Horizonte, em 2001, encontrou 38,1% pacientes com infecção simples (apenas um tipo de HPV). Os tipos mais prevalentes foram o 6 e o 16, ocorrendo em 48,9 e 36,7% dos casos, respectivamente. Quanto ao tipo de HPV, observou-se que os de alto risco foram mais prevalentes nas pacientes com número de células CD4+ abaixo de 499 do que os de baixo risco.

28 28 Em estudo desenvolvido na mesma Universidade, em 2002, 30 foi descrita prevalência de 80% de HPV na cérvice uterina de mulheres infectadas pelo HIV, sendo os tipos mais prevalentes o HPV-6 e o HPV-16. O HPV também foi freqüente na amostra estudada por Melo et al. (2003) 31, presente em 81,7% das portadoras do HIV que tiveram material da cérvice uterina examinado por PCR. Em publicação mais recente (2005), relatou-se que, das pacientes infectadas pelo HIV, 73,2% apresentaram resultado positivo para o DNA-HPV, comparado a 23,8% entre as soronegativas. Houve tendência à infecção por múltiplos tipos de HPV nas portadoras de HIV, enquanto que a infecção simples predominou nas soronegativas 32. Avaliação feita em São Paulo demonstrou mais freqüência de anormalidades nas citologias oncóticas cervicais das mulheres soropositivas em relação às soronegativas para o HIV 33,34 Levi et al. (2002) 34, acompanhando 208 portadoras do HIV, registraram prevalência de 98% de HPV detectado pela PCR em mulheres infectadas pelo HIV; 14,3% delas apresentaram genótipos de HPV de baixo risco e 21,2% exibiram alto risco, enquanto 64,3% possuíam ambos os tipos de risco. Em publicação posterior (2004), os mesmos autores 35 relataram o genótipo 16 como sendo o tipo de HPV mais comum entre as pacientes infectadas pelo HIV, enquanto no grupo-controle (não HIV) o HPV 51 apareceu como o mais comum, seguido pelo HPV 16. Gonçalves et al. (1999) 36 descreveram que os tipos HPV-16 e HPV-18 foram os mais prevalentes e que quase 20% dos tipos de HPV não foram

29 29 detectados. Tal achado pode ser explicado pela restrição do tamanho do fragmento baseado no polimorfismo do método de genotipagem utilizado. O HPV-53, o HPV-58 e o HPV-61 foram referidos 25 como os tipos mais prevalentes em uma grande população americana infectada pelo HIV, na qual a distribuição dos genótipos de HPV em mulheres portadoras do HIV era diferente das mulheres não HIV. Está bem documentado que mulheres infectadas pelo HIV têm mais prevalência de infecção pelo HPV 34,37,38,39 e de lesões intra-epiteliais escamosas cervicais (SIL) 40. Nesse grupo de pacientes imunossuprimidas, essas lesões têm prognóstico pior e progressão mais rápida que em pacientes imunocompetentes 41. As lesões são difíceis de serem tratadas, com taxa mais alta de recorrência, freqüentemente contendo o mesmo tipo de HPV prévio ao tratamento instituído 40. Em mulheres portadoras do HIV, a prevalência e a persistência da infecção pelo HIV aumentam com a queda da contagem de linfócitos T CD4 e elevação da carga viral 25 e alguns estudos mostram que tipos oncogênicos do HPV podem ser mais comuns com baixo CD4 e/ou carga viral alta 24,42. Resultados semelhantes foram descritos por Rachid e Schechter (2005) 20. Esses autores relataram que a prevalência da infecção pelo HPV aumenta à medida que ocorre progressão do dano imunológico associado à infecção pelo HIV; e que a persistência da infecção pelo HPV é inversamente proporcional à contagem de linfócitos T CD4 + e diretamente proporcional à carga viral do HIV.

30 Vírus da imunodeficiência adquirida (HIV) e neoplasias intra-epiteliais cervicais (NIC) Citologia cervical anormal é mais comum em mulheres infectadas pelo HIV e está associada à presença de infecção pelo HPV e grau de imunossupressão. Tanto a freqüência quanto a gravidade de esfregaços cervicais e NIC documentado histologicamente aumentam com o declínio da contagem de linfócitos T CD4 e também estão relacionados com alta carga viral 43. A incidência de citologia cervical alterada está aumentada em pacientes com baixa contagem de linfócitos T CD4 44. Levi et al. (2005) 45, estudando pacientes soropositivas e negativas para o HIV, verificaram que a contagem de células de Langerhans foi de quatro por campo nas soronegativas e de 1,92 por campo nas soropositivas, o que retrata resposta imune local inadequada nessas pacientes (p=0,01). A HAART não tem sido consistentemente associada ao risco reduzido de anormalidades cervicais relacionadas ao HPV em mulheres infectadas pelo HIV 46. Foi possível comprovar que as pacientes portadoras do HIV infectadas pelo HPV têm 13,3 vezes mais chances de desenvolver NIC do que as não portadoras de HPV 14. Posteriormente, constatou-se que as pacientes com carga viral do HIV acima de 400 cópias/ml, quantificada antes da biópsia do colo uterino, apresentaram chances 3,2 vezes maiores de desencadear lesão intra-epitelial (SIL). A contagem de linfócitos T CD4+ não influenciou o aparecimento da SIL 47.

31 A multiplicidade dos genótipos do HPV Embora a infecção por múltiplos tipos de HPV tenha sido descrita no passado 48, não parecia comum sua observação em amostras cervicais obtidas de pacientes imunocompetentes de muitos países. Infecções múltiplas foram encontradas em apenas 2,2% das participantes no início do estudo de coorte realizado em São Paulo, Brasil 49. A multiplicidade do HPV foi verificada em 2,6% das mulheres mexicanas do estado de Morelos, com citologias cervicais normais 50. A multiplicidade dos genótipos de HPV de alto risco é mais prevalente em mulheres jovens, sugerindo que o aumento da atividade sexual está relacionado com a transmissão sexual de múltiplos tipos de HPV de alto risco 51. Já se observou que a prevalência da infecção múltipla pelo HPV varia de acordo com o método de detecção. Demonstra-se que a infecção múltipla é comumente detectada quando se emprega PCR, sendo este método de alta especificidade e sensibilidade 2,34,35. Utilizando a PCR, tipos de HPV de alto risco foram detectados em mais da metade das lesões condilomatosas de indivíduos saudáveis e em 100% dos espécimes de indivíduos imunossuprimidos 52. Esse estudo demonstrou que a maioria das lesões condilomatosas contém múltiplos tipos de HPV, incluindo tipos associados a lesões displásicas. Em pacientes não infectadas pelo HIV, a prevalência de infecções múltiplas por HPV chega a ser alta em algumas populações estudadas, como demonstrado por Cuschieri et al. (2004) 51, que encontraram 43,3% de positividade para mais de um genótipo do HPV. Em grupo semelhante de pacientes, a

32 32 prevalência do HPV variou de 20%, em Edinburgh e Paraguai, a 14,9%, na Colômbia 51. Em mulheres infectadas pelo HIV, tipos de DNA-HPV de alto risco são significantemente mais freqüentes que em soronegativas. Além disso, a coinfecção por múltiplos tipos de HPV é comum nas pacientes imunossuprimidas 12,53. Portadoras do HIV são geralmente infectadas por múltiplos genótipos do HPV, com relato na literatura de até 80% 51. Os resultados do trabalho de Levi et al. (2002) 34 confirmam os achados da literatura, na qual 21,1% das pacientes possuíam um único tipo de HPV, enquanto 78,9% eram portadoras de múltiplos tipos. Um estudo realizado em São Paulo, Brasil, verificou infecção por mais de dois tipos de HPV em 45% das pacientes acometidas pelo HIV 35. Esta foi exatamente a mesma proporção encontrada em outra investigação em população de mulheres com HIV em Santos, São Paulo, confirmando a alta freqüência de infecções múltiplas pelo HPV em brasileiras portadoras do HIV 36. Em Belo Horizonte, Brasil, constatou-se predominância da infecção múltipla por HPV nas portadoras do HIV (50,0%) 32 quando comparadas com as soronegativas (33,3%), apesar da diferença encontrada não ter sido significante (p>0,05). A combinação mais freqüentemente encontrada foi a dos tipos 6, 11 e 16. Palefsky et al. (1999) 25 observaram que 403 (23%) entre mulheres americanas infectadas pelo HIV tinham dois ou mais tipos de HPV, com 3% apresentando seis ou mais tipos.

33 33 Em outras pesquisas, a multiplicidade da infecção pode ter sido subestimada devido ao uso de técnicas PCR-RFLP. Sun et al. (1997) 26 encontraram prevalência cumulativa de HPV de 56% em estudo longitudinal, mas com dificuldades relatadas em apenas 3% dos casos, o que atribuíram à infecção por múltiplos tipos de HPV. Ellerbrock et al. (2000) 41, empregando a estratégia MY09/11 com posterior restrição enzimática (RFLP), observaram múltiplos tipos em apenas 31 (12%) pacientes da sua coorte infectadas pelo HIV, em Nova Iorque. Pacientes infectadas pelo HIV com vida sexual ativa e aquisição contínua de novos tipos de HPV têm mais chances de serem portadoras de mais de um tipo de HPV do que as não HIV, visto que as últimas eliminam o HPV rapidamente após cada infecção Multiplicidade x persistência do HPV A persistência do DNA-HPV explica a alta associação entre imunossupressão mediada por HIV e lesões intra-epiteliais escamosas cervicais 55. Nesse estudo longitudinal, os autores registraram que a eliminação do HPV era menor em pacientes portadoras do HIV. Se há exposição à infecção contínua, o resultado é o acúmulo de genótipos de HPV diferentes e mais prevalência de mulheres infectadas por múltiplos tipos do HPV. Em pacientes submetidas ao tratamento de lesões intra-epiteliais escamosas de baixo grau, 36,2% das infectadas pelo HIV desenvolveram recorrência da lesão, comparadas com 11,1% das não HIV. Adotando conduta

34 34 expectante, 53,6% das mulheres HIV positivo apresentaram progressão, 32,1% persistência e 14,3% regressão parcial ou total da lesão, enquanto nas pacientes HIV negativo essas porcentagens foram de 23,3; 33,3 e 43,4%, respectivamente 12. Verificou-se que a presença de múltiplos tipos de HPV e baixa contagem de linfócitos T CD4+ parece ocupar papel importante, mas independente, na persistência do HPV 54. Um estudo prospectivo utilizando PCR/ hibridização reversa 56 relatou que a persistência da infecção pelo HPV em mulheres brasileiras aumenta o risco de aquisição de outro tipo de HPV, enquanto a co-infecção com múltiplos genótipos não influencia na persistência do HPV, o mais importante fator na gênese das anormalidades cervicais Multiplicidade x imunidade Com o aumento nos níveis de DNA-HPV, há relação entre a queda dos níveis de linfócitos T CD4 + e o aumento do número de tipos de HPV em espécimes cervicais e anais de mulheres e homens infectados pelo HIV 22. Nenhuma relação entre contagem de linfócitos T CD4 e presença do HPV pôde ser estabelecida 35. Além disso, não houve correlação significativa entre o número de genótipos do HPV e a contagem de linfócitos T CD4 ou da carga viral do HIV. A presença de múltiplos subgrupos de HPV pode refletir disfunção da resposta imune, que não é indicada pela contagem de linfócitos T CD4+ e que

35 35 vem ocorrendo ao longo do tempo. A resposta das citocinas no muco cervical está alterada em pacientes infectadas pelo HIV quando comparadas com as HIV negativo Multiplicidade x alteração citológica Chang et al. (1997) 57 descreveram um número decrescente de tipos de HPV em pacientes com piora do diagnóstico citológico. Tal achado foi confirmado por outros estudos em que se observou que o número médio dos tipos de HPV não aumenta significativamente com a piora da classe citológica ou diminuição da contagem de linfócitos T CD4 35,58,59. Observou-se clara tendência no decréscimo do número de genótipos do HPV com a progressão da classificação de Papanicolau em estudo realizado em mulheres brasileiras. A prevalência de múltiplos tipos de HPV foi mais alta em pacientes com classe citológica I e II de Papanicolau, comparada com aquelas com classe III 34. O número médio de tipos de HPV foi similar em todas as categorias citológicas, enquanto associação entre piora do diagnóstico citológico e queda da contagem de linfócitos T CD4 foi claramente observada 35. Apesar da alta carga viral do HPV e do HIV, o número de pacientes infectadas com mais de três tipos de HPV com classe III de Papanicolau não foi significativamente diferente daquelas infectadas por um único tipo de HPV 35.

36 Multiplicidade x lesões intra-epiteliais cervicais A detecção de infecções por múltiplos tipos de HPV tem sido proposta por um grupo de pesquisadores como um indicador de prognóstico para neoplasia intra-epitelial cervical em pacientes infectadas pelo HIV 60. Outros estudos não confirmam a associação entre multiplicidade de HPV e aumento da freqüência de lesões intra-epiteliais cervicais 35,61. Esses autores acreditam que a maioria das lesões intra-epiteliais cervicais é causada por um tipo de HPV, enquanto os outros tipos detectados atuam como fatores de menos importância e, possivelmente, não conferem risco adicional significante de neoplasia. A presença de múltiplos tipos de HPV torna impossível a atribuição de lesões prevalentes a um tipo particular de HPV 35. Acima de 50% das pacientes infectadas pelo HIV com neoplasia intraepitelial cervical de alto grau contêm um tipo de HPV ou mais, além do HPV A infecção múltipla pelo HPV foi mais freqüente entre as mulheres que apresentavam lesões de baixo grau e, à medida que aumentou a gravidade da lesão cervical, a infecção simples se tornou mais freqüente 57.

37 37 3 OBJETIVOS Determinar a prevalência do papilomavírus humano e identificar os seus genótipos em pacientes infectadas pelo HIV, de algumas cidades do estado de Minas Gerais. Investigar nessas pacientes a multiplicidade de genótipos do papilomavírus humano. Estabelecer possíveis associações relacionadas à progressão da infecção pelo HIV que possam justificar a maior prevalência e multiplicidade do HPV. nas mulheres infectadas pelo HIV.

38 38 4 PACIENTES E MÉTODOS 4.1 Considerações éticas Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFMG (ANEXO A), juntamente com o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (APÊNDICE A). 4.2 Pacientes Foram estudadas 288 pacientes atendidas no Ambulatório de Ginecologia do CTR-DIP Orestes Diniz da Prefeitura Municipal de Belo Horizonte, em convênio com a UFMG, e pacientes atendidas no sistema público de saúde das demais cidades mineiras: Betim, Barbacena, Conselheiro Lafaiete e Divinópolis. O período de estudo foi de agosto de 2003 a agosto de Todas as pacientes foram submetidas a questionário padrão durante atendimento ginecológico no ambulatório (APÊNDICE B). Realizaram-se anamnese, exame ginecológico completo com coleta de material para detecção do HPV pela PCR, coleta de material para colpocitologia oncótica, colposcopia e biópsia dirigida, quando indicada.

39 Critérios de inclusão A) População alvo Mulheres portadoras do vírus da imunodeficiência humana (HIV), rastreadas pelo enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA) e confirmadas pela imunofluorescência indireta ou western blot, com ou sem AIDS. B) População acessível Pacientes atendidas no ambulatório de ginecologia do Centro de Treinamento e Referência em Doenças Infecciosas e Parasitárias (CTR- DIP) Orestes Diniz da Prefeitura Municipal de Belo Horizonte, em convênio com a Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), em Belo Horizonte. Pacientes atendidas no ambulatório de ginecologia da Prefeitura Municipal das seguintes cidades do estado de Minas Gerais: Betim, Barbacena, Divinópolis e Conselheiro Lafaiete.

40 Critérios de exclusão Pacientes que se recusaram a assinar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para participar da pesquisa. Pacientes com impedimento para fornecer dados para o trabalho (barreira de linguagem, desorientação). Pacientes que tiveram suas amostras sem qualidade para a detecção do HPV através da reação em cadeia de polimerase (PCR). Pacientes histerectomizadas e gestantes. 4.3 Cálculo amostral Para calcular o tamanho da amostra do número de pacientes a serem observadas neste estudo, utilizou-se o Stat Calc do programa Epi-Info versão Foi estabelecido α = 0,05 (nível de significância estatística de 95%) e β = 0,20, conferindo ao estudo o poder estatístico de 80%. Com base nos dados da literatura, a prevalência do HPV entre as pacientes portadoras do HIV é variável.

41 41 TABELA 1 Prevalência do HPV em mulheres portadoras do HIV na literatura Zimmermmann Levi et al. Campos et al. Luque et al. (2002) 30 (2004) 35 (2005) 32 (2006) % 87% 73,2% 52% Optou-se por utilizar a prevalência de 50% para obter-se um tamanho amostral mínimo maior, o que garante mais precisão nos resultados dos testes estatísticos. Foi também necessário, para o cálculo amostral, determinar a precisão desejada para as medidas de associação. Nesse aspecto, o tamanho amostral foi determinado em função de se obter uma razão de chances (odds ratio) tal que fosse estatisticamente significativa a partir de um valor de 2,05. Deste modo, o número mínimo de casos necessário para conferir o poder estatístico proposto, considerando-se esses parâmetros (prevalência e odds-ratio), seria de Métodos É um estudo transversal, com componentes analíticos e descritivos. Para a sua execução, algumas etapas foram seguidas:

42 42 Etapa 1 Normatização de procedimentos em relação ao exame e coleta do material cervical das pacientes; instruções sobre o preenchimento do banco de dados; normas para diagnóstico e tratamento das lesões cervicais. Etapa 2 Exame das pacientes e coleta do material para diagnóstico e tratamento. Constituição do banco de dados. Etapa 3 Avaliação parcial dos resultados. Etapa 4 Término da coleta do material. Etapa 5 Digitação e análise dos dados. Etapa 6 Apresentação, discussão dos resultados e conclusão Exame físico Todas as pacientes foram submetidas a exame ginecológico completo, com coleta de material para detecção do HPV e seus genótipos, coleta de material para citologia oncótica e colposcopia. As pacientes que apresentaram alterações colposcópicas foram submetidas à biópsia dirigida Coleta de material para detecção do HPV e seus genótipos Foi utilizada a PCR (reação em cadeia da polimerase) para detecção do HPV. Após a colocação do espéculo vaginal, antes de coletar-se o material para citologia oncótica, com o auxílio de uma espátula de Ayre, fez-se um

43 43 raspado cauteloso do colo uterino. Quebrou-se essa espátula com o intuito de diminuir o seu comprimento, colocando-a em um tubo de ensaio contendo aproximadamente 2 ml de soro fisiológico 0,9%. O tubo foi rotulado com o nome completo da paciente, número de registro no serviço e data da coleta. A seguir, foi enviado ao Núcleo de Pesquisa e Apoio Diagnóstico (NUPAD) da Faculdade de Medicina da UFMG, acondicionado em caixa de isopor com gel refrigerado. Caso não fosse possível o envio imediato, o mesmo era armazenado em geladeira. Todo o material chegava ao laboratório em, no máximo, 24 horas. Foram utilizados primers específicos para os tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33 e 35 do papilomavírus humano Coleta de material para citologia oncótica A coleta de material para citologia oncótica foi realizada com espátula de Ayre e escova endocervical ( cytobrush ). Os laudos foram emitidos segundo a classificação de Bethesda (ANEXO C) Colposcopia Foi utilizado o colposcópio da marca Vasconcelos, modelo padrão, com três aumentos. Técnica: primeiro aplicava-se o ácido acético a 3% sobre o colo uterino, com o objetivo de pesquisar áreas acetobrancas. Após essa primeira avaliação

44 44 colposcópica, o colo era corado com solução de Schiller e novamente observado ao colposcópio. Toda área iodo-negativa era estudada. O passo seguinte era a aplicação de solução de bissulfito de sódio a 5% para retirar o iodo. O ácido acético a 3% era reaplicado e novamente era realizado estudo colposcópico com o objetivo de identificar as imagens alteradas. A representação gráfica da lesão foi registrada no prontuário da paciente. Para a classificação colposcópica das lesões cervicais, adotou-se a nomenclatura proposta pelo Comitê da Federação Internacional de Patologia Cervical e Colposcopia (Roma, Itália, maio de 1990) (ANEXO B) Biópsia dirigida do colo uterino A biópsia foi realizada sob visão colposcópica, utilizando-se a pinça Professor Medina ou similar. O material biopsiado foi fixado em formol a 10% e processado para estudo histopatológico na rotina dos Serviços de Biópsias do Departamento de Anatomia Patológica e Medicina Legal da Faculdade de Medicina da UFMG. Nas cidades do interior, o exame foi realizado pelo histopatologista local. As pacientes portadoras de lesões cervicais de alto grau foram submetidas à cirurgia de alta freqüência (CAF) para tratamento, com seguimento de três, seis e 12 meses. As recidivas que ocorreram foram novamente tratadas. O tratamento ocorreu em cada localidade ou em Belo Horizonte.

45 Exames laboratoriais PCR (reação em cadeia de polimerase) As amostras entregues ao NUPAD foram conservadas em geladeira a 4 C até seu processamento. Inicialmente, procedeu-se à homogeneização do material da amostra e todas as amostras foram transferidas para tubos Eppendorf, para que se processasse a centrifugação por um minuto, a rpm, para a formação de depósito no fundo do tubo (pellet). O sobrenadante foi desprezado e ao pellet foram adicionados 200µl de resina quelante (Chelex-100 a 20%). A mistura foi colocada em banho seco a 100 ºC por 20 minutos e colocada em geladeira até a preparação do mix, para a qual foram empregados os seguintes reagentes: MIX para a PCR com primers genéricos para o HPV (MY09 e MY11): Buffer (1X) 50mM de KCl; 4mM de MgCl 2 ; 10mM de Tris - HCl (ph 8,5) dntps (dexoxirribonucleotídeos trifosfato) µm Taq DNA polimerase...2,5 UI Primers 1 e 2 (2,5 µl de cada um)...5,0 µl (25 pmoles) Água...28,5 µl Total...40,0 µl DNA...10 µl

46 46 MIX para a nested PCR: Buffer (1X) 50mM de KCl; 4mM de MgCl 2 ; 10mM de Tris - HCl (ph 8,5) dntps (dexoxirribonucleotídeos trifosfato) µm Taq DNA polimerase...2,5 UI Primers nested 1 e 2 (1,0 µl de cada um)...2,0 µl (10 pmoles) Água...40,5 µl Total...49,0 µl Produto da 1º PCR...1 µl MIX para a tipagem com primers alelo-específicos: Buffer (1X) 50mM de KCl; 4mM de MgCl 2 ; 10mM de Tris - HCl (ph 8,5) dntps (dexoxirribonucleotídeos trifosfato) µm Taq DNA polimerase...2,5 UI Primers tipo-específicos 1 e 2 (2,5 µl de cada um)...5,0 µl (25 pmoles) Água...33,5 µl Total...45,0 µl DNA... 5 µl Obs: O buffer usado na reação da PCR vem pronto para uso junto com a enzima.

47 47 FIGURA 2 - Etapas da reação em cadeia da polimerase: preparação do mix para a realização da reação. Fonte: Souza (2000) 62. No mix da PCR com os primers genéricos para o HPV (geral), foram acrescentados 10 µl do DNA extraído e no mix da nested PCR foi adicionado 1 µl do produto da PCR realizada com os primers genéricos; no mix da PCR com os primers alelo-específicos foram acrescentados 5 µl do DNA extraído, completando o volume final de 50 µl e, após a adição do DNA, as amostras foram levadas ao termociclador por duas horas e 40 minutos, onde foi acionado o Programa de Amplificação, composto de três etapas: a. Desnaturação: o DNA de dupla-fita é separado em fitas únicas mediante brusca elevação da temperatura para 95 C. b. Anelamento: ocorre entre a cadeia original do DNA (agora já desnaturado) e a seqüência de nucleotídeos dos primers, que se ligarão à região inicial gênica a ser amplificada.

48 48 c. Extensão: a extensão é desempenhada pela enzima Taq DNA polimerase, de modo que ambas as fitas de DNA são convertidas em quatro fitas. A PCR é concluída, geralmente, após 40 ciclos de reação. Cada reação de PCR possui um Programa de Amplificação específico, onde o tempo e as temperaturas são variáveis. Os Programas de Amplificação usados no NUPAD são os seguintes: PCR Primer geral, globina, tipos 16, 31 e 35 94ºC ºC ºC x 72ºC ºC ºC....16hs PCR Primer geral interno (nested) 94ºC ºC ºC x 72ºC ºC ºC....16hs

49 49 PCR Primer tipo 6 94ºC ºC ºC x 72ºC ºC ºC....16hs PCR Primer tipo 11 94ºC ºC ºC x 72ºC ºC ºC hs PCR Primer tipo 18 94ºC ºC ºC x 72ºC ºC ºC....16hs

50 50 PCR Primer tipo 33 94ºC ºC ºC x 72ºC ºC ºC....16hs FIGURA 3 - Amostras sendo colocadas no termociclador onde ocorrerão as etapas da PCR: desnaturação, anelamento e extensão. Fonte: Souza (2000) 62. Depois de amplificados no termociclador, os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 2% corado com brometo de etídio, a partir da comparação visual com os fragmentos de DNA constituintes de um padrão de peso molecular conhecido.

51 51 FIGURA 4 - Montagem de gel de agarose. A agarose fundida é despejada nessa cuba de montagem, onde é deixada até a polimerização. Na foto pode-se ver o pente utilizado para a formação dos poços. Após o término da polimerização, o pente é retirado e em seu lugar ficam espaços cujo volume pode variar de 10 a 150 µl, dependendo do volume de agarose e do sistema de montagem. Para o controle da extração do DNA utilizou-se um par de primers que amplifica o gene da β globina humano. Essa amplificação atesta a integridade das amostras de DNA extraídas, ou seja, existe DNA adequado para a reação de PCR. Para a pesquisa dos tipos de HPV presentes nas amostras (tipagem), foram utilizados dois procedimentos de PCR. Primeiramente, foi feito o mix de detecção para o diagnóstico qualitativo. Quando o resultado foi positivo, procedeu-se à tipagem. A reação de detecção foi realizada por meio de PCR com um par de primers genéricos, seguida da reação de nested PCR com um par de primers interno.

52 52 Após o anelamento desses iniciadores, um DNA polimerase termoestável utilizou as resultantes de 20 a 25 fitas duplas de base para conduzir 40 ciclos de PCR. Deste modo, foi possível realizar a tipagem a partir do DNA extraído, com iniciadores específicos para cada tipo de HPV. FIGURA 5 - Esquema ilustrativo das etapas da PCR.

53 53 As amostras de DNA sem qualidade suficiente foram excluídas e as amostras positivas foram tipadas para os tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33 e 35, sendo utilizado um par de primers específico para a tipagem de cada tipo de HPV. Para cada amostra foram realizadas sete reações (6, 11, 16, 18, 31, 33 e 35): uma para cada tipo a ser pesquisado. QUADRO 1 Interpretação dos resultados do procedimento da PCR Globina Geral Consensus Resultado Negativo Negativo Negativo Amostra sem qualidade Positivo Negativo Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo O HPV foi classificado de acordo com seu potencial oncogênico em baixo risco (6, 11) e alto risco (16, 18, 31, 33 e 35). Importante ressaltar que, para evitar a contaminação do DNA estranho, foram utilizadas salas independentes para cada uma das seguintes etapas: extração do DNA, preparação do mix, procedimentos da PCR e eletroforese. A interpretação dos resultados do procedimento da PCR foi descrita no QUADRO 1 e os iniciadores utilizados no NUPAD estão descritos no QUADRO 2.

54 54 QUADRO 2 Esquema de iniciadores utilizados pelo NUPAD Tipo Nº Seqüência de Nucleotídeo Região Fragmento (pb) HPV 6 Pl 5'-TAGGGGACGGTCCTCTATTC-3 LCR 259 HPV 6 P2 5'-GCAACAGCCTCTGAGTCACA-3 LCR HPV 11 Pl 5'-GAATACATGCGCCATGTGGA-3' L1 357 HPV 11 P2 5'-AGCAGACGTCCGTCCTCGAT-3' L1 HPV 16 Pl 5'-TCAAAGCCACTGTGTCCTG-3' E6 271 HPV 16 P2 5'-CGTGTTCTTGATGATCTGCAA-3' E6 HPV 18 Pl 5'-TGGTGTATAGAGACAGTATACCCCA-3' E6 247 HPV 18 P2 5'-GCCTCTATAGTGCCCAGGTATGT-3' E6 HPV 31 Pl 5'-TGAACCGAAAACGGTTGGTA-3' E6 613 HPV 31 P2 5'-CTCATCTGAGCTGTCGGGTA-3' E7 HPV 33 Pl 5'-AGTAGGGTGTAACCGAAAGC-3' E6 411 HPV 33 P2 5'-CTTGAGGACACAAAGGTCTT-3' E6 HPV 35 Pl 5'-GAATTACAGCGGAGTGAGGT-3' E6 290 HPV 35 P2 5'-CACCGTCCACCGATGTTATG-3' E6 Consensus Pl 5'-CGTAAACGTMCCCTATTTTTTT-3' L Consensus P2 5'-TACCCTAAATACTCTGTATTG-3' L1 Geral Pl 3'-CGTCCMARRGGAWACTGATC-5' L1 450 Geral P2 5'-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3' L1 β-globina Pl 5'-CTAGCAACCTCAAACAGACA-3' 204 β-globina P2 5'-TGCCTATCAGAAACCCAAAGA-3' Fonte: Mannis et al. (1989) 63, Arndt, Nottelmann e Neumann (1994) 64 e Duggan et al. (1994) 65. Atualmente, o primer consensus não está sendo utilizado no NUPAD, sendo substituído pelo primer geral interno. Seqüência do primer geral interno (usado na nested PCR): P1 TTT GTT ACT GTG GTA GAT AC P2 GAA AAA TAA ACT GTA AAT CA

55 Estudo histopatológico do colo uterino Foi realizado pelo serviço de biópsias do Departamento de Anatomia Patológica e Medicina Legal da Faculdade de Medicina da UFMG, com padronização do laudo. Nas cidades do interior, o exame foi feito pelo histopatologista local. O material foi fixado em formol a 10% e processado para estudo histológico, sendo realizados cortes dos blocos de parafina com 5 µm de espessura, os quais foram corados com hematoxilina-eosina. Com base na literatura, a análise e descrição histológica, neste estudo, seguiram a orientação de Wright et al. (1994) 66, baseada na classificação proposta por Richart (1973) 67 (ANEXOS C; D) A citometria de fluxo para a contagem de linfócitos T CD4 A contagem de linfócitos T CD4 foi realizada a partir da utilização de anticorpos monoclonais para uso comercial e da realização de citometria de fluxo (Becton Dickinson). O número absoluto dos linfócitos T CD4 foi calculado baseado na contagem total de linfócitos. Foram aceitas as dosagens de linfócitos T CD4 realizadas pelo Laboratório Central do Hospital das Clínicas da UFMG ou Laboratório Central da PBH, cujos laudos constam no prontuário médico, porque esses laboratórios fazem parte da rede de CD4 do Ministério da Saúde e usam o kit e equipamento do mesmo fabricante.

56 56 Foi considerado na análise o menor valor da contagem de linfócitos T CD4 mais próximo da data da coleta para PCR nos seis meses que antecederam até seis meses após a data da coleta para PCR. A descrição da técnica está no ANEXO E Método de quantificação da carga viral do HIV Foram aceitos os laudos existentes em prontuário médico das dosagens da carga viral pelos testes: NASBA QR System (Organon Teknika) A técnica NASBA permite a amplificação isotérmica do RNA do HIV-1 de filamento simples, utilizando três enzimas: a transcriptase reversa do vírus da mieloblastose aviária, uma RNAse H e a RNA polimerase do fago T7. Possibilita também a obtenção de 10 6 a 10 9 cópias em menos de uma hora. Seu limite de detecção passou de 400 para 80 cópias do RNA viral por ml de plasma, recebendo o kit o nome de NASBA nuclisens HIV-1 Qt. A variação interensaios do kit NASBA é comparável à da PCR Roche. Quantiplex HIV RNA 3.0, tecnologia bdna (branched chain deoxyribonucleic acid utiliza moléculas de DNA ramificadas) do fabricante Bayer com limite inferior de detecção de 50 cópias/ml e superior de, no máximo, cópias/ml.

57 57 Os dois testes foram realizados no Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular - DIP da Faculdade de Medicina da UFMG ou pela Fundação Ezequiel Dias (FUNED) Instituto Octávio Magalhães Divisão de Epidemiologia e Controle de Doenças Laboratório de Virologia. Ambos fazem parte da rede nacional de quantificação da carga viral do HIV do Ministério da Saúde com as devidas padronizações de equipamento e kit. Foi considerado na análise o valor da carga viral cujo laudo estivesse no prontuário da paciente, dosado pelo método NASBA, NASBA nuclisens ou bdna, independentemente da sensibilidade de detecção do método. Utilizou-se a dosagem mais alta e mais próxima da data da coleta para PCR, no intervalo entre um ano antes até seis meses após a data da coleta para PCR. A descrição das técnicas está no ANEXO F Coleta dos dados Foram estabelecidos alguns critérios para a coleta dos dados: presença ou ausência de HPV, dosagem da carga viral do HIV e contagem de linfócitos T CD Presença ou ausência de HPV Foi considerada portadora de HPV a paciente infectada pelo HIV que apresentou resultado da PCR positivo no material coletado da cérvice uterina.

58 58 As pacientes infectadas pelo HIV que tiveram resultado da PCR negativo foram consideradas não portadoras de HPV Cortes na dosagem da carga viral A partir de estudo realizado anteriormente em nosso serviço 47, foram criados dois cortes para o valor da carga viral: 400 cópias/ml; > 400 cópias/ml. A seguir, dois novos cortes foram feitos baseados na média da quantificação da carga viral do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais Cortes na contagem dos linfócitos T CD4 Baseado na classificação em AIDS e não-aids, pelo Centro para Controle de Doenças e Prevenção (CDC), de , foram criados dois cortes para cada categoria de linfócitos T CD4: < 200 células/mm 3 ; 200 células/mm 3.

59 59 Dois novos cortes foram feitos baseados na média da contagem de linfócitos T CD4+ das mulheres portadoras do HIV, das cinco cidades de Minas Gerais Método estatístico Os dados foram armazenados e analisados no programa de computador Epi-Info, versão 3.3.2, de fevereiro de Para sua análise, também foi utilizado o programa EXCEL 2003, como auxiliar na conferência dos resultados, nas categorizações e nas seleções de subconjuntos de dados. Em relação aos testes estatísticos, nas comparações nas quais a variável dependente fosse categórica (presença ou ausência do HPV) e as variáveis independentes também fossem categóricas, foi empregado o teste do qui-quadrado. Foi considerado o valor de 5% (p<0,05) como limiar de significância estatística Método bibliográfico Para a redação do texto e referência bibliográfica deste estudo, foi consultado o Manual para normalização de publicações técnico-científicas 68. A revisão bibliográfica foi obtida no Medline, Lilacs e livros textos.

60 60 5 RESULTADOS A análise dos dados das 288 pacientes portadoras do HIV atendidas no Ambulatório de Ginecologia do CTR-DIP Orestes Diniz da Prefeitura Municipal de Belo Horizonte, em convênio com a UFMG, e no sistema público de saúde de Betim, Barbacena, Conselheiro Lafaiete e Divinópolis permitiu a apresentação dos resultados a seguir. Das 288 pacientes estudadas, cada uma das cidades contribuiu com as seguintes amostras: TABELA 2 Número e percentual de pacientes avaliadas, com a respectiva cidade de origem Cidades Pacientes n (%) Belo Horizonte 152 (52,8) Betim 36 (12,5) Barbacena 20 (6,9) Divinópolis 44 (15,3) Cons. Lafaiete 36 (12,5) Total 288 (100)

61 Características da amostra Foram analisadas as características amostrais de cada cidade participante do estudo e as características de todas as 288 pacientes, pela análise das informações contidas em um banco de dados unificado. As variáveis estudadas nessa etapa da análise foram idade (em anos) ao entrar no estudo, idade de início de atividade sexual, número de parceiros, estado civil, tipo de trabalho, tabagismo, uso de preservativo, forma de contágio e uso de drogas injetáveis. A TAB. 3 mostra a distribuição das variáveis quantitativas (idade ao entrar no estudo, idade de início de atividade sexual, número de parceiros) em cada uma das cinco cidades e no total, analisadas a partir da mediana. TABELA 3 Distribuição da mediana das variáveis quantitativas nas cinco cidades de Minas Gerais * VARIÁVEIS BH BETIM BARBACENA DIVINÓPOLIS Idade (em anos) Idade (em anos) de início de atividade sexual Número de parceiros 35 (20-61) 17 (11-32) 3,0 (1-30) 37 (20-67) 17 (12-25) 3,0 (1-10) 40 (20-65) 17 (12-27) 2,5 (1-30) 34 (23-64) 17 (10-34) 3,0 (1-50) CONS. LAFAIETE n 37,5 (21-65) (10-24) 283 3,0 (1-200) 266 Todas as cidades 35 (20-67) 17 (10-34) 3,0 (1-200) * Os números mostrados entre parênteses referem-se aos valores mínimo e máximo encontrados.

62 62 Optou-se por adotar a mediana para construção da TAB. 3, tendo em vista que o desvio-padrão para as variáveis idade ao entrar no estudo e número de parceiros foi alto em algumas cidades, sugerindo que a média não era a melhor opção para apresentação desses dados. As tabelas com os valores da média, mediana e desvio-padrão podem ser conferidas no APÊNDICE C. A TAB. 4 mostra as características sociais e comportamentais das pacientes infectadas pelo HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais.

63 63 TABELA 4 Características sociais e comportamentais das pacientes infectadas pelo HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais Características sociais e comportamentais BH (n=152) BETIM (n=36) BARBACENA (n=20) DIVINÓPOLIS (n=44) C. LAFAIETE (n=36) TODAS AS CIDADES (n=288) n % n % n % n % n % n % Estado civil Solteiras 49 32, , ,3 7 19, ,5 Separadas 15 9,9 4 11, , ,2 Viúvas 20 13,2 6 16, ,1 5 13, ,2 Casadas+ união estável 68 44, , , , ,1 Tipo de trabalho Do lar 82 53,9 5 13, , ,7 Fora do lar 68 44, , ,7 Profissionais do sexo , ,5 1 2,8 6 2,1 Ignorado 2 1, , ,5 Tabagismo Sim 40 26, , , , ,3 Não 92 60, , , , ,6 Ex-tabagista 20 13,2 3 8, ,8 6 16, ,2 Uso de preservativo Sim 60 39, , , ,7 Não 84 55, , , ,5 Ignorado 8 5, ,8 Forma de contágio Sexual , , , , , Sangue ,8 0 0,0 1 2,3 0 0,0 2 0,7 Ignorado 12 7,9 4 11,1 1 5,0 4 9,1 0 0,0 21 7,3 Uso drogas injetáveis Sim ,6 0 0,0 0 0,0 0 0,0 2 0,7 Não , , , , ,9 Ex-usuária ,8 1 5,0 1 2,3 1 2,8 4 1,4 HIV = vírus da imunodeficiência humana.

64 64 Ao unificarem-se as informações coletadas de todas as cinco cidades participantes do estudo, obteve-se amostra de 288 portadoras do HIV, cuja mediana de idade foi 35 anos, com início de atividade sexual média aos 17,8 anos. A promiscuidade sexual não foi fator que se destacou nesse grupo, tendo em vista que 44,1% das mulheres eram casadas ou com união estável, com mediana de parceiros sexuais durante a vida igual a três. Da mesma forma, o tabagismo foi outra característica que também não se destacou entre essas mulheres, já que 56,6% referiram não ter esse hábito. O grupo de tabagistas e ex-tabagistas foi de 43,5%. A maioria das pacientes desempenhava suas atividades profissionais no lar (51,7%), e apenas 2,1% eram profissionais do sexo. A transmissão sexual foi a via predominante (92%) para aquisição do vírus da imunodeficiência humana entre as 288 pacientes. Contudo, o uso do preservativo ainda não é prática comum adotada pelos parceiros dessas mulheres, tendo em vista que 54,5% delas mantinham relações sexuais desprotegidas. Quanto ao uso de drogas injetáveis, identificaram-se apenas duas (0,7%) usuárias e quatro (1,4%) ex-usuárias entre as pacientes de todas as cinco cidades de Minas Gerais. Na amostra de Conselheiro Lafaiete, uma paciente relatou ter tido 200 parceiros. Por esse motivo, a média do número de parceiros se mostrou tão elevada (10,4) quando comparada às demais cidades. O desvio-padrão foi de 34,2. Entretanto, a mediana manteve-se semelhante àquela encontrada no restante da amostra das outras cidades (3,0).

65 65 Na caracterização da amostra de Barbacena, o número de mulheres solteiras (35%) ultrapassou o número das casadas ou com união estável (25%). O número mais alto de viúvas (30%) foi encontrado nessa cidade. Em Divinópolis, assim como em Betim, metade das mulheres (50%) trabalhava fora do lar, característica que não predominou nas outras cidades analisadas. Na TAB. 5 são apresentadas as características clínicas e laboratoriais das pacientes infectadas pelo HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais.

66 66 TABELA 5 Características clínicas e laboratoriais das pacientes infectadas pelo HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais Características clínicas e laboratoriais TODAS AS BH BETIM BARBACENA DIVINÓPOLIS C. LAFAIETE CIDADES (n=152) (n=36) (n=20) (n=44) (n=36) (n=288) n % n % n % n % n % n % Classificação CDC AIDS (A3+B3+C1+C2+C3) 74 48, , , , NÃO AIDS (A1+A2+B1+B2) 75 49, , , , ,2 Ignorado , ,8 Uso de anti-retrovirais Usa , , , , ,7 Não usa 51 33, , , ,6 Ignorado , ,7 Colposcopia Normal 99 65, , , , ,2 Alterada 50 32, , , , ,1 Ignorada , ,8 5 1,7 Linfócitos T CD4+ Média Mediana ,5 408 Desvio-Padrão Carga Viral do HIV Média Mediana Desvio-Padrão HIV = vírus da imunodeficiência humana

67 67 Metade das mulheres (50%) tinha diagnóstico de AIDS ao entrar no estudo e 67,7% já faziam uso de anti-retrovirais. O exame colposcópico realizado na primeira consulta estava alterado em 35,1% das pacientes. Nos resultados de exames laboratoriais, a média e a mediana de linfócitos CD4+ encontradas no presente estudo foram, respectivamente, 455 e 408 células/mm³; enquanto a média e a mediana da carga viral do HIV foram, respectivamente, e 1100 cópias/ml. Destaca-se o fato de que em Belo Horizonte e em Betim o número de mulheres ainda não diagnosticadas com AIDS pelo CDC superou as portadoras dessa doença, resultado não observado nas demais cidades. A contagem de linfócitos TCD4 teve sua média mais baixa em Barbacena (365 células/mm³) e mais alta em Belo Horizonte e Betim (479 células/mm³). Quanto à quantificação da carga viral, a média mais alta foi a de Conselheiro Lafaiete ( cópias/ml) e a mais baixa a de Divinópolis ( cópias/ml). 5.2 Prevalência do HPV A prevalência do HPV foi alta nas amostras de todas as cinco cidades de Minas Gerais (78,8%). O GRÁF. 1 apresenta a prevalência do HPV por cidades e geral.

68 68 % BH (n=152) Betim (n=36) Barbacena (n=20) Divinópolis (n=44) C.Lafaiete (n=36) Total (n=288) Negativo 23,0% 13,9% 25,0% 11,4% 30,6% 21,2% Positivo 77,0% 86,1% 75,0% 88,6% 69,4% 78,8% Teste para avaliar heterogeneidade: x² = 6,07 (4 graus de liberdade) p=0,1942 GRÁFICO 1 - Detecção do DNA-HPV pela PCR, nas cinco cidades mineiras. Visto que cada cidade não contribuiu com o mesmo número de casos para o estudo global, foi aplicado teste estatístico (qui-quadrado) para checar se a prevalência do HPV era homogênea entre os municípios. O resultado encontrado foi x² = 6,07 (com 4 graus de liberdade), com p=0,1942; ou seja, a diferença de prevalência entre as cidades não foi estatisticamente significativa (p> 0,05). A presença do HPV de alto risco (pacientes com pelo menos um tipo de HPV de alto risco) foi observada em 160 (70,5%) casos, do HPV de baixo risco em 162 (71,4%) e do HPV de alto e baixo risco concomitante em 125 (55,1%).

69 Genotipagem: freqüência e multiplicidade A genotipagem do HPV foi realizada nas 288 amostras coletadas das pacientes participantes do estudo, utilizando a PCR, conforme relatado no capítulo 4 deste estudo. Os genótipos mais prevalentes foram o HPV-6 (63,9%) e o HPV-16 (48,5%), conforme pode ser observado na TAB. 6. No total das cidades, a taxa de pacientes com HPV detectado, mas não genotipado, variou de 0% (Barbacena) a 11,1% (Belo Horizonte), exceto em Conselheiro Lafaiete, cuja taxa foi de 48%. A infecção por múltiplos genótipos do HPV esteve presente em 64,8% dos casos do total das cidades, com predomínio de dois tipos (23,8%) e três tipos (18,9%). Quando considerada cada cidade separadamente, os tipos HPV-31 e HPV-33 foram os mais prevalentes em Barbacena (60% e 53,3%, respectivamente) e em Conselheiro Lafaiete (24%). A multiplicidade do HPV só não predominou nesta última cidade (20%). A TAB. 6 exibe a distribuição de freqüência dos genótipos do HPV e sua multiplicidade em cada uma das cinco cidades de Minas Gerais e em todas as cidades unificadas.

70 70 TABELA 6 Freqüência e multiplicidade dos genótipos do HPV, pela PCR, nas pacientes infectadas pelo HIV, das cinco cidades de Minas Gerais Freqüência e multiplicidade do HPV BH (n=117) BETIM (n=31) BARBACENA (n=15) DIVINÓPOLIS (n=39) CONS. LAFAIETE (n=25) TODAS AS CIDADES (n=227) n % n % n % n % n % n % Não genotipados 13 11,1 3 9,7 0 0,0 2 5, , ,2 Genotipados , , , ,8 HPV , ,2 8 53, ,5 1 4, ,9 HPV , ,3 6 40, ,9 2 8, ,3 HPV , ,8 5 33, ,7 2 8, ,5 HPV ,0 2 6,5 1 6,7 2 5,1 1 4,0 13 5,7 HPV ,5 2 6,5 9 60,0 4 10,3 6 24, ,7 HPV ,4 6 19,4 8 53, ,2 6 24, ,7 HPV , ,4 6 40, ,6 3 12, ,2 Infecções simples 24 20,5 7 22,6 4 26,7 7 17,9 8 32, ,0 Infecções múltiplas 80 68, , , ,9 5 20, ,8 2 tipos 32 27,4 6 19,4 4 26,7 9 23,1 3 12, ,8 3 tipos 23 19,7 8 25,8 2 13,3 9 23,1 1 4, ,9 4 tipos 13 11,1 4 12,9 2 13,3 8 20,5 1 4, ,3 5 tipos 12 10,3 3 9,7 3 20,0 4 10,3 0 0,0 22 9,7 HPV = papilomavírus humano; PCR = reação em cadeia de polimerase; HIV = vírus da imunodeficiência humana.

71 Análises dos fatores de risco associados à prevalência do HPV Com o objetivo de testar possíveis associações que possam justificar a maior prevalência do HPV nas mulheres infectadas pelo HIV, foram construídas as tabelas a seguir e aplicados os testes estatísticos mais indicados para cada análise proposta Uso de preservativo A primeira associação pesquisada foi entre a infecção pelo HPV detectado pela PCR e o uso de preservativo, nas cinco cidades de Minas Gerais (TAB. 7). Embora o HPV tenha sido mais prevalente entre aquelas mulheres que adotavam o preservativo (54,1%), essa diferença não foi estatisticamente significativa (p>0,05).

72 72 TABELA 7 Associação entre a infecção pelo HPV detectado pela PCR e o uso de preservativo, nas cinco cidades de Minas Gerais DNA - HPV Uso de preservativo Positivo n (%) Negativo n (%) Total n (%) Não usa 83 (45,9) 23 (47,9) 106 (46,3) Usa 98 (54,1) 25 (52,1) 123 (53,7) Total 181 (100) 48 (100) 229 (100) p = 0,7991 x 2 = 0,06 OR= 0,92 IC 95%= 0,46-1,83 HPV = papilomavírus humano; PCR = reação em cadeia de polimerase; HIV = vírus da imunodeficiência humana; x 2 = teste do qui-quadrado; OR= odds ratio; IC 95%= intervalo de confiança 95% Número de parceiros sexuais A TAB. 8 registra a associação entre a infecção pelo HPV detectado pela PCR e o número de parceiros sexuais em portadoras do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais. Foi utilizado como corte a mediana do número de parceiros, visto que representa melhor que a média os presentes resultados, já que esta última é influenciada por valores extremos que alteram o perfil da amostra deste trabalho (ANEXO G).

73 73 TABELA 8 Associação entre a infecção pelo HPV detectado pela PCR e o número de parceiros sexuais de portadoras do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais DNA - HPV Número de parceiros Positivo Negativo Total sexuais n (%) n (%) n (%) (61,7) 36 (63,2) 165 (62,0) < 3 80 (38,3) 21 (36,8) 101 (38,0) Total 209 (100) 57 (100) 266 (100) p = 0,8431 x 2 = 0,04 OR= 0,94 IC 95%= 0,49-1,80 HPV = papilomavírus humano; PCR = reação em cadeia de polimerase; HIV = vírus da imunodeficiência humana; x 2 = teste do qui-quadrado; OR= odds ratio; IC 95%= intervalo de confiança 95%. De acordo com a TAB. 8, a prevalência do HPV é maior (61,7%) nas pacientes que tiveram três ou mais parceiros sexuais. Entretanto, esse achado não foi significativo, de acordo com a análise estatística realizada (p>0,05) Carga viral do HIV O passo seguinte foi buscar alguma associação entre a infecção pelo HPV, detectado pela PCR, e a quantificação da carga viral do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais. Percebeu-se que quanto maior a carga viral do HIV, maior foi a prevalência do HPV (GRÁF. 2), porém os resultados encontrados (TAB. 9) não foram estatisticamente significativos (p>0,05).

74 74 Prevalência do HPV 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% > HPV - HPV + Carga Viral GRÁFICO 2 - Prevalência do HPV de acordo com a quantificação da carga viral do HIV. TABELA 9 Associação entre a infecção pelo HPV detectado pela PCR e a quantificação da carga viral do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais Carga Viral DNA HPV Positivo Negativo Total n(%) n(%) n(%) > (81,5) 28 (18,5) 151 (100) (75,6) 29 (24,4) 119 (100) p = 0,2441 x 2 = 1,36 OR= 1,42 IC 95%= 0,76 2,65 HPV = papilomavírus humano; PCR = reação em cadeia de polimerase; HIV = vírus da imunodeficiência humana; x 2 = teste do qui-quadrado; OR= odds ratio; IC 95%= intervalo de confiança 95%.

75 75 Optou-se por utilizar a média da carga viral encontrada e testar se esse novo corte conduzia a alguma associação estatisticamente significativa (TAB. 10), porém também não foi possível tal afirmação (p>0,05). TABELA 10 Associação entre a infecção pelo HPV detectado pela PCR e a média da quantificação da carga viral do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais DNA HPV Carga Positivo Negativo Total Viral n(%) n(%) n(%) > (86) 6 (14) 43 (100) (77,5) 51 (22,5) 227 (100) p = 0,2097 x 2 = 1,57 OR= 1,79 IC 95%= 0,67 5,01 HPV = papilomavírus humano; PCR = reação em cadeia de polimerase; HIV = vírus da imunodeficiência humana; x 2 = teste do qui-quadrado; OR= odds ratio; IC 95%= intervalo de confiança 95% Linfócitos T CD4+ Buscou-se encontrar alguma associação entre a infecção pelo HPV detectado pela PCR e a contagem de linfócitos T CD4+ em mulheres portadoras do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais. Nas pacientes com baixa imunidade, ou seja, com linfócitos T CD4+ < 200 células/mm³, o HPV tendeu a ser mais prevalente (GRÁF. 3), mas os resultados encontrados não foram significativos (p>0,05) para permitir essa conclusão (TAB. 11).

76 76 Prevalência do HPV 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% < HPV - HPV + CD4 GRÁFICO 3 - Prevalência do HPV de acordo com a contagem de linfócitos T CD4+. TABELA 11 Associação entre a infecção pelo HPV detectado pela PCR e a contagem de linfócitos T CD4+ em mulheres portadoras do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais CD4 DNA HPV Positivo Negativo Total n(%) n(%) n(%) < (82,2) 8 (17,8) 45 (100) (78,3) 49 (21,7) 226 (100) p = 0,5574 x 2 = 0,34 OR=1,28 IC95%= 0,53 3,20 HPV = papilomavírus humano; PCR = reação em cadeia de polimerase; HIV = vírus da imunodeficiência humana; x 2 = teste do qui-quadrado; OR= odds ratio; IC 95%= intervalo de confiança 95%.

77 77 Na TAB. 12, foi empregado o mesmo raciocínio de corte da carga viral e fez-se novo corte para a contagem de linfócitos T CD4+ utilizando a média encontrada na amostra (455 cél/mm³). Verificou-se que a prevalência do HPV é maior em mulheres com linfócitos T CD4+ menor que a média do grupo (79,1%), mas a diferença também não foi significativa (p>0,05). TABELA 12 Associação entre a infecção pelo HPV detectado pela PCR e a média da contagem de linfócitos T CD4+ em mulheres portadoras do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais DNA HPV CD4 Positivo Negativo Total n(%) n(%) n(%) < (79,1) 31 (20,9) 148 (100) (78,9) 26 (21,1) 123 (100) p = 0,9692 x 2 = 0,00 OR=1,01 IC95%= 0,54 1,89 HPV = papilomavírus humano; PCR = reação em cadeia de polimerase; HIV = vírus da imunodeficiência humana; x 2 = teste do qui-quadrado; OR= odds ratio; IC 95%= intervalo de confiança 95%. 5.5 Análise dos fatores de risco associados à multiplicidade do HPV A etapa seguinte consistiu em testar se havia alguma associação que pudesse justificar a multiplicidade do HPV nas mulheres infectadas pelo HIV. Optou-se por analisar esse aspecto (multiplicidade) a partir da variável número

78 78 de tipos de HPV detectados, utilizando-se a média (três) para fazer o corte entre os grupos de interesse, excluindo-se da análise as pacientes HPV negativo. O teste estatístico aplicado nas tabelas que se seguem foi o quiquadrado. Foram pesquisadas possíveis associações entre multiplicidade do HPV e uso do preservativo (TAB. 13), número de parceiros sexuais (TAB. 14), carga viral do HIV (TAB. 15; 16) e contagem de linfócitos TCD4+ (TAB. 17; 18) Uso de preservativo Mais da metade das pacientes (51,2%) que apresentaram mais de três tipos de HPV não usava preservativo, enquanto a maior parte (53,4%) das que tinham número menor ou igual a três tipos usava barreira de proteção (TAB. 13). Porém, o p não foi significativo (p>0,05).

79 79 TABELA 13 Associação entre multiplicidade do HPV e uso do preservativo pelas portadoras do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais DNA - HPV Preservativo > 3 tipos 3 tipos Total n (%) n (%) n (%) Não usa 21 (51,2) 54 (46,6) 75 (47,8) Usa 20 (48,8) 62 (53,4) 82 (52,2) Total 41 (100) 116 (100) 157 (100) p = 0,6070 x 2 = 0,26 OR= 0,83 IC 95%= 0,38-1,80 = teste do qui- HPV = papilomavírus humano; HIV = vírus da imunodeficiência humana; x 2 quadrado; OR= odds ratio; IC 95%= intervalo de confiança 95% Número de parceiros sexuais Esse fator de risco foi analisado utilizando-se a mediana do número de parceiros sexuais para fazer o corte entre os grupos de interesse, excluindo-se da análise as pacientes que desconheciam esse dado.

80 80 TABELA 14 Associação entre multiplicidade do HPV e número de parceiros sexuais de mulheres portadoras do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais N Parceiros DNA - HPV > 3 tipos 3 tipos Total n (%) n (%) n (%) 3 30 (26,1) 85 (73,9) 115 (100) < 3 16 (24,2) 50 (75,8) 66 (100) Total 46 (25,4) 135 (74,6) 181 (100) p = 0,7838 x 2 = 0,08 OR= 0,91 IC 95%= 0,42-1,93 HPV = papilomavírus humano; HIV = vírus da imunodeficiência humana; x 2 quadrado; OR= odds ratio; IC 95%= intervalo de confiança 95%. = teste do qui- De acordo com a TAB. 14, verifica-se que houve predomínio (73,9% e 75,8%) de pacientes com número menor ou igual a três tipos de HPV nos dois grupos estudados ( 3 e <3 parceiros, respectivamente). Esse resultado não foi estatisticamente significativo (p>0,05) Carga viral do HIV Embora tenha sido percebida uma tendência do grupo de pacientes com menos multiplicidade do HPV (número de tipos três) a estar associado à carga viral mais baixa ( 400 cópias/ml), não foi encontrada significância estatística (p>0,05) para permitir essa afirmação (TAB. 15).

81 81 TABELA 15 Associação entre a multiplicidade do HPV e a quantificação da carga viral do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais Carga Viral DNA - HPV > 3 tipos 3 tipos Total n (%) n (%) n (%) > (27,9) 75 (72,1) 104 (100) (21,0) 64 (79,0) 81 (100) Total 46 (24,9) 139 (75,1) 185 (100) p = 0,2816 x 2 = 1,16 OR= 0,69 IC 95%= 0,33-1,44 = teste do qui- HPV = papilomavírus humano; HIV = vírus da imunodeficiência humana; x 2 quadrado; OR= odds ratio; IC 95%= intervalo de confiança 95%. No entanto, ao fazer o corte da carga viral baseado na média da carga viral encontrada neste estudo (TAB. 16), destaca-se que pacientes com carga viral mais alta (> cópias/ml) tiveram maior prevalência de mais de três tipos de HPV quando comparadas com o grupo de carga viral mais baixa ( cópias/ml), ou seja, 41,4% x 21,8%, respectivamente. Essa diferença foi significativa (p<0,05).

82 82 TABELA 16 Associação entre a multiplicidade do HPV e a média da quantificação da carga viral do HIV, nas cinco cidades de Minas Gerais Carga Viral DNA - HPV > 3 tipos 3 tipos Total n (%) n (%) n (%) > (41,4) 17 (58,6) 29 (100) (21,8) 122 (78,2) 156 (100) Total 46 (24,9) 139 (75,1) 185 (100) p = 0,0250 x 2 = 5,02 OR= 0,39 IC 95%= 0,16-0,98 = teste do qui- HPV = papilomavírus humano; HIV = vírus da imunodeficiência humana; x 2 quadrado; OR= odds ratio; IC 95%= intervalo de confiança 95%. O GRÁF. 4, com os resultados apresentados na TAB. 16, permite a visualização de que no grupo de pacientes com número de tipos de HPV menor ou igual a três predominou a menor carga viral ( cópias/ml), enquanto no grupo com mais de três tipos de HPV predominou a carga viral mais alta (> cópias/ml).

83 83 80% 60% 40% 20% > % 3 tipos > 3 tipos Número de tipos do HPV GRÁFICO 4 - Associação entre a multiplicidade do HPV e a média da quantificação da carga viral do HIV Linfócitos T CD4+ Foram feitos dois cortes na contagem de linfócitos T CD4+ : o primeiro em 200 células/mm³ (TAB. 17); e o segundo baseado na média da contagem de linfócitos T CD4+ da presente amostra, que é de 455 células/mm³ (TAB. 18). Nas TAB. 17 e 18, o número de tipos de HPV menor ou igual a três foi característica marcante nos grupos estudados.

84 84 TABELA 17 Associação entre a multiplicidade do HPV e a contagem de linfócitos T CD4+, nas cinco cidades de Minas Gerais CD4 DNA - HPV > 3 tipos 3 tipos Total n (%) n (%) n (%) < (27,3) 24 (72,7) 33 (100) (24,5) 114 (75,5) 151 (100) Total 46 (25,0) 138 (75,0) 184 (100) p = 0,7393 x 2 = 0,11 OR= 0,87 IC 95%= 0,34-2,22 = teste do qui- HPV = papilomavírus humano; HIV = vírus da imunodeficiência humana; x 2 quadrado; OR= odds ratio; IC 95%= intervalo de confiança 95%. O corte na contagem de linfócitos TCD4+ empregado na TAB. 18 baseou-se na média encontrada no presente estudo (455cél/mm³).

85 85 TABELA 18 Associação entre a multiplicidade do HPV e a média da contagem de linfócitos T CD4+, nas cinco cidades de Minas Gerais DNA HPV CD4 > 3 tipos 3 tipos Total n (%) n (%) n (%) < (29,3) 70 (70,7) 99 (100) (20,0) 68 (80,0) 85 (100) Total 46 (25,0) 138 (75,0) 184 (100) p = 0,1467 x 2 = 2,11 OR= 0,60 IC 95%= 0,29-1,26 = teste do qui- HPV = papilomavírus humano; HIV = vírus da imunodeficiência humana; x 2 quadrado. Houve tendência do grupo de pacientes com menor imunidade (CD4+ <200 células/mm³ e CD4+ <455 células/mm³) a apresentar porcentagem mais alta de número de tipos de HPV maior que três (27,3% e 29,3% x 24,5% e 20%, respectivamente), quando comparado com o grupo de pacientes com mais imunidade (CD células/mm³ e CD células/mm³). Contudo, esta amostra não permite confirmar essa tendência, visto que o valor de p encontrado não foi significativo (p>0,05).

86 86 6 DISCUSSÃO Este é o primeiro estudo multicêntrico realizado no estado de Minas Gerais sobre a prevalência do HPV e sua multiplicidade em mulheres portadoras do HIV. Com uma amostra de 288 pacientes infectadas pelo HIV provenientes de cinco cidades mineiras (Belo Horizonte, Betim, Barbacena, Divinópolis e Conselheiro Lafaiete), encontrou-se alta prevalência (78,8%) do HPV, o que foi confirmado por outros autores 30,32,39, Características da amostra Em relação à idade das pacientes, o presente resultado (35 anos) foi similar ao encontrado em estudo realizado em São Paulo 34. O que se percebe é que, no Brasil, as infecções pelo HPV e HIV são mais comuns em mulheres em idade reprodutiva. Embora a mediana da idade de início da vida sexual tenha sido 17 anos, destaca-se o fato de algumas dessas mulheres terem iniciado sua atividade sexual aos 10 anos de idade. Isso demonstra quão precoce pode ser a exposição às doenças sexualmente transmissíveis, entre elas, o HPV e o HIV. Nas características sociais e comportamentais, Barbacena foi o município que se destacou por apresentar altos números (30%) de viúvas quando comparada com as demais cidades (9,1% a 16,7%). Além disso, verificou-se ali a

87 87 mais alta taxa de coito desprotegido (65% não usam preservativo), o mais alto número de tabagistas (50%), a mais alta taxa de ex-usuárias de drogas injetáveis (5%), a mais alta porcentagem de casos de AIDS (65%) e a mais baixa média de linfócitos T CD4+ (365 células/mm³). A transmissão sexual foi a via predominante (92%) para a aquisição do vírus da imunodeficiência humana, tendo em vista que o uso do preservativo ainda não é prática comum: apenas 42,7% delas o utilizam durante suas relações sexuais. Taxa semelhante foi encontrada 12, ou seja, 40% das 75 pacientes infectadas pelo HIV usavam preservativo e 44% das 75 integrantes do grupocontrole, HIV negativo, não usavam. A taxa de transmissão heterossexual do HIV neste estudo foi de 52%. Dados da literatura 54 revelam 334 adolescentes (13-18 anos) de 13 cidades americanas com taxa de 34,8% de coito desprotegido entre as HIV positivo (n=222) e 51,9% entre as HIV negativo (n=112). Ao analisar as características clínicas e laboratoriais, observou-se que metade das mulheres tinha diagnóstico de AIDS, pelo CDC, ao entrarem no estudo e mais da metade (67,7%) já fazia uso de anti-retrovirais. Esse achado demonstra o estado imunitário comprometido das pacientes em geral. Destaca-se o fato de que em Belo Horizonte e em Betim o número de mulheres ainda não diagnosticadas com AIDS, pelo CDC, superou as portadoras dessa síndrome. Nessas duas últimas cidades foram encontradas as médias mais altas de linfócitos TCD4+ deste estudo multicêntrico (479 células/mm³), conforme a TAB. 19.

88 88 TABELA 19 Contagem de linfócitos T CD4+ das pacientes infectadas pelo HIV, nas cinco Linfócitos T CD4+ BH n=152 BETIM n=36 cidades de Minas Gerais BARBACENA n=20 DIVINÓPOLIS n=44 CONS. LAFAIETE n=36 TODAS n=288 Média A média geral encontrada de linfócitos T CD4+ foi de 455 células/mm³. Essas médias não refletem a história imunológica das pacientes; o fato de mais da metade das pacientes terem diagnóstico de AIDS e um número mais alto (67,7%) usar terapia anti-retroviral significa que elas já apresentaram contagem de linfócitos TCD4+ muito mais baixo que o atual. O presente estudo não avaliou o CD4 mais baixo dessas pacientes, o que já está sendo feito em outra pesquisa que teve início posteriormente a esta, em nosso serviço. 6.2 Prevalência do HPV O teste molecular da PCR é, atualmente, padrão ouro para a detecção do DNA-HPV. Consiste na técnica mundialmente mais utilizada para detectar os diversos genótipos do HPV. Estudo de metanálise 53 abrangendo os continentes da América do Norte, África, Ásia, Europa e Américas do Sul e Central avaliou a prevalência dos tipos de HPV em grande número de mulheres infectadas pelo HIV (5578

89 89 pacientes). Pertenciam às Américas do Sul e Central (Brasil e México) 435 pacientes (7,8%), tendo sido o estudo brasileiro realizado na Universidade de São Paulo (USP), em Ribeirão Preto (SP) 33. Essa pesquisa demonstrou que a proporção de pacientes HIV positivo com HPV-16 aumentou com o aumento da gravidade das lesões cervicais. Entretanto, a prevalência do HPV-16 foi baixa nessas mulheres. Ao contrário, estudos realizados no Brasil 35,36 e na Índia 38 encontraram o HPV-16 como sendo o mais prevalente entre as mulheres infectadas pelo HIV. Os presentes resultados confirmam esses achados, apontando como genótipos mais prevalentes o HPV-6 (63,9%) e o HPV-16 (48,5%) nesse grupo de mulheres. Mais pesquisas foram desenvolvidas visando a investigar a prevalência do HPV entre mulheres portadoras do HIV 30,39. Outros autores buscaram estabelecer a prevalência do HPV não só nas mulheres infectadas pelo HIV, como também nas mulheres HIV negativo 32,35. As diferentes taxas de prevalência dos genótipos do HPV em mulheres infectadas pelo HIV de alguns desses trabalhos podem ser observadas na TAB. 20.

90 90 TABELA 20 Prevalência do HPV e seus genótipos em pacientes portadoras do HIV Este Zimmermmann Levi et al. Campos et Luque et HPV (2002) 30 (2004) 35 al. (2005) 32 al. (2006) 39 estudo (2007) HPV % 87% 73,2% 52% 78,8% HPV % 26,8% 48% 21,2% 6 47,1% 16,1% 3,3% 2,6% 63, ,5% 15,7% 13,3% 1,7% 31, % 30,9% 10% 12,0% 48,5 18 4,6% 15,2% 3,3% 5,2% 5,7 31 4,6% 7,1% - 7,0% 13, ,8% 2,2% 3,3% 9,2% 24,7 35 8,0% 5,8% 6,6% 0% 39,2 TOTAL Embora alguns pesquisadores 32,35 incluam pacientes HIV positivo e HIV negativo, os dados apresentados na TAB. 20 referem-se apenas às portadoras do HIV. Gonçalves et al. (1999) 36 encontraram cerca de 20% de casos de HPV não genotipado. A taxa global do presente estudo, de pacientes com HPV detectado, mas não genotipado, foi de 13,2%. Entretanto, taxa bem mais alta foi observada em Conselheiro Lafaiete (48%). Este dado reforça a diferença na prevalência dos genótipos do HPV de acordo com a localização geográfica em que cada estudo é realizado. A não genotipagem indica a presença do HPV sem, contudo, ter sido possível identificar o genótipo. Isto ocorreu porque não se pesquisaram todos os genótipos conhecidos do HPV. Outros autores usaram

91 91 maior número de primers, permitindo, assim, que mais tipos de HPV fossem detectados. Testaram-se e tipos de HPV. Atualmente, está sendo realizado em nosso serviço o seqüenciamento do vírus do HPV, o que está permitindo ampliar o diagnóstico. O seqüenciamento amplia as possibilidades de tipagem do vírus, pois possibilita a detecção de quase todos os tipos. Apresenta como fator limitante o fato de que se a amostra analisada tiver múltiplos tipos de HPV, as seqüências se apresentam de forma superposta, dificultando a avaliação, o que pode subestimar a prevalência das infecções múltiplas 70. Entretanto, é importante destacar que, no presente estudo, foi utilizada a PCR tradicional (ou seja, com o primer geral específico para cada tipo de HPV), o que permitiu a avaliação da multiplicidade. O seqüenciamento foi adicionado recentemente e a PCR, com os primers originais, continua sendo realizada, mesmo com o seqüenciamento. Alguns autores 37,71 observaram que a prevalência do HPV entre portadoras do HIV aumenta com a queda do estado imunológico. Estudo de coorte (n=2058 pacientes HIV-positivo) 71 demonstrou essa relação entre prevalência do HPV e imunidade ao relatar que cada tipo de HPV analisado esteve positivamente associado à baixa contagem de linfócitos TCD4+, exceto o HPV-16, que foi o tipo mais comum entre as pacientes com melhor imunidade em todas as visitas. Os resultados desta casuística não permitem estabelecer qualquer associação estatisticamente significativa entre a prevalência do HPV e alguns fatores de risco, como coito desprotegido, número de parceiros sexuais, carga viral do HIV e contagem de linfócitos T CD4+. É importante lembrar que este estudo é transversal e não permite avaliar o estado imunológico e a carga viral

92 92 dessas pacientes no decorrer do tempo. O seguimento de mulheres HIV positivo com PCR para o HPV da cérvice uterina, em conjunto com a avaliação da contagem de linfócitos T CD4+ e carga viral, poderia permitir melhor avaliação da associação entre a infecção pelo HPV e a imunossupressão nessas pacientes. 6.3 Multiplicidade do HPV Um dos grandes achados em mulheres infectadas pelo HIV é a alta proporção de múltiplos tipos de HPV 22,35,39,53. A infecção por múltiplos genótipos do HPV esteve presente, neste estudo, em 64,8% dos casos, com predomínio de dois tipos (23,8%) e três tipos (18,9%). Embora a multiplicidade do HPV não tenha sido característica marcante observada na cidade de Conselheiro Lafaiete (20%), este resultado pode ser atribuído ao fato da alta taxa de HPV não genotipado naquele município (48%), o que pode ter sido fator limitante para estabelecer a existência de múltiplos tipos de HPV em uma mesma paciente. Os genótipos do HPV mais prevalentes, em Conselheiro Lafaiete, provavelmente não são os dos primers disponíveis para testagem em nosso serviço. Em estudo desenvolvido em São Paulo, Brasil 36, descreveram-se os tipos 16 e 18 como sendo os mais prevalentes, as infecções múltiplas foram constatadas em 45% das portadoras do HIV e a taxa de HPV não genotipado foi próxima (20%) da encontrada no presente estudo (13,2%).

93 93 Visto que a multiplicidade do HPV é comum entre as pacientes infectadas pelo HIV em diversas pesquisas, a TAB. 21 mostra as diferentes taxas de multiplicidade do HPV de alguns autores: MULTIPLI- CIDADE Infecções múltiplas (2 ou mais tipos) TABELA 21 Multiplicidade do HPV em pacientes portadoras do HIV Palefsky et al. (1999) 25 (n=1778) 2 tipos 15% 3 tipos 4 tipos 5 tipos Gonçalves et al. (1999) 36 (n=141) Levi et al. (2004) 35 (n=255) Campos et al.(2005) 32 (n=41) Luque et al. (2006) 39 (n=229) Este estudo (2007) (n=288) 36% 45% 45% 50% 52% 64,8% Não disponível Não disponível Não disponível Não disponível Não disponível Não disponível Não disponível 18% 16% 14% 15% Não disponível Não disponível Não disponível Não disponível Não disponível Não disponível Não disponível Não disponível 23,8% 18,9% 12,3% 9,7% Foram consideradas infecções múltiplas aquelas com mais de um tipo de HPV. As diferenças entre as taxas apresentadas na TAB. 21 podem ser explicadas por diferentes tipos de métodos de genotipagem empregados. Apenas os trabalhos de Levi et al. (2004) 35 e o presente avaliaram as taxas de prevalência de 2, 3, 4 e 5 tipos ou mais de HPV entre os os autores citados. Palefsky et al. (1999) 25 analisaram a multiplicidade do HPV agrupando em dois tipos (15%), três a cinco tipos (15%), seis a 10 tipos (5%) e >10 tipos (<1%). Mostrou-se mais prevalência de múltiplos tipos de HPV em adolescentes portadoras do HIV (n=222), quando comparadas com as HIV

94 94 negativo (n=112) 54. A infecção múltipla por tipos de HPV de alto risco foi freqüente, com 40,7% das adolescentes HIV positivo apresentando mais de um tipo de HPV de alto risco comparado com taxa de 22% entre as adolescentes HIV negativo (p=0,0026). Entre os múltiplos genótipos, a freqüência geral de pacientes que apresentaram pelo menos um tipo de HPV de alto risco foi de 70,5% (160 casos), de HPV de baixo risco foi de 71,4% (162 casos) e de HPV de alto e baixo risco concomitante foi de 55,1% (125 casos). Os achados desta pesquisa diferem de outros 51 que estudaram amostras cervicais de pacientes pela técnica de PCR, detectando o HPV em 705 amostras (20%). A infecção múltipla com pelo menos um tipo de HPV de alto risco foi encontrada em 23,3% (164/705) dos casos, de HPV de baixo risco em 0,8% (6/705) e do HPV de alto e baixo risco concomitante em 19,3% (136/705). Essa diferença em relação aos resultados aqui encontrados pode ser atribuída à não realização de sorologia para o HIV no estudo de Cuschieri et al. 51, o que poderia justificar a baixa prevalência do HPV e sua multiplicidade em relação a este estudo. Alguns autores 72,73 descrevem que a presença de múltiplos tipos de HPV em pacientes infectadas pelo HIV é explicada pelo reaparecimento dos tipos de HPV que estavam latentes mais a aquisição de novos tipos. Uma teoria alternativa é a de que as infecções por múltiplos tipos de HPV possam ter algum benefício para a sobrevivência do HPV 22. Isto ocorreria porque se a perda do controle imunológico permite a replicação de múltiplos vírus, então é esperado que a persistência do vírus também ocorra em níveis detectáveis. A pergunta por que pacientes portadoras do HIV são infectadas por múltiplos tipos de HPV merece investigação futura. Tenta-se 35 explicar essa

95 95 associação pela possibilidade de mais exposição dessas mulheres a relações sexuais desprotegidas e à falha do sistema imunológico, de forma a permitir a replicação de mais tipos de HPV (perda da imunidade tipo-específica para HPV). Publicação sobre imunossupressão e co-infecção 22 defende a idéia de que múltiplos tipos de HPV em pacientes mais imunossuprimidas é consistente com mais exposição sexual ou perda do controle imunológico. Isso levaria à replicação viral suficiente para permitir a detecção dos genótipos do HPV por testes de PCR. Entretanto, essas são hipóteses ainda não foram comprovadas. A resposta imunológica é muito complexa e não deve ser avaliada apenas pela contagem de linfócitos T CD4+. As células de Langerhans, que representam o mecanismo imunológico cervical local, exercem papel fundamental como células apresentadoras de antígenos estranhos aos linfócitos T-CD4+. O estudo desenvolvido por Zimmermmann et al. (2006) 74 não mostrou associação entre a contagem de linfócitos T CD4+ e a gravidade da lesão intra-epitelial do colo uterino, diagnosticada pelo exame histopatológico. Deste modo, foi sugerido que a progressão da infecção pelo vírus do HPV pode estar associada às alterações das células de Langerhans. Acredita-se que se a baixa imunidade pode favorecer a multiplicação de tipos de HPV que estavam latentes e acelerar a replicação dos que foram recentemente adquiridos, a multiplicidade observada nas pacientes portadoras do HIV pode ser explicada como conseqüência desse processo. Além disso, o desaparecimento da infecção previsto como parte da história natural do HPV pode ser dificultado pela queda da imunidade do hospedeiro, o que favorece a existência da infecção múltipla.

96 96 A constatação de múltiplos tipos de HPV em alta porcentagem sugere que muitas pacientes adquirem tipos adicionais de HPV no momento da infecção pelos tipos mais prevalentes, como o HPV-16 e HPV-18. Tipos de HPV adicionais de alto e baixo risco podem ficar retidos em quantidade pequena em pacientes saudáveis, mas podem começar a replicar nas imunodeprimidas 52. Não houve correlação significativa entre o número de múltiplos genótipos do HPV e a contagem de linfócitos TCD4+ ou a presença de lesões cervicais, de acordo com resultados publicados 35. Ao estudar uma amostra de 255 mulheres infectadas pelo HIV, esses autores encontraram prevalência do HPV igual a 87%, com 45% de infecção múltipla com mais de dois tipos de HPV. Esses resultados são diferentes de outros 25, que verificaram número mais alto de pacientes HPV DNA positivo e freqüência também mais alta de múltiplos genótipos do HPV entre pacientes com linfócitos TCD4+ < 200 células/mm³. Esse estudo envolveu mulheres infectadas pelo HIV e 568 mulheres HIV negativo, com fatores de risco de infecção pelo HIV (hemotransfusão, drogas injetáveis, relação sexual com parceiro HIV positivo). Em relação à multiplicidade do HPV e à queda da imunidade, nota-se uma tendência, na presente investigação, do grupo de pacientes com menor imunidade (CD4+ < 200 células/mm³) a apresentar porcentagem mais alta de número de tipos de HPV maior que três, quando comparado com o grupo de pacientes com mais imunidade (CD células/mm³). Contudo, os resultados não permitiram confirmar essa tendência, visto que não houve significância estatística (p>0,05). Acredita-se que o tamanho amostral seja o fator limitante para explicar por que este trabalho encontrou resultados diferentes de outros autores 22.

97 97 Uma avaliação de 275 pacientes portadoras do HIV encontrou prevalência do HPV em 48,7% delas 37. Nesse grupo, as infecções pelo HPV de baixo risco, de alto risco e a infecção múltipla estiveram associadas à contagem de linfócitos TCD4+ <200 células/mm³ (p<0,05). Diferentemente dos presentes achados, nenhuma associação foi estabelecida quanto à quantificação da carga viral. Esta pesquisa não confirma a hipótese de que a multiplicidade do HPV está relacionada com o grau de imunidade do hospedeiro, visto que não se observou associação significativa entre a contagem de linfócitos TCD4+ e o número de genótipos do HPV. Entretanto, a multiplicidade do HPV esteve associada a níveis mais altos de carga viral do HIV. A diferença dos resultados entre os últimos estudos citados e este se deve ao número reduzido de primers disponíveis para testagem dos tipos de HPV em nosso serviço e ao tamanho de nossa amostra. O cálculo amostral foi baseado na prevalência e não na multiplicidade do HPV. Para testar associações seria necessário ampliar esta amostra. Sintetizando os estudos mencionados, percebe-se que as mulheres portadoras do HIV têm mais prevalência na cérvice uterina do DNA-HPV, de HPV com alto risco oncogênico e infecção múltipla pelo HPV, sendo que essas variáveis não estão, necessariamente, associadas a todos os fatores de progressão da doença. Comparando os resultados com os de outros autores 22,35,37,53,54, verificou-se que a infecção múltipla foi característica marcante nas pacientes portadoras do HIV.

98 98 Estudos prospectivos são necessários para determinar a influência que as infecções por múltiplos tipos de HPV exercem na história natural das lesões do colo uterino, especialmente em pacientes infectadas pelo HIV. Visto que muitas mulheres apresentam infecção pelo HPV que desaparece espontaneamente, a multiplicidade do HPV poderia explicar parcialmente a persistência das lesões cervicais. A contagem de linfócitos TCD4+ e a quantificação da carga viral são marcadores de progressão da AIDS que merecem continuar sendo estudados para determinar-se até que ponto podem influenciar na história natural das lesões cervicais induzidas pelo HPV. Será que a genotipagem é mesmo necessária em larga escala, como tem sido sugerido por alguns autores 13,70? E a vacina lançada recentemente para prevenir a infecção pelo HPV e o câncer cérvico-uterino 75,76,77? Determinar a prevalência dos genótipos do HPV e sua multiplicidade em cada população constitui etapa preliminar e fundamental para se proporem estratégias de prevenção e monitoramento mais adequadas à realidade da nossa população e dos serviços de saúde? Pode ser que, em curto ou longo prazo, a introdução da vacina em larga escala confirme a importância desse tipo de estudo para avaliar o impacto desse procedimento em diferentes grupos populacionais. Mas, por enquanto, são hipóteses a serem testadas e avaliadas em grupos populacionais menores ou nos países ricos, tendo em vista o alto custo da genotipagem e da vacinação em larga escala. Pelo que se percebeu, a genotipagem é essencial para a determinação dos tipos de HPV mais prevalentes. Como contribuição individual, a genotipagem permite a classificação das pacientes com HPV em grupos de alto e baixo risco para o desenvolvimento de câncer cervical; como contribuição coletiva, permite o

99 99 planejamento para introdução de estratégias de prevenção voltados para os tipos de HPV mais freqüentes em cada população. Sugerimos que a genotipagem seja proposta para mulheres portadoras do HIV, seja como forma de estabelecer o prognóstico das lesões cervicais nessas mulheres, seja como forma de detecção de novos tipos virais do HPV. Este estudo confirma a alta prevalência do HPV e sua multiplicidade na cérvice uterina de mulheres infectadas pelo HIV. Além disso, contribui para demonstrar a importância do estudo de cada população para planejamento adequado de programas de prevenção e sugere a necessidade de que estudos futuros sejam desenvolvidos para esclarecer o papel do HIV na maior prevalência e multiplicidade do HPV.

100 100 7 CONCLUSÕES A prevalência de HPV em mulheres infectadas pelo HIV é muito alta. Os genótipos mais prevalentes foram o HPV-6 e o HPV-16. Em Barbacena e em Conselheiro Lafaiete predominaram os genótipos HPV-31 e HPV-33. A infecção por múltiplos genótipos foi o padrão predominante de infecção pelo HPV, com predomínio de dois e três tipos. Não houve associação significante entre a prevalência do HPV e o uso de preservativo, o número de parceiros sexuais, a contagem de linfócitos T CD4 e a quantificação da carga viral do HIV. A multiplicidade do HPV parece estar associada a níveis mais altos de carga viral do HIV.

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108 108 ANEXOS E APÊNDICES ANEXO A Parecer ético

109 109 ANEXO B - Classificação colposcópica internacional aprovada pela Federação Internacional de Patologia Cervical e Colposcopia (IFCPC), Roma, 1990 A) Achados colposcópicos normais D) Colposcopia insatisfatória Epitélio pavimentoso original Epitélio cilíndrico Zona de transformação normal Junção escamocolunar não-visualizada Inflamação grave ou atrofia grave Colo não-visualizável B) Achados colposcópicos anormais E) Miscelânia 1) Dentro da zona de transformação Micropapilas não acetorreatoras Epitélio branco* Condiloma exofítico Plano Inflamação Micropapilar ou Atrofia microconvoluto Pontilhado* Ulceração Mosaico* Outros Leucoplasia* Área iodonegativa Vasos atípicos* 2) Fora da zona de transformação (ectocérvice, vagina) Epitélio branco* Plano Micropapilar ou microconvoluto Pontilhado* Mosaico* Leucoplasia* Área iodonegativa Vasos atípicos* C) Suspeita de carcinoma invasor (*) Especificar o grau Grau 1 Epitélio acetobranco fino Mosaico regular Pontilhado regular Leucoplasia fina Vasos atípicos Grau 2 Epitélio acetobranco espessado Mosaico irregular Fonte: De Palo (1996, p. 43) 78.

110 110 ANEXO C - Terminologia para a descrição histopatológica das lesões precursoras do câncer cervical, segundo a orientação de WRIGHT et al. (1994), baseada na classificação proposta por RICHART (1973) WHO/ISGYP* classificação Terminologia do Sistema de Bethesda Displasia leve (NIC 1) Lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau (SIL de baixo grau = LSIL) Displasia moderada (NIC 2) Displasia grave/carcinoma in situ (NIC 3) Lesão intra-epitelial escamosa de alto grau (SIL de alto grau = HSIL) *World Health Organization and International Society of Gynecological Pathologists. Fonte: Wright, Kurman e Ferenczy (2002, p. 256) 79.

111 111 ANEXO D - Descrição histopatológica baseada na classificação de RICHART (1973) Grau da neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) Características da histopatologia NIC 1 Lesões que apresentam o terço basal do epitélio acometido por células com distúrbio de polarização e maturação. NIC 2 Lesões que apresentam dois terços basais do epitélio acometido por células com pleomorfismo moderado, aumento da relação núcleo/citoplasma e cromatina granular. NIC 3 Lesões que apresentam mais de dois terços do epitélio acometido por células com pleomorfismo acentuado, cromatina granulosa e nucleomegalia acentuada. Neste grupo são incluídas as lesões que acometem todo o epitélio, porém, sem sinais de invasão. Fonte: Wright, Kurman, Ferenczy (2002) 79.

112 112 ANEXO E - TÉCNICA DE CITOMETRIA DE FLUXO PARA A CONTAGEM DE LINFÓCITOS T CD4 O aparelho, citômetro de fluxo, utilizado neste estudo para a contagem dos linfócitos T CD4 foi o FACSCount que segundo o fabricante, trata-se de um contador de células de dimensões compactas, computadorizado (BECTON DICKINSON, 1995). O sistema FACSCount fornece o número absoluto de linfócitos T auxiliares (CD3/CD4) e de linfócitos T supressores/citotóxicos (CD3/CD8) a partir de emissão de luz, utilizando dois ou mais complexos combinados anticorposubstância fluorescente (fluorocromos) (BECTON DICKINSON, 1995). Em cada tubo de amostra, existe um número conhecido de partículas de referência conjugadas com substâncias fluorescentes. Como o aparelho lê a intensidade de fluorescência tanto das partículas de referência quanto das células, conhecendo a quantidade de partículas, ele pode calcular o número de células. As células e as partículas de referência são separadas com base na fluorescência e depois contadas (BECTON DICKINSON, 1995). Segundo o fabricante, BECTON DICKINSON (1995), a amostra de cada paciente deve ser preparada, devendo-se executar os seguintes passos: 1) O par de reagentes CD3/CD4 e CD3/CD8 deve ser rotulado, escrevendo em cada um deles o número do paciente; 2) O par de tubos de reação é agitado em um aparelho chamado vórtex; 3) Estes tubos de reação são abertos em um outro aparelho chamado Coring- Station, colocados em uma estante de trabalho e protegidos contra a luz; 4) A amostra de sangue do paciente é homogeneizada, invertendo o tubo delicadamente e adicionado 50 µl em cada um dos tubos de reagentes CD3/CD4 e CD3/CD8; 5) Novamente os tubos são agitados no vórtex e após incubados por 60 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz na estante de trabalho; 6) Adiciona-se 50 µl de solução fixadora nos tubos e de novo são agitados no vórtex; 7) É feita a corrida para a leitura da amostra no FACSCount dentro de no máximo 2 horas após a preparação.

113 113 Quando a leitura da amostra do paciente é finalizada, o resultado do teste é impresso com as contagens absolutas de células CD4 e CD8 e a relação CD4/CD8, CD4/CD3 e CD8/CD3. Para a emissão do laudo, é opcional calcular o valor percentual dos linfócitos T CD4 e T CD8 em relação à contagem total de linfócitos. O cálculo do valor percentual dos linfócitos T CD4 e T CD8 em relação à contagem total de linfócitos é feito por meio das seguintes fórmulas: FÓRMULA 1 Cálculo do valor percentual dos linfócitos T CD4 % de linfócitos T CD4 = Número absoluto de linfócitos T CD4 x 100 Número de linfócitos totais FÓRMULA 2 Cálculo do valor percentual dos linfócitos T CD8 % de linfócitos T CD8 = Número absoluto de linfócitos T CD8 x 100 Número de linfócitos totais O número absoluto de linfócitos T CD4 e CD8 é fornecido pelo FACSCount. Para a obtenção do número de linfócitos totais, é preciso realizar um hemograma com a mesma amostra de sangue analisada no citômetro ou com outra amostra colhida no mesmo momento e fazer o cálculo por meio da seguinte fórmula: FÓRMULA 3 Para o cálculo do número absoluto de linfócitos totais Nº absoluto de linfócitos totais = Nº leucócitos totais x % linfócitos totais 100

114 114 ANEXO F - TÉCNICAS DE QUANTIFICAÇÃO DA CARGA VIRAL DO HIV-1 A- Teste NASBA HIV-1 RNA QT A quantificação pelo teste de NASBA HIV-1 RNA QT baseia-se na amplificação do RNA de HIV-1 da amostra, juntamente com padrões internos (VAN GEMEN et al., 1994). A quantidade de RNA amplificado é medida por meio da eletroquimioluminescência (BLACKBURN et al, 1991). Segundo o fabricante (ORGANON TEKNIKA, 1997), a metodologia NASBA QR é um ensaio de amplificação de ácido nucléico para a determinação qualitativa e quantitativa de RNA, desde o isolamento até a detecção do RNA amplificado. O software do leitor NASBA QR calcula automaticamente o número de cópias de RNA de HIV-1 do tipo selvagem no volume de plasma ou soro. Os resultados apresentados pelo software no intervalo de cópias de RNA devem ser interpretados como menos de 400 cópias (neste caso, a sensibilidade de detecção do teste é de 400 cópias). Com a evolução do software a sensibilidade de detecção passou para 80 cópias. A sensibilidade de detecção deste teste pode chegar ao limite mais baixo de 40 HIV-RNA cópias/ml, sendo que isto é determinado pela informação contida no computador e transmitida para o processador (RICHMAN et al., 1999). O teste é composto de quatro estágios distintos: 1 ESTÁGIO: Liberação do ácido nucléico À amostra, acrescenta-se o tampão de lise que contém tiocianato de guanidina e Triton X-100. As partículas virais e células presentes na amostra são desintegradas e as Rnases e Dnases presentes na amostra são inativadas. O ácido nucléico é liberado (FIGURA 1A). 2 ESTÁGIO: Isolamento do ácido nucléico Sob alta concentração de sal, todos os ácidos nucléicos no tampão de lise, incluindo os três RNA sintéticos adicionados necessário para o teste (utilizados como controle interno), ligam-se às partículas de sílica. Estas

115 115 partículas, agindo como fase sólida, são lavadas várias vezes. Finalmente, os ácidos nucléicos são eluídos da fase sólida (FIG. 1A). 3 ESTÁGIO: Amplificação do ácido nucléico O RNA de HIV-1 do tipo selvagem, presente no ácido nucléico eluído, é co-amplificado com o RNA obtido do plasma do paciente. A amplificação baseiase na extensão dos primers. O RNA da amostra e os controles adicionado servem como molde para a extensão do primer 1 (contendo o sítio de reconhecimento da T7 RNA polimerase) pela transcriptase reversa do vírus da mieloblastose aviária (AMV-RT). A extensão é seguida pela degradação da fita de RNA pela RNase H, síntese da segunda fita de DNA pela extensão do primer 2 pela AMV-RT e síntese de RNA pela T7 RNA polimerase. Com a síntese de RNA, o sistema entra na fase de amplificação isotérmica, resultando no acúmulo de RNA amplificados (FIGURAS 2A e 3A). FIGURA 1A Representação da fase de liberação e isolamento do ácido nucléico. Fonte: Manual do Ministério da Saúde/CN-DST/AIDS (1999, p.21) 80.

116 116 FIGURA 2A Representação da síntese da primeira fita de Cdna. Fonte: Manual do Ministério da Saúde/CN-DST/AIDS (1999, p.22) 80. FIGURA 3A Representação da síntese da segunda fita de DNA e ciclo da amplificação isotérmica. Fonte: Manual do Ministério da Saúde/CN-DST/AIDS (1999, p.23) 80.

117 117 4 ESTÁGIO: Detecção do ácido nucléico A detecção do RNA de HIV-1 em uma amostra baseia-se no princípio de eletroquimioluminescência (ECL). A detecção do RNA na amostra é feita por uma reação sanduíche entre micropérolas magnéticas marcadas com estreptoavidina, ligadas à biotina-oligo e uma sonda marcada com rutênio, as pérolas magnéticas carreando o complexo amplificado-hibridizado/sonda são capturados na superfície de um eletrodo por meio de um ímã. A tensão aplicada a este eletrodo dispara a reação de eletroquimioluminescência. A luz emitida pelas sondas marcadas com rutênio é proporcional à quantidade de amostra amplificada. O cálculo baseado nas quantidades relativas das amostras amplificadas revela a quantidade original de RNA de HIV-1 do tipo selvagem na amostra (FIGURA 4A). FIGURA 4A Hibridização da amostra amplificada com sondas específicas e genéricas. Fonte: Manual do Ministério da Saúde/CN-DST/AIDS (1999, p.24) 80. B- Teste Quantiplex HIV-1 RNA 3.0 (Bdna) Segundo o fabricante (BAYER, 2000) 81, a tecnologia do Bdna, é um ensaio de hibridização solução-sanduíche de ácidos nucléicos usando moléculas de DNA ramificadas (Bdna), amplificando o sinal de um alvo de RNA. O que é lido

118 118 pelo software do System 340 é o nível de sinal emitido pela reação, gerando todas as análises de dados. Os resultados são gerados em cópias/ml ou IU/ml. O limite de detecção para este teste foi definido como a concentração na qual 95% dos resultados são positivos (ERICE et al., 2000). A amostra é tratada com reagente de lise e o material nucléico do vírus liberado é então hibridado em solução usando dois conjuntos de sondas oligonucleotídeas. Uma das sondas serve como sonda de captura (localizada na superfície dos poços da placa) que hibrida especificamente com o RNA do HIV e faz com que o RNA do HIV fique ligada à placa. A segunda sonda serve como sonda que se liga ao RNA do HIV preso na placa e também serve para hibridar com um outro conjunto de sondas: préamplificadora e amplificadora (bdna), a essa última se atribui a função de aumentar o nível de sinal da hibridização. As moléculas de Bdna atuam como amplificadoras por se ligar com uma sonda marcada com fosfatase alcalina. Desta maneira, o sinal gerado pelo complexo HIV RNA-sonda é amplificado para detecção e quantificação do RNA viral. Finalmente, a adição de um substrato quimioluminescente reage com a última sonda e o sinal emitido é lido em um luminômetro. A unidade relativa de luz (RLU) gerada é proporcionalmente correlacionada com a quantidade de RNA do HIV na amostra.

119 119 FIGURA 5A Diagrama esquemático das etapas do teste de quantificação da carga viral do HIV pela técnica Bdna. Fonte: Bayer (2000) 81. O valor da carga viral do HIV em logaritmo pelos dois métodos descritos é calculado pela expressão log 10 do valor em cópias/ml.