Panorama. Teste Pré-natal não invasivo. Revista Médica

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1 Grupo Revista Médica :: Edição Especial :: Teste Pré-natal não invasivo Panorama Shutterstock TM Exame inovador permite rastreio de doenças genéticas fetais no sangue materno, já na nona semana de gestação.

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3 Por Dr. Gustavo Guida* Teste pré-natal não invasivo Exame inovador permite rastreio de doenças genéticas fetais no sangue materno, já na nona semana de gestação. Em 1969, Walknowska publicava no Lancet a presença de linfócitos fetais na circulação materna; em 1993, Simpsom e Elias publicavam no JAMA a existência de DNA fetal livre no sangue materno (cell-free fetal DNA cffdna). Porém, o uso habitual desse material era impedido por dificuldades técnicas, tanto para detecção e extração de DNA das células fetais, quanto para sequenciamento do material fetal, que representa só uma pequena parte do DNA livre no sangue materno. Durante as décadas de 1980 e 1990, surgiram testes de rastreamento não invasivos. Na ultrassonografia, tornaram-se mais conhecidos marcadores de risco para as aneuploidias: a translucência nucal, a presença de osso nasal, entre outros. A dosagem de marcadores em sangue materno (testes duplo, triplo e quádruplo) passou a ser usada, associada à ultrassonografia, na seleção das gestações em risco dentro da população, para indicação de exames invasivos. São métodos relativamente baratos e confiáveis, porém com algumas limitações. A ultrassonografia, como é de conhecimento geral, é examinador- -dependente; mesmo com o rastreio bioquímico associado, ainda persiste uma especificidade abaixo do ideal, o que num teste de rastreio acaba por acarretar um grande número de falso-positivos, levando mais gestantes a se submeterem a biópsia de vilo coriônico ou amniocentese. Com o desenvolvimento do NGS (next-generation sequencing) surge a capacidade de lidar com o cffdna e gerar uma grande quantidade de sequências lidas a partir dele. Os primeiros exames em DNA fetal livre surgiram a partir da aplicação do sequenciamento em larga escala e métodos de contagem. Através da abordagem conhecida como shotgun-sequencing, realiza-se o sequenciamento de diversos trechos de cada cromossomo, independente da ordem, que depois são contados e comparados proporcionalmente. Algumas limitações inerentes a este método são a necessidade de se ter um cromossomo de referência para aplicar a proporcionalidade, o que impede a detecção das triploidias, e o fato de alguns cromossomos serem ricos em sequências que são sub-representadas nessa técnica de sequenciamento, diminuindo a sensibilidade do método. Um dos principais cromossomos envolvidos em aneuploidias viáveis, o cromossomo 13, está nessa situação. DASA 3

4 O teste NIPT Panorama tem três importantes vantagens em relação aos demais NIPTs disponíveis comercialmente: maior sensibilidade e menor taxa de falsos positivos em 9 semanas, e, resultado mais rápido, em ate 10 dias. PANORAMA TM : A NOVA GERAÇÃO EM TRIAGEM NÃO INVASIVA: Duas inovações ainda modificariam substancialmente a triagem não invasiva. O uso do sequenciamento de sequências alvo, os SNPs (single nucleotide polimorphism), e a aplicação de um algoritmo utilizando análise bayesiana dos dados gerados. COMO É FEITO Após a coleta de sangue periférico materno, este é centrifugado para separar o plasma e a buffy coat, camada leucoplaquetária. No plasma, encontra-se o cffdna, misturado ao DNA materno. Quando este material é usado no sequenciamento, gera um conjunto de dados que compreende o perfil de SNPs materno, e um conjunto de sinais contaminantes, isto é, do feto. Já da buffy coat, é obtido o perfil de SNPs materno, que servirá como base para a descrição da sequência fetal. Cada um dos 23 pares de cromossomos materno está representado centenas de vezes no conjunto de mais de dezenove mil SNPs sequenciados no exame. Cada SNP materno é registrado como em homozigose ou heterozigose; para aqueles em homozigose, só há uma possibilidade de herança, enquanto para os alelos em heterozigose, são duas as heranças possíveis. A partir do perfil materno, o algoritmo NATUS (Next-generation Aneuploidy Test Using SNPs) realiza a análise bayesiana, gerando cada um dos perfis possíveis para o feto, considerando situações euploides e aneuploides. No sequenciamento do plasma, haverá uma leitura para cada alelo a princípio, 2 alelos maternos e 2 do feto. Comparando este resultado e o perfil materno, é possível gerar um perfil candidato para o feto, a ser então comparado às possibilidades pré-teste. A partir dos possíveis perfis, é elaborado o score de risco para cada uma das aneuploidias em estudo. LIMITAÇÕES Como o método funciona primariamente com a comparação do DNA fetal com o materno, existem algumas restrições. É necessária uma quantidade mínima de DNA fetal livre para a realização da análise; no caso do Panorama TM, quantidades tão pequenas quanto 4% já permitem a obtenção de resultados acurados, frente a necessidades maiores dos métodos de comparação proporcional (Figura 1). Além disso, quando há a presença de gêmeos dizigóticos, ovodoação ou gestante com transplante de medula, é contraindicada a análise. Para os gêmeos, a presença de 2 DNAs fetais simultâneos reduz a sensibilidade e especificidade abaixo do aceitável. Já a ovodoação ou o transplante de medula significam que o sangue periférico da gestante e o óvulo não são relacionados entre si, impedindo a dedução dos perfis pelo NATUS. Excepcionalmente, a consanguinidade, quando ocorre uma homozigosidade muito elevada no conjunto dos SNPs utilizados, também impede a obtenção de resultados confiáveis. Todos os exames abaixo do padrão estabelecido como ideal de acurácia dos resultados não são liberados; no caso da baixa fração de DNA fetal (<5% das primeiras coletas), é solicitada uma nova amostra, já que a fração de DNA livre aumenta durante a gestação, alcançando níveis suficientes para o exame em mais de 90% dos casos em que uma segunda coleta faz-se necessária.

5 FIGURA 1: Histograma de fração fetal após 9ª semana ,8% Número de amostras ,8% 0 < 4% Entre 4 e 8% Fração fetal livre 11,225 Commercial Panorama NIPT cases Fonte: Natera Inc. VANTAGENS O teste de trissomias fetais Panorama TM permite hoje o diagnóstico das trissomias dos cromossomos 21, 18 e 13, além da síndrome de Turner e a triploidia. O Panorama TM tem demonstrado ser capaz de fornecer resultados de elevada acurácia de forma consistente em todas as frações fetais até 4%, em comparação com os métodos de contagem, cuja acurácia pode ser comprometida no intervalo de fração fetal entre 4-8%. É importante ressaltar que as observações comerciais têm mostrado que cerca de 29% das gestações encontram-se nesta faixa crítica de 4-8% de fração fetal, nas quais a taxa de detecção dos outros métodos para a trissomia do 21 pode cair para valores tão baixos quanto 75%. Comparado aos métodos invasivos cariótipo de vilo corial, amniocentese ou cordocentese, que apresentam riscos ao feto, apesar de mitigados pela sua realização por profissionais experientes, e são associados a algum desconforto após o procedimento o Panorama TM é mais seguro e menos incômodo. Comparado aos outros testes não invasivos, é mais sensível, específico e acurado. Além disso, tem resultado em cerca de 10 dias, sendo capaz de determinar ainda o sexo fetal na nona semana de gestação. COMPARAÇÃO DA SENSIBILIDADE E TAXA DE FALSO POSITIVO DOS NIPTS EM GESTAÇÕES DE 9 SEMANAS. Sensibilidade Razão de falsos positivos Trissomia 21 (Síndrome de Down) Trissomia 18 (Síndrome de Edwards) Trissomia 13 (Síndrome de Patua) Monossomia X (Síndrome de Turner) Cromossomos Sexuais Trissomia Sequenom MaterniT21 99,1% 0,2% 100% 0,3% 91,7% 0,9% 94,7% 0,5% Feminino 97,9% 0,5% Masculino 99,4% 2,1% Testes pré-natais não invasivos: Comparação entre os trabalhos de pesquisa Verinata Verifi 99,9% 0,2% 97,3% 0,4% 87,5% 0,1% 95% 1% Ariosa Harmony 100% 0,1% 98% 0,1% 80% 0,05% 96,7% Não declarado Natera Panorama 100% (83/83) 0% 100% (27/27) < 0,1% 100% (13/13) 0% 91,7% (11/12) < 0,1% 100% % % 100% (5/5) 97,6% 0,8% 99,1% 1,1% > 99% Não declarado > 99% Não declarado 100% (469/469) 0% 100% (533/533) 0% Triploidia Incapaz de detectar Incapaz de detectar Incapaz de detectar 100% (8/8)

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS O PanoramaTM é um exame que visa ao rastreio de aneuploidias como todo teste de rastreio, indica-se a confirmação por outro método, no caso, o cariótipo ou array-cgh de material fetal. Ele não substitui a ultrassonografia apesar de muito melhor na avaliação de aneuploidias, o PanoramaTM não é capaz de avaliar malformações por outras causas, índice de líquido amniótico ou crescimento do feto, entre tantas das funções já bem estabelecidas da ultrassonografia. Sua maior vantagem é reduzir grandemente o número de exames invasivos por conta de resultados falso-positivos de ultrassonografia ou do teste triplo, ou mesmo os indicados unicamente devido à idade materna. Em uma única coleta, é possível obter a sexagem fetal e a estimativa de risco das aneuploidias, com valores de falso-positivo e falso-negativo expressivamente melhores do que os possíveis por outros métodos não invasivos. Em vista disso, não nos parece distante considerar que o PanoramaTM acabe por tornar-se o exame de escolha no rastreio de aneuploidias fetais, com resultados mais rápidos e confiáveis, sem expor os fetos a riscos desnecessários. Marcello Bravo REFERÊNCIAS *Dr. Gustavo Guida Consultor em Genética Clinica do Grupo Dasa Médico Geneticista do Hospital Universitário Pedro Ernesto; Membro titular da Sociedade Brasileira de Genética Médica. 1. Fetal lymphocytes detected in maternal blood Walknowska, J. et al. (1969) Lancet 1, Fetal DNA sequences exist in maternal blood Simpson, J.L. & Elias, M.D. (1993) JAMA. 270: Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood Fan HC et al. (2008) PNAS 4. Rabinowitz et al. Presented at ASHG 2012, Zimmermann et al. Presented at SMFM Palomaki GE et al. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study. Genet Med Nov; 13(11): Canal do médico:

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