PRIMAQUINA E CARBOXIPRIMAQUINA EM PACIENTES COM MALÁRIA VIVAX

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PRIMAQUINA E CARBOXIPRIMAQUINA EM PACIENTES COM MALÁRIA VIVAX Michelle Valéria Dias Ferreira BELÉM - PA 2014

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PRIMAQUINA E CARBOXIPRIMAQUINA EM PACIENTES COM MALÁRIA VIVAX Autor: Michelle Valéria Dias Ferreira Orientador: Prof. Dr. José Luiz Fernandes Vieira Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêutica, área de concentração: Fármacos e Medicamenos, do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará como requisito para a obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. BELÉM - PA 2014

3 Dados Internacionais de catalogação-na-publicação (CIP) Ferreira, Michelle Valéria, Primaquina e carboxiprimaquina em pacientes com malária vivax / Michelle Valéria Ferreira Orientador: José Luiz Vieira. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Belém, Malária Vivax. 2. Primaquina. 3.Carboxiprimaquina. I. Título. CDD 22. ed

4 FOLHA DE APROVAÇÃO MICHELLE VALÉRIA DIAS FERREIRA PRIMAQUINA E CARBOXIPRIMAQUINA EM PACIENTES COM MALÁRIA VIVAX Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêutica, área de concentração: Fármacos e Medicamenos, do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará como requisito para a obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Aprovado em: 01/10/2014 Banca examinadora: Prof. Dr. José Luiz Fernandes Vieira (orientador) Instituição: UFPA Assinatura Profª. Drª. Marcieni Andrade de Ataíde (membro) Instituição: UFPA Assinatura Profª. Drª. Osmarina Pereira da Paixão e Silva (membro) Instituição: UFPA Assinatura

5 A minha família.

6 AGRADECIMENTOS A Deus, por se fazer sempre presente em minha vida; Aos meus familiares, pai, mãe, irmão e sobrinho, pelo carinho, apoio, dedicação e incentivo, tão importantes para que eu pudesse prosseguir meus estudos; meu porto seguro; Ao meu orientador, pela credibilidade na minha capacidade de desenvolver essa pesquisa e superar os obstáculos da vida; meu companheiro e amigo; À Universidade Federal do Pará, que me oportunizou a participar dessa pesquisa; A CAPES, pelo apoio financeiro, tão importante para a dedicação ao trabalho desenvolvido; Ao Cnpq, que financiou o projeto rede Malária, do qual foram selecionadas as amostras para essa pesquisa; À Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, pela doação das amostras; A Marly Marques pelo intermediação entre a UFPA e à Fundação de Medicina Tropical do amazonas, pelas informações e fornecimento dos dados pertinentes para essa pesquisa; A equipe de trabalho do LATOX-UFPA Estafania, Marcela, Monique, Shirlene, Olavo e Wilson, pelo apoio na organização e extração das inúmeras amostras; E por fim, aos pacientes, que mesmo no momento de fragilidade aceitaram em participar desse projeto de pesquisa; sem os quais essa pesquisa não seria possível.

7 Dê um passo a frente e você não estará mais no mesmo lugar Chico Science

8 RESUMO PRIMAQUINA E CARBOXIPRIMAQUINA EM PACIENTES COM MALÁRIA VIVAX A primaquina é o único antimalárico disponível para cura radical da infeção pelo P. vivax. Estudos recentes tem creditado ao fármaco aumento das falhas terapêuticas levando a proposição de novos esquemas terapêuticos que assegurem a eficácia sem aumento das reações adversas. Este estudo comparou as concentrações de primaquina e carboxiprimaquina em sangue total, coletadas antes do início do tratamento e após 3, 7 e 14 dias, de pacientes com malária vivax em uso de doses totais de 210 mg e 420 mg administrados por 14 dias em seguimento laboratorial de 180 dias. Para determinação do fármaco e do metabólito foi empregada a cromatografia líquida de alta eficiência após prévia separação do material biológico do papel de filtro e extração líquido-líquido do analito. O tempo médio de recorrência foi 85 dias. As concentrações de primaquina e carboxiprimaquina no grupo de 210 mg variaram de 136 ng/ml a 93,7 ng/ml e de 88 ng/ml a 109 ng/ml em D3 e D14, respectivamente. Já no grupo de 420 mg, foram observados valores de 144 ng/ml a 71 ng/ml e de 84,5 ng/ml a 108 ng/ml, respectivamente. A relação entre o fármaco e seu metabólito no grupo de 210 mg variou de 2.4 a 2.6 e no grupo de 420 mg de 2.21 a 0.33 em D3 e D14. Quando os pacientes do grupo de 420 mg foram realocados no seguimento clínico laboratorial, as concentrações de primaquina variaram de 213 ng/ml a 54.2 ng/ml e as de carboxiprimaquina variaram de 81 ng/ml a 117 ng/ml em D3 e D7 naqueles com recorrência parasitária. Nos pacientes curados a primaquina variou de 123 ng/ml a 74 ng/ml e a carboxiprimaquina de 81 ng/ml a 132 ng/ml em D3 e D14, respectivamente. As relações entre o fármaco e seu metabólito variaram de 2.85 a 0.87 em D3 e D7 dos indivíduos com recorrência parasitária e de 2.4 a 0.73 naqueles curados. Concluiu-se que a primaquina não se acumulou no decorrer do tratamento nas doses de 210 mg e 420 mg, assim como a dose total administrada não se associou às concentrações sanguíneas. Por outro lado, foi observada elevada concentração de carboxiprimaquina em D7 entre os dois grupos. A relação entre o fármaco original e seu metabólito foi influenciada pelo perfil diferenciado destas substâncias apenas no grupo que recebeu 420 mg em D3. A concentração de primaquina mostrou-se diferente em D7 quando comparados os dois grupos e a resposta parasitológica associou-se às concentrações nesse mesmo dia ao fim de 180 dias de seguimento clínico laboratorial dos pacientes. Palavras-chave: Malária vivax; Primaquina; Carboxiprimaquina.

9 ABSTRACT PRIMAQUINE AND CARBOXIPRIMAQUINE IN PATIENTS WITH MALARIA VIVAX Primaquine is the only licensed drug for the radical cure of P. vivax infection. Recent studies reported increased rates of therapeutic failure to primaquine leading to the proposition of alternative therapeutic schedules which ensures efficacy and security of primaquine usage. In this study, we compare the concentrations of primaquine and carboxiprimaquine in whole blood of patients with P. vivax under 210 mg and 420 mg of Primaquine during 14 days in pre dose samples and on 3,7 and 14 days of treatment. The follow up period was 180 days. A high performance liquid procedure previously validated was used to determine primaquine and carboxiprimaquine after previous separations of whole blood from filter paper and liquid-liquid extraction. Mean time of recurrence of parasites was 85 days. The concentrations of primaquine and carboxiprimaquine in the group of 210 mg ranged from 136 ng/ml to 93,7 ng/ml and 88ng/mL to 109 ng/ml on D3 and D14, respectively. In the group of 420 mg, the levels ranged from 144 ng/ml to 71 ng/ml and 84.5 ng/ml to 108 ng/ml, respectively. The relations between the levels of parent drug and its main metabolite in the group of 210 mg ranged from 2.4 to 2.6, and in the group of 420 mg from 2.21 to 0.33 on D3 and D14. When patients of the group receiving 420 mg were reallocated according reappearance of parasites during follow um period, primaquine in patients with reappearance of parasites ranged from 213 ng/ml to 54.2ng/mL, and carboxiprimaquine ranged from 81 ng/ml to 117 ng/ml on D3 and D7. In cured patients, primaquine ranged from 123 ng/ml to 74 ng/ml and carboxiprimaquine from 81 ng/ml to 132 ng/ml on D3 e D14, respectively. The relation between primaquine and carboxiprimaquine ranged from 2.85 to 0.87 on D3 and D7 of patients with reappearance of parasites and from 2.4 to 0.73 in cured patients. In conclusion, primaquine does not show significant accumulation during the treatment in both doses, as well the total dose administered was not associated with the levels of primaquine in whole blood. On other hand, carboxiprimaquine show high levels on D7 of both groups. The relation between primaquine and carboxiprimaquine was associated with different profiles of parent drug and its main metabolite in group of 420mg on D3. The concentration of primaquine showed differences in D7 compared the two groups and parasitological response was associated with the concentrations that day after 180 days of clinical laboratory monitoring of patients. Keywords: Malaria vivax; primaquine; carboxiprimaquine.

10 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Mapa da ocorrência da malária no mundo 16 Figura 2 - Mapa de ocorrência da malária no Brasil 17 Figura 3 - Mapa de ocorrência da malária vivax no mundo 18 Figura 4 - Ciclo biológico do Plasmodium vivax 21 Figura 5 - Sítios de ação dos antimaláricos 25 Figura 6 - Estrutura quimica da primaquina 28 Figura 7 - Primaquina e seus metabólitos 30 Figura 8 - Esquema de extração da primaquina 39 Figura 9 - Cromatograma das soluções padrões de quinidina (2.5µg/mL,) 43 Primaquina (60ng/mL) e carboxiprimaquina (104ng/mL) Quadro 1 - Antimaláricos classificados de acordo com suas classes químicas 26 Quadro 2 - Esquema longo de tratamento da malária vivax não complicada 27 Quadro 3 - Esquema curto de tratamento da malária vivax não complicada 27 Quadro 4 - Ajuste de dose de primaquina para pacientes 70Kg 29

11 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Características dos pacientes com malária vivax em uso de primaquina por grupo de estudo de acordo com o esquema terapêutico 42 Tabela 2 - Curvas de calibração da primaquina e carboxiprimaquina em amostras de sangue total adicionada de concentrações crescentes do fármaco de interesse 43 Tabela 3 - Concentrações Médias de Primaquina (PQ) e Carboxiprimaquina (CPQ), e as respectivas relações, em diferentes dias de estudos em pacientes com P. vivax tratados com dose total de 210mg de Primaquina em 14 dias 44 Tabela 4 - Concentrações Médias de Primaquina (PQ) e Carboxiprimaquina (CPQ), e as respectivas relações, em diferentes dias de estudos em pacientes com P. vivax tratados com dose total de 420mg de Primaquina em 14 dias 45 Tabela 5 - Concentrações de Primaquina (PQ) e Carboxiprimaquina (CPQ), expressas em ng/ml de pacientes com Plasmodium vivax em uso de 420mg de primaquina em 14 dias, alocados de acordo com a recorrência da parasitemia ou cura após seguimento clínico-laboratorial 46

12 ABREVIATURAS E SIGLAS CDC CLAE CPQ CQ ELISA FDA FMTAM FT G-6-PD HCL IFI MS NaOH OMS OPAS PNCM PQ RAs RCPA SUS UFPA Centers for Disease Control and Prevention Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Carboxiprimaquina Cloroquina Enzyme-linked Immunosorbent Assays Food and Drug Administration Fundação de Medicina Tropical do Amazonas Fracasso Terapêutico Glicose-6-fosfato desidrogenase Ácido Clorídrico Imunofluorescência Indireta Ministério da Saúde Hidróxido de Sódio Organização Mundial de Saúde Organização Pan-Americana de Saúde Programa Nacional de Controle da Malária Primaquina Reações Adversas Resposta Clinica e Parasitológica Adequada Sistema Único de Saúde Universidade Federal do Pará

13 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REFERENCIAL TEÓRICO Malária vivax EPIDEMIOLOGIA AGENTE ETIOLÓGICO TRANSMISSÃO CICLO BIOLÓGICO MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DIAGNÓSTICO LABORATORIAL TRATAMENTO Primaquina CONSIDERAÇÕES GERAIS CINÉTICA REAÇÕES ADVERSAS INTOXICAÇÃO AGUDA CONTA-INDICAÇÕES Falha terapêutica e cura radical na infecção pelo p. vivax Monitorização terapêutica de antimaláricos OBJETIVOS Geral Específicos METODOLOGIA Casuística LOCAL DE ESTUDO POPULAÇÃO DE ESTUDO ESQUEMA TERAPÊUTICO Procedimentos ACOMPANHAMENTO CLÍNICO E LABORATORIAL AMOSTRAS DETERMINAÇÃO DA PARASITEMIA... 38

14 4.2.4 EXTRAÇÃO DE PQ E CPQ QUANTIFICAÇÃO DE PQ E CPQ Avaliação estatística Parecer da comissão de ética RESULTADOS Características gerais dos pacientes Parâmetros de validação da metodologia analítica para determinação das concentrações de PQ e CPQ em sangue total por CLAE Determinação das concentrações de PQ, CPQ e sua relação em sangue total DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS ANEXO A Aprovação do Comitê de Ética e Pesquisa em Seres Humanos FMTAM... ANEXO B Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

15 14 1 INTRODUÇÃO A malária é uma doença milenar, que apesar dos esforços dos órgãos governamentais para controle e erradicação, ainda constitui importante questão de saúde pública, pois mais de 40% (3,3 bilhões de pessoas) da população mundial distribuída em 106 Países apresenta risco de contrair a doença. No Continente Americano, aproximadamente 137 milhões de pessoas vivem nas áreas endêmicas, e em 2010, foram registrados casos nas Américas. Destes, 89% nos Países do bioma amazônico, onde as condições socioeconômicas e ambientais favorecem a proliferação do vetor (PYBUS et al, 2012). O Plasmodium vivax predomina fora da África, sendo responsável em 2012, por cerca de 50% dos casos da doença no mundo. É a principal espécie de Plasmódio em áreas endêmicas da Ásia, América Central e do Sul, Oriente Médio e Oceania (WHO, 2013). O esquema terapêutico de primeira linha para cura radical da malária vivax consiste da associação cloroquina (CQ) e primaquina (PQ), as quais atuam nas fases eritrocitária e hepática do ciclo de vida do Plasmódio no hospedeiro humano, com destaque para os hipnozoítas, que são estágios latentes alojados nos hepatócitos dos indivíduos infectados responsáveis pelas recaídas tardias da doença (HILL et al, 2006; WHO, 2010a). Os relatos de falha terapêutica no tratamento da malária vivax a esta associação são antigos, comuns e mundialmente distribuídos nas áreas endêmicas, inclusive na Amazônia brasileira. No passado se referiam a resistência de cepas de P. vivax a CQ, entretanto, os padrões de recorrência parasitária suscitaram questionamentos acerca da eficácia terapêutica da PQ. De fato, as repetidas recaídas da doença reportadas em diversos países, inclusive no Brasil, têm sido atribuídas a falha terapêutica da PQ (HILL et al, 2006). A PQ é o único fármaco licenciada pelo Food and Drog Administration (FDA) há mais de seis décadas para eliminar os hipnozoítos do tecido hepático (WHO, 2010a). É efetiva quando administrada em doses apropriadas, contudo, tóxica ao sistema hematopoietico, acarretando metemoglobinemia e hemólise, em pacientes com deficiência de glicose-6-fosfato-desidrogenase (FERNANDO, RODRIGO e RAJAPAKSE, 2011).

16 15 Não há consenso acerca das doses e duração do tratamento com PQ na malária vivax, pois deve-se assegurar a eficácia hipnozoiticida, assim como, a segurança de uso, a exemplo, a Organização Mundial de Saúde (OMS) estabelece tratamento diferenciado para o Sudeste asiático e Pacífico Sul, recomendando o dobro da dose utilizada das demais regiões endêmicas (WHO, 2010a), sujestão que o Centers for Disease Control and Prevention (CDC) passou a adotar regularmente, mesmo ainda sem aprovação do FDA (PRICE et al, 2011). No Brasil, o Ministério da Saúde propõe dois esquemas de tratamento: o curto (0,5mg/Kg/dia por sete dias) e o longo (0,25mg/Kg/dia por 14 dias) (MS, 2010b). A efetividade curativa da PQ foi comparada em diferentes doses e duração de tratamento, inclusive na Amazônia brasileira, onde a dose total de 3.5 mg/kg de PQ durante sete dias foi associada a recorrência parasitária entre 26 a 40% durante seguimento de 180 dias (DURAND et al, 2014; ORJUELA-SANCHEZ et al, 2009). Sabe-se que a dose total de PQ é a principal determinante da sua eficácia terapêutica. Via de regra, há boa correlação entre dose administrada de um fármaco e sua concentração em fluídos biológicos e consequente resposta terapêutica, entretanto, a PQ apresenta características farmacocinéticas peculiares, como meia vida biológica reduzida, as quais podem comprometer o estabelecimento destas correlações. Por outro lado, não foram descritas as concentrações de PQ e seu principal metabólito, a carboxiprimaquina (CPQ), em fluídos biológicos no decorrer do tratamento da malária vivax no Brasil. Portanto, se justifica a realização deste estudo que determinou as concentrações de PQ e CPQ por cromatografia líquida de alta eficiência no sangue total de pacientes com malária vivax alocados em dois grupos em função da dose total administrada, objetivando conhecer as concentrações de PQ e CPQ na população amazônida, assim como, avaliar se a dose total do fármaco se associa às concentrações no sangue total e se estas se relacionam à resposta parasitológica após seguimento clínico laboratorial de 180 dias.

17 16 2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 Malária EPIDEMIOLOGIA A malária ocorre principalmente nas áreas tropicais e subtropicais do planeta, onde as condições ambientais, como temperatura e pluviosidade, favorecem a sobrevivência e proliferação do vetor. A população mais atingida é da África subsaariana, pois além das condições climáticas adequadas, outros fatores, como eficácia vetorial, prevalência da espécie de Plasmódio mais suscetível de causar a forma grave da doença e escassez de recursos para controle e erradicação contribuem para sua elevada incidência (Figura 1) (CDC, 2014). Figura 1 - Mapa da ocorrência da malária no mundo. Fonte: Adaptado de CDC, 2014.

18 17 Em 2012, foram estimados 207 milhões de casos de malária no mundo, principalmente na África (80%), seguido pelo oeste da Ásia (13%) e Mediterrâneo Oriental (6%). Foram registrados cerca de 627 mil óbitos, destes 90% na África, 7% no sudoeste Asiático e 3% no Mediterrâneo oriental. Cerca de 482 mil óbitos ocorreram em crianças menores de cinco anos, correspodendo a 72% do total (WHO, 2013). Pacientes nesta faixa etária, grávidas e primos-infectados constituem o grupo de risco às infecções graves, por apresentarem pouca ou nenhuma imunidade (LANGHORNE et al, 2008). As principais espécies de Plasmódio causadoras da doença são o P. falciparum, predominante na África, e o P. vivax no sudeste da Ásia, Índia e nas Américas Central e do Sul, onde foi responsável por cerca de 65% dos casos, em Destaca-se que medidas de controle para erradicação recomendadas pela OMS, como o uso de mosquiteiros impregnados com inseticidas de poder residual prolongado e o tratamento com derivados da artemisinina, contribuiram significativamente para redução da carga global de P. falciparum, contudo, sem efeito significativo sob P. vivax, que passou a predominar em algumas áreas endêmicas (WHO, 2013). Nas Américas, o Brasil apresentou o maior número de notificações da doença. O País registrou em 2012, mais de 242 mil casos, dos quais aproximadamente 203 mil por P. vivax. Cerca de 99,9% ocorreram na Amazônia Legal, onde condições ambientais são propicias a proliferação do mosquito vetor, assim como, os aglomerados populacionais residem ou trabalham às proximidades dos criadouros dos vetores (MS, 2008; Sistema de Informação de Vigilância Epidemiológica - SIVEP, 2012; WHO, 2013) (Figura 2). Figura 2 - Mapa de ocorrência da malária no Brasil. Fonte: Adaptado de WHO, 2013.

19 AGENTE ETIOLÓGICO Cerca de 100 espécies de protozoários do gênero Plasmodium infectam diferentes animais como répteis, aves e mamíferos, contudo, cinco são reconhecidas como causadoras da malária no homem: P. falciparum, P. knowlesi, P. malariae, P. ovale e P. vivax. Destas, as mais prevalentes são P. falciparum (na África) e P. vivax (no restante do mundo). A primeira é responsável pelos casos mais graves, enquanto o P. vivax pelas recaídas tardias da doença (BARID, 2013; CDC, 2012; WHO, 2013). O P. malariae é pouco freqüente nas áreas endêmicas. A infecção pelo P. knowlesi tem sido relatada apenas em regiões de floresta do Sudeste da Ásia. P. vivax se distribui principalmente na Ásia e América Latina e P. ovale em algumas regiões da África Ocidental e ilhas do Pacífico Ocidental (Figura 3) (CDC, 2014; MS, 2010b; WHO, 2010a e WHO, 2011a). Figura 3 - Mapa de ocorrência da malária vivax no mundo. Fonte: Adaptado de BARID, O P. vivax apresenta baixa incidência na população africana, pois assim como P. Knowlesi, necessitam do antígeno eritrocitário Duffy para invadir eritrócitos (CARVALHO e CARVALHO, 2011), que nesta etnia é pouco freqüente (HOWES et al, 2011). Porém, estudos têm mostrado alguns casos de malária vivax em grupos populacionais Duffy negativos (CDC, 2014; MACKINNON et al, 2005; MÉNARD et al, 2010; MENDES et al, 2011 e JENS, PAGLIARINI e NOVARETTI, 2005).

20 19 Várias cepas de P. vivax circulam nas áreas endêmicas, com características peculiares quanto à suscetibilidade aos antimaláricos, virulência e intervalo para relapso. Como por exemplo, foram identificados fenótipos de cepas como Chesson, Madagascar, St Elizabeth, Hibernans, Norte Coreano e Norte Indiano em diferentes áreas endêmicas (WHITE, 2011) TRANSMISSÃO A transmissão da malária depende da existência do reservatório humano e do vetor. Ocorre principalmente pela picada das fêmeas dos mosquitos do gênero Anopheles, durante repasto sanguíneo, mas também pode ocorrer, embora raramente, por transfusão sanguínea, compartilhamento de agulhas, transplante de órgãos e via placentária. Existem mais de 400 espécies de mosquitos do gênero Anopheles distribuídos pelo mundo, com exceção da Antártida, destas, cerca de 30 a 40 espécies são potencialmente transmissoras da doença. Os mosquitos são encontrados tanto nas áreas endêmicas, quanto naquelas onde a malária foi erradicada, oferecendo risco constante de reaparecimento da doença (CDC, 2014). No Brasil, cinco espécies de anofelinos se destacam: Anopheles (N) darlingi, A. (N) aquasalis, A. (N) albitarsis, A. (K) cruzi e A. (K) bellator. Habitam geralmente águas límpidas e sombreadas, as quais são comuns na região Amazônica (MS, 2009; MS, 2010c). A espécie mais abundante na Amazônia Brasileira é o Anopheles (N) darlingi, que é o vetor mais antropofílico e eficiente, com capacidade de transmitir P. falciparum, P. vivax e P. malariae (MARTINS-CAMPOS et al, 2012; SILVA-NUNES et al, 2012; SINKA et al, 2010), além de se desenvolver em ambientes alterados pela ação humana, tais como reservatórios de peixes e hidrelétricas (VITTOR et al, 2009).

21 CICLO BIOLÓGICO O ciclo se inicia (Figura 4) quando a fêmea do mosquito Anopheles, infectada pelo Plasmódio exerce a hematofagia e inocula esporozoítos (forma infectante) na corrente sanguínea do hospedeiro vertebrado, os quais migram pela circulação periférica aos hepatócitos. Neste estágio ocorre a formação do vacúolo parasitóforo (MILLER et al, 2002; PRUDENCIO, RODRIGUEZ e MOTA, 2006), no qual o esporozoíto se diferencia em trofozoíto pré-eritrocítico e se multiplica por reprodução assexuada do tipo esquizogonia, dando origem aos esquizontes teciduais e, posteriormente, a milhares de merozoítos (CDC, 2014). Nesta fase primária do ciclo, denominada pré ou exo-eritrocítica ou tissular, algumas formas podem permanecer latentes no fígado por dias ou até meses nas infecções pelo P. vivax e P. ovale, denominadas de hipnozoítos, os quais são responsáveis pelas recaídas tardias da doença (FERREIRA, 2005). Os hipnozoítos não desenvolvem completamente a esquizogonia tissular (esquizontes préeritrocíticos), interrompendo o ciclo de reprodução assexuada no hepatócito. Tempos após a exposição humana ao P. vivax, este processo pode vir a ser continuado, ocorrendo assim, a recaída da doença (KROTOSKI et al, 2012). A segunda fase do ciclo é denominada eritrocítica e se inicia quando os merozoítos tissulares, liberados na corrente sanguínea, invadem eritrócitos, estabelecendo a infecção (CDC, 2014). A seqüência de invasão é, provavelmente, similar para todas as espécies de plasmódios, porém o P. vivax apresenta predileção pelos reticulócitos (KITCHEN, 1938; VRYONIS, 1939; SIMPSON et al, 1999). Os parasitos aderem à superfície dos eritrócitos através das glicoproteínas presentes na membrana, formando um vacúolo derivado desta organela. O parasito penetra no interior deste vacúolo infectando a célula (MILLER et al, 2002). Os merozoítos se desenvolvem por esquizogonia eritrocitária e sofrem maturações, morfologicamente distintas, compreendendo três etapas, respectivamente: forma em anel, trofozoítos e esquizontes. Os eritrócitos se rompem liberando os parasitos na circulação sanguínea, que invadirão novas células, reiniciando o ciclo. Após sucessivas gerações de merozoítos sanguíneos, uma proporção dos parasitos assexuados se diferencia em formas sexuadas, os microgametócitos (masculino) e macrogametócito (feminino), os quais permanecem

22 21 na corrente sanguínea periférica, e durante repasto sanguíneo das fêmeas do mosquito Anopheles, irão evoluir no interior do inseto, dando origem ao ciclo sexuado ou esporogônico (KROTOSKI et al, 2012 e WHITE e IMWONG, 1982). No intestino médio do mosquito ocorre a gametogênese, formando o oocisto, que por divisão esporogônica forma esporozoítos, os quais migram às glândulas salivares (WHITTEN, SHIAO e LEVASHINA, 2006). As fêmeas se tornam infectantes e ao exercerem nova hematofagia, inoculam os esporozoítos com a saliva, iniciando novo ciclo no hospedeiro vertebrado (FERREIRA, 2005). Figura 4 - Ciclo biológico do Plasmodium vivax. Fonte: Adaptado de CDC, MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS As manifestações clínicas ocorrem geralmente entre 7 a 30 dias após o repasto sanguíneo de acordo com a espécie de Plasmódio (CDC, 2014). Na infecção pelo P. vivax o início da sintomatologia ocorre entre 12 a 17 dias (KROTOSKI et al, 2012 e

23 22 WHITE e IMWONG, 1982). Os sinais e sintomas resultam da liberação de inúmeros compostos resultantes da degradação do grupo heme na fase eritrocítica do ciclo do Plasmódio, dentre elas a hemozoína e a glicose fosfato isomerase, as quais estimulam macrófagos e outras células a produzirem citocinas, responsáveis pela febre e calafrios (CDC, 2014). Inicialmente, o paciente pode ser assintomático, ou apresentar sintomatologia inespecífica, como cefaléia, fadiga, náuseas, vômitos e mialgia. A seguir, se inicia o acesso paroxístico característico da malária com calafrios, tremores generalizados e febre que pode ser superior a 40 C, acompanhados ou não dos sintomas acima descritos, seguido de defervescência, sudorese profusa e fraqueza intensa (CDC, 2014; MS, 2008 e MS, 2010a). Após os primeiros paroxismos, a febre torna-se intermitente, dependendo da duração do ciclo eritrocitário da espécie de Plasmódio que é de 48 horas para P. falciparum e P. vivax e 72 horas para P. malariae, e por isso, denominadas terçã maligna, terçã benigna e quartã, respectivamente. Ressalte-se que esta terminologia está em desuso atualmente, pois a regularidade do acesso malárico pode não ser claramente evidenciada em virtude do tratamento precoce, da infecção por mais de uma espécie de Plasmódio e pelas características da resposta imune dos primos infectados a daqueles residentes nas áreas de elevada endemicidade (BAIRD, 2009 e MS, 2001). O quadro clínico pode ser leve, moderado ou grave, a depender da espécie de Plasmódio, da carga parasitária, do tempo decorrido entre a infecção e o diagnóstico e tratamento, bem como, do estado imune do hospedeiro (MS, 2010b), sendo categorizada em não complicada ou complicada (grave) em função das manifestações clínicas. Na primeira, os sinais e sintomas são típicos do acesso malárico. Já a ocorrência de hipoglicemia, convulsões, vômitos repetidos, icterícia e distúrbio da consciência, indicam evolução desfavorável à forma grave, que geralmente cursa com hiperparasitismo (mais de 5% dos eritrócitos infectados), anemia grave, distúrbios hidroeletrolíticos e do equilíbrio ácido-base, insuficiência respiratória e renal, colapso circulatório, distúrbios hemorrágicos e da coagulação e coma. Nesses casos, a letalidade é estimada entre 10 a 20% (WHO, 2010a). Apesar do P. falciparum ser responsável pela forma grave da doença por causar modificações na superfície dos eritrócitos infectados, promovendo seu seqüestro microvascular, impedindo assim, o fluxo sanguíneo normal aos tecidos e

24 23 órgão (CDC, 2014), estudos têm demonstrado manifestações clínicas graves também na malária por P. vivax, com insuficiência respiratória, trombocitopenia, anemia grave e manifestações neurológicas (ANSTEY et al, 2007; CARLINI, WHITE Jr e ATMAR, 1999; LACERDA et al, 2012; MUELLER et al, 2009; OBALDÍA, 2007; PRICE et al, 2007; SHAIKH et al, 2012; TAN et al, 2008; THAPA, PATRA e KUNDU, 2007). Na malária vivax, as comorbidades, como dengue hemorrágica, podem agravar o quadro hematológico dos pacientes. Soma-se a hemotoxicidade dose dependente dos antimaláricos, especialmente a PQ e seus metabólitos, reconhecidamente causadores de metemoglobinemia e de hemólise na deficiência de G6PD (SANTANA et al, 2007). A falência de múltiplos órgãos e choque cardiogênico têm sido descritos, mas são necessários estudos complementares acerca do papel das bactérias e outras comorbidades nestas síndromes. Na gravidez, a infecção pelo P. vivax pode causar anemia materna, aborto espontâneo, baixo peso ao nascer e malária congênita (ALEXANDRE et al, 2010; ANSTEY et al, 2012; DOUGLAS et al, 2012; LACERDA et al, 2012). O P. vivax tem maior capacidade de induzir resposta inflamatória, resultando em menor limiar pirogênico, quando comparado ao P. falciparum. Por outro lado, a aderência das células endoteliais é menos freqüente na infecção pelo P. vivax. Porém, o risco de anemia grave é semelhante nas duas espécies. Ressalta-se que continuam desconhecidos os mecanismos fisiopatológicos responsáveis pelos casos graves de malária por P. vivax (ANSTEY et al, 2012) DIAGNÓSTICO LABORATORIAL O diagnóstico precoce e o tratamento correto e oportuno são as medidas mais adequadas para reduzir a incidência, gravidade e a letalidade pela doença. O diagnóstico laboratorial é indispensável para confirmar a infecção, uma vez que os achados clínicos são, via de regra, inespecíficos e se assemelham a outras doenças febris agudas (MS, 2009; MS, 2010b) Vários métodos laboratoriais podem ser empregados para diagnóstico da malária como pesquisa direta do parasito por microscopia de luz; indireta por detecção de anticorpos seja pela imunofluorescência indireta (IFI) ou por Enzyme-linked

25 24 Immunosorbent Assays (ELISA); detecção de antígenos por imunocromatografia empregado nos testes rápidos disponíveis atualmente, além de técnicas moleculares, por reação em cadeia da polimerase (PCR) (WONGSRICHANALAI et al, 2007) A pesquisa direta do parasito em microscopia de luz é considerada padrão ouro para diagnóstico da malária, por apresentar elevado grau de sensibilidade e de especificidade, permitindo também a identificação da espécie de Plasmódio e sua quantificação (WHO, 2009b; WONGSRICHANALAI et al, 2007). O exame é realizado em esfregaço delgado (distendido) ou espesso (gota espessa) de sangue periférico. Na prática, o último é mais utilizado, pois a concentração de sangue por campo microscópico auxilia a identificação do Plasmódio (MS, 2009). As técnicas imunocromatográficas usadas nos testes rápidos detectam antígenos específicos ou enzimas do parasito. Alguns detectam apenas uma espécie (P. falciparum), outros as infecções mistas (P. vivax, P. malariae e P. ovale) (WONGSRICHANALAI et al, 2007). São de fácil execução, entretanto não determinam a parasitemia e apresentam maior custo, quando comparadas à microscopia de luz. Soma-se a sensibilidade e a especificidade variáveis, além das alterações frente à umidade e temperatura elevadas, comuns nas áreas endêmicas tropicais (WHO, 2010a) TRATAMENTO O tratamento adequado e precoce constitue o alicerce para o controle da malária, pois previne a ocorrência dos casos graves e, conseqüente óbito, elimina as fontes de infecção para os hospedeiros, contribuindo para a redução da transmissão e por fim, evita o desenvolvimento e progressão da resistência aos antimaláricos (MS, 2008; WHO, 2010a; WHO, 2010b). Os antimaláricos atuam em uma ou mais etapas do ciclo biológico do Plasmódio (Figura 5) e de acordo com o local de ação podem ser classificados em: esporonticidas (eliminam a fonte de infecção para o homem); esquizonticidas teciduais (ciclo pré-eritrocítico, evitando o início da infecção); hipnozoiticidas (nas formas latentes da infecção por P. vivax ou P. ovale, evitando as recaídas tardias); esquizonticidas sanguíneos (ciclo eritrocítico, reduzindo a parasitemia e a

26 25 recrudescência da doença) e gametocitocida (formas sexuadas, eliminando as fontes de infecção para o mosquito) (BAIRD, 2009) Figura 5 - Sítios de ação dos antimaláricos. Fonte: Adaptado de BARID, Outra classificação comumente empregada se baseia nos grupos químicos constituintes principais das moléculas destes fármacos (Quadro 1) (MS, 2001; WHO, 2010b).

27 26 FAMÍLIA QUÍMICA ANTIMALÁRICOS 4-Aminoquinolinas Cloroquina, Amodiaquina, Piperaquina Amino-alcoois Quinina, Quinidina, Mefloquina, Halofantrina, Lumefantrina Sulfonamidas e sulfonas Sulfadoxina, Sulfalena, Dapsona Biguanidas Proguanil, Clorproguanil Diaminopirimidina Pirimetamina 8-Aminoquinolina Primaquina Lactonas sesquiterpenicas Artemisinina, Arteter, Artemeter, Artesunato, Dihidroartemisinina Naftoquinona Atovaquona Quadro 1 - Antimaláricos classificados de acordo com suas classes químicas. Fonte: Adaptado de WHO, Vários fatores são considerados para a escolha do antimalárico, como: espécie de Plasmódio infectante, pela especificidade dos esquemas terapêuticos; idade do paciente, pela maior toxicidade dos antimaláricos às crianças e idosos; histórico anterior de malária, pela possibilidade de resistência; gravidez e comorbidades, condições de maior risco para a forma grave da doença e de reações adversas; padrões de resistência aos antimaláricos na área e a capacidade operacional dos serviços de saúde. Na presença de sinais de gravidade é necessária hospitalização e utilização de esquemas terapêuticos especiais (MS, 2010b). A OMS fornece orientações globais para tratamento em cada área geográfica, a fim de subsidiar o estabelecimento de protocolos nacionais específicos, os quais no Brasil são determinados pelo Programa Nacional de Controle da Malária (PNCM) do MS, que disponibiliza gratuitamente antimaláricos em todo território nacional nas unidades do Sistema Único de Saúde (SUS), com esquemas terapêuticos padronizados de acordo com a espécie de Plasmódio, faixa etária e peso (CDC, 2014; MS, 2010a ; MS, 2010b; MS, 2010c; WHO, 2010a). O tratamento da malária por P. vivax objetiva a cura radical, isto é, o emprego de fármacos que atuem nos ciclos sanguíneo e tecidual do Plasmódio, evitando a recrudescência e a recaída da infecção. No primeiro, a CQ é o quimioterápico de escolha nas áreas onde o P. vivax é sensível. Naquelas onde ocorre resistência, recomenda-se terapia combinada de derivados da artemisinina como o artesunato com amodiaquina, mefloquina ou piperaquina. Já na fase tissular, o único fármaco utilizado é a PQ (WHO, 2010a).

28 27 A OMS recomenda dose total de 25 mg/kg de CQ, dividida em três dias, em combinação com 0,25 mg/kg/dia de PQ (15 mg/dia), administrada com alimentos para reduzir os efeitos adversos gastrintestinais, uma vez ao dia por 14 dias. Devido os relatos de falha terapêutica na Oceania e no Sudeste Asiático, emprega-se dose de 0,5 mg/kg/dia de PQ (30 mg/dia) por 14 dias (CDC, 2014; FERNANDO, RODRIGO e RAJAPAKSE, 2011; PUKRITTAYAKAMEE et al, 2010; WHO, 2010a). O esquema terapêutico proposto pelo MS segue as orientações globais da OMS, porém propõe duas opções: longo, por 14 dias (Quadro 2) ou curto, por sete dias (Quadro 3) com o dobro da dose (MS, 2010b). Nº DE COMPRIMIDOS/MEDICAMENTO/DIA Idade/Peso 1º dia 2º dia 3º dia 4º ao 14º Dias CQ PQ CQ PQ CQ PQ PQ 9-11 anos / Kg 2 1/2 2 1/2 2 1/2 1/ anos / kg /2 15 anos / 50 kg Quadro 2 - Esquema longo de tratamento da malária vivax não complicada. Fonte:Adaptado de MS,2010b. CQ: Cloroquina comprimidos de 150 mg, PQ: comprimidos de 15 mg Nº DE COMPRIMIDOS/MEDICAMENTO/DIA Idade/Peso 1º dia 2º dia 3º dia 4º ao 7º Dias CQ PQ CQ PQ CQ PQ PQ 9-11 anos / Kg anos / kg anos / 50 kg Quadro 3 - Esquema curto de tratamento da malária vivax não complicada. Fonte: Adaptado de MS, 2010b. CQ: Cloroquina comprimidos de 150 mg, PQ: comprimidos de 15 mg O CDC recomendou o aumento da dose de 0,25 mg/kg/dia para 0,5 mg/kg/dia por até 14 dias para adultos, em conjunto com um esquizonticida sanguíneo como a CQ, a partir de evidências de certas cepas de P. vivax de Papua Nova Guiné (Indonésia), áreas da Oceania, e outras partes do mundo necessitarem de doses maiores de PQ para evitar as recaídas. Um dos pré resquisitos para uso deste

29 28 esquema terapêutico é a disponibilização de testes confiáveis de avaliação da atividade da G6PD (HILL et al, 2006). 2.2 Primaquina CONSIDERAÇÕES GERAIS A PQ pertence à classe das 8-aminoquinolinas (Figura 6). Foi sintetizada nos Estados Unidos em 1946, como parte dos esforços de tratamento e prevenção da malária nos campos de guerra (CDC, 2014; VALE et al, 2009). Em 1952 foi licenciada pelo FDA, e desde então é a única droga indicada para cura radical da infecção por P. vivax e P. ovale, em combinação com um esquizonticida sanguíneo (BURGOINE et al, 2010; FERNANDO, RODRIGO e RAJAPAKSE, 2011). Apresenta-se sob a forma de comprimidos de difosfato de primaquina contendo 5 mg, 7,5 mg ou 15 mg de base livre do fármaco (WHO, 2010a) Figura 6 - Estrutura quimica da PQ. Fonte: BAIRD, Apesar do uso há décadas, os mecanismos de ação antimalárica e toxicidade da PQ não foram totalmente elucidados, entretanto, acredita-se que se relacionem à alteração do ciclo redox intracelular. (FERNANDO, RODRIGO e RAJAPAKSE, 2011; PYBUS et al, 2012). Os produtos de biotransformação oxidados, como a 5- hidroxiprimaquina, aumentam a susceptibilidade à hemólise intravascular aguda na deficiência de G6PD, que está envolvida na defesa do eritrócito aos danos provocados

30 29 pelas espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (BOLCHOZ et al, 2001; BURGOINE et al, 2010). A PQ age contra formas intra-hepáticas de Plasmodium spp., sobre gametócitos e formas assexuadas de P. falciparum. Também apresenta atividade significativa contra os estágios sanguíneos de P. vivax (BAIRD, 2009; MYINT et al, 2011). A ação hipnozoiticida é alcançada, geralmente, após dose total de 3,0 a 3,5 mg/kg. As indicações terapêuticas da PQ na malária por P. vivax são: profilaxia primária, profilaxia terminal e cura radical. Na primária indica-se 0,5 mg/kg/dia (máximo 30mg/dia) antes da exposição nas áreas endêmicas, continuando até sete dias após retorno para prevenir a progressão da infecção para os eritrócitos. A eficácia desta medida tem se mostrado satisfatória em ensaios clínicos realizados na Ásia e América do Sul. Na profilaxia terminal utiliza-se a mesma dose, porém, por 14 dias para aqueles que estiveram expostos, mas não fizeram profilaxia para eliminação das formas hepáticas. Na cura radical, a dose diária com maior eficácia recomendada é de 0,5 mg/kg/dia (máximo 30mg/dia) por 14 dias associada a um esquizonticida sanguíneo (HILL et al, 2006). Estudos clínicos demonstraram que a dose total é a principal determinante da eficácia terapêutica, pois o risco de recaída diminui proporcionalmente ao aumento da dose administrada de PQ (JOHN et al, 2012; SCHWARTZ, REGEV-YOCHAY e KURNIK, 2000). Neste sentido, o MS recomenda o ajuste da dose para pacientes com mais de 70 kg, objetivando alcançar dose total de 3,2 mg/kg (Quadro 4) (MS, 2010b). Porém, o aumento da dose é limitado pela hemotoxicidade da PQ (MYINT et al, 2011). Faixa de peso / Kg Dose total de primaquina (mg) Tempo de administração (dias) Esquema longo (15 mg/dia) Esquema curto (30 mg/dia) Quadro 4 - Ajuste de dose de primaquina para pacientes 70Kg. Fonte: MS, 2010b

31 CINÉTICA O perfil farmacocinético da PQ caracteriza-se por rápida absorção pelo trato gastrintestinal, pico de concentração plasmática entre uma a três horas, ampla distribuição pelo organismo, como fígado, cérebro, coração, pulmões e músculo esquelético, rápida biotransformação a carboxiprimaquina (CPQ), cerca de 40%, meia-vida em torno de 5 horas e excreção de 15 mg em cerca de 24 horas. A CPQ apresenta meia vida consideravelmente superior a PQ, que não se acumula nos compartimentos orgânicos. Estudos demonstraram que o gênero do paciente, a presença de Plasmódio e a deficiência de G6PD não alteraram a cinética da PQ; (BANGCHANG et al, 1994; ELMES et al, 2006; MIHALY et al, 1984; MIHALY et al, 1985). Porém, observou-se aumento da concentração plasmática máxima de PQ, e redução da CPQ, em pacientes coreanos, sugerindo cinética diferenciada entre grupos étnicos (KIM et al, 2004). A PQ é biotransformada principalmente pela Monoamino Oxidases (MAO), em especial a MAO-A, a CPQ, que é o principal produto de biotransformação. Outra rota envolve enzimas do citocromo P-450 (CYP2C19, 3A4 e 2D6), originando vários produtos de biotransformação oxidados como: 5-hidroxi, 6-desmetil primaquina; 5- hidroxiprimaquina; 5,6-dihidroxi-8-aminoquinolina e 6-metoxi-8-aminoquinolina (Figura 7) (CONSTANTINO et al, 1999; PYBUS et al, 2012). Primaquina Metabólitos conjugados e/ou hidroxilados N-acetilprimaquina Carboxiprimaquina Figura 7 - Primaquina e seus metabólitos. Fonte: Adaptado de MIHALY et al, 1984.

32 REAÇÕES ADVERSAS As reações adversas (RAs) mais comuns nas doses terapêuticas empregadas no tratamento da malária vivax são consideradas leves a moderadas como dor abdominal, náuseas e vômitos. Entretanto, são severas quando levam a hematotoxicidade, especialmente, a metemoglobinemia dose dependente e anemia hemolítica na deficiência de G6PD (BANGCHANG et al, 1994; HILL et al, 2006). A deficiência de G6PD é comum nas pessoas de etnia africana, que apresentam a variante A, cuja atividade enzimática é superior a 10%, tornando-os relativamente menos suscetíveis a hemólise mais grave induzida pela PQ, quando comparados aos caucasianos e asiáticos, que apresentam a variante B, que apesar de ser menos prevalente, apresentam atividade enzimática menor, tornando-os vulneráveis a quadro hemolítico mais grave (FERNANDO, RODRIGO e RAJAPAKSE, 2011). Nos últimos, recomenda-se a suspensão da PQ. Nos casos de hemólise branda, o fármaco deve ser administrado em dose de 0,75 mg de base/kg uma vez por semana por dois meses (WHO, 2010a). Ressalta-se que os metabólitos 5- hidroxiprimaquina e 6-metoxi-8-aminoquinolina foram diretamente associadas à hematotoxicidade da PQ (VALE et al, 2009). Geralmente 0-2% dos indivíduos sob uso de PQ apresentam reação grave e 0-2% interrompem a profilaxia (HILL et al, 2006). Outras RAs inespecíficas têm sido descritas, como fraqueza e mal-estar. Nas doses terapêuticas usuais, a PQ não costuma causar granulocitopenia (MS, 2001) INTOXICAÇÃO AGUDA Podem ocorrer transtornos gastrintestinais, fraqueza, metemoglobinemia, cianose, anemia hemolítica, icterícia e depressão da medula óssea. O tratamento é sintomático e a redução da metemoglobinemia é realizada pelo azul de metileno em doses apropriadas (WHO, 2010a).

33 CONTRA-INDICAÇÕES É contra-indicada nas grávidas pelo risco de hemólise ao feto, pois não é possível caracterizar a atividade da G6PD nesses; nos menores de quatro anos e nos deficientes de G6PD. Não há dados confiáveis sobre a excreção de primaquina no leite materno para justificar a interrupção do uso nas lactantes (WHO, 2010a). 2.3 FALHA TERAPÊUTICA E CURA RADICAL NA INFECÇÃO PELO P. VIVAX O uso disseminado de antimaláricos exerce forte pressão seletiva no Plasmódio, favorecendo o desenvolvimento de resistência, que pode ser prevenida ou retardada, dentre outras maneiras, pelo uso combinado de antimaláricos com diferentes mecanismos de ação e pela adesão plena aos regimes de dose prescrita. (WHO, 2010a). Considera-se falha terapêutica à cloroquina na malaria vivax quando ocorre piora do quadro clínico, que requeira hospitalização com parasitemia positiva; parasitemia positiva e temperatura axilar 37,5 ºC entre D3 e D28; e parasitemia entre D7 e D28, independente da condição clínica. Por outro lado, o sucesso do tratamento é definido como ausência de parasitas no D28, independente da temperatura axilar e naqueles que não preencheram nenhum dos critérios de falha do tratamento acima descritos (WHO, 2009a). As taxas de fracasso terapêutico variam nas diferentes áreas endêmicas, e na Amazônia brasileira tem sido estimada entre 4% a 10%. De natureza multifatorial, envolve variáveis relacionadas ao hospedeiro humano, ao Plasmodium e ao vetor. Nas áreas endêmicas, resulta da reinfecção, qualidade do antimalárico, relapso dos hipnozoítas, uso inadequado dos fármacos, adesão ao esquema proposto, variáveis farmacocinéticas inerentes a cada antimalárico em grupo populacional específico e da resistência da cepa circulante, em especial à cloroquina. Na malária vivax é caracterizado pela recaída (nova parasitemia decorrente da inicial) resultante da ativação dos hipnozoítos (relapso) ou da continuidade ou reaparecimento das formas parasitárias sanguíneas (recrudescência) no período de seguimento clínico e

34 33 laboratorial, seja pela falta de adesão ou resistência do Plasmódio aos fármacos utilizados (HAYNES, 2006; PEREIRA, ISHIKAWA e FONTES, 2011). É difícil diferenciar recaída de nova infecção nas áreas endêmicas (BAIRD, 2009), pois os métodos de biologia molecular para genotipagem não permitem distinguir de maneira confiável recaída por relapso ou recudescência e nova infecção (WHO, 2009a). Como por exemplo, pacientes com reconhecida recaída da infecção primária cujos parasitos foram genotipados, apresentaram mais da metade de sequência genotípica diferente daqueles que causaram a infecção primária (CHEN et al, 2007; IMWONG et al, 2007), representando, desta forma, um desafio para caracterização da recaída (WHO, 2008). A cura radical da malária por P. vivax se refere à eliminação dos hipnozoitas tissulares, responsáveis pelo relapso da doença, semanas a meses após a infecção inicial. O número e a frequência dos relapsos dependem de vários fatores como: carga de esporozoíto inoculada, imunidade do hospedeiro e cepa e/ou região geográfica na qual a infecção foi adquirida (WHITE, 2011; JOHN et al, 2012). De fato, os padrões de relapso, tempo de dormência e propensão a reativação dos hipnozoítas variam entre cepas de P. vivax que circulam nas diferentes áreas endêmicas (WHITE, 2011). Sugere-se que o fator determinante para eficácia terapêutica da PQ seja a dose total administrada e não a quantidade diária ingerida ou o tempo de tratamento. Os fatores inerentes a adesão ao tratamento, como tolerância aos efeitos adversos gastrintestinais, duração e administração supervisionada, também contribuem significativamente para o sucesso terapêutico (JONH et al, 2012). 2.4 MONITORIZAÇÃO TERAPÊUTICA DE ANTIMALÁRICOS A avaliação da eficácia terapêutica na malária vivax não complicada se fundamenta nas respostas clínica e parasitológica. A OMS recomenda que sejam feitas avaliações em diferentes dias de seguimento clínico e laboratorial (D0, antes da primeira dose do medicamento, D3, D7, D14, D21 e D28). Os determinantes da resposta terapêutica são multifatoriais e várias ferramentas de avaliação são empregadas, dentre estas, a monitorização das concentrações de antimaláricos, que permite correlacionar a resposta parasitológica às concentrações sanguíneas dos

35 34 fármacos, auxiliando na interpretação das falhas terapêuticas e na caracterização da resistência do Plasmódio aos antimaláricos, bem como, no estabelecimento de esquemas terapêuticos adequados nas diferentes áreas endêmicas, uma vez que, concentrações subterapêuticas de antimaláricos nos fluídos biológicos exercem forte pressão seletiva ao Plasmodio, elevando o risco de resistência; por outro lado, altas concentrações podem acarretar efeitos tóxicos (DUARTE e GYORKOS, 2003; WHO, 2011b). As concentrações de antimaláricos nos diferentes fluídos biológicos após uso de doses terapêuticas foram definidas apenas para alguns fármacos, uma vez que a falta de padronização dos estudos farmacocinéticos e a elevada variabilidade intra e inter individual dos parâmetros cinéticos destes quimioterápicos, geraram algumas vezes, dados inconsistentes para o estabelecimento do esquema terapêutico ideal. De fato, a dose do antimalárico deve ser adequada para determinadas populaçõesalvo, tais como crianças, grávidas e nas comorbidades (especialmente HIV/AIDS e desnutrição), objetivando assegurar a eficácia terapêutica, quer seja, prover níveis sanguíneos que excedam a concentração inibitória mínima ao parasito, assegurando desta forma a cura (WHO, 2011b). Diversos fatores influenciam nas concnetrações de antimaláricos nos fluídos biológicos e, como conseqüência, a resposta terapêutica, os quais são inerentes ao fármaco, como suas propriedades físico-químicas, farmacocinéticas e prováveis mecanismos de ação; as características intrínsecas do organismo humano, como o histórico de episódios anteriores de malária, estado imune, comorbidades, obesidade e as condições de exposição, como dose e duração do tratamento. A monitorização dos antimaláricos requer a coleta de amostras válidas, seguida de determinações confiáveis, assim como, a interpretação dos resultados de acordo com o esquema terapêutico proposto. Geralmente, após etapa prévia de extração líquido-líquido ou sólido-líquido da matriz biológica (sangue total impregnado em papel de filtro, plasma ou soro), o analito é determinado por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção de fluorescência ou ultravioleta (WHO, 2011b).

36 35 3 OBJETIVOS 3.1 Geral Determinar e comparar as concentrações de primaquina e carboxiprimaquina no sangue total de pacientes com malária por Plasmodium vivax, tratados com diferentes doses de primaquina 3.2 Específicos Identificar o perfil epidemiológico dos pacientes de estudo; Quantificar as concentrações de primaquina e carboxiprimaquina no sangue total por cromatografia líquida de alta eficiência em diferentes dias de seguimento clínico laboratorial da malária por Plasmodium vivax (D0, D3, D7 e D14) nos dois grupos de tratamento; Estabelecer e comparar a relação entre as concentrações sanguíneas de primaquina e carboxiprimaquina intra e inter grupos de tratamento; Associar as concentrações de primaquina e carboxiprimaquina à resposta parasitológica após seguimento clínico laboratorial de 180 dias.

37 36 4 METODOLOGIA Foi realizado estudo prospectivo de casos para comparação de dois regimes de doses de primaquina em pacientes com malária por P. vivax. 4.1 Casuística LOCAL DO ESTUDO O estudo foi realizado no período de Janeiro de 2011 a Dezembro de 2012, na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMTAM), autarquia estadual de referência para assistência, ensino e pesquisa em doenças tropicais situada na cidade de Manaus no Estado do Amazonas. As determinações de primaquina e carboxiprimaquina foram realizadas no Laboratório de Toxicologia da Universidade Federal do Pará (UFPA), situado na cidade de Belém no Estado do Pará no período de Janeiro a Dezembro de POPULAÇÃO DO ESTUDO Foram selecionados 38 pacientes adultos de ambos os gêneros provenientes da rede de atenção básica da cidade de Manaus com malária vivax não complicada diagnosticada pelo exame da gota espessa, com parasitemia 250 parasitos assexuados/ml, os quais foram referenciados para atendimento na Fundação de Medicina Tropical do Estado do Amazonas. Foram excluídos pacientes com as seguintes características: Portador de comorbidades, tais como cardiopatias, nefropatias, hepatopatias, HIV, desnutrição grave, diabetes mellitus;

38 37 Gravidez; Sinais de gravidade da doença; Presença de malária mista; História de hipersensibilidade ao medicamento do mesmo grupo químico previsto na pesquisa; Uso prévio de antimaláricos nos últimos 30 dias; Impossibilidade de retornar nos dias previsto para seguimento. Não aceitar ou não ser autorizado a participar do estudo (termo de consentimento livre e esclarecido) ESQUEMA TERAPÊUTICO Os pacientes foram alocados em dois grupos: Grupo 01- tratados com quatro comprimidos de 150 mg de CQ, no primeiro dia e três comprimidos do segundo ao terceiro dia, e um comprimido de 15 mg de PQ, do primeiro até o décimo quarto dia (dose total 210 mg, que corresponde a 3,5 mg/kg em indivíduos de 60Kg). Grupo 02: receberam o mesmo tratamento da CQ acima descrito, contudo a dose de PQ foi dobrada, isto é, dois comprimidos de 15 mg de PQ até o décimo quarto dia (dose total 420 mg que corresponde a 7 mg/kg em indivíduo de 60 Kg) (WHO, 2010a). 4.2 Procedimentos ACOMPANHAMENTO CLÍNICO E LABORATORIAL O seguimento clínico laboratorial dos pacientes seguiu o protocolo da OMS. Foram verificadas as condições clínicas, como temperatura axilar e realizadas a punção digital para confecção da gota espessa e determinações de PQ e CPQ para realização deste estudo em D0, D3, D7 e D14, respectivamente. O seguimento clínico

39 38 laboratorial foi de 180 dias (WHO,2010a). Ressalte-se que a administração supervisionada dos medicamentos pela equipe médica responsável pela pesquisa foi realizada apenas nos dias de coleta de material biológico AMOSTRAS O sangue total para determinação da parasitemia e quantificação de PQ e CPQ foi coletado antes da administração da próxima dose de antimalárico nos diferentes dias deste estudo, mediante punção da polpa digital do dedo indicador, previamente higienizado com álcool à 70%, com lanceta estéril. Parte foi transferido para confecção da gota espessa em lâminas identificadas e depois coradas por Giemsa (ph de 7,2). Outra porção, foi transferida para papel de filtro Whatman, em quatro aplicações de 100 µl cada, em gotas concêntricas de aproximadamente 5 cm de diâmetro, formando spots. Em seguida, o papel de filtro foi seco a temperatura ambiente por três horas e acondicionado em envelope comum devidamente identificado. As amostras foram enviadas ao Laboratório de Toxicologia da UFPA DETERMINAÇÃO DA PARASITEMIA Foi realizada a contagem de parasitos assexuados por 200 leucócitos. Na presença de menos de 10 parasitos, a contagem prosseguiu até 500 leucócitos. Por outro lado, se a contagem microscópica foi superior a 500 parasitos, sem ter atingido o número de 200 leucócitos, a mesma foi interrompida após a leitura do último campo. Para o cálculo da parasitemia foi utilizada a seguinte fórmula (OPAS, 2004): Densidade parasitária/mm 3 = número de parasitos contados/(100 campos) número de leucócitos contados

40 EXTRAÇÃO DE PQ E CPQ (Figura 8): A extração de PQ e de CPQ procedeu-se conforme esquema a seguir 1 - Os spots foram recortados com tesoura em pequenos pedaços em tamanhos mais ou menos uniformes e transferidos para tubos de polietileno tipo Falcon com capacidade de 15mL 2 - Adicionou-se 1.5mL de ácido clorídrico (HCL) 0.1N 3 - Os tubos foram submetidos ao homogeneizador BHS-300, Benfer, por 20 minutos 4 - Em seguida colocados em banho de ulta-som Q-335D, Quimis por uma hora 5 - Os spots foram retirados com auxílio de bastão de vidro 6 - Adicionou-se 0,5 mml de hidróxido de sódio (NaOH) 2M, 100µl de quinidina, Sigma, em concentração de 1µg/mL de metanol (padrão interno) e 6mL de éter metil terc butílico (Vetec) 7 - Os tubos foram agitados em vortex Q- 22ob1, Quimis, por 15 minutos 8 - centrifugados a 2000 rpm à 25 C, centrífuga 2K15, Sigma Laborzentrifugen ; por igual período 9 Por último a camada orgânica foi separada e evaporada em banho de água a 60 ºC Figura 8 Esquema de extração da PQ

41 QUANTIFICAÇÃO DE PQ E CPQ Realizada por cromatografia líquida de alta eficiência após prévia separação do sangue do papel de filtro e extração líquido-líquido dos analitos. Foram utilizados procedimentos previamente validados no Laboratório de Toxicologia da UFPA (Dua et al, 1996). Após extração, as amostras foram reconstituídas com fase móvel composta de acetonitrila 30% em solução aquosa de trietilamina 0,1%, ajustando o ph para 3,5 com ácido fosfórico a 50%, submetida à desgaseificação em ultra-som Q-335D, Quimis, por quinze minutos antes do uso. Foi utilizado cromatógrafo líquido de alta eficiência (Varian, USA), composto por uma bomba isocrática (PROSTART 300), injetor manual reodyne (Modelo 772i), com loop de 20uL, coluna de fase reversa (X- Terra): RP- 8, 15cm, 5µm e 4.6 mm de diâmetro interno (Waters, Saint Quentin-en-Y velines, France); pré-coluna: 2.1x 10mm; detector duplo canal ultravioleta (Modelo 320) e vísivel (PROSTAR 220). As condições instrumentais seguidas foram: pressão de 2350 psi, comprimento de onda de 254 nm e fluxo de 1 ml/min. Utilizou-se a Primaquina (Sigma ) e a Quinidina (Sigma ) como padrão interno, para determinação dos tempos de retenção. As amostras foram injetadas no CLAE em microseringa de 50µL, Hamilton. 4.3 Avaliação estatística A normalidade das variáveis foi avaliada pelo teste de Lilliefors. Os dados foram expressos como média e desvio padrão, e quando recomendado, como mediana e quartis. O teste do qui quadrado com correção de yates foi usado para comparar as variáveis qualitativas em ambos os grupos. Para comparar as concentrações de PQ e CPQ entre os dois grupos de estudo, alocados em função da dose, assim como do Grupo 2 realocado em função da resposta parasitológica, foi utilizado o teste t de student. As concentrações de PQ e CPQ foram compradas em cada grupo nos diversos dias de estudo pela ANOVA. O nível de significância aceito foi 5%. Para as análises estatísticas foi empregado o software Biostat v. 5.3.

42 Parecer da comissão de ética O estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FMTAM (ANEXO A), recebendo a aprovação número 937/2010. Os pacientes que aceitaram participar do mesmo, após o devido esclarecimento, assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (ANEXO B). Nenhum incentivo econômico foi oferecido aos sujeitos.

43 42 5 RESULTADOS 5.1 Características gerais dos pacientes Foram incluídos no Projeto Rede Malária da FMTAM/CNPQ 200 pacientes com diagnóstico de malária por P. vivax que preencheram os requisitos para inclusão. Destes, foram alocados de forma aleatória, 10 pacientes no grupo 01 e 28 no grupo 02. As características dos participantes por grupo de estudo estão apresentadas na Tabela 1. Tabela 1 - Características dos pacientes com malária vivax em uso de primaquina por grupo de estudo de acordo com o esquema terapêutico Grupos de estudo n Grupo 1 Primaquina(210mg) n Grupo 2 Primaquina(420mg) Gênero masculino, % 10 80* 28 71* Idade, anos 10 38(9) ** 28 40(12) ** Peso, Kg 10 69(12) ** 26 78(13) ** Hemácias, milhões/mm (1523) ** (1180) ** Densidade parasitária em D0, mm (2429) *** (4021) *** *X 2 <0.05 ** resultados expressos como média e desvio padrão *** resultados expressos como média e desvio padrão geométrico 5.2 Parâmetros de validação da metodologia analítica para determinação das concentrações de PQ e CPQ em sangue total por CLAE Os parâmetros de validação da metodologia analítica para determinação das concentrações de PQ e CPQ em sangue total foram: limite de detecção de 20ng/mL; limite de quantificação de 30ng/mL; recuperação média de 90%, 85% e 78% em concentrações de 60ng/mL, 240ng/mL e 422ng/mL; precisão intra ensaio nas mesmas concentrações usadas para o estudo de recuperação foram 90%, 88% e 92%. Os tempos de retenção da QN (padrão interno), PQ e CPQ foram 2,1; 4,2 e 9,5 minutos respectivamente (Figura 9). Não foram observadas interferência da cloroquina,

44 43 desetilcoroquina, quinina, acetaminofeno e dipirona. As concentrações de PQ e CPQ foram obtidas após plotagem da relação entre as áreas da amostra e do padrão interno em curva de calibração previamente elaborada contendo concentrações crescentes do fármaco e seu metabólito diluidas de maneira apropriada em sangue total de voluntários saudáveis as quais foram aplicados em papel de filtro (Tabela 2). Foram obtidos a equação da reta e o coeficiente de determinação. Os ensaios foram realizados em triplicata. Tabela 2 Curvas de calibração da primaquina e carboxiprimaquina em amostras de sangue total adicionada de concentrações crescentes do fármaco de interesse Relação área/ Relação área/padrão Primaquina Carboxiprimaquina Padrão Interno Interno de (ng/ml) (ng/ml) de Primaquina Carboxiprimaquina , Figura 9 Cromatograma das soluções padrões de quinidina (2.5µg/mL,) Primaquina (60ng/mL) e carboxiprimaquina (104ng/mL)

45 Determinação das concentrações de PQ, CQP e sua relação em sangue total As concentrações médias de PQ e CPQ de pacientes com malária vivax do grupo 1 estão apresentadas na Tabela 3, juntamente com a média da relação entre as concentrações do fármaco original e seu metabólito. A análise de variância (ANOVA one way) das concentrações de PQ entre os diferentes dias não indicou diferença significativa (F= 0,7658; p= 0,5159). Resultados semelhantes foram obtidos para CPQ (F= 0,2849; p= 0,7594) e para relação entre o fármaco original e seu principal metabólito (F= 0,1913; p= 0,8290). Tabela 3 - Concentrações médias de Primaquina (PQ) e Carboxiprimaquina (CPQ), e suas respectivas relações em diversos dias de estudos em pacientes com P. vivax tratados com dose total de 210mg de Primaquina em 14 dias Dia n PQ (ng/ml) X±d.p. CPQ (ng/ml) X±d.p. Relação PQ/CPQ X±d.p. D0 10 nd nd nd D (97) 88 (43) 2.4 (2.8) D (25) 90 (41) 1.4 (0.8) D (41) 109 (67) 2.6 (4.7) X±d.p. (média e desvio padrão) Nd Não detectado As concentrações médias de PQ e CPQ em pacientes com malária vivax do grupo 2, juntamente com as médias da relação entre as concentrações do fármaco original e seu metabólito estão apresentadas na Tabela 4. A análise de variância indicou que as concentrações de PQ foram semelhantes nos diferentes dias de estudo (Tabela 4). Entretanto, as concentrações de CPQ se apresentaram diferente (F= 9,9094; p= 0,0004). O teste de TUKEY indicou que a concentração média do metabólito foi maior em D7, quando comparada a D3 e a D14. A média da relação entra as concentrações de PQ e CPQ foi diferente entre os dias de estudo (F= 4,1648; p=0,0223). O teste de TUKEY indicou que a média da relação em D3 foi significativamente superior a D7 e D14.

46 45 Tabela 4 - Concentrações Médias de Primaquina (PQ) e Carboxiprimaquina (CPQ), e as respectivas relações, em diferentes dias de estudos em pacientes com P. vivax tratados com dose total de 420mg de Primaquina em 14 dias. PQ (ng/ml) CPQ (ng/ml) Dia n X±d.p. X±d.p. D0 28 nd nd nd Relação PQ/CPQ X±d.p. D (121) 84.5(60) 2.2(3.2) D (74) 219(133) 0.37(0.8) D (41) 108(71) 0.33(0.6) X±d.p. (média e desvio padrão) Nd Não detectado Para avaliar se a administração de doses diferentes exerceu efeito significativo sobre as concentrações sanguíneas de PQ, CPQ e da relação entre as concentrações destes dois compostos, efetuaram-se comparações entre grupos em cada dia de estudo. As concentrações médias de PQ mostraram-se semelhantes entre os grupos em D3 (t= -0,1827; p= 0,4282), D7 (t= -0, 4121; p=0,3423) e D14 (t= 1,1660; p=0,4853). Entretanto, as concentrações médias de CPQ em D7 (t= -3,5266; p=0,0011) se mostraram diferentes entre os grupos. De maneira semelhante, as médias da relação entre as concentrações de PQ e CPQ mostraram-se diferentes em D7 (t= 2,3819; p=0,0139). Durante o período de seguimento clínico laboratorial de 180 dias foi registrada a recorrência da parasitemia em 10 pacientes alocados no grupo 2. O tempo médio de recorrência parasitária foi 85 dias, com amplitude de 60 a 165 dias. Para avaliar se as concentrações sanguíneas de PQ, CPQ e a relação entre estes compostos se associaram a resposta parasitológica após seguimento de 180 dias, os pacientes do grupo 2 foram realocados em função da recorrência parasitária e as concentrações médias de PQ, CPQ e da relação entre compostos foram comparadas entre os grupos (Tabela 5).

47 46 Tabela 5 - Concentrações de Primaquina (PQ) e Carboxiprimaquina (CPQ), expressas em ng/ml de pacientes com Plasmodium vivax em uso de 420mg de primaquina em 14 dias, alocados de acordo com a recorrência da parasitemia ou cura após seguimento clínico-laboratorial de 180 dias. recorrência curados Dia PQ CPQ n n n Relação (ng/ml) (ng/ml) PQ/CPQ n PQ CPQ Relação n n (ng/ml) (ng/ml) PQ/CPQ D0 nd nd nd nd nd nd D (178) (44) (3.3) (95) 12 81(44) (3.3) D (23.8) 6 117(116) (1.2) (74) (116) (0.5) D14 1 nd** 2 nd** 1 nd 12 74(41) (27) (0.56) X±d.p. (média e desvio padrão) nd - Não determinado ** Não realizado pelo número insuficiente. Inicialmente foram feitas comparações entre as concentrações médias de PQ, CPQ e da relação entre estas concentrações em cada grupo de estudo. Nos pacientes com recorrência da infecção as médias das concentrações de PQ em D3 e D7 foram semelhantes (t= 1,9773; p=0,0059). Tal achado se justifica pelo reduzido tamanho amostral deste grupo, pois as concentrações em D3 foram cerca de quatro vezes superiores àquelas de D7. Entretanto, a média da concentração de CPQ foi significativamente superior em D7, quando comparada a D3 (t= -1,7319; p=0,05). Por fim, as médias das relações entre as concentrações em D3 e D7 foram semelhantes (t= 1,2266; p=0,1329). Nos indivíduos com resposta parasitológica adequada, a análise de variância das concentrações de PQ não indicou diferença significativa nos dias de estudo (F=2,4294; p=0,0995). Por outro lado, as concentrações de CPQ foram diferentes (F= 8,38; p= 0,0013). O teste de TUKEY indicou que as concentrações de CPQ em D7 foram significativamente superiores a D3 e D14. Por fim, as relações entre as concentrações de PQ e CPQ foram semelhantes nos diferentes dias de estudo (t=0,2076; p=0,4144). A seguir, as concentrações médias de PQ, CPQ e da relação entre estas foram comparadas em função da resposta terapêutica após seguimento clínico laboratorial. As médias das concentrações de PQ em D3 foram semelhantes nos dois grupos (t=1,4774; p=0,077). Já no D7, foram observadas concentrações médias significativamente superiores nos individuos curados (t= - 3,7663; p=0,0008), quando comparado aqueles com parasitemia durante o seguimento de 180 dias. As médias das concentrações de CPQ foram semelhantes entre os grupos em D3 (t= -0,1599;

48 47 p=0,4375) e em D7 (t= -0,9440; p=0,1796). As relações médias das concentrações de PQ e CPQ tambem foram semelhante entre os grupos em D3 (t=0.2076, p=0,4144) e em D7 (t=0,4992; p=0,3219). Resalta-se que não foram feitas comparações em D14, pela ausência de dados de pacientes com recorrência da infecção.

49 48 6 DISCUSSÃO A cloroquina e a primaquina são fármacos de primeira linha para tratamento da malária vivax nas áreas endêmicas espalhadas pelo mundo (WHO, 2010). Os relatos de falha terapêutica a esta associação são antigos, comuns e mundialmente distribuídos, inclusive na Amazônia brasileira. (CALVOSA, 2005). O aumento das falhas terapêuticas merece destaque nas investigações acerca da doença e suas determinantes, assim como, na proposição de novas abordagens de tratamento. Os estudos de efetividade e eficácia desta associação referiam-se principalmente à resistência do P. vivax a cloroquina, incluindo a descrição de mutações gênicas, dentre estas a Pfmdr1 e a compreensão dos mecanismos envolvidos na toxicidade ao sistema hematopoietico e outros efeitos adversos da PQ (BAIRD, 2009; CDC, 2014; FERNANDO, RODRIGO e RAJAPAKSE, 2011; PUKRITTAYAKAMEE et al, 2010). O estado da arte da resistência do P. vivax considera a participação da PQ, cuja diferença da intensidade de ação já foi documentada em diversas regiões, como no oeste da Indonésia e em Chesson, Nova Guiné, Colombia, Somália, África Oriental e Sudeste da Ásia. Um dos principais desafios na terapêutica da malária por P. vivax é alcançar a cura radical de forma efetiva e segura ao paciente, pois os relapsos repetidos dos hipnozoitas acarretam danos a saúde e ao desenvolvimento, especialmente nas crianças provocando anemia crônica e severa, mal nutrição, retardo de crescimento e abandono escolar (BAIRD, 2004; CDC, 2014; KIMBI et al, 2005; PUKRITTAYAKAMEE et al, 2010). Os autores são unânimes ao afirmarem que a principal determinante da eficácia terapêutica da PQ é a dose total administrada e não a duração do tratamento. Entretanto, ao se estabelecer a dose diária deve-se levar em conta a toxicidade ao sistema hematopoiético desta 8-aminoquinolina, especialmente nos indivíduos com deficiência de G6PD. Neste sentido, a OMS recomenda que o uso da PQ por até 14 dias, e a imediata retirada na ocorrência de hemólise. Entretanto, como o uso da PQ geralmente não é supervisionado, a adesão ao tratamento prolongado é limitada, comprometendo a efetividade do fármaco. (CDC,2014; WHO, 2010a). Vários estudos compararam a efetividade da PQ em diferentes doses e duração de tratamento (ABDON et al, 2001; DA SILVA et al, 1989; GRIETENS et al, 2010). Durand et al. (2014) relataram estudo clínico na Amazônia Peruana com 540

50 49 pacientes adultos e crianças com malária por P. vivax sintomática e expressão normal de G6PD, no qual foram comparados três esquemas terapêuticos: 150mg por 5 dias, 210mg por 7 dias e 210mg por 14 dias. Os pacientes receberam adicionalmente doses usuais de cloroquina. O risco de relapso após 180 dias de seguimento foi maior (28%) naqueles que receberam 150mg por 5 dias, corroborando relato anterior que indicou que dose total de 150mg é insuficiente para prevenir relapso de P. vivax (JOHN et al, 2012). Os demais grupos apresentaram risco menor e semelhante de relapso de 10.2% e 13.5%, respectivamente. Os autores também destacaram que o esquema de sete dias foi bem tolerado, assim como, não foram relatados efeitos adversos significativos e concluiram que a dose total de 210mg de PQ administrada 14 dias apresenta eficácia razoável com baixa taxa de relapso. Os casos de recorrência no seguimento foram creditados a nova infecção (DURAND et al, 2014). Por outro lado, foi demonstrado que a dose total de 210mg apresenta eficácia razoável em algumas áreas endêmicas e se associa à altas taxas de falência de tratamento, a exemplo, na Amazônia brasileira a dose total de 210mg de PQ durante sete dias foi associada a taxas de recorrência entre 26 a 40% durante seguimento de 180 dias (ORJUELA-SANCHEZ et al, 2009). Neste sentido, o guia para tratamento da malária (WHO, 2010a) passou a recomendar o uso de dose total de 420mg, assim como, sugeriu estudos adicionais para determinar a duração do tratamento, de forma a minimizar os eventuais efeitos adversos e assegurar a adesão. Recomenda também que a atividade da G6PD seja avalida nestes pacientes (WHO, 2010a). Frente a estes questionamentos, foi criada a "Rede Interdisciplinar de Pesquisa Clínica em Malária por Plasmodium vivax na Amazônia Brasileira: Farmacovigilância e Abordagem Clínico-Diagnóstica nos Estados do Amazonas, Pará, Amapá e Mato Grosso" (REDEMALARIA/CNPQ/FAPEAM), da qual este estudo se enquadra em um dos diversos objetivos específicos da rede, quer seja, comparar a eficácia e efetividade da PQ em doses diferentes de 210mg (grupo 01) e 420mg (grupo 02), administradas em 14 dias. Apesar da alteração na dinâmica de ocupação espacial da região, e consequente distribuição dos anofelinos, a doença permanece com característica ocupacional, predominando nos adultos do sexo masculino em idade produtiva, conforme demonstrado neste estudo, os quais apresentam maior risco de exposição ao vetor, ao se aproximarem dos seus criadouros que são comuns nas áreas de exploração dos recursos naturais, como metais nobres e madeira, para onde esses

51 50 indivíduos se deslocam, tornado-se patente o impacto social e econômico causado pela doença na região (CORDEIRO, FILOMENO e COSTA, 2002; GUERRA, SNOW e HAY, 2006). A malária por P.vivax cursa, via de regra, de forma assintomática nas áreas de elevada endemicidade, ou com sinais e sintomas clínicos comuns do acesso malárico, como febre, calafrios e sudorese. Em raros casos há agravamento do quadro clínico com evolução à óbito, que geralmente é acompanhado por hemólise aguda e edema pulmonar agudo. Os pacientes deste estudo foram incluidos voluntariamente e não apresentaram manifestações clínicas ou sinais de agravamento no decorrer do tratamento que justificasse sua exclusão. A densidade parasitária foi considerada baixa, incluindo daqueles que apresentaram recorrência, o que pode justificar a ausência de sintomatologia significativa no decorrer do tratamento (HARINASUTA e BUNNAG, 1998; WHO, 2010a). A persistência da parasitemia ou a recorrência em até 28 dias após início do tratamento na presença de concentrações de cloroquina e desetilcloquina superiores a 100ng/mL no sangue total indica resistência a cloroquina (BAIRD et al, 1997). Por outro lado, o retorno da parasitemia entre 45 a 60 dias, sugere relapso de hipnozoitas ou nova infecção nas áreas endêmicas (WHO, 2010a). Neste estudo, a recorrência da parasitemia em tempo médio de 85 dias, pode sugerir tanto a falta de eficácia terapêutica da primaquina, quanto nova infecção. Contudo, dois fatores contribuem para aumento da probabilidade de relapso; a) todos os pacientes do estudo foram oriundos de Manaus, área de baixo risco de transmissão e o período de seguimento de 180 dias coincidiu com a menor incidência da doença na cidade. b) os padrões de relapso no Brasil, ocorrem durante os primeiros seis meses após tratamento, corroborando o achado deste estudo, más admite-se a coexistência de hipnozitas com fenótipos de longo período de latência com aqueles de relapso frequente (BOULOS et al, 1991; ORJUELA-SÁNCHEZ et al, 2009). O conhecimento das concentrações sanguíneas de antimaláricos durante o tratamento é essencial para assegurar a adesão ao tratamento e auxiliar na caracterização da resistência da cepa infectante de Plasmodium. Foram determinadas as concentrações de PQ e de CPQ, por esta ser o principal produto de biotransformação da PQ, contudo desprovido de atividade antimalárica, a qual é devida aos derivados hidroxilados da PQ, entretanto sua determinação em fluidos biológicos é recomendada em razão da sua elevada meia vida biológica, quando

52 51 comparada a do fármaco original (BHATIA et al, 1986; FLETCHER et al, 1981, MIHALY et al, 1985). A PQ não apresenta concentração de referência para caracterização da adesão ou resistência, ao contrário da cloroquina, para qual o valor de 100ng/mL em amostra de sangue total em D28 é utilizado para caracterização da resistência ao fármaco (BAIRD e HOFFMAN, 2004). A eficácia da política de distribuição de antimaláricos pelos órgãos oficiais na região Amazônica pode ser caracterizada pela ausência de concentrações mensuráveis de PQ em D0. De maneira geral, no decorrer do tratamento as concentrações de PQ se assemelharam aquelas reportadas em voluntários saudáveis da Tailândia e em pacientes com malária vivax na India (MIHALY et al, 1985; FLETCHER et al, 1981). Flether et al. (1981), relataram teores médios de PQ em pacientes tailandeses do sexo masculino de 233ng/mL e nos caucasianos de 162ng/mL, após 2,5h da administração de 45mg de PQ por 5 dias; Por outro lado, Bangchang et al. (1994) relataram valores inferiores em pacientes tailandeses do sexo masculino, com concentração máxima de 57,7ng/mL e Kim et al. (2004) reportaram valores médios significativamente superiores em Coreanos com malária vivax. É reconhecida a variabilidade das concentrações de antimaláricos nos diferentes grupos populacionais, assim como, quanto ao gênero, idade, gravidez e obesidade. Neste estudo, o elevado desvio padrão das médias das concentrações de PQ e CPQ nos dois grupos nos diferentes dias caracteriza a elevada variabilidade inter individual nas concentrações do fármaco e do matabólito (KIM et al, 2004) A ausência de diferença significativa nas concentrações de PQ nos diferentes dias de estudos em cada grupo de doses diferentes evidencia sua reduzida meia vida biológica e ausência de acúmulo significativo. De fato, quando coadministrada com cloroquina, a PQ possui meia vida em torno de 6.6 ( ) horas. Por outro lado, as concentrações máximas de CPQ são alcançadas cerca de 8(4-12) horas após administração de PQ, e sua meia vida biológica é de 33.2 ( ) horas. A meia vida biológica do metabólito superior ao fármaco original foi evidenciada pelas concentrações significativamente elevadas de CPQ em D7, quando comparadas a D3 e D14, no grupo de maior dose. A relação entre PQ e CPQ foi influenciada pelo acúmulo diferenciados destas substâncias também apenas no grupo que recebeu 420mg em D3, a qual foi significativamente superior a D7 e D14 (PUKRITTAYAKAMEE et al, 2014). A ausência de diferença significativa entre as concentrações de PQ entre os dois grupos de doses em todos os dias de estudo, pode

53 52 ser creditado a sua meia vida biológica reduzida e ausência de acumulação significativa nos compartimentos orgânicos. Por outro lado, a média das concentrações de CPQ e a média da relação entre PQ e CPQ foram significativamente superiores em D7 no grupo que recebeu 420mg de PQ, corroborando desta forma, o perfil cinético do metabólito. Os pacientes que receberam dose total de 420mg foram realocados em dois subgrupos em função da resposta parasitológica durante 180 dias, a fim de associar as concentrações de PQ, CPQ e relação entre as concentrações no sangue total com o reaparecimento da parasitemia. As concentrações médias de PQ foram significativamente superiores em D7 nos pacientes curados, quando comparados aqueles os quais a doença recorreu. Já a CPQ e a relação entre o PQ e CPQ foram semelhantes no decorrer do estudo. Ao se avaliar a resposta parasitológica da PQ deve-se considerar o envolvimento dos produtos de biotransformação hidroxilados, como a 5-OH primaquina, responsáveis pela ação antimalárica e efeitos adversos do fármaco, assim como, é reconhecido o papel do CYP- 450 em especial a isoforma 3A4 na formação desses derivados, e vários estudos correlacionaram o genótipo de atividade da CYP-3A4 à recorrência parasitária. Portanto, a maior concentração de PQ em D7, provavelmente indica maior probabilidade de formação de derivados hidroxilados e consequentemente maior atividade farmacológica da PQ. Resssalte-se que em alguns pacientes com recorrência parasitária não foram encontrados níveis mensuráveis de PQ e seu metabólito em D14. Provavelmente a não adesão a todos os dias de tratamento justifica este achado, uma vez que, a taxa de não adesão ao tratamento com PQ na Amazônia brasileira foi estimada em aproximadamente 30%. (ALMEIDA, RODRUIGES e VIEIRA, 2014; BOWMAN et al, 2005; PYBUS et al, 2013; VASQUEZ-VIVAR e AUGUSTO, 1992). De maneira geral, os resultados deste estudo corroboram relatos prévios acerca da farmacocinética da PQ em diferentes grupos populacionais, nos quais foram demonstrados ausência de acúmulo significativo do fármaco em tecidos corporais em diferentes doses. Por outro lado, a diferença do perfil do principal metabólito ficou evidenciada nas duas doses utilizadas. Por fim as concentrações de PQ se associaram a resposta terapêutica apenas em D7. CONCLUSÃO

54 53 Os resultados deste estudo indicaram que: a) A malária por P. vivax na amazônia brasileira se relaciona as atividades ocupacionais, com maior incidência em indivíduos do gênero masculino na idade produtiva; b) O tempo médio de reaparecimento da parasitemia foi de 85 dias, sugerindo relapso ou nova infecção; c) Foi observada elevada variabilidade inter individual nas concentrações de primaquina e carboxiprimaquina em ambos os grupos; d) A primaquina não se acumulou nos pacientes dos dois grupos no decorrer do estudo. Entretanto, foi observada concentrações elevadas de carboxiprimaquina em D7 nos dois grupos; e) A relação entre o fármaco original e seu metabólito foi influenciada pelo perfil cinético diferenciados destas substâncias apenas no grupo 420mg em D3, a qual foi significativamente superior a D7 e D14; f) A dose total administrada não influenciou as concentrações sanguíneas de PQ. Por outro lado, as concentrações de CPQ e a relação entre o fármaco original e seu metabólito foram significativamente superiores no grupo que recebeu 420mg de PQ em D7. g) As concentrações de PQ associaram-se somente a resposta parasitológica em D7 ao fim de 180 dias de seguimento clínico laboratorial dos pacientes.

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72 ANEXO B - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido 71

73 72

74 73