Metabolismo de aminoácidos

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1 Aula de Bioquímica II Tema: Metabolismo de aminoácidos Prof. Dr. Júlio César Borges Depto. de Química e Física Molecular DQFM Instituto de Química de São Carlos IQSC Universidade de São Paulo USP borgesjc@iqsc.usp.br

2 Metabolismo do Nitrogênio Nitrogênio: para ser utilizado pelos animais, ele precisa ser fixado - Grande custo energético Reduzido de N 2 para NH 3 (amônia) - Somente algumas poucas bactérias de solo ou que vivem associadas a raízes de plantas podem converter N 2 a NH 3- Fixação de nitrogênio As rotas de biossíntese de aminoácido e nucleotídeos necessitam de nitrogênio na forma solúvel e reacional Amônia, aminoácidos e nucleotídeos são utilizados de forma econômica pela maioria dos organismos - Reciclagem menor custo energético - Excedente é eliminado na natureza Principais formas de excreção de N

3 Degradação oxidativa de Aminoácidos Energia metabólica gerada nos tecidos 1. Metabolismo dos carboidratos e lipídeos (~90%) 2. Metabolismo dos aminoácidos (~10%) - Derivados de proteínas endógenas e exógenas Carnívoros podem obter até 90% de energia proveniente de aminoácidos Herbívoros obtém apenas uma pequena fração de suas necessidades energéticas a partir dessa via Microrganismos retiram aminoácidos do ambiente e podem utilizá-lo como fonte de energia Plantas utilizado para biossíntese de proteínas. Raramente ou nunca oxidam aminoácidos Aminoácidos podem sofrer degradação oxidativa: 1. Dieta rica em proteínas excedente de aminoácidos podem ser catabolizados e virar gordura ou glicogênio 2. Durante o jejum ou diabetes mellitus proteínas são utilizadas como combustível 3. Protein turnover Durante a dinâmica normal de síntese e degradação das proteínas no organismo

4 Degradação das proteínas da dieta A digestão de proteínas pode ser dividida em fases 1º: Gástrica 2º: Pancreática 3º: Intestinal Estômago Gastrina HCl do suco gástrico elimina microrganismos e desnatura proteínas. O muco da mucosa gástrica protege da agressão do suco gástrico. A desnaturação torna as proteínas mais susceptíveis à hidrólise de proteases gástricas. Pepsinas são enzimas que são ativas em ph ácido. Pepsina é gerada a partir da pró-enzima pepsinogênio (remoção de 46 aminoácidos do NH 2 terminal), em ph abaixo de 2. Pepsina corta proteínas (em Phe, Trp e Tyr) em peptídeos menores e aminoácidos livres Intestino delgado A chegada do hidrolisado no Intestino induz a secreção de secretina e liberação de HCO 3- pelo pâncreas, neutraliza o ph no intestino delgado Secreção de colescitocinina induz a secreção de precursores de enzimas pancreáticas: Quimiotripsinogênio, Tripsinogênio e Procarboxipeptidase Enteropepdidase ativa o tripsinogênio em tripsina, esta ativa as outras pró-enzimas Carboxipeptidase e aminopeptidase hidrolisam os peptídeos em aminoácidos livres Os aminoácidos livres entram nos capilares sanguíneos das vilosidades e são transportados até o fígado.

5 Renovação de proteínas As proteínas estão em constante processo de degradação e síntese. - A concentração proteica geral mantém-se constante no indivíduo adulto e saudável. - Entretanto há grande variação na velocidade de degradação para cada proteína. - Os aminoácidos excedentes são oxidados e o N é excretado NH 3 é tóxico. Renovação Renovação de cerca de 400 g de proteínas/dia em um adulto com dieta adequada Eliminação de N correspondente a 100 g de proteína/dia Como 400 g são renovados, os 100 g eliminados devem ser repostos pela alimentação Aminoácidos em excesso não são armazenados para utilização futura e tampouco excretados São convertidos em intermediários metabólicos, como piruvato, oxalacetato, acetil-coenzima (Acetil-CoA) e α-cetoglutarato

6 Degradação das proteínas intracelulares Processo controlado para regular a fisiologia das células Proteínas regulatórias que tem sua concentração ajustada às variações de condições do organismo. Remoção de proteínas defeituosas, velhas, mal enoveladas, etc. Dois processos para a degradação intracelular de proteína: 1) Catepsinas: proteases de lisossomos. Atuam na degradação de proteínas de membrana, extracelulares e proteínas de meia-vida longa. 2) Proteólise mediada pelo sistema ubiquitina-proteassoma: processo mais geral que ocorre no citoplasma. A ubiquitina é uma proteína de 76 aminoácidos de organismos eucarióticos Encontrada livre ou covalentemente ligada a outras proteínas Proteína abundante e muito conservada evolutivamente Papel da adição de ubiquitina marcador para degradação de proteínas pelo proteossoma 26S

7 Degradação das proteínas intracelulares Principais alvos da via ubiquitina-proteossoma Proteínas velhas Proteínas mutantes Proteínas enoveladas erroneamente ou desnaturadas Reguladores de processos bioquímicos (proliferação, diferenciação, resposta inflamatória e imunológica) Doenças genéticas, neurogenerativas e tumores malignos são induzidos quando certos componentes desse sistema de degradação estão ausentes ou desregulados Ligação isopeptídica Envolve o grupo -NH 3+ da cadeia lateral da Lys

8 ¼ do total ¾ do total Visão geral da degradação de Aminoácidos Destino dos Aminoácidos 1) Unidades monoméricas para a biossíntese de proteínas 2) Metabolismo energético Oxidação dos aminoácidos 10-15% das necessidades energéticas 3) Precursores de compostos nitrogenados: heme, aminas biologicamente ativas, nucleotídeos e coenzimas (NADH)

9 Visão geral da degradação de Aminoácidos Ocorre em 2 etapas 1) Separação do grupo α-nh 3 do esqueleto carbônico gerando o α-cetoácido correspondente. 2) Cadeias laterais dos aminoácidos: oxidação por vias variadas. 20 cadeias carbônicas laterais são convertidas em compostos comuns do metabolismo dos carboidratos e lipídios Aminoácidos glicogênicos Aminoácidos cetogênicos

10 A maioria dos aminoácidos é metabolizado no fígado. O N 2 é abundante na atmosfera mas muito inerte para ser usado na maioria dos processos bioquímicos. A amônia gerada no fígado é reciclada é usada nas sínteses O destino do α-nh 3+ de Aminoácidos 4 aminoácidos tem papel central Glu, Gln, Asp, Ala prontamente convertidos em intermediários no ciclo de Krebs O excesso de NH 4 + é excretado. A amônia é tóxica para os animais As bases moleculares não são totalmente esclarecidas Em humanos, estágios finais de intoxicação leva a encefalopatia e coma Mudanças de ph celular Redução de intermediários de ciclo de Krebs Excesso de NH 3 leva a alcalinização de fluidos celulares

11 As Aminotransferases Reações de transaminação Transaminases específicas para cada aminoácido - Dependem de Pirodoxal-Pi PLP (vitamina B6 = pirodoxina) - Sofre transformações reversíveis entre as formas: PLP Piridoxamina-Pi Aminotransferases ou transaminases - Catalisam a transferência do α-nh 3+ dos aminoácidos para o α-cetoglutarato gerando Glutamato carreador de -NH 3+ para excreção ou reações bossintéticas

12 As Aminotransferases TRANSAMINAÇÃO Coleta de grupos α-nh 3+ de diferentes aminoácidos na forma de Glu Presentes no citossol e na mitocôndria Diferentes aminotransferases dentro das células - Muitas são específicas para α-cetoglutarato como aceptor de α-nh Em menor grau para oxalacetato Diferem na especificidade para aminoácido Reações reversíveis Mecanismo de reação comum mecanismo pingue-pongue

13 Reação geral de Transaminação Ping 1) O aminoácido se liga ao sítio ativo 2 Grupo amino é transferido ao piridoxal fosfato, que é convertido a piridoxamina-fosfato 3) Liberação do α-cetoácido Co-fator aminado Pong 4) Grupo amino é transferido para o α- cetoácido (α-cetoglutarato) 5) Formação do produto: Glu 6) Regenera a enzima

14 O destino do Glu no hepatócito Nos hepatócitos, Glu é transportado do citossol para a mitocôndria onde sofre: 1. Desaminação oxidativa ou 2. Transaminação Esses dois caminhos levam a produção de Asp e/ou amônia 1. Desaminação oxidativa do Glu com a liberação do íon amônio Glutamato desidrogenase (mitocondrial - fígado) Utiliza NAD + ou NADP + Regulada alostericamente: GTP (-) ADP (+) Além da Glu desidrogenase, não se conhece enzimas análogas para outros aminoácidos Isso significa que para ser retirado o grupo amino deve estar contido essencialmente no Glu

15 O destino do Glu no hepatócito Nos hepatócitos, Glu é transportado do citossol para a mitocôndria onde sofre: 1. Desaminação oxidativa ou 2. Transaminação Esses dois caminhos levam a produção de Asp e/ou amônia 2. Transaminação do Glu formando Asp (o segundo repositório de grupo α-nh 3+ dos aminoácidos) Aspartato aminotransferase (AST) Transaminase glutâmico-oxalacética (TGO) AST é a aminotransferase mais ativa na maioria dos tecidos de mamíferos

16 O destino do Glu no hepatócito A ação conjunta das transaminases (T) e da glutamato desidrogenase (GD) permite canalizar o nitrogênio da maioria dos aminoácidos para dois compostos: Asp e NH 4+ num processo chamado de transdeaminação. Excreção Indireta (ciclo da ureia) Excreção Direta ou indireta

17 Ala, Gln e Glu: Carreadores de -NH GLUTAMATO 2. GLUTAMINA 3. ALANINA Fígado (intracelular) Músculo e outros tecidos Músculo Piruvato Circuito GluGlnGlu O Glu e a Gln desempenham papel crucial no metabolismo do nitrogênio Como a NH 3 é tóxica e sua conversão em ureia ocorre no fígado, o NH 4+ produzido em outros tecidos é incorporado em compostos não tóxicos para serem transportados na circulação. No citosol de hepatócitos, α-nh 3+ da maioria de aminoácidos são transferidos para o α-cetoglutarato formando Glu Tecido periférico - Músculo e outros Plasma sanguíneo Tecido hepático O excesso de -NH 3+ gerado na maioria dos tecidos é convertida no grupo -NH 3+ da Gln para encaminhamento para o fígado

18 O papel de Ala, Gln e Glu Ciclo da Glicose-Alanina Ala atua como um transportador da NH 3 e piruvato do músculo (em atividade anaeróbica) até o fígado. Músculo e tecidos que degradam aminoácidos como combustível o grupo -NH 3+ como Glu. O grupo -NH 3+ do Glu pode ser transformado em Gln (via Gln-sintetase) e transportada para o fígado OU Transferido ao piruvato (produto da glicólise muscular) pela ação da Ala-aminotransferase Ala no fígado é convertida em Glu (ALT ou TGP) o qual pode entrar na mitocôndria e sob a ação da glutamato desidrogenase libera amônia O gasto energético da gliconeogênese é imposto somente ao fígado. O músculo precisa de todo ATP para a contração muscular. O N é excretado via UREIA ou usado na biossíntese O piruvato será empregado na produção de glicose, via gliconeogênese, que pode retornar ao músculo. - Ação complementar ao Lactato no Ciclo de Cori

19 O destino final do NH 3 em ureotélicos: Excreção na forma de ureia Animais terrestres necessitam de vias metabólicas para a excreção de N e diminuição da toxicidade da NH 3 e diminuição da perda de água Plantas reciclam essencialmente todos os grupos NH 3 e a excreção de N ocorrem em condições específicas Nos animais ureotélicos a NH 3 atinge a mitocôndria dos hepatócitos será convertida em UREIA Ciclo da UREIA ou ciclo Krebs-Henseleit (1932; 1 ciclo metabólico a ser descrito!!) No ciclo da UREIA um dos átomos de N é derivado do Asp, o outro é derivado do próprio NH 4+ livre. O átomo de C vem do bicarbonato (HCO 3- ) oriundo do metabolismo oxidativo. A UREIA, que tem alta solubilidade (~10-11 mol/l), atinge a circulação e chega aos rins onde é excretada na urina

20 O destino final do NH 3 em ureotélicos: Excreção O ciclo da ureia - Inicia na mitocôndria e termina no citoplasma - Requer lançadeiras Fase mitocondrial - Carbamoil-Pi-sintetase I - Ativa NH Isoenzima I comprometida com o ciclo da ureia - Isoforma II gera carbamoil-pi para síntese de pirimidinas no citoplasma Fase citoplasmática 1) Ornitina-transcabamoilase 2) Arginino-succinato-sintetase -Une Asp (oriundo da AST) com citrulina - Requer intermediário ativado com AMP 3) Arginino-sucninase - Única reação reversível do ciclo 4) Arginase - Hidrólise da Arg gerando Ureia e regenerando Ornitina

21 As reações de ativação Uso de ATP para ativar intermediários do ciclo de Krebs Gasto de energia para eliminar substância tóxica NH 4 +

22 O bi-ciclo de Krebs Interconexão do Ciclo da ureia e de Krebs Fumarato é metabólito comum em ambos os ciclos Depende de transporte de intermediários comuns entre mitocôndria e citoplasma Trocadores envolvidos: 1) Glu-Asp 2) Malato-α-cetoglutarato - Glu-OH - Isoenzimas mitocondriais e citoplasmáticas cuidam da interconversão de intermediários para o transporte por membranas por sistema lançadeira Sistema lançadeira Malato-Aspartato é responsável pelo encaminhamento de NADH gerado na via glicolítica no citoplasma para a mitocôndria (1) Argininosuccinato sintetase (2) Argininosuccinase (3) Fumarase (citossólica) (4) MDH (citossólica) (5) AST (citossólica)

23 Regulação do ciclo da ureia Regulação de curto prazo Regulação alostérica da carbamoil fosfato sintetase I - Estimulo por N-acetilglutamato (produzido a partir de condensação de glutamato e acetil- CoA pela N-acetilglutamato sintase). - A N- acetilglutamato sintase é ativada por arginina, que sinaliza acúmulo de intermediários do ciclo da ureia e excesso de NH A Arg adequa a velocidade de formação de NH 4 + a sua conversão em ureia. Regulação a longo prazo 1) A quantidade de ureia excretada em humanos é dependente da dieta - em condições alta ingestão proteica produção de ácidos graxos a partir dos α- cetoácidos correspondentes dos aminoácidos ingeridos. - em condições de jejum prolongado onde as cadeias carbônicas dos aminoácidos são utilizadas como precursores gliconeogênicos. Nessas condições há da síntese das enzimas do ciclo da ureia e da carbamoil fosfato sintetase I (elevação de cerca de 10 a 20 vezes). 2) Diminui em condições de dieta pobre em proteínas e rica em carboidratos e lipídios Redução da concentração das enzimas envolvidas no ciclo

24 Balanço energético A síntese de uma molécula de ureia consome 4 ligações Pi - 2 ATP para a síntese de carbamoil-pi - 2 equivalentes ATP: ativação citrulina em citruil-amp libera PPi Pirofosfatase alcalina hidroliza PPi em 2 Pi 2 NH HCO ATP H 2 O 1 ureia + 2 ADP Pi AMP H + O custo é substancialmente reduzindo pelo acoplamento do transporte de equivalentes redutor na forma de NADH para a mitocôndria pela lançadeira Malato-aspartato 1 NADH = 2,5 ATP na fosforilação oxidativa Hiperamonemia Depleção de intermediários do ciclo de Krebs e diminuição da taxa de oxidação da glicose vital para o tecido cerebral. - Alto consumo de α-cetoglutarato para a síntese de Glu. Comprometimento da transmissão do impulso nervoso e encefalopatia via ação exacerbada da transmissão GABAérgica alta [Glu]. Falhas genéticas ocasionam hiperamonemia ou aumento dos intermediários - Intolerância a dietas proteicas - Reações irreversíveis causam aumento dos intermediários do ciclo - Dieta deve ser suprida com os aminoácidos essenciais

25 VISÃO GERAL do metabolismo de NH 3 Principais vias do transporte de nitrogênio entre órgãos, após proteólise muscular Aminoácidos oriundos de proteólise intracelular ou da digestão - Grupo NH 3 é encaminhado via Ala ou Gln para o Fígado, gerando Glutamato - Ciclo da UREIA capta o NH 4- livre e NH 3 do Asp, ambos oriundos do Glutamato via glutamato desidrogenase e AST - Ureia e Gln são liberados na corrente sanguínea e excretados pelos Rins na urina - Rins tem Glutaminase gerando NH 4- livre e Glu Compostos nitrogenados excretados pelo homem Composto Quantidade excretada (g/dia) Ureia 30 NH 4 + 0,7 Creatinina 1,4 Ácido úrico 0,8

26 Degradação da cadeia carbônica dos aminoácidos Rende 10-15% da energia extraída pelo organismo Removido o grupo NH 3, resta o esqueleto carbônico do aminoácido na forma de α- cetoácido. As 20 cadeias carbônicas são oxidadas por vias próprias, porém convergem para 6 componentes do metabolismo: piruvato, acetil CoA, oxaloacetato, fumarato, α- cetoglutarato e succinato (4 últimos são intermediários do ciclo de Krebs). A partir desse ponto o metabolismo da cadeia carbônica dos aminoácidos confunde-se com o dos carboidratos ou ácidos graxos. Um mesmo aminoácido pode contribuir para diferentes componentes do metabolismo. O destino final do α-cetoácido depende do tecido e do estado fisiológico podendo ser: - Oxidado pelo ciclo de Krebs - Utilizado na Gliconeogênese - Conversão em triacilglicerol

27 O destino do esqueleto de C de Aminoácidos Aminoácidos cetogênicos - Corpos cetônicos - Ácidos graxos Aminoácidos glicogênicos - Gliconeogênese

28 Rearranjos químicos na degradação de cetoácidos Transaminação (transferência de grupo NH 3 ): coenzima piridoxal-fosfato Transferência de carbono auxiliada por 3 cofatores principais Transfere grupo metil (-CH 3 ) Transfere CO 2 Transfere grupo: -CH 3, -CH 2 OH e -COH

29 6 Aminoácidos convertidos, total ou parcialmente, em piruvato Treonina Serina Alanina Glicina Cisteína Triptofano Piruvato pode ser convertido em Acetil-CoA e oxidado no ciclo de Krebs, usado para gliconeogênese via oxaloacetado ou para síntese de ácidos graxos

30 7 Aminoácidos convertidos, totalmente ou parcialmente, em Acetil-CoA Triptofano Lisina Fenilalanina Tirosina Leucina Isoleucina Treonina Trp é precursor de Serotonina, Niacina e outros Tyr é precursor de melanina Falhas genéticas na degradação da Phe pode causar fenilcetonúria

31 5 Aminoácidos convertidos em α- cetoglutarato Prolina Glutamina Glutamato Arginina Histidina

32 4 Aminoácidos convertidos em Succnil-CoA Metionina Treonina Isoleucina Valina 2 Aminoácidos convertidos em Oxaloacetado Asparagina e Aspartato

33 Os Aminoácidos de cadeia ramificada não são degradados no Fígado Leucina Isoleucina Valina Sofrem transaminação e descarboxilação oxidativa por enzimas específicas no tecido periférico

34 A origem do Nitrogênio das moléculas orgânicas Os organismos apresentam dependência variada do meio ambiente com relação ao suprimento de aminoácidos A principal fonte de nitrogênio para os seres vivos é o N 2 atmosférico - Diferentemente do O 2, o N 2 é um gás pouco reativo Para ser assimilado pelas células, o N 2 precisa ser convertido em NH 3 - Processo chamado de Fixação de nitrogênio 30-40% são fixados por: - Processo naturais, não biológicos como descargas elétricas (raios) e radiação UV (10-15%) - Processos industriais (fertilizantes) (25%) processo Haber-Bosch: ~10% da energia industrial mundial

35 A origem do Nitrogênio das moléculas orgânicas Fixação de nitrogênio 60-70% do nitrogênio disponível para os seres vivos são fixados por bactérias - bactérias fixadoras de N 2 compreendem um grande número de espécies que habitam os mais diversos nichos ecológicos (solo, oceano, rios, etc.) Vegetais e muitas bactérias conseguem sintetizar todos os aminoácidos sendo o grupo NH 3 + obtido a partir de NH 3 e a cadeia carbônica a partir de carboidratos As bactérias, produzem um excesso de NH 3 que é liberado para o solo. Bactérias da família Rhizobiaceae invadem as raízes de leguninosas, induzindo a formação de nódulos complexos, responsáveis pela fixação do nitrogênio. Bactérias endofíticas como as do gênero Burkholderia ganham acesso ao sistema vascular de não-leguminosas como gramíneas (milho, arroz, gramas, etc) Bactérias de vida livre como Azobacter A fixação por simbiose é mais eficiente que a realizada por bactérias de vida livre.

36 A origem do Nitrogênio das moléculas orgânicas Fixação de nitrogênio Bactérias de dois gêneros e convertem NH 3 em nitratos e nitritos Plantas (em geral) e bactérias são capazes de converter NO 2 - e NO 3- em NH 3. Porém, ANIMAIS tem que obter, a partir dos aminoácidos, TODO o N para a síntese de suas macromoléculas nitrogenadas A quantidade total anual de nitrogênio fixado excede Kg. Setas vermelhas indicam reações que em sua maior parte ocorrem em ambientes anaeróbios.

37 Redução de Nitrato e Nitrito

38 Nitrogenase: a maquinaria de fixação de N A nitrogenase é a enzima que N 2 a amónia (NH 3 ) Duas proteínas: Dinitrogenase (propriamente dita Tetrâmero α 2 β 2 ): cujo sítio ativo é composto por um centro de ferro-molibdénio (FeMo) Componente I. Dinitrogenase redutase: proteína de ferro-enxofre contendo centros de ferro-enxofre (FeS) do tipo [4Fe-4S] Componente II. Canalizador de e para o cofator FeMo. Seria capaz de sofrer oxirredução multi-eletrônica ou seriada Local onde o N 2 é reduzido

39 Nitrogenase: a maquinaria de fixação de N Na conversão de N 2 a NH 3, a ligação tripla do tem de ser (pelo menos parcialmente) quebrada, sendo este processo energeticamente custoso. 8 e H + + N ATP + 16 H 2 O 1 2 NH 3 + H ADP + 16 P i 1) O centro [4Fe-4S] 2+, recebe um e do doador eletrônico (por ex, ferredoxina), convertendo-se na forma reduzida [4Fe-4S] + ; 2) ATP liga-se ao Componente II, induzindo uma alteração na sua conformação estrutural; 3) Componente II associa-se ao Componente I, ocorrendo hidrólise simultânea do ATP a ADP e transferência do e do centro [4Fe-4S] + para o centro P do componente I; 4) Ocorre dissociação das duas proteínas e liberação de ADP do Componente I; 5) O componente I utiliza o e recebido num dos passos catalíticos de redução do N /4 5

40 8x Nitrogenase: a maquinaria de fixação de N Reação seriada

41 Nitrogenase: a maquinaria de fixação de N Reação seriada Dissociação entre componente II e componente I não mostrado. Componente II Dinitrogenase redutase Componente I Dinitrogenase Próton é entregue (1 a 1) por uma rede de transferência de moléculas de água

42 A amônia é incorporada em Glu e Gln A amônia é, primeiramente, incorporada em Glu e Gln - os coletores de grupos amino, sendo, então, utilizados para a síntese dos demais aminoácidos. - Bactérias como E. coli sintetizam os 20 aminoácidos - Humanos sintetizam apenas 11 dos 20 aminoácidos - Os demais 9 aminoácidos são denominados AMINOÁCIDOS ESSENCIAIS que devem ser obtidos da dieta. Tyr e Cys, apesar de serem considerados não essenciais, são sintetizados a partir de aminoácidos essenciais obtidos da dieta.

43 Síntese de aminoácidos Os aminoácidos não essenciais são sintetizados por reações bem simples, enquanto as vias para formação dos essenciais são bem complexas Precursores da biossíntese dos 11 aminoácidos não essenciais no organismo humano Precursor de átomos de C O nitrogênio entra nessas vias à partir do glutamato e glutamina

44 Precursores da biosíntese de aminoácidos em plantas e bactérias Os aminoácidos são derivados de intermediários do ciclo de Krebs, da glicólise ou da via das pentoses fosfato