NAYARA PEREIRA SOARES

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1 1 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DESENVOLVIMENTO E INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM MEDICAMENTOS NAYARA PEREIRA SOARES AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE EM MULHERES COM SÍNDROME DOS OVÁRIOS POLICÍSTICOS: IMPACTO DA DIETA Natal, RN 2015

2 2 NAYARA PEREIRA SOARES AVALIAÇÃO GENOTOXICIDADE EM MULHERES COM SÍNDROME DOS OVÁRIOS POLICÍSTICOS: IMPACTO DA DIETA Tese apresentada ao programa de pós-graduação em desenvolvimento e inovação tecnológica em medicamentos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisitos para obtenção do título de doutor. Área de concentração: ensaios pré-clínicos e clínicos Orientadora: Profa. Dra. Telma Maria Araújo Moura Lemos Natal, RN 2015

3 Catalogação da Publicação na Fonte Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Soares, Nayara Pereira. Avaliação da genotoxicidade em mulheres com síndrome dos ovários policísticos: impacto da dieta / Nayara Pereira Soares. - Natal, f: il. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Telma Maria Araújo Moura Lemos. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. 1. Dano de DNA - Tese. 2. Dieta - Tese. 3. Obesidade - Tese. 4. Síndrome dos Ovários Policísticos - Tese. I. Lemos, Telma Maria Araújo Moura. II. Título.

4 3 NAYARA PEREIRA SOARES AVALIAÇÃO GENOTOXICIDADE EM MULHERES COM SÍNDROME DOS OVÁRIOS POLICÍSTICOS: IMPACTO DA DIETA Tese apresentada ao programa de pós-graduação em desenvolvimento e inovação tecnológica em medicamentos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de doutor. BANCA EXAMINADORA

5 4 DEDICATÓRIA A Deus, o condutor dos meus passos, o dono dos meus sonhos e a razão das minhas escolhas. A minha família, meu pai Eliseu e minha mãe Rozilene, exemplos de humildade, com os quais aprendi que a melhor herança a ser deixada é a educação. A meu irmão, Ernandy, minha cunhada Caroline e minha sobrinha Yasmin. Obrigada por nossa família, amo vocês. A meu namorado, Wober Ronand, que compartilhou as lágrimas e os sorrisos dessa jornada. Deus nos conduza a eternidade! Aos familiares, vovó Irene, tios, tias e primos, da família Soares e da família Pereira, vocês são uma linda escolha de Deus para minha vida. Aos amigos, tesouros encontrados nos mais variados tempos da vida, a jornada tem mais sorrisos com cada um de vocês!

6 5 AGRADECIMENTOS A Prof a. Telma Maria de Araujo Moura Lemos, pelas oportunidades de crescimento e por acreditar que eu seria capaz de corresponder ao trabalho. Agradeço também a toda a sua família, no nome de sua mãe, Dona Juraci, que admiro a garra e que muito me ajudou nos tempos difíceis. Muito obrigada por tudo! A Ana Celly Souza Santos e Carolina Minnicelli, amigas e companheiras de laboratório, de trabalho, de risadas e de muitas lutas. Formamos uma equipe feliz e vencedora. Sem vocês, o caminho não teria sido tão prazeroso. Ao casal Décio e Adriana, companheiros de aventuras acadêmicas, desde a seleção do doutorado, amigos leais, nós conseguimos! Ao Prof. George Dantas de Azevedo, pela parceria e incentivo na execução do trabalho. Ao Prof. Eduardo Caldas Costa, pelos ensinamentos, pela confiança e pelo apoio na elaboração dos artigos, além das valiosas contribuições na banca de qualificação. A Prof a Dr a. Debora Damasceno e toda a equipe do Laboratório de Pesquisa Experimental em Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de Botucatu, em especial a Rafael Bottaro Gelaleti e Aline de Oliveira Netto, pela colaboração nas análises de genotoxicidade. A todos os funcionários e bolsistas do Laboratório de Análises Clínicas e Toxicológicas e do Laboratório de Biologia Molecular, pelo apoio na realização de muitas etapas do trabalho. A todos os coordenadores, professores, alunos, funcionários e amigos do PPg- DITM, pela oportunidade de aprendizados e descobertas. A Prof a Adriana Augusto de Rezende, por todo apoio e incentivo em muitos momentos da jornada e por suas contribuições na banca de qualificação, obrigada! Aos demais professores que contribuíram na banca de qualificação, Ana Paula Fayh, pela sua colaboração nas discussões dos aspectos nutricionais e pela atenção dedicada no pouco tempo de convivência. E a Melina Bezerra Loureiro, suas observações foram importantes para os ajustes necessários no trabalho. E, em especial, a todas as voluntárias do trabalho, especialmente as mulheres com SOP. A disponibilidade e dedicação de cada uma de vocês propocionaram mudanças em suas saúdes e na minha vida. Obrigada!

7 6 O bonito não é realizar o nosso próprio sonho, mas realizar o sonho de Deus. Monsenhor Jonas Abib

8 7 RESUMO Avaliação da genotoxicidade em mulheres com Síndrome dos Ovários Policísticos: Impacto da dieta. Introdução: Síndrome dos Ovários Policísticos (SOP), segundo o critério de Rotterdam, está presente em 6-12% das mulheres em idade reprodutiva, é caracterizada pelo hiperandrogenismo, resistência à insulina (RI) e por seu estado inflamatório, fatores comumente exacerbados pela presença da obesidade e associados com o aumento da genotoxicidade. Alimentação saudável com implicação na perda de peso atua restabelecendo as funções reprodutivas e metabólicas na SOP, entretanto sua influência na redução da genotoxicidade é desconhecida. Objetivos: investigar se existem diferenças entre os marcadores de genotoxicidade e de risco cardiometabólicos em mulheres com SOP e controle, e avaliar a efetividade da intervenção dietética nos marcadores de genotoxicidade e de risco cardiometabólicos em mulheres com SOP sobrepeso ou obesas. Metodologia: as participantes tinham faixa etária entre 18 e 35 anos. No primeiro estudo transversal foram incluídas 27 mulheres com diagnóstico de SOP e 20 controles que tiveram seus marcadores antropométricos, hormonais, bioquímicos e inflamatórios avaliados, além da genotoxicidade. O segundo estudo foi um ensaio clínico de intervenção dietética, com dieta de restrição calórica de 500 Kcal/dia por 12 semanas com 22 mulheres com SOP sobrepeso ou obesas. Dados antropométricos, de consumo alimentar, hormonais e bioquímicos foram avaliados e a genotoxicidade, de ambos os estudos, foi verificada pelo teste do cometa. Resultados: não houve diferenças significativas entre o marcador de genotoxicidade tail intensity (p= 0,18), tail moment (p= 0,76) e tail length ( p=0,109) na SOP quando comparado ao grupo controle. Mulheres com SOP apresentam um pior perfil de risco cardiometabólico. A intervenção dietética reduziu os marcadores genotoxicidade: tail intensity (24,35 ± 5,86 pré-dieta vs. 17,15 ± 5,04 -pos-dieta) e tail moment (20,47 ± 7,85 pré-dieta vs. 14,13 ± 6,29 -pós-dieta) com p =0,001 para ambos os marcadores. Sem diferenças no tail length (p=0,07). Provocou também a perda de peso (3,5%) e redução dos marcadores de risco cardiometabólicos, como a RI e o hiperandrogenismo. Conclusão: mulheres com SOP apresentam pior perfil de risco cardiometabólico comparado com mulheres controles, entretanto genotoxicidade semelhante. A intervenção dietética reduz a genotoxicidade de mulheres com SOP sobrepeso ou obesas, assim como reduz os fatores de risco cardiometabólicos. Palavras-chave: Dieta, Dano de DNA, Síndrome dos Ovários Policísticos, sobrepeso, obesidade.

9 8 ABSTRACT Genotoxicity evaluation in women with Polycystic Ovary Syndrome: Diet Impact Introduction: Polycystic Ovary Syndrome (PCOS), present in 6-12% of women of reproductive age, the criterion of Rotterdam, is characterized by hyperandrogenism, insulin resistance (IR) and its inflammatory state, exacerbated by obesity and factors associated with the increase in damage DNA. Weight loss, combined with healthy eating, acts restoring the reproductive and metabolic functions in the SOP, though its influence in reducing DNA damage in PCOS are unknown. Aim: To investigate whether there are differences between DNA damage markers and factors of cardiometabolic risk in women with PCOS and control, and evaluate the effectiveness of nutritional intervention in DNA damage markers and cardiometabolic risk markers in overweight and obese women with PCOS. Methods: the study was conducted in two studies and the participants were aged between 18 and 35 years. In the first study, a prospective case-control, were included 27 women diagnosed with PCOS and 20 controls. In the second study, clinical trial of nutritional intervention with 12-week calorie-restricted diet 500Kcal / day. The genotoxicity, DNA damage (intensity tail, tail moment and tail length) was evaluated by the comet assay. Anthropometric data, dietary intake, hormonal, biochemical and inflammatory were evaluated in different studies. Results: there was no significant difference between the DNA damage marker tail intensity (p = 0.18), tail moment (p = 0.76) and tail length (p = 0.109) in PCOS when compared to the control group. Data after nutritional intervention in PCOS women with overweight and obesity showed a decrease in DNA damage markers: tail intensity (24.35 ± pre-diet vs ± Post-diet) and tail moment (20.47 ± prediet vs ± post-diet) (p <0.001). Reduction of weight (3.5%) and decreased cardiometabolic markers IR and hyperandrogenism. Conclusion: women with PCOS have a worse cardiometabolic risk profile compared to control however similar genotoxicity identified by DNA damage. Nutritional intervention reduced the genotoxicity of overweight and obese women with PCOS, and reduce the factors of cardiometabolic risk. Key-words: Diet; DNA damage; Polycystic Ovary Syndrome; overweight; obesity.

10 9 LISTA DE FIGURAS Figura 1- Delineamento experimental das avaliações realizadas na tese...26 Figura 2- Escore semi-quantitativo de Ferriman e Gallwey modificado...27 Figura 3- Cometa representando o dano de DNA visualizado por microscópio de fluorescência...31 Figura 4- Acompanhamento da intervenção dietética nas mulheres com SOP e sobrepeso ou obesidade...33 Figura 5- Diferenças entre os marcadores de Tail intensity, Tail moment e Tail Length em mulheres com e sem SOP estratificado pelo índice de massa corporal, nas figuras A, B e C...36 Figura 6- Fluxograma dos pacientes durante o estudo II...37 Figura 7- Dano de DNA em mulheres com sobrepeso/obesidade com síndrome dos ovários policísticos, antes e após a intervenção dietética (n=22)...41 Figura 8- Regressão logística múltipla com progesterona e QUICK no modelo explicativo da variação dos danos de DNA medido pelo tail intensity...42

11 10 LISTA DE TABELAS Tabela 1- Classificação do estado nutricional por meio do índice de massa corporal (IMC) e do risco de complicações metabólicas pela circunferência da cintura(cc)...28 Tabela 2- Tabela 2- Valores de referência para marcadores hormonais, bioquímicos e inflamatórios...29 Tabela 3- Equação proposta pela FAO/OMS (2001) para calculo da taxa metabólica basal...33 Tabela 4- Marcadores clínicos, hormonais, metabólicos e inflamatórios de mulheres com SOP e controle saudável Tabela 5- Indicadores antropométricos e sinais clínicos da Síndrome dos Ovários Policísticos...38 Tabela 6- Consumo alimentar antes e no final da intervenção dietética de 12 semanas em mulheres com sobrepeso e obesas com síndrome dos ovários policísticos...39 Tabela 7- Avaliação antropométrica, hormonal, metabólica e inflamatória após a intervenção com a dieta em mulheres com síndrome dos ovários policísticos...40

12 11 LISTA DE ABREVIAÇÕES AC- aberrações cromossómicas ADA- American Diabetes Association AES-PCOS Society the androgen excess and PCOS society AGEs- agentes de glicação avançada AGS- ácido graxo saturado AMDR= acceptable macronutrient distribution CC circunferência de cintura CG- carga glicêmica CHO- carboidrato COL- colesterol CT- colesterol total DCV doença cardiovascular DHEAS- dehidroepiandrosterona sulfato DM2 diabetes mellitus tipo 2 DMSO- dimetilsulfoxido DNA- ácido desoxirribonucléico DRI- Dietary Reference Intakes EROs- espécies reativas de oxigênio EUA- estados unidos da américa FIB- fibra FL- folato FSH hormônio folículo estimulante HAS hipertensão arterial sistêmica HDL lipoproteína de alta densidade HOMA-IR homeostasis model assessment insulin resistance HUOL Hospital Universitário Onofre Lopes hscrp- proteína C reativa ultrassensível IL-6 interleucina 6 IMC índice de massa corporal IG- índice glicêmico kcal quilocalorias LAPGO- Laboratório de Pesquisa Experimental em Ginecologia e Obstetrícia LDL lipoproteína de baixa densidade LH hormônio luteinizante LIP- lipídios MEJC- Maternidade Escola Januário Cicco Na- sódio NAF- Nível de atividade física NEE- necessidades energéticas estimadas NIH National Institute of Health OHdG- hidroxideoxiguanosina OMS Organização Mundial da Saúde PBS- phosphate buffered saline PCR-proteína c reativa PNT- proteína QUICKI- Quantitative insulin sensitivity check index RI resistência à insulina

13 R24h- recordatórios de 24 horas RN-Rio Grande do Norte SCGE- Cell Gel Eletrophoresis Assay SM síndrome metabólica SHBG proteína ligadora de hormônio sexual SOP síndrome dos ovários policísticos SPSS-statistical package for the social sciences TCLE- termo de consentimento livre e esclarecido TMB- taxa metabólica basal TG- triglicerídeos TNF-α fator de necrose tumoral alfa TI- tail intensite TM- tail moment TL- tail length UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte Vs. versus VCT- valor calórico total WHO- world organization health 12

14 13 Sumário 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Síndrome dos Ovários Policísticos e suas manifestações clínicas Síndrome dos Ovários Policísticos e suas alterações cardiometabólicas Genotoxicidade e Síndrome dos Ovários Policísticos Aspectos nutricionais e sua relação com a genotoxicidade na Síndrome dos Ovários Policísticos OBJETIVOS Objetivo Geral Objetivos Específicos MATERIAIS E MÉTODOS Casuística Desenho Experimental Coleta de dados Avaliação Antropométrica Ensaios Hormonais e Bioquímicos Avaliação da Genotoxicidade - Teste do Cometa Preparo das lâminas Preparo das amostras sanguíneas e confecção das lâminas Eletroforese e Coloração Análise das lâminas Aspectos Nutricionais Consumo alimentar Protocolo de Intervenção Dietética Análise estatística dos dados RESULTADOS Avaliações dos marcadores cardiometabólicos e de genotoxicidade em mulheres com SOP e controles saudáveis Impacto da intervenção dietética nos marcadores de risco cardiometabólicos e na genotoxicidade de mulheres com SOP sobrepeso ou obesas DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERENCIAS... 53

15 14 ANEXOS ANEXO A Aprovação do comitê de ética em pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes ANEXO B Tampões e soluções ANEXO C Carta de submissão à revista: Annals of Nutrition and Metabolism APÊNDICE A Formulário de pesquisa para coleta de dados clínicos APÊNDICE B Artigo submetido na Annals of Nutrition and Metabolism... 71

16 15 1. INTRODUÇÃO A Síndrome dos Ovários Policísticos (SOP) é um distúrbio endócrino complexo de etiologia desconhecida e caráter multifatorial, que acomete atualmente de 6-12% das mulheres em idade reprodutiva. Por ser caracterizada por anovulação crônica, presença de ovários micropolicísticos e hiperandrogenismo, a SOP é considerada a principal causa de infertilidade entre as mulheres em idade reprodutiva (EHRMANN, 2005; MARCH et. al., 2010). Além das características inerentes ao seu diagnóstico, a SOP está associada a diversas condições de risco cardiometabólicos (WILD et al., 2010). Trabalhos publicados nos últimos dez anos pelo nosso grupo de pesquisa relatam aumento na prevalência de síndrome metabólica (SM) (SOARES et al., 2008), obesidade, principalmente central, (COSTA et al., 2010), hipertensão arterial sistêmica (HAS) (AZEVEDO et al., 2011), alteração na função autonômica cardíaca (SÁ et al., 2011), maior risco de desenvolver diabetes mellitus tipo 2 (DM2) (PONTES et al.,2012) e, recentemente, a descoberta do aumento da inflamação de baixo grau, independente do estado nutricional (SANTOS et al., 2014) e alterações degenerativas na retina (DE SOUZA-JÚNIOR et al., 2015) em mulheres com SOP quando comparadas a mulheres sem a síndrome. As alterações metabólicas e reprodutivas da SOP também estão associadas ao aumento do estresse oxidativo (LIU et al., 2010) e, consequentemente, aumento na instabilidade genômica, o que aumenta o risco de eventos mutagênicos e carcinogênicos, tornando a síndrome um agente genotóxico ao organismo dessas mulheres ( MORAN et al., 2008, CHITTENDEN et al., 2009). A obesidade está presente em 38-88% das mulheres com SOP e atua como fator determinante para ampliação das características inerentes a doença, como o hiperandrogenismo e as alterações metabólicas e cardiovasculares (COSTA et al., 2012), além te ter sido associada com o aumento na instabilidade genômica, tanto na SOP (YESILADA et al; 2006) como na população com obesidade e sem a síndrome (DOMNEZ-ALTUNTAS et al., 2014).

17 16 A modificação do estilo de vida, com dieta saudável e prática de atividade física, é a terapêutica de primeira linha para mulheres com SOP, principalmente com sobrepeso e obesidade (WILD et al., 2010). Trabalhos com diferentes padrões de dieta para essas mulheres evidenciaram que uma pequena redução do peso (aproximadamente de 5%), por meio de intervenções dietéticas de curto prazo (quatro a oito semanas) promove redução no hiperandrogenismo, assim como nas alterações metabólicas, como a RI e inflamação, provocando melhoras na fertilidade nessas mulheres (MEHRABANI et al., 2012; MORAN et al., 2013; PANIDIS et al., 2013). Na população em geral a perda de peso, associada a padrões dietéticos saudáveis, também foram associados à redução das lesões ao DNA (FENECH, 2005). No entanto, em nossos conhecimentos, a relação da dieta e perda de peso com alterações na genotoxicidade em mulheres com SOP é desconhecida. Assim, com esse trabalho, buscamos primeiramente avaliar se existem diferenças nos marcadores de genotoxicidade entre mulheres SOP e controles saudáveis, assim como nos fatores de risco cardiometabólicos. Também procuramos investigar se a intervenção dietética proposta poderia contribuir para redução dos marcadores de genotoxicidade e risco cardiometabólico nas mulheres SOP com sobrepeso e obesidade.

18 17 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Síndrome dos Ovários Policísticos e suas manifestações clínicas A Síndrome dos Ovários Policísticos (SOP) é um distúrbio endocrinológico, heterogêneo, de etiologia desconhecida e alta variação fenotípica (FAUSER et al., 2012), descrita pela primeira vez na literatura médica por Stein e Leventhal, em 1935, em seus relatos sobre a associação entre ovários policísticos, amenorreia, hirsutismo e obesidade. Atualmente, acredita-se que o aparecimento da SOP esteja associado a fatores de origem genética, com genes envolvidos na via de sinalização da insulina e/ou na biossíntese e regulação de androgênios (XU et al., 2011) e fatores ambientais, como alimentação e estilo de vida (GOODARZI et al., 2011). No entanto, como esses fatores interagem resultando no quadro patológico da síndrome ainda não está totalmente elucidada. Estudos na SOP têm merecido especial atenção nos últimos anos, principalmente por sua considerável prevalência mundial, chegando a atingir 12% da população feminina em idade fértil, o que determina sua forte influência sobre a saúde dessas mulheres, tanto física (BAIRD et al., 2012) quanto emocional (VELTMAN- VERHULST et al., 2012). No Brasil, o panorama é similar ao relatado mundialmente, com diagnóstico da síndrome em 13% das mulheres, evidenciada, também, pela presença de anovulação e do hiperandrogenismo (PONTES et al., 2012). É importante ressaltar que essa prevalência é variável, pois depende dos critérios estabelecidos para o diagnóstico da doença. Em 1990, foi realizada a National Institute of Health Conference, conferência que buscou a primeira padronização dos critérios de diagnóstico da SOP, sendo os mesmos atualizados em 2004, pela publicação do Consenso de Rotterdam realizado pela European Society of Human Reproduction and Embryology/ American Society of Reproductive Medicine (ESHRE/ASRM) e, posteriormente, pelas diretrizes da Androgen Excess and PCOS Society (AES-PCOS) em 2006, sugerindo que a definição da SOP deverá incluir pelo menos dois dos três seguintes critérios: (a) oligo e/ou anovulação, (b) sinais clínicos e/ou bioquímicos de hiperandrogenismo e (c) ovários policísticos na ultra-sonografia e exclusão de doenças relacionadas a distúrbios endócrinos (ROTTERDAM, 2004).

19 18 O hiperandrogenismo, presente em 50% dos casos da doença (LEGRO et al., 2013), é o termo utilizado para descrever os sinais clínicos e/ou bioquímicos, decorrentes do aumento da ação biológica dos andrógenos no organismo (AZZIZ et al., 2009). Este pode ser classificado como idiopático, quando existe a presença de características clínica e ausência das alterações bioquímicas, e ainda hiperandrogenismo oculto, quando existe a ausência de características clínica e presença de alterações bioquímicas (AZZIZ et al., 2006; GOODMAN et al., 2001). Essas alterações hormonais são responsáveis pelo quadro clínico da SOP manifestado pelas anormalidades menstruais, hirsutismo, acne, alopecia e infertilidade, causada, principalmente, por anovulação (YARAK et al.,2005; ROMANO et al., 2011). Cerca de 70% das portadoras de SOP são anovulatórias, com anormalidades menstruais que variam de oligomenorréia (< 8 ciclos/anos), amenorreia (mais de 3 meses sem menstruar), a episódios recorrentes de hemorragias uterinas disfuncional, que podem estar relacionados com o excesso de estrógeno e deficiência de progesterona. O hisurtismo é caracterizado pelo aumento de quantidade de pelos nas mulheres em locais usuais aos homens, como queixo, buço, abdome inferior, ao redor de mamilos, entre os seios, glúteos e parte interna das coxas. Uma das formas de se caracterizar o hirsutismo é a escala de Ferriman-Gallwey, que identifica e quantifica a presença dos mesmos com escore > 8 (ROMANO et al., 2011). No entanto, a presença isolada desses fatores não caracteriza fidedignamente o hiperandrogenismo e por isso devem ser avaliadas com cautela (AZZIZ et al., 2004). Ainda é possível observar nessas mulheres a presença de transtornos psíquicos, que não fazem parte dos critérios de diagnóstico, mas que são importantes de serem identificados, com quadro de depressão, ansiedade e autoestima baixa (FERREIRA et al.,2006), além da presença de apneia do sono (MORAN et al., 2015). Tais fatores contribuem para diminuir ainda mais a qualidade de vida destas pacientes (TEEDE et al., 2010). 2.2 Síndrome dos Ovários Policísticos e suas alterações cardiometabólicas O perfil metabólico nas mulheres com SOP é complexo e caracterizado pela associação de fatores de risco para o desenvolvimento de Doenças Cardiovasculares (DCV) como: alterações no metabolismo da glicose/insulina, com aumento da resistência à insulina (RI) e intolerância à glicose, e maior risco de

20 19 desenvolver Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) (MARTINS et al., 2007; PONTES et al.,2012), aumento da hipertensão arterial sistêmica (HAS) (AZEVEDO et al., 2011), alteração na função autonômica cardíaca (SÁ et al., 2011) e dislipidemia com padrão aterogênico (WILD et al., 2011); além do aumento da inflamação de baixo grau (SANTOS et al., 2014) e maior prevalência de obesidade, principalmente central (COSTA et al., 2010), com aumento na incidência de síndrome metabólica (SM) (GLUECK et al.,2003; KANDARAKIS et al., 2008; MELO et al., 2012). Alterações no metabolismo da glicose/insulina como a RI e a hiperinsulinemia compensatória atinge aproximadamente 80% das mulheres com SOP no mundo (CARMINA et al.,2004; TRAUB et al.,2011) e, no Brasil, estudos tem demonstrado frequências que variam de 42 a 56%, dependendo dos métodos empregados para seus diagnósticos (PONTES et al., 2012), estando essas diretamente relacionadas ao hiperandrogenismo (EHRMANN et al.,2005). A RI caracteriza-se pela redução na secreção e excreção hepática de insulina e/ou como problemas na sinalização dos receptores de insulina provocando a resistência à insulina sistêmica. No entanto, o tecido ovariano se mostra sensível à ação de tal hormônio, o que dificulta a redução desses fatores de risco (SIEGEL et al.,2002; MUKHERJEE et al.,2010). As dislipidemias, alterações constantes na SOP, são caracterizadas por alterações nas concentrações séricas de qualquer um dos tipos de lipoproteínas estudas atualmente, por exemplos, a lipoproteína de baixa densidade (LDL- colesterol) e a lipoproteína de alta densidade (HDL- colesterol) (MATFIN, 2010). Na SOP as anormalidades nas lipoproteínas apresentam padrões variados, com aumento dos triglicerídeos (TG), do colesterol total (CT) e das LDL- colesterol, associados com redução da HDL- colesterol, o que confere a essas mulheres uma dislipidemia aterogênica (KIM; CHOI, 2013), dislipidemia comumente observada em pacientes com obesidade, SM, RI e DM2 e, reconhecidamente, fator de risco para desenvolvimento de aterosclerose (KATHIRESAN et al., 2006; WILD et al., 2011). Outra alteração metabólica bastante prevalente em mulheres com SOP é a inflamação crônica de baixo grau proveniente do desequilíbrio entre as citocinas pró e anti-inflamatórias (OJEDA et al., 2013). O fator de necrose tumoral α (TNF-α), Proteína C-reativa ultrassensível (hspcr) e interleucinas são os principais mediadores da inflamação (TUMU et al., 2013) e possuem associação com o aumento no risco em

21 20 desenvolver DCV, aterosclerose, dislipidemia, hipertensão e DM2 (DULEBA et al.,2012). Em recente estudo demostramos que mulheres com SOP apresentam níveis elevados de citocinas inflamatórias, independentemente do estado nutricional (SANTOS et al., 2014), esclarecendo a influência que a síndrome provoca no perfil inflamatório. Também já foi evidenciada a relação do perfil inflamatório alterado e a função ovariana, que interfere na fertilização e na implantação de óvulos nessas mulheres (SIEGEL et al.,2002), reduzindo o sucesso na reprodução. A obesidade presente em quase 80% das mulheres com SOP, principalmente a formada por tecido adiposo visceral, está associada a um aumento na produção de um grande número de moléculas, pró e anti-inflamatórias, podendo estar relacionado diretamente com a inflamação de baixo grau e na resistência a insulina presentes nessas mulheres (DULEBA et al., 2012). O acúmulo de gordura, caracterizado pela hipertrofia dos adipócitos, é regulado por mecanismos neurológicos, hormonais e metabólicos que mantêm o equilíbrio entre a aquisição e o gasto de energia e que exercem um papel crucial na manutenção e amplificação das anormalidades clínicas e bioquímicas associadas à síndrome (PASQUALI et al.,2011). No entanto, ainda não está claro se mulheres com SOP apresentam uma predisposição à obesidade, ou se esta é um fator secundário, responsável pelo agravamento da síndrome (THOMAS et al.,2007). A associação com a obesidade pode resultar também em desordens reprodutivas relacionadas às complexas interações entre o eixo hipotálamo-hipófiseovário, originando a infertilidade nas mulheres com a síndrome (NYBACKA et al., 2011). As distintas alterações metabólicas supracitadas presentes na fisiopatologia da SOP, associadas ao hiperandrogenismo, podem contribuir para o aumento do estresse oxidativo local e sistêmico, propiciando um desequilíbrio do estado redox no organismo nessas mulheres (LIU et al., 2010). Dados na literatura já relatam um aumento nos níveis de marcadores de estresse oxidativo nas mulheres com SOP (SABUNCU et al., 2001; FENKCI et al., 2003) estejam elas com obesidade (LIU e ZHANG, 2012), ou não (KURDOGLU. et al., 2012), assim como níveis reduzidos de substâncias antioxidantes (FENKCI et al.,2003). Esses fatores, isolados ou aliados, sugerem um aumento da genotoxicidade na SOP e no risco de desenvolver câncer, quando comparado a mulheres sem a doença (YESILADA et al., 2006; HAOULA et al., 2012).

22 Genotoxicidade e Síndrome dos Ovários Policísticos. Nossos genes estão em constante exposição à ação deletéria de agentes causadores de dano de DNA, podendo resultar em disfunções celulares, como instabilidade genética, expressão do gene alterado, mutagênese ou morte celular (DIZDAROGLU, 1991; EVANS; COOKE, 2006). Essas lesões podem ocasionar quebras de fitas simples e/ou duplas, ligações cruzadas entre cadeias de DNA e entre DNA e proteínas (SANCAR et.al., 2004). Grande parte dos danos ao DNA são causados pelo desequilíbrio entre a formação e a remoção das Espécies Reativas e Oxigênio (EROs), o que provoca estresse oxidativo e constitui uma das principais causas de danos moleculares para estruturas celulares como lipídios, proteínas e DNA (KARIHTALA, SOINI, 2007). Os agentes genotóxicos causadores de danos ao DNA podem possuir natureza endógena, quando decorrem da instabilidade inerente das ligações químicas específicas dos nucleotídeos, como produto do metabolismo e/ou respiração celular, como consequência das reações hidrolíticas e oxidativas orgânicas, ou ainda como resposta ao estímulo fagocitário; e de natureza exógena, ou ambiental, tais como agentes físicos e compostos químicos provenientes de medicamentos, exposição a raios ultravioletas, poluição atmosférica e hábitos de vida inadequados como uso de tabaco e consumo de dieta pouco saudáveis (BIANCHI; ANTUNES, 1999; COSTA et al., 2003; FRIEDBERG et al., 2006; LYKKESFELDT, 2007). Pesquisas recentes demonstram que, associados a esses fatores já descritos, a presença de doenças crônicas não transmissíveis, como DM2 e DCV, aliados a obesidade, também atuam na diversidade das origens das lesões ao DNA (FERNÁNDEZ-SÁNCHEZ et al.,2011). Em vias moleculares, esses agentes genotóxicos interagem quimicamente com o material genético, formando ligações covalentes com o DNA, ficando fortemente presos e, durante a replicação, acabam por não permitir abertura das cadeias, atrapalhando a ação da DNA polimerase, resultando em deleções, alterações oxidativas ou mesmo quebras na molécula de DNA (MÍDIO; MARTINS, 2000). Para identificação dessas lesões, sejam elas genotóxicas e/ou citotóxicas, a literatura dispõe de inúmeras técnicas, dentre elas: o teste de micronúcleo, que avalia a formação de fragmentos (micronúcleos) de DNA ligados à membrana em células (FENECH et al., 1999),

23 22 ensaios de aberrações cromossômicas (AC) (GHOSH et al., 2007), técnica do ensaio de Gamma-H2AX, que avalia os marcadores de proteínas fosforizadas ( KUO e YANG, 2008), avaliação dos níveis de 8-hidroxideoxiguanosina (8-OHdG), produto de oxidação do DNA, além do teste do cometa (GONTIJO ;TICE, 2003). O Teste Cometa ou Single Cell Gel Eletrophoresis Assay (SCGE) destaca-se devido a sua capacidade de detectar danos do DNA induzidas por agentes alquilantes, intercalantes e oxidativos, sendo uma técnica capaz de medir lesões prémutagênicas, passíveis de reparação (KAMMANN et al., 2001). Suas vantagens de escolha incluem utilização de diminuída quantidade de amostra de células, sua simplicidade e rapidez para a obtenção dos resultados, reduzido custo, além da sensibilidade para detecção de baixos níveis de danos no DNA (GONTIJO; TICE, 2003). A técnica baseia-se na inserção de células em gel de agarose sobre uma lâmina de microscopia, seguida de uma lise e, posteriormente, submetida a corrente elétrica em tampão alcalino. Devido à presença de cargas negativas no DNA se o mesmo estiver rompido (clastogênese) ele migrará para fora do núcleo, ficando com a aparência de um cometa ou cauda. Essa estrutura pode ser visualizada em microscópio de fluorescência e a imagem do "cometa" obtido é dividida entre a "cabeça", local de fixação das células antes da lise, e a "cauda" que representa os fragmentos de DNA danificadas. Assim o grau de dano do DNA é refletido no comprimento da cauda e na quantidade de DNA contida na mesma. O DNA que não estiver rompido ou quebrado não irá migrar, permanecendo armazenado no núcleo (TICE et al., 2000; FRIEDBERG et al., 2006; KANG et al., 2013). Avaliação da genotoxicidade é cada vez mais utilizada para o biomonitoramento da instabilidade genômica de indivíduos com doenças como DM2 (XAVIER et al., 2015) e doenças ateroscleróticas (GRAY et al., 2015). Na SOP, até o dado momento, são reduzidos os números de trabalhos nessa temática, o que têm produzido resultados relativamente conflitantes, em parte pelas amostras relativamente pequenas da maior parte destes estudos, assim como a variabilidade nos marcadores e ensaios utilizados nos mesmos (MURRI et al., 2013), o que, por muitas vezes, dificulta suas comparações.

24 Aspectos nutricionais e sua relação com a genotoxicidade na Síndrome dos Ovários Policísticos Estudos epidemiológicos suportam a hipótese de que o aumento do consumo de frutas e vegetais, com dietas ricas em fibras e com baixo teor de gordura induz a redução nos fatores de risco de doenças crônicas (JOSHIPURA et al., 2009; GEORGE et al., 2012; CASES et al., 2015), além de demonstrarem serem eficientes na redução do estresse oxidativo, pela ação dos compostos bioativos, como os antioxidantes, em mecanismos específicos sobre o estresse oxidativo e inflamação (DRAGSTED et al., 2006; PAXTON et al., 2012). Ao contrário, dietas ricas em gorduras saturadas e açúcares simples são importantes fontes de geração de agentes de glicação avançada (AGEs) que originam agentes oxidantes no organismo (VLASSARA et al., 2008). Estudo recente demonstrou que a exposição excessiva aos AGEs exógeno, pode exacerbar o perfil metabólico e hormonal, bem como o estresse oxidativo na SOP (TANTALAKI et al., 2014). As melhores proporções de macro e micronutrientes para as dietas de mulheres com SOP ainda não estão totalmente esclarecido. Estudos demonstram benefícios na redução da glicose pós-prandial e na sensibilidade a insulina com dietas de baixa carga glicêmica (CG) e/ou índice glicêmico (IG) (BRAND-MILLER et al., 2003; WALSH et al., 2013), bem como favorável perda de massa gorda ( GOSS et al., 2014) e redução de riscos metabólicos (MARSH et al., 2010; SUZANNE et al., 2013). Dietas hiperprotéicas também foram associadas a melhorias significativas na perda de peso e nos marcadores de risco cardiometabólicos em mulheres com SOP, tanto mais eficazes que as normoprotéicas (SORENSEN et al., 2012), como igualmente eficazes (TOSCANI et al., 2011). Além da avaliação de diferentes proporções de macronutrientes da dieta, trabalhos que estudam nutrientes específicos nessa população já relataram os benefícios da suplementação com vitamina D e do Cálcio na função hormonal (PAL et al., 2012;TEHRANI et al., 2014), do ômega-3 na melhoras na sensibilidade à insulina (RAFRAF et al., 2012) e dos ácidos graxos poli-insaturados (PUFA) na modulação do perfil androgênicos (CUSSONS et al., 2009; PHELAN et al., 2011).

25 24 Revisões sistemáticas que buscaram esclarecer essa composição ideal da dieta na SOP identificaram que a redução de peso, atingida por dieta hipocalórica associada a um padrão de alimentação saudável, é capaz de reduzir a massa adiposa e melhorar as alterações cardiometabólicas, independente das proporções dos macronutrientes utilizados na dieta, na maioria dos estudos avaliados (MEHRABANI et al., 2012; MORAN et al., 2013; PANIDIS et al., 2013). A Androgen Excess and Polycystic Ovary Syndrome Society (AE-PCOS) estabeleceu que a modificação no estilo de vida, através da dieta e exercício físico, com interrupção do tabagismo e etilismo, é escolha prioritária para o tratamento da SOP, principalmente as que apresentam sobrepeso e obesidade e associação com fatores de risco cardiometabólicos (WILD et al., 2010; RAVN et al.,2013). Para essas mulheres, estudos de intervenção para perda de peso em curto prazo (quatro a oito semanas) têm efeitos positivos na redução da gordura abdominal e dos níveis séricos de insulina (HOLTE et al.,1995; NORMAN et al.,2006), além de redução na androgenicidade (MORAN et al.,2013), na RI (HOEGER et al., 2006) e na melhora do perfil lipídico (MORAN et al., 2003). Clinicamente, melhorias no hisurtismo, no ciclo menstrual e na fertilidade também são relatadas com a redução do peso e a melhora no consumo alimentar (MEHRABANI et al., 2012; SALAMA et al., 2015). Na população em geral, a perda de peso e a segurança de quantidades adequadas de antioxidantes e micronutrientes, através da dieta, também estão relacionadas com a redução na genotoxicidade e, consequentemente, redução na instabilidade genômica (GAZIEV et al., 1996;FENECH, 2005). No entanto não foram encontrados dados que demonstram a influência da dieta e/ou perda de peso na instabilidade genômica em mulheres com SOP. Assim, diante do exposto, este trabalho busca, primeiramente, esclarecer o comportamento dos marcadores de genotoxicidade, medidos pelo teste do cometa, e fatores de riscos cardiometabólicos em mulheres com SOP e ovulatórias saudáveis para, posteriormente, avaliar se a dieta é capaz de reduzir a genotoxicidade e os parâmetros cardiometabólicos das mulheres com SOP sobrepeso ou obesas.

26 25 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral Avaliar o impacto da dieta sobre a genotoxicidade no grupo de mulheres com SOP sobrepeso ou obesas. 3.2 Objetivos Específicos Avaliar os parâmetros antropométricos, bioquímicos, hormonais, inflamatórios e de resistência à insulina, em mulheres com SOP e controles saudáveis; Avaliar os marcadores de genotoxicidade (tail intensity, tail moment e tail length) em mulheres com SOP e controles saudáveis; Analisar o impacto da intervenção dietética sobre os parâmetros antropométricos, bioquímico, hormonais e de resistência à insulina, no grupo de mulheres com SOP sobrepeso ou obesas; Analisar o impacto intervenção dietética nos marcadores de genotoxicidade (tail intensity, tail moment e tail length) no grupo de mulheres com SOP sobrepeso ou obesas;

27 26 4. MATERIAIS E MÉTODOS A presente tese foi dividida em dois estudos: o primeiro consistiu em um estudo transversal realizado em uma amostra de 47 mulheres, 27 com diagnóstico de SOP e 20 mulheres controle. O segundo foi um estudo clínico de intervenção dietética com duração de 12 semanas em um grupo de 22 mulheres com SOP sobrepeso ou obesas. 4.1 Casuística Em ambos os estudos, foram incluídas mulheres, com idades entre 18 e 35 anos, recrutadas no ambulatório de ginecologia e obstetrícia da Maternidade Escola Januário Cicco (MEJC), da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), e no laboratório de Análises Clínicas e Toxicológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, no município de Natal, RN. No primeiro estudo participaram mulheres ovulatórias saudáveis e mulheres com SOP diagnosticadas segundo os critérios de Rotterdam (ESHRE/ASRM, 2004) e, para o segundo estudo, foram selecionadas mulheres com SOP classificadas com sobrepeso (IMC 25-29,9 kg/m²) ou obesidade (IMC kg/m²). Foram excluídas, de ambos os estudos, mulheres que apresentaram outras causas de hiperandrogenismo e de irregularidades menstruais, como hiperprolactinemia, falência ovariana prematura, hipotireoidismo primário, grávidas, diabéticas, com doença cardiovascular, fumantes e mulheres que faziam o uso crônico de alguns medicamentos, dentre eles contraceptivos orais, agentes sensibilizadores da insulina, antilipêmicos e qualquer outro agente hormonal nos últimos três meses. Foram excluídas mulheres que engravidaram ou iniciaram uso de medicamentos durante o decorrer dos estudos, além das mulheres que não seguiram o protocolo de intervenção proposto no segundo estudo. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL) (Número do parecer Anexo-A) seguindo todas as recomendações da resolução 466/12 do Conselho Nacional de Saúde. Todas as voluntárias receberam informações claras sobre a natureza, os objetivos, riscos e benefícios dos estudos, e ainda a garantia de atendimento e acompanhamento médico de qualidade independente da sua participação, sendo assegurado o sigilo sobre a sua

28 27 identidade e a liberdade de retirar-se do estudo em qualquer hora. Foram incluídas as voluntárias que assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. 4.2 Desenho Experimental No primeiro estudo as variáveis antropométricas, marcadores de genotoxicidade, além dos marcadores hormonais, bioquímicos e inflamatórios foram avaliados em mulheres com SOP e mulheres controle, com idades e composição corporal similares No segundo estudo, mulheres com diagnósticos de SOP, classificadas com sobrepeso (IMC 25-29,9 kg/m²) e obesidade (IMC kg/m²) participaram da intervenção dietética e receberam dieta hipocalórica, com redução de 500kcal/dia e proporções balanceadas de macronutrientes, por um período de 12 semanas. As variáveis antropométricas, de consumo alimentar e de genotoxicidade, além dos marcadores hormonais e bioquímicos foram avaliados ao início e ao final do período de intervenção. O delineamento do estudo está descrito na figura 1. Figura 1. Delineamento experimental das avaliações realizadas na tese. Fonte: Dados trabalhados pelo autor

29 Coleta de dados Foram coletadas informações por meio da aplicação de questionários estruturados (Apêndice-A) com itens sobre, antecedentes gineco-obstétricos, hábitos de vida, história atual e pregressa de outras doenças, além dos antecedentes familiares. Foi aplicado o escore de Ferriman-Gallwey (Figura 2) para mensuração do grau de hirsutismo. Todos os questionários foram aplicados pelo mesmo avaliador. Figura 2: Escore semi-quantitativo de Ferriman e Gallwey modificado. Nota: Na escala modificada de Ferriman-Gallwey a variação de pontuação acontece ente 1-4, nas diversas áreas de quantificação do corpo. Há presença de hirsutismo se a soma dos escores for superior a Avaliação Antropométrica A avaliação antropométrica compreendeu a aferição do massa corporal (P) e estatura (E), que possibilitou o cálculo do índice de massa corporal (IMC), para classificação do estado nutricional das voluntárias, além da medida da circunferência da cintura (CC) para avaliação risco de doenças cardiovasculares (WHO,1997). Os pontos de cortes para as classificações supracitadas estão descritos na tabela 1.

30 29 Tabela 1- Classificação do estado nutricional por meio do índice de massa corporal (IMC) e do risco de complicações metabólicas pela Circunferência da cintura (CC) Classificação IMC (kg/m 2 ) Eutrófica 18,5 a 24,9 Sobrepeso 25,0 a 29,9 Obesidade grau I 30,0 a 34,9 Obesidade grau II 35,0 a 39,9 Classificação CC(cm) Sem risco de complicações metabólicas < 80 Risco aumentado de complicações metabólicas 80 a <88 Risco muito aumentado de complicações metabólicas 88 IMC= Índice de massa corporal; CC= Circunferência da cintura FONTE: Adaptado da OMS (WHO,1997) As medidas de peso (Kg) e estatura (cm) foram realizadas em balanças devidamente calibradas, com estadiômetro acoplado, da marca Filizola, com capacidade de 150 kg e precisão de 100 g. As participantes foram avaliadas descalças e com roupas leves, posicionadas e mantidas imóveis, de forma ereta, com os pés juntos, braços estendidos, mãos ao lado do corpo e cabeça em ângulo de 90º com o pescoço, despidas de qualquer adorno que pudesse interferir na aferição. As medidas de estatura foram realizadas após inspiração profunda, enquanto a haste horizontal do estadiômetro foi abaixada até o ponto mais alto da cabeça. A obtenção destas medidas possibilitou o cálculo do IMC, definido como peso (kg)/ estatura² (m) (WHO,1997). Para aferição da CC, as pacientes foram posicionadas de pé, eretas, com abdome relaxado, braços estendidos ao longo do corpo e os pés separados em torno de 25 a 30 cm. Passou-se a fita métrica ao redor da menor curvatura localizada entre as costelas e a crista ilíaca. Orientou-se às pacientes a inspirar e, em seguida, expirar totalmente quando ocorreu a realização da medida (WHO,1997). 4.5 Ensaios Hormonais e Bioquímicos Foram realizadas coletas de amostra de sangue periférico, após jejum prévio de 12 horas, para avaliação dos marcadores hormonais e bioquímicos. As dosagens hormonais de caracterização da síndrome foram: hormônio folículo estimulante (FSH), progesterona, testosterona total, prolactina, deidroepiandrosterona sulfato (DHEAS) e a globulina ligadora de hormônios sexuais (SHBG). Foram avaliados também os níveis séricos de insulina basal. Todos os testes foram realizados

31 30 pelo método de quimiluminescência, no aparelho Immulite 1000 (Diagnostic Products Corporation Los Angeles CA, EUA) e os valores de referência adotados foram de acordo com as recomendações do fabricante dos reagentes. O perfil bioquímico foi avaliado por meio das concentrações séricas de glicose de jejum, colesterol total, HDL-colesterol, LDL-colesterol e triglicerídeos. As dosagens foram realizadas por ensaios enzimático-colorimétricos com kits comerciais (Labtest Diagnóstica-SA, São Paulo/SP) no equipamento Bioplus 2000 (Bioplus, Barueri/SP). Os níveis de LDL-colesterol foram determinados utilizando a fórmula de Friedewald (FRIEDEWALD et al.,1972). A avaliação da RI foi determinada por meio do modelo HOMA-IR (homeostasis model assessment insulin resistance), através da seguinte fórmula: Glicemia (mmol) x Insulina (uu/ml) 22,5, com ponto de corte >2,71 e por meio do QUICKI (Quantitative insulin sensitivity check index), através da fórmula: 1 (Log insulina + Log glicemia), com ponto de corte <0,33 (CARMINA, LOBO, 2004; GELONEZE et al., 2006). Adicionalmente, no estudo I, foi avaliado o estado inflamatório por meio das citocinas fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucina-6 (IL-6) e proteína c- reativa ultrassensível (hscrp), dosadas pelo método de quimiluminescência, no aparelho Immulite 1000 (Diagnostic Products Corporation Los Angeles CA, EUA). Todos estes parâmetros foram classificados de acordo com as recomendações da American Diabetes Association (ADA, 2015), V Diretrizes Brasileiras sobre Dislipidemias (2013) e seguindo as recomendações dos fabricantes dos reagentes. Os valores de referencia para os marcadores utilizados encontram-se descritos na tabela 2.

32 31 Tabela 2- Valores de referência para marcadores hormonais, bioquímicos e inflamatórios. Hormônios Referências FSH (mui/ml) 3,0 a 14,0 Testosterona (ng/dl) Não detectável a 73 DHEAS (μg/dl) 35 a 430 Progesterona (ng/ml) Não detectável a 1,13 Prolactina (ng/ml) 2,83 a 30,0 SHBG (nmol/l) 13 a 71 Estradiol (pg/ml) 8,7 a 183 Perfil Lipídico alterado (mg/dl) Colesterol Total 240 Colesterol HDL < 40 Colesterol LDL Triglicerídeos Citocinas inflamatórias IL-6 (pg/ml) Não detectável a 5,9 TNF-a (pg/ml) Não detectável a 8,1 hscrp 3,0 NOTA: FONTE: V Diretriz Brasileira sobre Dislipidemias (79).De acordo com os kits do fabricante.shbg: proteína ligadora de hormônio sexual; FSH= hormônio folículo estimulante; DHEAS= dehidroepiandrosterona sulfato; TNFα= fator de necrose tumoral- alfa; hscrp= proteína c reativa ultrasensível; IL-6= interleucina Avaliação da Genotoxicidade - Teste do Cometa A genotoxicidade foi avaliada pelos marcadores: tail intensity, tail moment e tail length, utilizando o teste do cometa. Essas análises seguiram o protocolo proposto por Gontijo e Tice (2003) Preparo das lâminas Cada lâmina foi imersa em uma solução de agarose de ponto de fusão normal e tampão fosfato-salino (phosphate buffered saline-pbs) livre de cálcio (Ca2 + ) e magnésio (Mg 2 ) e colocada para secar em temperatura ambiente Preparo das amostras sanguíneas e confecção das lâminas Com o auxílio de micropipeta, a amostra de sangue periférico (20 l), foi misturada a agarose de baixo ponto de fusão (120 l) e colocada sobre a lâmina com agarose de ponto de fusão normal, preparada anteriormente. Em seguida, lamínulas foram sobrepostas a lâminas que foram levadas ao refrigerador (4 C) para solidificação da agarose. Foram confeccionadas duas lâminas por amostra. As lâminas foram mergulhadas em solução de lise contendo NaCl a 2,5 M, EDTA (100 mm), Tris

33 32 (10mM), Triton X-100 (1ml), DMSO (10 ml), N-Lauroil-sarcosinato (1%) e levadas a geladeira onde permaneceram, no mínimo, por 2 horas. Ao retirar as lâminas da solução de lise, as mesmas foram lavadas com PBS gelado por cinco minutos Eletroforese e Coloração As lâminas foram depositadas em cuba de eletroforese horizontal (Bio Agency ) e cobertas por solução tampão de eletroforese (ph >13), composto por NaOH e EDTA a 4 o C, por 20 min. Em seguida, foi realizada a eletroforese com 25v, por 30 min. e a 300 ma. As lâminas foram neutralizadas em Tris (ph=7,5) durante cinco minutos, fixadas em etanol 100% e, após secagem em temperatura ambiente, foram coradas utilizando-se 50 L de solução de brometo de etídio (20 g/ml), cobertas por uma lamínula e analisadas imediatamente em microscópio de fluorescência com aumento de 40x Análise das lâminas Foram analisados 100 células, nucleóides, por amostra (sendo 50 nucleóides por lâmina), utilizando um sistema de análise por imagem automática (Comet Assay IV, Perceptive Instruments, UK ). Para determinar a extensão do dano do DNA foram utilizados os dados expressos como Tail intensity (TI) percentagem de DNA na cauda- (fração de DNA na cauda dividida pela quantidade de DNA na célula multiplicado por intensidade cauda -% cauda), Tail moment (TM) momento de cauda (produto da cauda e a média da distância da migração nas unidades de cauda, em unidade arbitrária) e comprimento da cauda-tail length (TL) distância a partir do meio ou o perímetro estimativa da cabeça cometa para o último sinal visível na cauda, em metros) (OLIVE et al., 2006). As imagens obtidas são exemplificadas na figura 3. Figura 3. Cometa representando o dano de DNA visualizado por microscópio de fluorescência. A B C Nota: A- Célula normal, B- Célula com dano modero; C- Célula com dano grave. Fonte: Dados trabalhados pelo autor.

34 33 As leituras das lâminas, assim como as análises computacionais referentes à extensão da lesão genômica foram realizadas no LAPGO (Laboratório de Pesquisa Experimental em Ginecologia e Obstetrícia) da Faculdade de Medicina- UNESP Botucatu, sob a orientação da Professora Dra. Débora Damasceno e colaboração dos alunos Rafael Bottaro Gelaleti e Aline de Oliveira Netto. 4.7 Aspectos Nutricionais Consumo alimentar O consumo alimentar foi avaliado por meio da aplicação de quatro recordatórios de 24 horas (R24h). Dois R24h aplicados antes da dieta, [um na primeira consulta e outro na entrega do plano (intervalo de sete dias, sendo um em dia útil da semana e outro no final de semana)], e os outros dois foram aplicados após as doze semanas de intervenção, objetivando ampliar as informações sobre o consumo alimentar das voluntárias. As avaliações foram realizadas pelo mesmo avaliador e de forma individual. As informações obtidas com os R24h foram inseridas no software Virtual Nutri Plus, 2014, que analisou, de maneira quantitativa, o consumo calórico (VCT valor calórico total), a distribuição percentual de carboidrato (CHO), proteína (PTN), lipídio (LIP), ácido graxo saturado (AGS), ácido graxo monoinsaturado, ácido graxo polinsaturado, colesterol (COL), fibra (FIB), bem como Vitamina A, Vitamina C, Vitamina E, Folato (FL) e sódio (Na), antes e após o período de intervenção dietética. Os dados de consumo obtidos nos R24h de cada momento foram corrigidos pela variabilidade inter e intra pessoal por meio do programa Multiple Source Method (MSM) Protocolo de Intervenção Dietética A intervenção dietética incluiu atendimentos individuais com duração média de 60 minutos, em intervalos iniciais de 15 dias e posteriormente de 30 dias, por um período de 12 semanas do estudo. Conforme descrito na figura 4.

35 34 Figura 4. Acompanhamento da intervenção dietética nas mulheres com síndrome dos ovários policísticos e sobrepeso Acompanhamento ou obesidade. da Intervenção Nutricional Encontro 1 Encontro 2 Encontro 3 Encontro 4 Encontro 5 Primeira Consulta Nutricional T= O Retorno Nutricional S= 2 Retorno Nutricional S=4 Retorno Nutricional S=8 Ultima Nutricional S=12 Entrega do plano alimentar e das orientações dietéticas S=0 Nota: s= semanas. Nota: S= Fonte: semanas Dados de trabalhados estudos pelo autor. Na primeira consulta, foram calculadas as necessidades energéticas estimadas (NEE) (Kcal/dia) das voluntárias como proposto pela FAO/WHO, 2001, sendo realizado pela multiplicação da taxa metabólica basal (TMB) pelo Nível de atividade física (NAF) para mulheres, conforme demostrado na tabela 3. As mulheres foram avaliadas como sedentárias e o NAF utilizado foi 1,5. Tabela 3- Equação proposta pela FAO/WHO (2001) para cálculo da taxa metabólica basal. Faixa etária (anos) Equação para Mulheres NAF a 18 a 30 14,818 x peso (Kg) + 486,6 Estilo de vida sedentário - 1,40 a 1,69 Estilo de vida ativos - 1,70 a 1,99 Estilo de vida intenso- 2 a 2,40 30 a 60 8,126 x peso (Kg) + 845,6 a NAF= nível de atividade física; Kg= quilograma; Em seguida, realizou-se a prescrição dietética por meio do déficit calórico de 500kcal/dia do valor da NEE visando redução de 0,5 kg/semana, almejandose a perda de 5% do peso corporal inicial ao final das 12 semanas. A composição da dieta manteve-se equilibrada com 15% de energia proveniente de proteínas, 60% de carboidratos (<10% de açúcar simples) e 25% de gordura (<8% de gordura saturada), com um consumo de 25 g/dia de fibras, de acordo com as recomendações para redução da obesidade (BRASIL, 2006; XAVIER et al., 2013).

36 35 As quantidades de micronutrientes da dieta foram estabelecidas baseadas nas ingestões dietéticas de referencia-dris (Dietary reference intakes) para mulheres adultas com diferentes faixas etárias (TRUMBO P et al., 2002). A dieta foi projetada para gerar um aumento no consumo das porções de frutas, legumes, grãos integrais e laticínios de baixo teor de gordura, além de um reduzido consumo de gorduras saturadas, colesterol, sódio e açucares refinado. Os números de porções alimentares e calorias variaram de acordo com as necessidades previamente estabelecidas de cada voluntária, respeitando e preservando os hábitos alimentares das voluntárias. Foram entregues planos dietéticos individualizados, composto de três refeições principais e dois ou três lanches, uma lista de substituições de alimentos e orientações gerais sobre hábitos de vida saudável (BRASIL, 2006; TRUMBO et al., 2002; BRASIL, 2014). 4.8 Análise estatística dos dados Os dados foram analisados por meio do software IBM SPSS (Statistical Package for the Social Sciences, Chicago IL) versão 20.0 para Microsoft Windows. A significância estatística foi estabelecida em 5% (p < 0,05). Os dados foram testados quanto à normalidade utilizando o teste de Shapiro-Wilk e expressos na estatística descritiva como distribuição de frequências para variáveis qualitativas, em média ± desvio padrão (DP), para as variáveis quantitativas paramétricas, em mediana com intervalo de confiança de 95% (IC) ou como mediana e intervalo interquartil (percentis 25% - 75%) para as demais variáveis. Para as comparações dos grupos SOP e o controle, foram utilizados os testes t de Student para amostras independentes e Mann-Whitney para dados paramétricos e não-paramétricos, respectivamente. Para avaliação da influência da obesidade, as voluntárias foram agrupadas pelo IMC, como eutróficas (IMC <25) e com sobrepeso e obesidade ( 25 IMC <40). Para as comparações das variáveis pré e pós-intervenção dietética, foram aplicados o teste t de Student pareado e Wilcoxon para dados paramétricos e nãoparamétricos, respectivamente. A fim de avaliar o poder da intervenção, foi realizado o cálculo do poder estatístico do estudo por meio do Teste de Cohen (d), adotando-se o tamanho do efeito de pequeno 0,20 0,30, médio 0,40 0,70 e grande 0,80 (Cohen, 1988). A análise de regressão linear multivariada foi realizada para identificar os fatores

37 36 explicativos da variação do dano ao DNA. Foram selecionadas para análise multivariada as variáveis que apresentaram valores de p < 0,20, adotando-se o critério enter. O modelo foi considerado significativo quando apresentou todas as variáveis explicativas com p < 0,05.

38 37 5. RESULTADOS 5.1 Avaliações dos marcadores cardiometabólicos e de genotoxicidade em mulheres com SOP e controles saudáveis As médias da idade, IMC e CC entre os grupos, não apresentaram diferenças estatísticas significantes (p> 0,05). Como esperado, os pacientes com SOP apresentaram maior pontuação para o hirsutismo, além de níveis reduzidos de SHBG, progesterona e estradiol (p<0,001). Enquanto que os níveis de FSH, testosterona e prolactina, não obtiveram diferenças significativas entre os grupos. Foi evidenciado um aumento nos níveis de insulina e índice HOMA, colesterol LDL e citocinas inflamatórias hscrp, TNF-α e IL-6 no grupo SOP, todos com p< 0,05. Os valores estão descritos na tabela 4. Tabela 4. Parâmetros clínicos, hormonais, metabólicos e inflamatórios de mulheres com SOP e controle saudável. SOP Controle p (n=27) (n=20) Idade (anos) 26,5 ± 6,4 25,5 ± 6,7 0,365 IMC (kg/m 2 ) 28,7±6,1 27,7±8,7 0,281 CC (cm) 92,8±15,7 88,1±17,4 0,223 Hirsutismo 17,6 ±3,5 3,3 ± 1,2 0,001 Hormônios FSH (mui/ml) 4 (3-5) 3,8(2,3-4,5) 0,213 SHBG (nmol/l) 80(70-88) 153( ) 0,001 DHEAS (μg/dl) 174( ) 99(75-144) 0,001 Testosterona (ng/dl) 126( ) 132( ) 0,822 Prolactina (ng/ml) 6(4,3-7,5) 4,9(4,2-8,9) 0,834 Progesterona (ng/ml) 0,50 3,87 0,001 Estradiol (pg/ml) 44,32 112,48 0,001 Marcadores Metabólicos Glicemia de jejum (mg/dl) 79 ±10,3 75,1±11,9 0,233 Insulina basal (μiu/ml) 12,5(11-16,5) 10(6,6-13) 0,001 HOMA-IR (mol x μu/l) 2,4(1,9-3,2) 1,8(1,2-2,7) 0,022 QUICK 0,33(0,32-0,34) 0,34(0,32-0,37) 0,023 Triglicerídeos (mg/dl) 101±73 80±42 0,236 Colesterol Total (mg/dl) 156( ) 153( ) 0,694 Colesterol HDL (mg/dl) 42(35-56) 41(39-48) 0,961 Colesterol LDL (mg/dl) 96,5(83-111) 85(54-100) 0,031 Perfil Inflamatório hscrp (mg/l) 105(75-197) 39(30-54) 0,001 TNF-α (pg/ml) 7,8(6,5-113) 5,3(4,2-7,3) 0,001 IL-6 (pg/ml) 6,4(5,7-7,9) 2,3(2,1-2,5) 0,001 NOTA: Valores expressos em média ± desvio padrão pelo teste t pareado ou mediana (percentis 25 th -75 th ) pelo teste de Wilcoxon; SOP= síndrome dos ovários policísticos; CC= circunferência da cintura; SHBG: proteína ligadora de hormônio sexual; FSH= hormônio folículo estimulante; DHEAS= dehidroepiandrosterona sulfato; QUICKI= quantitative insulin sensitivity check index; HOMA-IR=homeostasis model assessment insulin resistance TNF-α= fator de necrose tumoral- alfa; hscrp= proteína c reativa ultrasensível; IL-6= interleucina-6.

39 38 As comparações entre os marcadores de dano de DNA tail intensity, tail momente e tail length nas mulheres SOP e controles saudáveis, na amostra total e agrupadas pelo IMC, estão representados na figura 5. As médias dos valores do dano de DNA, identificados pelo tail intensity, nas mulheres com SOP foram de 24± 6,32% e nas controles de 21,7± 5,22% na amostra total. Quando agrupadas pelo IMC, no grupo das eutróficas com SOP as médias foram de 24,1± 6,88% e eutróficas controles de 20± 5,45%; as médias dos grupos das mulheres sobrepeso ou obesas com SOP de 23,9± 6,23% e controle de 24,3± 3,78%. A comparação das médias não obtiveram diferenças significativas. Figura 5- Diferenças entre os marcadores de Tail intensity, Tail moment e Tail Length em mulheres com e sem SOP estratificado pelo índice de massa corporal, nas figuras A, B e C.

40 39 Nota: O tamanho do efeito (ES) foi calculada por Cohen d. Fonte: Dados trabalhados pelo autor 5.2 Impacto da intervenção dietética nos marcadores de risco cardiometabólicos e na genotoxicidade de mulheres com SOP sobrepeso ou obesas O diagrama a seguir esclarece o número da amostral final, identificando as perdas no decorrer do estudo II (Figura 6). Figura 6- Fluxograma dos pacientes durante o estudo II. Fonte: Dados trabalhados pelo autor.

41 40 Vinte e duas mulheres com SOP (25,3 ± 3,4 idade) finalizaram a intervenção dietética e tiveram seus dados incluídos no estudo. Na tabela 5, estão descritas as características fenotípicas das voluntárias, como estado nutricional, risco de complicações metabólicas, regularidade menstrual e sinais clínicos da síndrome. Tabela 5- Características clínicas das mulheres com SOP. Características % N Estado nutricional (IMC) Sobrepeso (25-29,9) 45,5 10 Obeso (30-40) 54,5 12 Classificação da Circunferência da Cintura (cm) Sem risco de complicações metabólicas (< 80) 13,6 3 Com risco mínimo de complicações metabólicas ( 80 e <87) 18,2 4 Com risco moderado de complicações metabólicas ( 88) 68,2 15 Classificação da RCE Menor risco para DCV ( 0,50) 13,6 3 Maior risco para DCV (> 0,50) 86,4 19 Menarca (média 12 anos) <10 anos 54,5 12 >10 anos 45,5 10 Regularidade Menstrual Menstruação regular 27,3 6 Oligomenorréia 31,8 7 Amenorreia 40,9 9 Sinais Clínicos da SOP Hirsutismo 72,7 16 Acne 45,5 10 Acantose 72,7 16 SOP= síndrome dos ovários policísticos; IMC= índice de massa corporal; RCE= relação cintura estatura; CC= circunferência da cintura; DCV= doença cardiovascular. Fonte: Dados trabalhados pelo autor. O consumo alimentar das voluntárias, antes e depois da dieta, está descrito na tabela 6. Depois da intervenção dietética de 12 semanas, a ingestão calórica foi significativamente reduzida em 675 (± 440) kcal/dia, com reduções também nos consumos de carboidratos (106,9 ± 25,6 g/dia), proteínas (20 ± 5,6 g/dia), gordura totais (25,7 ± 5,6 g/dia), gorduras saturadas (21,1 ± 2,7 g/dia), além de colesterol (147,2 ± 90,3 g/dia) e de sódio (792 ± 671,4 mg/dia). Verificou-se também aumento do consumo de gorduras mono (3,6 ± 2,4) e poliinsaturadas (2,4 ± 4,4 g/dia). Os níveis de vitaminas A, C e E foram ajustados para os valores de recomendação das DRI.

42 41 Tabela 6- Consumo alimentar antes e pós dieta de 12 semanas em mulheres com sobrepeso e obesas com SOP. Mulheres com SOP (n=22) Antes Dieta Pós Dieta p a Energia Total (kcal/dia) 2076,2± 503,8 1401,2± 264 0,001 Consumos diários AMDR (% energia) Proteínas ,9 % 18,7 % 0,01 Carboidratos ,7 % 53,1 % 0,01 Lipídios Totais ,4 % 28,2 % 0,01 Consumos diários (dia) DRI/AI Proteína, g 46 82,7 ± 7,3 62,7 ± 6,3 0,001 Carboidratos, g ,6 ± 18,2 177,7 ± 37,9 0,001 Fibras, g 25 17,5 ± 7,86 19,1 ± 8,0 0,322 Gorduras totais, g ,7 ± 23,6 42,3 ± 17,2 0,001 Saturadas, g ± 6,7 12,1 ± 2,2 0,001 Monoinsaturadas, g ,1 ± 3,3 14,7 ± 5,3 0,003 Poliinsaturadas, g ,9 ± 1,4 11,2 ± 5,2 0,001 Colesterol, mg ,8 ± 164,3 147,6 ± 50,9 0,001 Sódio, mg ,2 ± 977,3 1281,3 ± 426,7 0,001 Vitamina A, mcg (RAE) a ,1 ± ,9 ± 755 0,884 Vitamina C, mg ± ,8 ± 717,2 0,862 Vitamina E, mg (AT) b 15 9,3 ± 2,7 15,2 ± 3,7 0,001 Folato, mcg ,3 ± ,8 ± 47 0,016 Note: AMDR= acceptable macronutrient distribution. DRIs= Dietary Reference Intakes; AI= Range; Valores em médias ± SD; teste t pareado*. a Retinol activity equivalents (atividade equivalente de retinol), b AT = mg d-αtocopherol( Tocoferol). Fonte: Institute of Medicine/Food and Nutrition Board, 2005 e dados trabalhados pelo autor. O impacto da intervenção dietética sobre os parâmetros antropométricos, hormonais e bioquímicos estão apresentados na tabela 7. A média da perda de peso foi de 3,5% (~ 2 kg) com redução significativa no IMC, FSH, nos níveis de testosterona e SHBG e aumento na progesterona (p<0,05). A dieta proporcionou também uma melhora significativa no metabolismo da glicose, com redução dos níveis de glicemia e insulina de jejum, assim como da RI (p<0,05). A melhora no perfil lipídico foi evidenciada pela redução LDL-colesterol (p<0,05), no entanto não houve alterações significativas nos níveis triglicérides e HDL-colesterol (p<0,05).

43 42 Tabela 7- Parâmetros antropométricos, hormonais e metabólicos antes e pós-dieta em mulheres com SOP. Mulheres com SOP Antes Dieta Pós-Dieta p (n=22) Antropometria Peso (kg) 73,3 ± 17,0 71,2 ± 16,4 0,001 IMC (Kg/m 2 ) 29,8 ± 4,1 28,9 ± 5,8 0,001 CC (cm) 95,4 ± 15,8 93,2± 13,2 0,13 Hormônios FSH (mui/ml) 4,0 ± 1,3 2,4 ± 0,9 0,001 Progesterona (ng/ml) 0,37 (0,26-0,58) 1,89 (1,13-2,42) 0,001 SHBG (nmol/l) 158 ( ) 115 (99-122) 0,001 Testosterona (ng/dl) 140 (113,2-207,7) 129 (81,4-169,2) 0,001 Marcadores Metabólicos Glicemia de jejum(mg/dl) 79± 9, ± 8,7 0,027 Insulina basal(μiu/ml) 11,3 (8,07-15,07) 5,5 (4,1-7,6) 0,001 HOMA-IR(mol x μu/l) 1,9 (1,3-3,3) 0,9 (0,7-1,3) 0,001 QUICKI 0,34± 0,03 0,38± 0,02 0,001 Triglicerides (mg/dl) 123 (63-164) 94 (47,5-135) 0,385 HDL cholesterol (mg/dl) 43,7 ± 13,7 46,2 ± 15 0,068 LDL cholesterol (mg/dl) 89 (70-104) 86 (50-50) 0,001 Nota: Todos os valores expressos em médias ± desvios-padrões ou mediana e amplitude interquartil (25% a 75%). As comparações estatísticas foram realizadas pelo teste t de Student pareado para meios e pelo teste de Wilcoxon para medianas. SOP = síndrome dos ovários policísticos; IMC = índice de massa corporal; CC= circunferência da cintura; FSH=hormônio folículo-estimulante; SHBG = globulina de ligação da hormona sexual; HOMA-IR = avaliação do modelo de homeostase da resistência à insulina; QUICKI = índice de verificação quantitativa da sensibilidade à insulina. Fonte: Dados trabalhados pelo autor. O impacto da dieta sobre a genotoxicidade nas mulheres com sobrepeso/obesas com SOP está representado na figura 7 e aponta uma redução significativa nos marcadores de dano de DNA tail intensity (24,3 ± 5,9 % vs. 17,1 ± 5,0%, p= 0,001) e tail moment (20,5 ± 7,8 vs. 14,1 ± UA 6,3 UA, p=0,002) com grande tamanho do efeito (d de Cohen> 0,8). O tail length mostrou uma tendência à redução (208,4 ± 45,9 μm vs. 185,7 ± 40,5μm), porém sem diferenças significativas (p = 0,07).

44 43 Figura 7- Dano de DNA em mulheres com sobrepeso/obesidade com síndrome dos ovários policísticos, antes e após a intervenção dietética (n=22). Nota: Marcadores de dano de DNA: tail intensity, tail length and tail moment. Boxplots mostra quartis médio, superior e inferior e mínimo e máximo de dados. O tamanho do efeito (ES) foi calculado por Cohen d. Fonte: Dados trabalhados pelo autor

45 44 A análise post hoc poder estatístico post (bilateral) para a diferença entre os valores iniciais vs. pós-intervenção foi realizado para determinar o poder alcançado do Wilcoxon Signed Rank Test, com base no tamanho da amostra investigada (n = 22) para os parâmetros de danos no DNA. Assim os parâmetros de danos no DNA tail intensity e o tail moment, apresentaram melhoras após a intervenção. Considerando-se um alfa de 0,05, o poder alcançado foi de 0,99 para ambos os marcadores. Na tentativa de explicar quais fatores poderiam estar influenciando na variação de dano de DNA, realizou-se uma regressão logística múltipla que identificou nível de progesterona e QUICK como responsáveis por 47,5% da variação dos danos no DNA medido pela tail intensity (%). Os índices para as probabilidades correspondentes (intervalo de confiança de 95% - IC) para QUICK e progesterona foram de 84,8% (20,17-149%) e 6,11% (1,17-11%), respectivamente, antes da dieta. As mesmas variáveis não explicam a variação do dano do DNA após a dieta. Esses dados estão demonstrados na figura 8, na qual o tail intensity (%) observado e o previsto, antes e depois da dieta. Figura 8- Regressão logística múltipla com progesterona e QUICK no modelo explicativo da variação dos danos de DNA medido pelo tail intensity. Nota: Regressão logística múltipla com odds ratio e 95% para os pacientes com sobrepeso e obesidade com síndrome dos ovários policísticos, identificando os níveis de progesterona e QUICK responsáveis pela mudança de danos no DNA medido pela tail intensity. Fonte: Dados trabalhados pelo autor

46 45 6. DISCUSSÃO Avaliações dos marcadores de danos no DNA e metabólicos em mulheres com SOP e controles Nos últimos anos, o avanço expressivo no entendimento da patofisiologia da SOP e no desenvolvimento de novas abordagens de tratamento para a doença, vem propiciando a melhora no perfil metabólico e reduzindo as características clínicas ocasionadas pela doença, melhorando a qualidade de vida dessas mulheres. No entanto, ainda existem lacunas importantes no conhecimento científico ou fatos não integralmente esclarecidos, no que se refere a alterações moleculares. Em nossa amostra, utilizando o teste do cometa para avaliação da genotoxicidade, não foi possível identificar diferenças significativas entre os marcadores de dano de DNA em mulheres com SOP e mulheres sem a síndrome, ainda que os dados estejam tendenciosos ao aumento em alguns marcadores de dano de DNA na SOP. Esses dados discordam de trabalhos sobre o tema na literatura, nos quais foram encontrados aumento na frequência de dano de DNA (NERSESYAN e CHOBANYAN et al., 2010) e maior susceptibilidade à oxidação do mesmo (DINCER et al., 2005; NERSESYAN et al., 2006). Também foi identificada uma associação positiva da SOP com o aumento na frequência de micronúcleos e de vários tipos de aberrações cromossômicas, quando comparadas as mulheres sem a doença (YESILADA et. al., 2006; MORAN et al., 2008). No entanto, nem sempre esse padrão é encontrado. Autores que avaliaram os níveis de 8-hidroxideoxiguanosina (8- OHdG) como marcadores de dano de DNA derivados do estresse oxidativo, também não encontraram níveis mais elevados desse marcador em mulheres com SOP quando comparadas as controle (HAMURCU et al., 2010) e Sova et al, em 2010, quando avaliaram esse mesmo marcador em mulheres com SOP e controles, divididas em eutróficas e sobrepeso, identificaram níveis mais baixos de 8- OHdG na SOP, independente do IMC, quando comparadas as controle saudáveis. É provável que nos tecidos avaliados nesses estudos, eventuais erros de pareamento provocados pela formação de 8-OHdG tenham sido reconhecidos pela proteína p53 normal e corrigidos por meio de proteínas de reparo, impedindo a mutação de genes responsáveis pelo controle da proliferação celular. O mesmo pode ter ocorrido

47 46 na nossa amostra, podendo nos levar a inferir que o mecanismo envolvido nessa observação pode estar relacionado com o defeito de reparação de DNA nos tecidos alvos, e não necessariamente, com baixos níveis de dano. Nossos resultados revelaram também níveis reduzidos de progesterona e estradiol no grupo SOP que caracterizam a anovulação crônica associada à infertilidade nessas mulheres (GONZALEZ et al., 2012). A infertilidade é reconhecida como característica importante para maior incidência de instabilidade cromossômica, assim como o hiperandrogenismo, por sua associação com o aumento de micronúcleo (TRKOVA et al., 2000). No entanto, também foi encontrado em nosso resultado aumento nos níveis de DHEAS que podem estar relacionados com a ausência na diferença de genotoxicidade entre os grupos estudados. Isso porque, Brignardello e seus cols. (2007) demostraram que em seu trabalho com suplementação de DHEA os níveis plasmáticos de espécies reativas de oxigênio apresentaram uma redução de 47%, enquanto que antioxidantes como glutationa e vitamina E tiveram elevação em seus níveis, 38 e 76%, respectivamente. Embora o hormônio DHEAS tenha sido sinalizado com estimulador da produção de antioxidante, ele pode apresentar efeitos contrapostos, atuando tanto na eliminação como na indução do estresse oxidativo, dependendo da sua concentração (BASTIANETTO et al., 1999; GALLO et al., 1999). A produção de enzimas antioxidantes estaria aumentada em indivíduos com SOP em comparação com indivíduos saudáveis (VERIT e EREL, 2008), o que poderia auxiliar na resposta do padrão de genotoxicidade encontrado nos nossos resultados. No entanto, essa hipótese é questionada por outros autores que demostram níveis reduzidos de antioxidantes no plasma de mulheres com SOP, gerando uma reduzida capacidade antioxidante (FENKCI et al., 2003) nessas mulheres quando comparadas a mulheres sem a síndrome (SABUNCU 2001, DINGER et al., 2005; VICTOR et al., 2011). Mas, como não avaliamos capacidade antioxidante em nosso estudo e nem marcadores antioxidantes, não é possível esclarecer essa relação. Nossos resultados revelaram também elevação nos marcadores de RI, como o índice HOMA-IR e redução dos marcadores de sensibilidade à insulina, como o QUICK nas mulheres com SOP quando comparadas a controles saudáveis. Esses dados corroboram com os relatos da literatura que demostram maior predisposição dessas mulheres a desenvolver alterações no metabolismo da glicose/insulina, propiciando

48 47 aumento nos níveis de RI e a hiperinsulinemia compensatória nessas mulheres, independente da presença da obesidade (ESCOBAR et al., 2003;EHERMANN et al.,2005; GONZALEZ et al., 2005; ALVAREZ et al.,2006; AKAMINE et al., 2010). Os possíveis mecanismos de origem da hiperinsulinemia na SOP podem ocorrer pela secreção excessiva de insulina e/ou devido diminuição da depuração da mesma (LIVADAS et al., 2013). Níveis persistentemente elevados de insulina podem resultar em falta de sensibilidade das suas células-alvo ao longo do tempo, o que agrava ainda mais a hiperinsulinemia e aumenta o potencial para a disfunção das células betapancreáticas (DEUGARTE et al., 2005). A RI já foi correlacionada, anteriormente, com o aumento nos níveis de dano de DNA, além do aumento na separação cromossômica em mulheres com SOP, conferindo-lhes maior instabilidade genômica (MORAN et al., 2008). Em nossos resultados torna-se visível um aumento significativo de marcadores inflamatórios nas mulheres com SOP, quando comparado as mulheres controles pareadas pelo IMC, ratificando o que já foi demostrado em nosso estudo prévio (SANTOS et al., 2014) sobre a influencia da síndrome no estabelecimento da inflamação crônica de baixo grau. A inflamação tecidual é gerada pela infiltração de células imunes que estão associadas à produção de espécies reativa de oxigênio e nitrogênio, encontrando-se diretamente associada como a presença da RI e do hiperandrogenismo, propiciando um aumento adicional no estresse oxidativo e, consequente, no dano de DNA (BLAIR et al., 2013; GONZALEZ et al;, 2006; HULSMANS et al., 2010). O estresse oxidativo pode induzir um estado próinflamatório contribuindo para RI e hiperandrogenismo na SOP, assim como a hiperglicemia gera aumento nos níveis de ROS a partir de células mononucleares, que ativam a libertação de TNF-alfa e aumentam os fatores de transcrição NF-kappa B. Como resultado, as concentrações de TNF-alfa, um mediador conhecido da resistência à insulina, se exacerbam e o sistema operacional resultante cria um ambiente inflamatório que aumenta ainda mais resistência à insulina e contribui para hiperandrogenismo (KIRALY et al., 2015). A inflamação e a RI apresentam uma relação de causa-efeito com a obesidade e contribuem para o aumento da produção de ERO em pacientes obesos. Por isso as voluntárias do presente estudo foram agrupadas quanto ao IMC em eutróficas e

49 48 com sobrepeso e obesidade para avaliação da genotoxicidade, independente da obesidade. Os resultados não relataram diferenças significativas entre os grupos de estudos, divergindo dos resultados encontrados por Fernández-Sanchez (2011) que demonstrou a existência de uma correlação positiva entre o aumento do estresse oxidativo e a obesidade, que pode acontecer devido ao estímulo que o tecido adiposo exerce na produção de macrófago e de citocinas inflamatórias, aumentando a respiração celular e a produção do EROS (SIQUEIRA, 2000). Impacto da dieta nos marcadores de Dano de DNA e nos marcadores cardiometabólicos nas mulheres com SOP e sobrepeso e obesidade Nossos resultados revelaram o positivo impacto da dieta na redução da genotoxicidade, por meio da redução dos marcadores de dano de DNA, em mulheres com SOP, bem como nos marcadores de risco cardiometabólicos. Essa estratégia pode constituir uma terapêutica importante para proteção e/ou reparo de alterações no genoma, visto o já relatado aumento na susceptibilidade à oxidação do DNA apresentado por elas, em comparação com mulheres saudáveis ovulatórias (MORAN et al., 2008; DINGER et al., 2005; LIU J e ZHANG, 2012; YESILADA et al., 2006). Ressaltamos que a medição de danos no DNA, escolhida para avaliação da genotoxicidade em nosso estudo, é considerado como um biomarcador ideal para a avaliação da influência dos alimentos ou componentes de alimentos sobre doenças consequentes de alterações genômicas, como o câncer, e o ensaio cometa alcalino (electroforese em gel de célula única) é considerada como uma técnica adequada para tal uma avaliação (WASSON et al., 2008). Demostramos também uma modificação no padrão de consumo de nutrientes após dieta, como a redução da ingestão de gorduras totais e substituição do consumo de gordura saturada por poli-insaturados, revelando uma possível influencia desse padrão na redução dos níveis de dano de DNA relatados no estudo. Esses dados colaborando com uma recente publicação que associou a fontes e tipos de gordura na dieta com os aumentos nos níveis de danos no DNA (BISHOP et al., 2015). Além disso, houve uma redução significativa no consumo de carboidratos simples e um aumento no consumo das gramas de fibras, sem diferenças significativas. No entanto, trabalho em animais despontaram para a relação existente entre o consumo de fibras e a manutenção

50 49 da microbiota intestinal, influenciando na redução dos marcadores de estresse oxidativo e auxiliando na proteção do genoma, o que pode sugerir a associação com esses fatores (NAVARRO et al., 2015). As reduções de danos no DNA neste estudo também podem ser reflexo do aumento proporcional no consumo de vitaminas antioxidantes com A, C e E, presente em frutas e vegetais que estão associadas com o combate de EROs, reduzindo o dano de DNA e aumentando sua capacidade de reparação do DNA (ZEIGER 2003; GAZIEVet al., 1996; COLLINS et al., 2003; KABAT et al., 2012; MITJAVILA et al., 2013). A dieta indicada possibilitou o aumento no consumo de folato pelas mulheres. Estudo que avaliou suplementação de folato (5 mg/dia) durante 8 semanas entre as mulheres com a SOP, resultou numa significativa redução dos marcadores inflamatórios, de RI e aumento de antioxidantes, reduzindo os marcadores de estresse oxidativo (BAHMANI et al., 2014). Neste trabalho não houve administração de suplementos. As concentrações de antioxidantes, vitamina e minerais que apresentaram aumento no consumo, após a dieta, foram provenientes de fontes de alimentos naturais inseridos no contexto da alimentação saudável prescrita às voluntárias. Estudos demonstram que a adesão a Dietas consideradas de padrão saudável como dieta DASH (Dietary Approaches to Stop Hypertension), abordagem dietética para tratamento da hipertensão, e dieta do Mediterrâneo, são compostas dos mesmos princípios adotados no presente estudo: o estimulando o aumento no consumo de frutas, hortaliças, fibras, minerais, castanhas, sementes e laticínios com baixos teores de gordura. Além de redução no consumo de alimentos com alto teor de gordura total e saturada e colesterol. Trabalhos avaliando a adesão ao padrão alimentar DASH durante 8 semanas entre mulheres com sobrepeso e obesas com SOP apresentaram efeitos benéficos em peso, IMC, triglicerídeos no soro, insulina e melhora na capacidade antioxidante em comparação com a dieta controle (ASEMI et al., 2014). Dietas ricas em vegetais e com uma quantidade considerável do ácido graxo poliinsaturado em substituição de gordura saturada, durante 8 semanas, também foi suficiente para diminuir as quebras no DNA de indivíduos com DM2 ( MULLNER et al., 2013). Essa estratégia pode ser ainda mais importante para mulheres com SOP, visto a relatada

51 50 redução dos níveis basais de antioxidantes nessas mulheres (MOHAMADIN et al., 2010). A dieta hipocalórica para redução de peso seguida pelas voluntárias SOP também pode ter cooperado para a redução dos marcadores de dano de DNA apresentada nos nossos resultados. Este fato é apoiado por evidências, na população em geral, nas quais a redução calórica em 20%, por meio de dieta ou por aumento no gasto energético, por um período de um ano, resultou em melhorias significativas nos marcadores de dano de DNA (HOFER et al., 2008), bem como dados demostrados por Benassi-Evans B e seus colaboradores (2010), nos quais a perda de peso utilizando duas proporções distintas de macronutrientes, alta de proteína (35% de proteína, 40% de carboidratos) ou alta de carboidrato (17% de proteína, 58% de carboidratos), com duração de 12 semanas, reduziu a genotoxicidade, independente da proporção de macronutrientes da dieta. Restrições calóricas de 6 meses também foram suficientes para melhorar os marcadores de longevidade e reduzir o estresse oxidativo, refletindo em menos danos no DNA (HEILBRONN et al., 2006). O excesso de peso, muitas vezes proveniente do consumo de refeições ricas em gordura e alto teor de carboidratos, atua como fator de estresse para a proliferação de adipócitos, causando superprodução de ROS (CALLE EE e KAAKS R, 2004). Trabalhos que demonstram a eficácia de dietas hipocalóricas com diferentes proporções de macronutrientes (hiperprotéicas ou hiperglicêmica, com proporções iguais de gorduras) são igualmente eficazes na redução de peso e na melhora das anormalidades reprodutivas e metabólicas de mulheres com SOP (SORENSEN et al., 2012) e acreditamos que os nossos resultados possibilitam que essas melhorias sejam ampliadas para a instabilidade genômica nessas mulheres. Os mecanismos exatos relacionados à instabilidade genômica na SOP são incertos, no entanto, hiperandrogenismo, hiperglicemia e RI, além do aumento da geração de ROS podem estar associados ao aumento dos danos de DNA nessas mulheres (GONZÁLEZ et al., 2006; KURDOGLU et al., 2012). Por isso, a redução do hiperandrogenismo após a dieta pode estar relacionado com a redução do dano ao DNA apresentado no nosso estudo, uma vez que existe uma relação direta entre os níveis de andrógenos e aumento da expressão de proteína oxidativa (MORAN et al., 2003;

52 51 GONZÁLEZ et al., 2006). Além disso, o nosso modelo multivariado demonstrou que antes da intervenção dietética havia uma influência dos níveis de progesterona e QUICK na variação de danos no DNA e que, após a dieta, esses marcadores perderam o poder de influencia sobre a variação do dano, nos levando a acreditar que a redução desses fatores de risco pode conferir proteção ao genoma nessas mulheres. Outro fator que pode estar associado à redução das lesões ao DNA após a dieta, é a melhora da sensibilidade à insulina. Houve uma redução de aproximadamente 50% de insulina em jejum e, consequentemente, o índice HOMA-IR, o que pode estar relacionado com atenuação do estresse oxidativo, comumente encontrado elevado em mulheres com SOP (HYDERALI BN e MALA K,. 2015; MURRI et al., 2013). Estudo demostra que estratégias para redução do peso, como exercício físicos e/ou modificação da dieta, são capazes de aumentar a sensibilidade à insulina por melhorar as defesas antioxidantes e reduzir o estresse oxidativo, corroborando com nossos achados (MURRI et al., 2010). No entanto, ao traduzir nossos resultados para a prática clínica, é preciso ter em mente que a nossa população do estudo consistiu-se de um número relativamente pequeno de pacientes e que as características fenotípicas da síndrome são bastantes variáveis de regiões, populações e alterações metabólicas. Além disso não foram incluídas mulheres controles na intervenção, o que inviabiliza a extrapolação para mulheres sem a síndrome.

53 52 7. CONCLUSÕES -Verificamos aumento nos marcadores de hiperandrogenismo, resistência à insulina, lipídios séricos e citocinas inflamatórias em mulheres com SOP quando comparado á mulheres controles, conferindo-lhes pior perfil de risco cardiometabólico; - O pronunciado aumento do dano de DNA nas mulheres com SOP, não foi confirmado em nossa amostra, permanecendo o grupo SOP e o controle com genotoxicidades semelhantes; - A intervenção dietética reduziu o peso, o IMC, a resistência à insulina, melhorou o perfil lipídico e o hiperandrogenismo nas mulheres com SOP sobrepeso ou obesas, reduzindo o risco cardiometabólico nessas mulheres; - A intervenção dietética reduziu a genotoxicidade de mulheres com SOP sobrepeso ou obesas. Assim é possível sugerir que a incorporação de práticas que busquem minimizar a obesidade e melhorar o padrão de consumo alimentar utilizando-se de alimentação saudável, além de serem alternativas de tratamento para redução dos fatores de risco cardiometabólico, também pode configurar uma importante terapêutica para redução da genotoxicidade, conferindo assim, um efeito protetor ao organismo das mulheres acometidas pela SOP. A partir desses resultados buscaremos investigar, com futuros estudos, quais práticas ou alimentos consumidos, podem influencia na redução da genotoxicidade na SOP, para assim, identificar um padrão alimentar ideal de consumo que minimizem os efeitos maléficos causados pela síndrome e propor condutas que possibilitem uma proteção genômica a essas mulheres.

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67 66 ANEXOS ANEXO A Aprovação do comitê de ética em pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes.

68 67 ANEXO B Tampões e soluções 1. Solução de Lise ESTOQUE, para volume de 1 L: 2,5 M NaCl que corresponde a 146,1g 100 mm EDTA que corresponde a 37,2g 10mM Tris que corresponde a 1,2g 1% N-Lauroyl-Sarcosine* que corresponde a 10g a. Colocar todos os reagentes em um Becker (exceto o N-Lauroyl- Sarcosine*), em seguida adicionar, inicialmente, 800ml de água destilada, para iniciar a diluição no agitador; b. Ajustar o ph para 10, com o NaOH, antes de colocar o N-Lauroyl-Sarcosine; c. Depois de ajustar o ph, colocar o N-Lauroyl-Sarcosine e completar com água destilada até atingir o volume de 1000ml(1L); d. Depois de pronta a solução, coloca-lá m um vidro âmbar esterilizado e conservar em temperatura ambiente, abrigado da luz. Essa solução é valida por no máximo 4 meses. 2. Solução de EDTA EDTA 14,89g (preciso) Água Destilada 200ml OBS: O ph deve ser ajustado para 10, com NaOH. Depois de pronta, adicionar a solução em um vidro âmbar, esterilizado e conserva-la em temperatura ambiente, abrigado da luz. Essa solução é valida por no máximo 4 meses. 3. Solução de NaOH NaOH 200g Água Destilada 500ml OBS: Depois de pronta, adicionar a solução em um vidro âmbar, esterilizado e conserva-la em temperatura ambiente, abrigado da luz. Essa solução é valida por no máximo 4 meses. 4. Solução de Neutralização: 0,4 M Tris corresponde a 48,5g Água Destilada 1000ml OBS: o ph deve ser ajustado para 7,5 com HCl. Depois de pronta, adicionar a solução em um vidro âmbar, esterilizado e conserva-la em temperatura ambiente, abrigado da luz. Essa solução é valida por no máximo 4 meses. 5. Solução de Coloração ou Brometo de Etídio: ESTOQUE *Usar luva apropriada e máscara para preparo da solução. Cuidado ao manipular o brometo de etílico, pois é uma substancia cancerígena.. Brometo de Etídio 10mg Água Destilada 50ml

69 68 OBS: Depois de pronta, colocar a solução em um pote plástico (de coleta de urina) e conservar em temperatura ambiente, abrigado da luz. 6. Solução de Coloração ou Brometo de Etídio: USO Fazer uma diluição da solução de coloração estoque de 1 para 10, ou seja: Solução de Coloração de Estoque 1ml Água Destilada 9 ml 7. Preparo da Agarose 7.1 Agarose: Ponto de fusão Normal Agarose 300mg (0,3g) PBS livre de Ca2+ e Mg 2+ 20ml * Essa agarose só pode ser diluída no momento em que foi utilizada Coloca-se a agarose em um Becker para diluí-la em PBS livre de Ca 2+ e Mg 2+, deixando-a ferver de duas a três vezes no microondas. Manter o gel já diluído no banho Maria a 60 C. Essa agarose é utilizada para preparação da lâmina. 7.2 Agarose- Low Melting Point ( Baixo ponto de fusão) Agarose 100mg (0,1g) PBS livre de Ca2+ e Mg 2+ 20ml * Essa agarose só pode ser diluída no momento em que foi utilizada Colocar a agarose em um Becker e diluí-la em PBS livre de Ca 2+ e Mg 2+, Aquecer no microondas, sem deixar ferver, e em seguida, transferi-la para o banho Maria a 37 C. Essa agarose é utilizada na preparação da amostra. 8. Solução de LISE USO * Para preparo da solução de LISE USO é necessário utilizar a solução de LISE ESTOQUE Triton X-100 1ml DMSO 10ml Colocar em uma proveta de 100ml o DMSO seguido do Triton X-100 e, em seguida, completar o volume para 100ml com a solução de lise Estoque (item 1) OBS: Essa solução deve ser feita aproximadamente duas horas antes de ser utilizada. Depois de pronta, colocar a solução em uma cobeta de vidro com tampa e embrulhada em papel alumínio. Manter na geladeira á 4, até a hora do uso. 9. Solução Tampão da Eletroforese Formada pela junção da solução de EDTA com a solução de NaOH prepara anteriormente. Solução de EDTA (item2) 5ml Solução de NaOH (item 3) 30ml Misturar as duas soluções em um Becker e completar o volume para 1000ml com água destilada gelada. O ph deve ser ajustado para 13. Depois de pronto deixar o tampão da geladeira até o momento de ser utilizado.

70 ANEXO C Carta de submissão à revista: Annals of Nutrition and Metabolism 69

71 APÊNDICE A Formulário de pesquisa para coleta de dados clínicos. 70

72 71 APÊNDICE B Artigo submetido na Annals of Nutrition and Metabolism Diet-induced weight loss reduces DNA damage in overweight/obese women with Polycystic Ovary Syndrome Nayara Pereira Soares 1, Ana Celly Souza dos Santos 1, Eduardo Caldas Costa 2, George Dantas Azevedo 3, Débora Cristina Damasceno 4, Ana Paula Trussardi Fayh 5, Telma Maria Araújo Moura Lemos 1 Affiliation 1 Department of Clinical and Toxicological, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil 2 Department of Physical Education, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil 3 Department of Morphology, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil 4 Department of Gynecology and Obstetrics, Botucatu School of Medicine, São Paulo State University, Botucatu, São Paulo, Brazil 5 Department of Nutrition, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil Abbreviated title: Diet reduces DNA damage in PCOS Key terms: Diet; DNA damage; Polycystic Ovary Syndrome; overweight; obesity Word count: 2849 Number of figures and tables: 5 Corresponding author and person to whom reprint requests should be addressed: Nayara Pereira Soares Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia Universidade Federal do Rio Grande do Norte Rua General Cordeiro S / Natal / RN N, Petrópolis CEP: Phone: (84) nayara.pereirasoares@gmail.com Disclosure statement: The authors have nothing to disclose

73 72 Abstract Aims: We aimed to investigate the impact of intervention with diet to induce weight loss (500Kcal deficit per day) over DNA damage and cardiometabolic risk factors in women with overweight/obesity diagnosed with Polycystic Ovary Syndrome (PCOS). Methods: A study was conducted in Natal, RN, Brazil selecting overweight/obese (BMI 25 and <39 kg/m2) women (18 35 years old). The levels of DNA damage were assessed by gel electrophoresis of a single cell (SCGE). Repeated 24 h dietary recall questionnaires, anthropometry, biochemical profile and sex hormones were collected at baseline and after twelve weeks the intervention. Results: women exhibiting a decrease in the markers of DNA damage: tail intensity (24.35 ± pre diet vs ± pos-diet) (p <0.001) and tail moment (20.47 ± pre diet vs ± postdiet) (p <0.002). Reduction of calorie intake, weight loss, decreased sexual hormone and cardiometabolic markers such as insulin, HOMA-IR and LDL cholesterol were verified In the multivariate regression analysis, QUICK and progesterone were responsible for the variation markers in DNA damage before the diet, losing its influence upon diet. Conclusion: DNA damage and cardiometabolic risk factors decreased after intervention in women with PCOS indicating the relevance of a nutritional approach in this group of patients. Key-words: Diet; DNA damage; cardiometabolic risk factors, overweight, obesity, Polycystic Ovary Syndrome.

74 73 Introduction Polycystic ovary syndrome (PCOS) is the most common endocrine disorder in women of reproductive age, affecting 6-12% of the referred population [1, 2]. The main features of PCOS include chronic anovulation, hyperandrogenism and altered ovarian morphology [3]. In addition, women with PCOS have an increased prevalence of cardiometabolic risk factors and diabetes [4-6]. Our research group has reported higher prevalence of central obesity [7], insulin resistance [8], low-grade chronic inflammation [9], hypertension [10], metabolic syndrome [11] and a worse autonomic cardiac function [12] in women with PCOS compared to healthy women. It is well established that obesity, which is present in 30-70% of women with PCOS [13,14], as well as other cardiometabolic risk factors (e.g., insulin resistance) are associated with generation of reactive oxygen species (ROS), which may increase DNA damage [15,16]. DNA damage occurs through constant exposure to DNA mutagens of exogenous and/or endogenous origin [17] including cell metabolism and inflammatory responses [18]. Previous studies have reported that women with PCOS present higher DNA damage than healthy ovulatory women, suggesting increased genomic instability [19,20] and an increased risk for developing cancer in this population [21,22]. Thus, interventions that decrease obesity and improve cardiometabolic risk factor may reduce genomic instability and DNA damage. From a clinical perspective, a healthy diet with moderate weight reduction (5-10%) improves cardiometabolic risk factors in overweight/obese women, which may reduce genomic instability and DNA damage [23, 24]. The Androgen Excess and Polycystic Ovary Syndrome (AE-PCOS) Society states that lifestyle modification, including a healthy diet with moderate weight reduction, should be the first-line therapy for overweight/obese women with PCOS [25, 26]. This is supported by previous investigations, which reported that reducing caloric diet in the setting of adequate nutritional intake and healthy food choices improves several cardiometabolic risk factors in overweight/obese women with PCOS [6, 27, 28]. However, to the best of our knowledge no previous study investigated the effects of a diet on DNA damage in women with PCOS. Therefore, this study aims to assess the effects of diet on DNA damage and cardiometabolic risk factors of overweight/obese women with PCOS. Our initial hypothesis is that a diet can improve the standard of food intake, reduce weight and cardiometabolic risk factors, which in turn would reduce the DNA damage.

75 74 Material and Methods Subjects and study design Overweight and obese (body mass index 25 and <39 kg/m 2 ) women with PCOS, aged from 18 to 35 years, were eligible for this trial. Thirty-five patients were selected from the Januário Cicco Maternity Hospital of the Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil. The diagnosis of PCOS was made according to the Rotterdam ESHRE-ASRM-sponsored PCOS criteria [3] by two independent endocrinologists. Patients diagnosed with other disorders, such as type 2 diabetes, nonclassical congenital adrenal hyperplasia, thyroid dysfunction, and hyperprolactinemia as well as patients with renal or hepatic dysfunction or use of medications known to affect reproduction, cardiovascular and/or metabolic function within 90 days of study entry were excluded. This study was approved by the Institutional Ethics Committee and all subjects gave their written informed consent. All patients participated in a 12-week diet intervention program. At baseline and after twelve weeks the following parameters were analyzed: habitual dietary intake, weight, waist circumference, hormonal and biochemical parameters and DNA damage levels,. At study entry all women were oriented to maintain their habits, especially regarding the physical activity (none of them was involved in a regular physical activity program). Dietary Intervention Each participant s energy needs were calculated and adjusted to generate a 500-kcal deficit per day [29, 30]. Dietary characteristics included15% energy from protein, 60% from carbohydrates (8% simple sugar) and 25% from fat (7% saturated fat) with macronutrient composition calculated as a percentage of the total calories, andwith a consumption of 25g/day of fibers. An amount of 400g/day of fruits and vegetables was ingested by patients. Cereals, roots and tubers, milk and dairy products, meat and eggs, with low supply of saturated fats, cholesterol and refined grains, were recommended [31, 32]. Diets were supervised by a dietician and delivered together with a list of healthy food, seasonal shopping lists, meal plans, and recipes. Every two weeks, patients returned to measure body weight and, if necessary, adjustments were made to the diet to improve compliance. Energy and macronutrient intake were evaluated using 24h dietary recalls (2R24h) prior to the diet intervention and post-diet. Food intake

76 75 based on the information obtained with the 24hR was calculated using software Virtual Nutri Plus, version Anthropometric Patients were submitted to a clinical examination before and after the dietary intervention period. The following anthropometric parameters were assessed: height (m), weight (kg), and waist circumference (WC) (cm). WC was measured after expiration, with tape not extensible at the midpoint between the tenth rib and the iliac crest. Body mass index (BMI) was calculated as current weight (kg) divided by squared height (m), according to World Health Organization [33]. Biochemical and hormonal parameters Peripheral blood samples were obtained after overnight fasting. The metabolic profile included fasting glucose, triglycerides, high-density lipoprotein (HDL) and lowdensity lipoprotein (LDL) levels. All biochemical assays were determined using commercial kits (Diagnostic Labtest - SA, São Paulo, Brazil) by the colorimetric method / enzyme in equipment Bioplus 2000 (Bioplus, Barueri, São Paulo State, Brazil). LDL-cholesterol was calculated following Friedewald s formula [34]: LDL= total cholesterol - HDL-C-(triglycerides/5). The results are expressed as mg/dl. Follicle stimulating hormone (FSH), progesterone, testosterone, sex hormone binding globulin (SHBG), and insulin were assessed by chemiluminescence (Immulite 1000, Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA). Insulin resistance (IR) was calculated by the homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-IR): fasting insulin (µiu/ml) x fasting glucose(mmol/l)/22.5 and the quantitative insulin sensitivity check index (QUICKI),QUICKI=1/ (log insulin (µiu/ml) +log glycemia (mg/dl) [35]. DNA damage analysis DNA damage was analyzed for single-cell gel electrophoresis (SCGE) according Gontijio and Tice (2003) [36]. Briefly, a volume of 10 ml peripheral blood was mixed with 100 µl of 0.5% low melting point agarose at 37 o C, layered on slides precoated with normal melting point agarose and immediately covered with a coverslip. The slides were allowed to cool at 4 o C for 5 minutes (min) to solidify the agarose. The slides were gently removed and immersed in a freshly prepared solution of ice-cold lysis (2.5 M NaCl, 100 mm EDTA, 10 mmtris, 1% Triton X-100 and 10% dimethyl sulfoxide

77 76 added immediately before use) to lyse cells and to allow the DNA to unfold. After 1h in the dark at 4 o C, slides were briefly rinsed in phosphate-buffered saline (PBS) and placed in a horizontal electrophoresis unit, filled with fresh alkaline electrophoresis buffer (300mMNaOHand 1mMEDTA ph> 13). Electrophoresis was conducted at 4 o C for 20 min at 25 V and 300 ma. The slides were neutralized in a buffer (0.4 M Tris ph 7.5).The dry analytical microscope slides were stained with ethidium bromide (20 g/ml in distilled H 2 O; 50l/blade), covered with a coverslip before analysis ina Zeiss fluorescence microscope. The microscope was connected to a device (CCD) charge coupling and a personal computer for analysis system (Comet Assay II Perceptive Instruments, UK) to determine the extent of DNA damage. Results were expressed as percentage of DNA in the tail (tail DNA fraction divided by the amount of DNA in the cell, multiplied by intensity tail - tail%), tail moment (tail product and the mean distance of migration in tail arbitrary units), and the tail length (distance from the medium or the perimeter of the head estimated to last visible comet tail signal (m) [37]. Hundred cells randomly selected (50 of each of the two replicate slides) were marked by a blood sample. Statistical Analyses Results are presented as mean, SD, and 95% confidence interval (CI) or as median and interquartile range (25 th -75 th percentiles). The data was tested for normality using the Shapiro-Wilk test. Comparisons between baselines post-intervention were performed using paired t-test and Wilcoxon signed-rank test for parametric and nonparametric analyses, respectively.in addition, the effect size was calculated using Cohen s d: small effect = 0.2; medium effect= 0.5; large effect = 0.8 [38]. Data were analyzed using SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) version 20.0 for Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL). For the post hoc power analysis, the G*Power for Windows was performed. In order to identify metabolic risk factors that explain the variation in DNA damage before and after intervention, a multivariate linear regression analysis was performed. Correlation tests of Pearson and Spearman were respectively applied for parametric and nonparametric variables. A multivariate analysis was performed with variables with p values <0.20 in the previous association tests.the model was considered significant when presented all the explanatory variables with p<0.05.

78 77 Results Figure 1 shows the patient s recruitment flow diagram. Twenty-two volunteers (26 ± 6.0 years of age, 1.56 ± 6 6 cm height) completed the study. Women with PCOS Overweight/obese (n= 35) Dietary intervention 12 weeks (n= 27) Completed the study (n=22) Excluded: (n= 08) diabetes (n= 02) smoking (n=01) pregnant (n =01) started medications (n= 04) Discontinued intervention: (n= 05) personal problems (n=02) time constraints (n= 03) Fig.1 Flow diagram schematically representing the design of this study Dietary intake baseline and post-diet of the patients is shown in Table 1. After a 12-week intervention, the self-reported 24-hour caloric intake was significantly reduced by 675 (±440)kcal/day, with reduced consumption of carbohydrates (106.9 ± 25.6 g/day), proteins (20 ± 5.6 g/day), total fat (25.7± 5.6 g/day), consumption of saturated fats (21.1 ± 2.7 g/day), cholesterol level (147.2 ± 90.3 g/day), and sodium (792 ± mg/day). It was also verified increased consumption of fiber (5.6 ± 9.5 g/day) and mono (3.6±2.4) and polyunsaturated fats (2.4± 4.4 g/day). The levels of vitamins A, C and Ewere adjusted to the reference values recommended by Dietary Reference Intakes (DRI) [29].

79 78 Table 1. Dietary intake assessed before and at the end of the total 12-wk dietary intervention in overweight and obese patients with polycystic ovary syndrome. PCOS women (n=22) Nutrient Baseline (Week 0) Post-Diet (Week 12) Total Energy (kcal/day) ± ± Daily Intakes (% energy) AMDR Protein ,9 % 18,7 % Carbohydrate ,7 % 53,1 % Total fat ,4 % 28,2 % Daily Intakes (day) RDA/AI Protein, g ± ± Carbohydrate, g ± ± Total dietaryfiber, g ± ± Total fat, g ± ± Saturatedfat, g ± ± Monounsaturatedfat, g ± ± Polyunsaturatedfat, g ± ± Cholesterol, mg ± ± Sodium, mg ± ± Vitamin A, mcg (RAE) a ± ± Vitamin C, mg ± ± Vitamin E, mg (AT) b ± ± Folate,mcg ± ± Note: AMDR= acceptable macronutrient distribution. DRIs= Dietary Reference Intakes; AI= Range; Data are means ± SD; test t paired*. a Retinol activity equivalents, b AT = mg d-αtocopherol. Fonte: Institute of Medicine/Food and Nutrition Board, p a Table 2 shows the effect of intervention on anthropometric, hormonal, and biochemical parameters. The weight loss of 3.5% (~2 kg) was related with significant reduction in BMI, FSH, testosterone and SHBG levels and increase progesterone. It was also noted a reduction of fasting blood glucose and plasma insulin, HOMA-IR and an increase QUICK. However, there were no significant changes in WC, triglyceride and HDL-cholesterol levels.

80 79 Table 2. Baseline and post-diet anthropometric, hormones and metabolic parameters in overweight and obese patients with polycystic ovary syndrome. PCOS women Baseline Post-Diet p a (n=22) (Week 0) (Week 12) Anthropometric Body weight (kg) 73.3 ± ± BMI (kg/m 2 ) 29.8 ± ± Waist circumference (cm) 95.4 ± ± Hormones FSH (mui/ml) 4.0 ± ± Progesterone (ng/ml) 0.37 ( ) 1.89 ( ) SHBG (nmol/l) 158 ( ) 115 (99-122) Testosterone (ng/dl) 140 ( ) 129 ( ) Metabolic Fasting glucose (mg/dl) 79± ± Fasting insulin (μiu/ml) 11.3 ( ) 5.5 ( ) HOMA-IR (mol x μu/l) 1.9 ( ) 0.9 ( ) QUICK 0.34 ± ± Triglycerides (mg/dl) 123 (63-164) 94 ( ) HDL cholesterol (mg/dl) 43.7 ± ± LDL cholesterol (mg/dl) 89 (70-104) 86 (50-50) Note: Data are expressed mean ±SDs or median (25 th 75 th percentile). a Statistical comparisons were performed by student t test paired for means and by Wilcoxon test for medians. PCOS= polycystic ovary syndrome; BMI= body mass index; WC= waist circumference; FSH=follicle-stimulating hormone; SHBG= sex hormone binding globulin; HOMA-IR= homeostasis model assessment of insulin resistance; QUICKI=quantitative insulin sensitivity check index A decrease on DNA damage markers was observed after the diet intervention (Figure 2). Tail intensity (24.3 ± 5.9% vs.17.1 ± 5.0%), and tail moment (20.5 ± 7.8 UA vs. 14.1± 6.3 UA) decreased after intervention (p < 0.01) with a large effect size (Cohen s d > 0.8), while tail length showed a trend to decrease (208.4 ± 45.9 µm vs ± 40.5µm) (p = 0.07).

81 80 Fig.2 Variation of DNA damage markers: tail intensity, tail length and tail moment in overweight and obese patients with polycystic ovary syndrome (n=22).boxplots show median, upper and lower quartiles and minimum and maximum data. The effect size (ES) was calculated by Cohen s d. A post hoc statistical power analysis (two-tailed) for the difference between baseline vs. post-intervention was conducted to determine the achieved power of the Wilcoxon signed-rank test, based on the investigated sample size (n=22) forthe DNA damage parameters. In this line, tail intensity and tail moment,as parameters of DNA damage, presented improvements after intervention. Considering an alpha of 0.05, the achieved power was 0.99 for both tail intensity and tail moment. Multiple logistic regression identified progesterone level and QUICK responsible for 47.5% of the variation of DNA damage measured by tail intensity. The ratios for the corresponding probabilities (95% confidence interval - CI) for QUICK and progesterone were 84.8% ( ) and 6.11% ( ), respectively, before the diet. The same variables did not explain the variation of the DNA damage after the diet.

82 81 Figure 3 plots the different values of the tail intensity in observed versus predicted probabilities before and after the diet. A B Fig.3. Multiple logistic regression with odds ratio and 95% for overweight and obese patients with polycystic ovary syndrome (n = 22), identifying the levels of progesterone and QUICK responsible for the change of DNA damage measured by the tail intensity Discussion The main findings of our study were that a healthy diet intervention with an average weight loss of 3,5% reduced the cardiometabolic risk factors (mainly insulin resistance) and DNA damage in overweight/obese women with PCOS. To the best of our knowledge, this is the first report showing the positive impact of a healthy diet intervention on genomic instability of an adult female population with an increased cardiometabolic risk factors (i.e., women with PCOS). Effects of diet, weight loss and nutritional factors associated with DNA damage and /or repair processes are inconclusive in the literature. In this sense, our results support the hypothesis of a proper and balanced diet (even with a discrete loss of weight) exerting a protection role on genome, by enhancing DNA repair and / or preventing cell death and mutations as shown in previous studies [24,39,40,41]. Some factors might have influenced the reduced DNA damage after diet intervention observed in our study, such as reducing the intake of total fats to replace