Cortez, Susana Separação selectiva de microrganismos por filtração anisotrópica

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1 Universiae o Minho Cortez, Susana Separação selectiva e microrganismos por filtração anisotrópica ata e Publicação 5 Resumo Tipo Metaaos A filtração e células a fase líquia é uma operação em grane expansão em biotecnologia, na inústria alimentar e e bebias ou no tratamento e águas resiuais. evio ao aumento a importância económica estas inústrias torna-se necessário interpretar, e forma correcta os aos obtios e filtrações, principalmente porque, poe influenciar a escolha o métoo e filtração. É neste contexto que surge o trabalho apresentao e seguia, que tem como objectivo a separação selectiva e microrga... Liqui phase cell filtration is an expaning process in biotechnology, in the foo an beverage inustry or wastewater treatment. ue to the increasing economical importance of those inustries it becomes necessary to interpret, in a correct way, the ata filtration, mainly because it may influence the choice of the filtration metho. In this context the work that is presente here was create with the purpose the selective separation of microorganisms by the process of anisotropic filtration.... masterthesis Esta página foi geraa automaticamente em T13::3Z com informação proveniente o RepositóriUM

2 Introução 1.Introução O estuo o transporte e fluios em meios heterogéneos tem aplicação em istintos campos a ciência e engenharia tais como a reologia, geofísica, física e química, física o polímero, a ciência os colóies, a tecnologia o petróleo, a agricultura e a biotecnologia [1, ]. Uma subclasse particularmente notável os materiais heterogéneos é a área os meios porosos. Mesmo o termo "meios porosos" engloba uma varieae profuna e processos e ispositivos como torres empacotaas, leitos e areia e substâncias como pera calcária, filtros e papel e partículas catalíticas. Para meios porosos a preição o fluxo o fluio entre fases continua a ser alvo e vários estuos, apesar e já se terem passao muitos anos e pesquisa. As soluções a este problema são e grane importância para muitas aplicações. Por exemplo prever o fluxo e o transporte e contaminantes nos aquíferos e nos movimentos na zona insaturaa, o óleo e o gás em reservatórios e petróleo, no calor e no transporte e massa em reactores e leito fixo em engenharia química, em reservatórios geotérmicos e em materiais e construção, na ispersão e poluentes os epósitos e esperícios raioactivos, em processos e filtração, e em transporte os líquios e os proutos químicos nos pulmões e nos outros órgãos, como estuos na engenharia bioméica [1, ]. O movimento e colóies e e microrganismos em meios porosos é um fenómeno extremamente presente na natureza e inústria: no movimento as partículas ao longo o solo, em filtros e purificação e águas, na separação cromatográfica, etc. [3,4,5]. É importante saber como o tamanho e a forma essas partículas, na forma e matéria ispersa, influenciam o fluxo urante a sua passagem por meios porosos e cromatográficos, em particular. A cromatografia é efinia como um processo e separação e componentes e uma amostra pela sua istribuição entre um fluio corrente (fase móvel) e um asorvente (fase estacionária) [6]. A fase estacionária poe ser um sólio, ser um líquio asorvio a um sólio ou ser um gel; e poe ser empacotaa numa coluna ou espalhaa por uma superfície, formano uma camaa fina. A fase móvel poe ser um líquio ou um gás. e acoro com Sewell et al. [7] os parâmetros que caracterizam uma cromatografia são: a assimetria os picos, a capaciae, a selectiviae, o número e anares ou e pratos, a altura os anares e a resolução. Além isso, poe ser importante conhecer o coeficiente e partição e/ou e retenção. one A eluição é caracterizaa por um coeficiente e istribuição ou partição, C s K = (Equação 1.1) Cm C s é a concentração e soluto na fase estacionária e soluto na fase móvel. K ao por: Cm representa a concentração e 1

3 Introução O coeficiente e retenção, R, é efinio por: V m R = (Equação 1.) V r A capaciae ' k e um ao componente é aa através e: ' Vr Vm k = (Equação 1.3) Vm em que V é o volume e retenção (ou eluição) o pico o soluto corresponeno a um tempo r e retenção t r, característico e caa proteína e função a sua imensão, V m é equivalente ao volume e vazios meio pelo tempo e retenção, t e um componente excluío. Logo, é também válio que: k' tr t = (Equação 1.4) t No funo, o factor e capaciae ' k trauz o número e moles, volume ou o tempo a amostra na fase estacionária, sobre o número e moles, volume ou o tempo a amostra na fase móvel. O factor e capaciae poe ser consierao uma proprieae intrínseca o suporte. É função a fracção e vazios (ε ) e o coeficiente e partição ( K ), seno este último uma proprieae o suporte. No caso e estarem presentes ois compostos na amostra, por exemplo, a selectiviae S a cromatografia está relacionaa com a capaciae em istinguir os ois picos (um para o composto 1, outro para o composto ), e é efinia por: k S = (Equação 1.5) k ' ' 1 Em cromatografia um prato é a maior zona uniforme capaz e acomoar o soluto e tem uma aa altura, H. Numa mesma coluna poe haver pratos com alturas iferentes. O número e pratos ( N ) é ao por: L N = (Equação 1.6) H seno L o comprimento a coluna e H a altura o prato. Uma amostra introuzia na coluna e arrastaa pelo eluente, nunca tem um fluxo pistão perfeito, sofre sempre uma certa ispersão. Como consequência o perfil e eluição é uma curva e Gauss e a Equação 1.6 poe tomar outras formas. Quanto menor for a altura os pratos maior é o número e etapas iscretas para um ao comprimento e coluna. Isto aumenta as hipóteses e se conseguir uma boa separação entre componentes semelhantes. No entanto, uma pequena altura e prato não significa, necessariamente, uma boa resolução. Uma boa separação epene e uma combinação e factores: a altura o prato, que é uma

4 Introução meia a ispersão no interior a coluna e a selectiviae e capaciae e asorção por parte o material que constitui o enchimento a coluna, relativamente aos iferentes solutos. O factor e resolução, R s, é uma meia a separação entre picos, ou banas, que calcula-se através a expressão: tr tr1 Rs = (Equação 1.7) /.( t + t ) 1 w1 w em que t r é o tempo e retenção o pico (quantiaes e soluto em uniaes e tempo) e t w é a largura a base o pico em uniaes e tempo. Uma resolução R s > 1.5 permite a chamaa resolução e linha e base, ou seja, a separação completa e ois picos e igual tamanho. A selectiviae, o número e pratos teóricos e o factor e resolução estão relacionaos através e: ' 1 k ( ) R s = S 1 N (Equação 1.8) ' 4 1+ k seno S ao pela Equação 1.5 e ' k o valor méio os factores e capaciae relativos aos ois solutos. Como á para perceber, a resolução poe ser alteraa variano os valores e S, N e ' k. Por exemplo, um aumento a resolução é aquirio com o aumento o factor e capaciae (e notar que se k ' > 1 o aumento e k ' não tem efeito), o aumento a selectiviae (por exemplo pela iminuição a velociae a fase móvel e o iâmetro as partículas e enchimento ou aumentar o tamanho a coluna) e o aumento o número e pratos (iminuino o iâmetro as partículas e enchimento) [7]. Numerosos métoos cromatográficos existentes são poerosos meios e separação e partículas e moléculas e têm uma base experimental e teórica bem estabelecia. No entanto, até agora, o movimento e macromoléculas e nanopartículas em meios porosos continua a ser objecto e investigação [7,8,9] Cromatografia e exclusão molecular A cromatografia e exclusão molecular (SEC, o inglês, size exclusion chromatography) consiste numa separação em solução por efeito crivo. Isto é, as moléculas são separaas em função as suas imensões (o seu volume hiroinâmico), uma vez que a fase estacionária (matriz ou resina) tem poros que permitem ou ificultam a entraa as moléculas a separar. Assim, as moléculas e menor tamanho ficam retias nos poros e percorrem um caminho maior, seno as maiores as primeiras a sair (ver Figura ). Em conições ieais é o volume hiroinâmico que etermina o fraccionamento as moléculas, não haveno qualquer interacção e outra orem com a matriz [7]. 3

5 Introução Figura Princípio a Cromatografia e Exclusão Molecular [1]. Para se conseguir uma boa resolução é funamental a escolha o gel (matriz), o tamanho a amostra e a qualiae e enchimento a coluna. e um moo geral, eve escolher-se um gel em que as moléculas e maior imensão saiam com o volume e espaços vazios. A cromatografia e exclusão molecular é um os métoos stanar com mais vasta aplicação. É, frequentemente, usaa como o primeiro passo um esquema e purificação para separar moléculas e interesse as que têm características (e tamanho) raicalmente iferentes. Também poe ser empregue para muar o ambiente o tampão ou para retirar o sal e uma amostra e biopolímeros, como por exemplo, a remoção e sal em amostras conteno proteínas precipitaas por salting out, seno um processo menos moroso o que a iálise. Finalmente, a SEC poe ser implementaa como um meio para eterminar parâmetros moleculares como o raio hiroinâmico e a comum massa molecular, o que é conseguio usano, por exemplo, proteínas e peso molecular bem conhecio e traçano uma recta e calibração, como será escrito epois [1]. e acoro com eutscher et al. [11] na cromatografia e exclusão molecular, um volume e eluição o pico o soluto, V r, e substâncias e peso molecular elevao ( MW ), teno um coeficiente e istribuição, aproximaamente, e 1. coincie com o volume e espaços vazios, intra partículas a coluna, V m. Para moléculas com um coeficiente e istribuição menor que 1., existe uma relação linear entre o log(mw ) e o volume ou tempo e eluição o soluto. Assim, em conições ieais, a orem e eluição poe ser prevista, geralmente, pelo tamanho e moléculas uma vez que existe uma relação linear entre o seu volume e eluição e o valor logarítmico o seu peso molecular [1]. É exibio, esquematicamente, o gráfico e calibração para a SEC na Figura 1.1.a. e um exemplo para proteínas na Figura 1.1.b. Em eterminaas gamas o peso molecular MW e um soluto ou nanopartículas existe uma epenência linear e log(mw ) com o volume e eluição ou o tempo e retenção, 4

6 Introução intervalo. Moléculas maiores são excluías e não separaas numa situação como a o intervalo 1. Moléculas menores penetram completamente na fase estacionária e não estão separaas na situação o intervalo 3. Na Figura 1.1.b observa-se que algumas proteínas, apesar e terem um peso molecular semelhante, se ispersam ao longo o tempo e retenção. Goosell et al. [13] efenem que a razão este leque está relacionaa com a iferença a forma as macromoléculas e proteína que poe ivergir a esfera ieal. 1 Log(MW) 3 V V t Retention time Figura 1.1.a. Figura 1.1.b. Figura 1.1.a. Representação esquemática a epenência o peso molecular os solutos MW com o tempo e retenção, one V é o volume e espaços vazios e V t é o volume total a coluna. Figura 1.1.b. Exemplo a relação linear entre o logaritmo o peso molecular para proteínas stanar e o tempo e retenção. Nesta experiência usou-se uma coluna I-15 com uma fase móvel que consistia em tampão fosfato e sóio,8 M (ph 7.) conteno.3 M e cloreto e sóio e % (v/v) etanol. Caual, 1 ml/min [1]. Um efeito similar é observao na cromatografia e exclusão molecular e nanopartículas. Algumas experiências foram levaas a cabo numa coluna com microesferas e gel e agar (,5% agar) para a purificação e separação e alguns vírus [3]. A coluna com imensões e cm x 3 cm continha microesferas e iâmetro 15 µm a 149 µm. O volume a amostra foi e ml, o caual e 6 ml/h. Foram separaas as seguintes espécies em iferentes combinações: Vírus influenza A (Shpe), tamanho 1 nm, MW = 17 ; Aenovírus tipo, tamanho 8 nm; Poliovírus tipo I, tamanho 8 nm, MW = 6 8 ; ECHO tipo 7, tamanho 4 nm; Material celular, e ribossomas celulares. A posição o pico e retenção para caa uma as espécies mencionaa versus o seu tamanho está esquematizaa na Figura O resultao correspone ao escrito anteriormente para as proteínas mas a ispersão os istintos vírus confirma que a forma as partículas eve ser tomaa em consieração. 5

7 Introução Figura Gráfico o tamanho e vírus versus posição o pico e retenção, numa coluna com 3 ml e espaços vazios, [3]. Os géis poem oferecer um limite e exclusão e partículas entre 3 nm a 4 nm (para Sephacryl S-1 Superfine, [14]), mas no caso a Figura , para granes macromoléculas e vírus, isso significa que a SEC actua na gama e ifusão interior menos acessível one a forma a molécula se torna importante. Por exemplo, a separação cromatográfica em gel o vírus e mosaico o tabaco (TMV) e o vírus e mancha anelar o tabaco (TRS), referia no trabalho e Mikes [1], foi feita usano apenas pressão hirostática urante menos e 1 minutos. O autor emonstrou que o vírus TMV aparece a um volume e eluição e 18 ml, que correspone ao volume e espaços vazios a coluna. O vírus TMV consiste, principalmente, em bastonetes com 3 nm e largura e 15 nm e iâmetro. É provável que a geometria o vírus impeça a sua entraa nos poros. O vírus TRS consiste num poliero com 6 nm e iâmetro. É fácil e ver que a forma as partículas cria um problema no mecanismo e exclusão por tamanho, one se assumiu aquela partícula com, presumivelmente, forma esferóie. A epenência o intervalo e fraccionamento as matrizes na SEC em função o tamanho os poros está representaa na Figura baseao nos aos tabelaos e eutscher et al. [11]. Os limites e fraccionamento superiores e inferiores são representaos por linhas. O limite superior caracteriza moléculas excluías a matriz (poros intra - partículas). Como poe ser visto pela linha inferior para o fraccionamento e macromoléculas e MW ~ 1 e mais alto, o tamanho e poro intra partícula ana ao reor e 1 µm. 1 4 Fractionation range, ka Pore iameter, nm Figura Intervalo e fraccionamento as matrizes na SEC versus iâmetro o poro, seguno eutscher et al. [11]. As linhas oblíquas trauzem o limite superior e inferior e fraccionamento. 6

8 Introução A cromatografia e exclusão molecular baseia-se no equilíbrio que se estabelece entre a fase móvel e a fase estacionária. Recentemente surgiram técnicas e cromatografia funamentaas na separação em situações e não equilíbrio, urante o fluxo e uma solução numa coluna com poros intra partículas. Estas técnicas, esignaas por cromatografia hiroinâmica (HC, o inglês, hyroynamic chromatography) e cromatografia slalom (SC, o inglês, slalom chromatography), baseiam-se no uso e fluxo laminar que ocorre nos espaços intersticiais originaos entre as partículas na coluna. Estes processos epenem a taxa e eluição e o tamanho as partículas no empacotamento e não o tamanho os poros ou a sua natureza química [15]. A HC foi esenvolvia e aplicaa até hoje, sobretuo, na separação e polímeros sintéticos como poliestirenos. A orem e eluição na HC é a mesma que na SEC. A SC tem sio reportaa mais para moléculas e caeia upla e NA e a sua orem e eluição é oposta à verificaa na cromatografia e exclusão molecular e na cromatografia hiroinâmica, portanto [15]. Em seguia escreve-se em pormenor as características e caa uma estas técnicas e não equilíbrio. 1.. Cromatografia hiroinâmica e partículas rígias Venema et al. [16] explicam que na introução a cromatografia hiroinâmica (HC) como uma técnica e separação por tamanho nos anos setenta, esta foi experimentaa entro e pequenos vasos capilares cilínricos lineares e em colunas empacotaas com partículas esféricas e 1 µm a µm, Figura Figura Esboço a separação na cromatografia hiroinâmica num leito granular e num capilar cilínrico. urante o fluxo e uma solução e polímeros num capilar, sob a influência o movimento Browniano (movimento, neste caso, os polímeros evio ao movimento as moléculas a fase móvel), caa molécula alcançará toas as regiões acessíveis o espaço capilar urante o seu transporte. Contuo, a região acessível a caa polímero epene o seu tamanho molecular. evio à conformação, o polímero poe não atingir a região perto a 7

9 Introução superfície capilar. Por causa o perfil e velociaes o fluxo (perfil parabólico) surgem regiões inacessíveis one a velociae o fluio é baixa e o graiente e velociae é alto (próximo a paree o capilar). ese que a ensiae a camaa esvaziaa epena o tamanho molecular, é esenvolvia uma separação: polímeros maiores eslocam-se mais rapiamente pelo vaso capilar o que os menores. É neste fenómeno que se baseia a cromatografia hiroinâmica (HC), e acoro com Hoaglan et al. [17]. A cromatografia hiroinâmica oferece um métoo para a separação e polímeros em solução ou partículas em suspensão com base no seu tamanho. No leito e uma coluna, a separação ocorre nos canais intra partículas e a orem e eluição é e granes para pequenos, análogo ao a cromatografia e permeação por gel [18]. A gama inâmica a separação epene o tamanho as partículas o leito e empacotamento a coluna. A aplicação e HC num capilar para classificação e separação e fibras com partículas e tamanho a orem o mícron é escrita por Pascale et al. [19]. Numa experiência com um tubo e iâmetro e 15 mm e comprimento e 1 m (fluxo laminar) foram separaas suspensões e fibras e polpa e papel, e partículas micrométricas usaas na proução e papel como um aitivo. As fibras e celulose têm um comprimento e. mm a 4 mm e as micropartículas (CaCO 3 ) têm um tamanho ao reor os 3 µm. Obtiveram-se os seguintes resultaos para uma velociae e fluxo.11 m/s ( Re ~ 165): para fibras ispersão axial e tempo méio e passagem, respectivamente: 18 ± 4 cm /s e 91± 4 s; para os aitivos 16 ± 8 cm /s e 17 s; o tempo méio o fluio portaor foi também 17 s. A iferença e tempo entre o pico os aitivos e as fibras é 8 s. A HC tem sio aplicaa, com sucesso, para meição e istribuição o tamanho molecular e polímeros com peso molecular elevao, solúveis em água [17]. A extensão o métoo tem sio testaa através e experiências com xantano e poliacrilamia hirolisaa. O xantano é um polissacário bastante rígio, consierano aqui a macromolécula o polissacário xantano tipo MW = 1.6E+6 [], a uma concentração e 4 ppm numa solução e 5 g/l e NaCl, e ph = 7, na forma e bastonetes rígios com comprimento 1µm, e largura nm. A separação ocorre urante a convecção o polímero issolvio pelo volume intersticial a coluna e cromatografia empacotaa com esferas não porosas. Configurações em não equilíbrio o polímero são prontamente originaas pelo fluxo complexo através as esferas. Essas alterações e configuração afectam, fortemente, as meias o tamanho molecular. Para maximizar a resolução, a tensão hiroinâmica eve ser reuzia pelo emprego e taxas e fluxo extremamente baixas. Para poliestirenos (polímeros com estrutura aleatória linear) com massas moleculares altas (1 4 a a 1 7 a), foi observao por Stegeman et al. [15], que a resolução parece ser quase inepenente a velociae e eluente. As alturas e prato reuzias foram observaas, também, por serem quase constantes para velociaes a fase móvel reuzias numa gama e > 15, seno a velociae a fase móvel aa por: ν = u / em que p m 8

10 Introução p é o iâmetro as partículas, u é a velociae e fluxo, e m é o coeficiente e ifusão a molécula e soluto. A zona e separação os poliestirenos issolvios, em HC, foi estuaa numa coluna preenchia com partículas não porosas monoispersas e 1.5 µm. Na gama e velociae reuzia, e a 15, foram obtias alturas e prato reuzias bem abaixo e para amostras e polímero com massas moleculares e, 43 9 e 775 a. Isto permite separações e polímero a alta velociae com eficiência elevaa. Supono que os canais intersticiais numa coluna empacotaa poem ser representaos por um conjunto e tubos capilares, foi esenvolvio um moelo para a taxa e migração e macromoléculas que em seguia foi comparao com aos e eluição experimentais. Foram investigaas a influência o tamanho e o tipo e macromolécula, a eficácia o solvente e a velociae a fase móvel na eluição na HC. O comportamento a eluição em colunas empacotaas parece obeecer, basicamente, a teorias e migração simples esenvolvias para tubos abertos. As posições relativas o pico na HC epenem, ligeiramente, a velociae e eluente [1]. Esferas não porosas e sílica com tamanhos na gama e 1.4 µm a.7 µm foram utilizaas como empacotamento para a cromatografia hiroinâmica também no trabalho e Stegeman et al. [] com a mesma altura o prato a coluna H. Foi observao que até pesos moleculares e 1E+6 o comportamento e eluição os poliestirenos concora muito bem com os moelos teóricos existentes. Porém, para poliestirenos maiores a taxa e fluxo mostrou uma influência nas posições relativas o pico. e acoro com aos e Gramain e Myar [3] é possível estimar uma razão o tamanho a molécula com o tamanho o poro λ e uma razão o tamanho a molécula com o tamanho a partícula λ p. Para um poliestireno e peso molecular 1E+6 o tamanho a molécula é cerca e 1 nm, consequentemente, para partículas com tamanho no intervalo e 1.4 µm a.7 µm, assumino uma porosiae o empacotamento e.36 tem-se, respectivamente, λ e.19 a.1 e λ p e.7 a.37, o que significa a presença e uma região e ifusão não acessível. Hoaglan e Pru homme [17] usano um enchimento e partículas não porosas numa coluna emonstraram que a HC e macromoléculas flexíveis e rígias fornece meias o tamanho molecular que epenem fortemente a taxa e fluxo a coluna. Esta epenência a taxa e fluxo é explicaa por moelos macromoleculares simples em termos e eformação e orientação num alongamento uniaxial fixo. Numa experiência e HC, uma pequena quantiae e uma solução e polímero iluío foi injectaa numa coluna empacotaa com esferas e 1 µm a 4 µm. A coluna proporciona uma ree e poros com passagens e fluxo por interstícios um pouco maiores o que as imensões e caa molécula (tamanho e poro ~ 9

11 Introução 3.5 µm a 15 µm, raio o polímero ~.5 µm a.5 µm). A técnica e cromatografia hiroinâmica acompanha as muanças a conformação molecular pela taxa e fluxo epenente os volumes e eluição as moléculas, que poem sofrer extensão e orientação através a tensão hiroinâmica. A inução o alongamento pelo fluxo num polímero flexível, acontece quano a caeia é sujeita a forças hiroinâmicas maiores em magnitue o que as forças e relaxamento a caeia, que surgem o movimento e Brown. A força e um fluxo poe ser, frequentemente, correlacionaa com o seu número e eborah e : a razão as forças hiroinâmicas com as forças e Brown. Só acontece um significativo alongamento molecular em fluxos estacionários para valores e e elevaos, normalmente a partir e e >.5. Uma enorme eformação molecular acontece quano e é maior o que a uniae [17]. Estas eformações manifestam-se, sobretuo, em queas e pressão extremamente altas, mesmo meias para soluções e concentração baixa e polímero e bombeaas através os materiais porosos. No fluxo e soluções e polímeros não esféricos através e meios porosos não são encontraas queas e pressão excessivamente elevaas. Contuo, polímeros rígios com a forma e bastonete poem ser capazes e se orientar num fluxo elevao [17]. Embora não provoque efeitos reológicos ramáticos como no caso e polímeros flexíveis, a orientação e polímeros com forma e bastonete urante o fluxo através e passagens estreitas a coluna poe também etectar-se como teno um comportamento o fluxo epenente a eluição. Estuos muito recentes têm tentao escrever melhor o movimento e polímeros ao longo o empacotamento e uma coluna e cromatografia hiroinâmica. A maioria as teorias e HC erivou o moelo usao para escrever a migração e polímeros em vasos capilares abertos, [4], Figura 1... Figura 1... Princípio e separação a HC, one uma partícula com raio efectivo r eff é excluía a paree num canal com iâmetro h no qual um perfil e velociae parabólico u (y) é aplicao originano uma velociae máxima [4]. No moelo e retenção, a migração o polímero é escrita pelo valor e retenção τ como função a razão λ [16, 5]. τ = / t = 1/(1 + λ C ) (Equação 1..1) t m λ 1

12 Introução one t m é o tempo e migração o polímero, t é o tempo e retenção corresponente fracção e vazios a coluna e λ é o tamanho relativo a molécula efinio como: λ = r eff /(h / ) (Equação 1..) em que r eff é o raio efectivo a macromolécula e h é o raio o capilar. O coeficiente C é consierao uma constante para efeitos secunários [16, 4] e varia entre.5 e 5. Para uma exclusão simples num perfil e fluxo parabólico C = ½ [5]. Num leito empacotao numa coluna e cromatografia hiroinâmica são recomenaos os seguintes valores e C :.698 [6],.7 [16],.8 [7]. e acoro com a Equação (1..1), na HC toas as macromoléculas vão eluir no intervalo ~.73V r a V r, one V r é o volume e eluição e um soluto e tamanho pequeno ou o volume e espaços vazios o empacotamento. Venema et al. [7] argumentam que o raio efectivo poe ser calculao a partir o raio e giração, r g : π r eff = r g (Equação 1..3) O raio e giração poe ser eterminao, por sua vez, pela sua epenência com a massa molecular o polímero: b r g = amw (Equação 1..4) one a e b são constantes e MW é a massa molecular. Num tubo aberto e HC, a largura o canal é conhecia precisamente e igual ao raio. Num leito empacotao e HC, porém, o raio os canais intersticiais é muito mais ifícil e efinir. Nos leitos empacotaos o raio o capilar a Equação (1..1) poe ser substituío por um raio efectivo pela representação os canais intersticiais como uma orem e tubos cilínricos com a mesma razão e volume por superfície. este moo o raio e canal efectivo rc é eterminao por [1]: p ε r c = (Equação 1..5) 3 1 ε one p é o iâmetro a partícula e ε é a porosiae a coluna. Para o cálculo o raio o canal efectivo o leito r c, tem que ser conhecia a porosiae a coluna, ε. Seguino o exemplo e Venema et al. [16], ao usar a Equação (1..5), o raio o canal efectivo o leito, para partículas com 1 µm foi calculao obteno-se o valor e.13 µm. 11

13 Introução A resistência o leito presente numa coluna, ϕ, á informação se a coluna está bem ou mal empacotaa e poe ser calculaa por: ϕ = P p (Equação 1..6) νηl one η é a viscosiae o solvente (Pa s), ν é a velociae linear o solvente (mm/s), p é o iâmetro a partícula (mm), L é o comprimento a coluna (mm) e é a quea e pressão observaa (Pa). Continuano com o exemplo e Venema et al. [16], a coluna empacotaa com partículas e 1 µm tinha um valor e ϕ igual a 38. Para colunas empacotaas com partículas não porosas um valor e ϕ próximo e 4 é consierao normal. Nesse caso poe então ser assumio que a coluna está bem empacotaa. P Muitas vezes, na HC nota-se a presença e um pico alargao. Este esenvolvimento poe ever-se à ispersão causaa pela coluna ou poliispersão os polímeros na amostra. Poe também ser provocao por factores externos como o volume e injecção e etecção, tubulação e conexão. Para minimizar os efeitos externos é necessário calcular o volume o pico os eluentes. A importância relativa a HC poe aumentar em sistemas one há fracturas ou caminhos e fluxo preferenciais com taxas e fluxo mais altas. Poe aumentar aina em sistemas e meios porosos com partículas menores, como, por exemplo, areia fina. Recentemente, para macromoléculas rígias e semi flexíveis foi mostrao que a HC se converte na SC slalom chromatography Cromatografia slalom Hoje em ia são utilizaos oligonucleótios sintéticos em muitos processos biológicos moleculares. Algumas aplicações, como ensaios e eterminação o genótipo epenem fortemente a pureza os oligonucleótios. A metoologia e purificação os oligonucleótios continua a estar epenente e técnicas traicionais e separação como a electroforese em gel e poliacrilamia (PAGE), ou HPLC no entanto, é possível utilizar outro processo [8]. A cromatografia slalom (SC) foi escoberta inepenentemente em 1988 por ois grupos como um novo métoo e fraccionamento o tamanho e moléculas relativamente granes e NA (> 5 bases e pares). Uma característica particular esta cromatografia é que a separação ocorre por um fenómeno hiroinâmico em vez e um e equilíbrio. Quer isto izer que na SC, granes moléculas e NA são eluías muito epois as pequenas, e que o grau e retaramento e NA é afectao, e moo significativo, por vários factores 1

14 Introução hiroinâmicos como o tamanho as partículas o empacotamento, a taxa e fluxo, a viscosiae e a temperatura o solvente. Pelo contrário, factores químicos como a natureza e o tamanho os poros o empacotamento, assim como a hirofobiciae o solvente, não têm um efeito crítico [9]. A principal vantagem a SC é a rapiez e simpliciae o proceimento experimental. Poe ser executaa pela introução e soluções e NA num sistema convencional e HPLC (por exemplo), one uma separação e NA rápia, sensível e reproutível poe ser automatizaa, não seno necessária a extracção e NA o gel [9]. A separação baseia-se no facto e que moléculas longas e NA (5 a 5 bp) têm e se esviar na sua passagem através os canais estreitos e tortuosos entre as partículas o empacotamento, Figura Quanto mais longa é a molécula e NA mais ifícil é a sua passagem pelos interstícios [1]. Figura Princípio a cromatografia slalom [1]. Para moelar o movimento e uma molécula e NA no interior e uma coluna SC Anré e Guillaume [8] efiniram o parâmetro, τ, enominao tempo e retenção relativo. Esse parâmetro é ao pela equação: t ( u) τ = (Equação 1.3.1) t ( ) seno t (u) o tempo e migração o NA à velociae u a fase móvel e t ( ) o tempo e retenção quano a molécula está completamente esticaa. A variável u é equivalente à variável F (ml/min). Seguno os autores τ poe ser também ao por: τ = ψ ( + 1) + τ ' e Eu Eu (Equação 1.3.) one ψ é uma constante empírica que epene e algumas características geométricas o fragmento e NA. τ ' é o valor e τ para o valor e velociae mais baixo a fase móvel (para este valor a fracção e estiramento o fragmento e NA ), E é a constante a equação: por u ( por por) = E. (Equação 1.3.3) x 13

15 Introução em que por é o número e poros (ou segmentos) ocupaos pela caeia e NA. Quano por tem-se o número e poros ocupaos pela caeia e NA no ponto máximo e estiramento. A viabiliae a Equação 1.3. no estuo e rastejamento e proteínas é analisaa no trabalho exposto por Anré e Guillaume [8]. Para conseguir este objectivo experimentou-se a migração e iferentes proteínas numa fase estacionária o tipo C1 (iâmetro as partículas e enchimento igual a 5 µm) sobre um largo intervalo a taxa e fluxo e a viscosiae a fase móvel. Sujeitou-se caa uma as proteínas soro e albumina humana (HSA), soro e albumina bovina (BSA) e soro e albumina e galinha (CSA) a separações com iferentes taxas e fluxo e istintas viscosiaes a fase móvel (com glicerol). Partino os valores o tempo e retenção calcularam-se os coeficientes E para caa taxa e fluxo e caa viscosiae. Verifica-se que na epenência e E com a velociae o líquio houve uma interrupção para o valor crítico a taxa e fluxo a fase móvel ( F ). Para valores baixos a velociae a fase móvel ( F < F ) o valor E mostrou-se esprezável e relativamente c constante ( E ), o que significa que a estrutura a proteína se encontrava na forma e rolo ' aleatório, que é uma estrutura compacta (neste omínioτ τ, comportamento e retenção hiroinâmico). A Figura 1.3.a. mostra o cromatograma para a separação as três proteínas analisaas a.6 ml/min e com uma viscosiae a fase móvel e c Figura 1.3.a. Figura 1.3.b. Figura 1.3.a. Cromatograma para a HSA, 1, BSA, e CSA, 3, no caso em que F =.6 ml/min e a viscosiae a fase móvel µ = 1.17, [8]. Figura 1.3.b. Curva e F c versus viscosiae para a proteína HSA, [8]. µ Acima e F c, E aumenta visivelmente, perto ou abaixo e F c o valor e E permanece relativamente constante. Este resultao confirma o facto que, neste omínio, a estrutura a proteína começou a perer a sua rigiez e migrou através o empacotamento seguino numa forma mais ou menos curvaa (istinta uma partícula esférica) pelo moo cromatográfico e slalom. Nesta gama, para um valor constante e F, o valor e E aumenta com o aumento a viscosiae a fase móvel. Isto confirma que a viscosiae actua na estrutura a proteína através e um aumento a sua extensão quano a viscosiae a fase móvel aumenta. A uma 14

16 Introução gama e viscosiaes e 1.9 a 1.5 cp, para a proteína HSA, traçano F c versus µ obtémse, sempre, um comportamento linear, originano a equação F = µ, com um coeficiente e correlação r =, 989 (Figura 1.3.b.). A iminuição e F c é observaa em relação à viscosiae o que mostra uma grane epenência o alongamento a molécula com a velociae a fase móvel para os valores mais elevaos e viscosiae a fase móvel. c Anré e Guillaume [8] testaram também as possibiliaes e aumentar as capaciaes e fraccionamento a cromatografia slalom. Foram separaas moléculas e NA e ois tipos: fragmentos lineares e plasmíeos, que são fragmentos circulares e NA. Fez-se variar a composição a fase móvel, pela aição, em separao, e três agentes e compactação a várias concentrações. As moléculas a separar foram aina sujeitas a iferentes taxas e velociae a fase móvel. Nessas conições observou-se uma iferença no comportamento o NA circular e linear que é, potencialmente, muito útil, por exemplo, pelo facto o NA genómico linear ser uma contaminação relevante na preparação e plasmíeos. Anré e Guillaume [8] concluem, então, que o movimento as moléculas e NA na SC é extremamente epenente o alongamento as mesmas. Além isso, agentes e compactação istintos têm istintos efeitos em moléculas e NA circulares e lineares, poeno a SC ser aplicaa na sua separação. Peyrin et al. [3] consieraram a hipótese os mecanismos e SC e HC poerem ser relacionaos e alcançaos, em simultâneo, no mesmo sistema cromatográfico, em relação às proprieaes elásticas e polímeros flexíveis. Em geral, esperavam que o princípio e fraccionamento a cromatografia hiroinâmica fosse preponerante se o polímero estivesse na forma esférica, enquanto o fenómeno slalom governasse a separação quano ocorresse a eformação e macromoléculas (elongação a forma). A teoria estes autores aquire mais sentio sabeno que a forma circular e uma molécula e NA tem uma estrutura mais compacta o que o corresponente fragmento linear (por exemplo, o plasmíeo super enrolao pgem 1 (3.73 kbp) tem um raio e giração r g igual a 8 nm e o raio e giração calculao para a forma linear foi e 145 nm), e que uma caeia upla e linear e NA poe apresentar uma grane varieae e formas. Para fragmentos entre a 1 bp, a forma a molécula e NA é aproximaa à e um bacilo e consequentemente, o mecanismo HC não poe ser aplicao. Por outro lao, fragmentos superiores a kbp poem ser trataos como uma estrutura aleatória enrolaa em esfera. Note-se, contuo, que as proprieaes elásticas e moléculas e upla caeia e NA são iferentes as os polímeros sintéticos como os poliestirenos, classicamente separaos por HC. Assim, para emonstrarem a esperaa transição SC HC, os autores testaram o comportamento cromatográfico e ácios nucleicos que possuem uma forma aleatória com um certo grau e consoliação, como uma molécula super enrolaa (supercoile) circular e caeia upla e NA. 15

17 Introução Os resultaos alcançaos por Peyrin et al. [3] vieram confirmar a hipótese formulaa, e que poe haver transição entre os regimes e migração HC e SC. A preponerância relativa e um os ois mecanismos é epenente tanto a taxa e fluxo o eluente como a flexibiliae o polímero, ou seja, a forma a macromolécula Meios Porosos funamentos teóricos iz-se que um meio poroso é homogéneo quano a resistência ao escoamento é a mesma em qualquer ponto e seguno uma irecção. A homogeneiae é relativa e epene as imensões intrínsecas os materiais. Um solo com grãos milimétricos será homogéneo em relação a um valor e escala compatível, como por exemplo 1 m 3. Já um maciço rochoso será homogéneo se consierarmos um valor e escala muito maior [31]. Quano a resistência ao escoamento é igual em toas as irecções o meio poroso poe consierar-se isotrópico. A grane maioria os meios porosos naturais não são isotrópicos, são anisotrópicos. Anisotrópico iz-se e um corpo fisicamente homogéneo, mas cujos valores e certas proprieaes físicas e químicas variam com a irecção. Os corpos cristalizaos são geralmente anisotrópicos [3]. Apesar a anisotropia os meios porosos poem consierar-se homogéneos ese que se estabeleça uma escala e homogeneiae compatível com as respectivas imensões [31]. Existem várias formas e escrever meios porosos e os fenómenos e transferência e massa associaos, neles ocorrios. Normalmente, as uas maiores prioriaes consieraas são o coeficiente e ifusiviae efectiva (fenómeno e transferência e massa) e o coeficiente e permeabiliae (fenómeno e fluxo). A previsão e o controlo a ifusiviae efectiva ou a permeabiliae e leitos compactos com misturas e partículas, são importantes para processos tais como: catálise com seimentação, imobilização e células em matrizes porosas, cromatografia e biofilmes, entre outros. Estes ois coeficientes são funções características os meios porosos, nomeaamente a porosiae e a tortuosiae. O coeficiente e ifusiviae efectiva ( ), que caracteriza a transferência e massa nos meios porosos, é efinio por: ε e = (Equação 1.4.1) τ em que é o coeficiente e ifusiviae no seio o meio, ε é a porosiae e τ é a tortuosiae [33]. e 16

18 Introução Em operações unitárias e processos inustriais que envolvam o uso e leitos fixos porosos, é essencial conhecer o coeficiente e permeabiliae o leito ( k ), para relacionar a velociae e fluxo o fluio com o graiente e pressão. e acoro com a bem conhecia equação e Carman Kozeny: u 3 p = 36K ε P ( 1 ε ) µ L (Equação 1.4.) one u representa a velociae o fluio, P é a quea e pressão através o meio, µ é a viscosiae o fluio, e L é o comprimento o leito. Para um leito e partículas esféricas o coeficiente e permeabiliae k (m ) epene o iâmetro as partículas ε e a tortuosiae τ. p, a porosiae k p p 3 ε ε ε = = 36 K K ( 1 ε ) τ 36 (1 ε ) (Equação 1.4.3) one o coeficiente e Kozeny ( K ) é ao por K = K. Para leitos granulares K = 4,-5. τ K é o coeficiente e forma e Kozeny e epene a forma a secção transversal o poro (para um poro cilínrico K = ) [34]. Como se poe verificar, a ifusiviae efectiva e a permeabiliae epenem, ε ε respectivamente, e e τ τ. Embora tenha sio feito um grane esforço para se estuar especificamente os meios porosos, a relação entre porosiae, tortuosiae e a istribuição o tamanho as partículas que constituem o meio, é aina uma questão em aberto. Outro aspecto pertinente tem a ver com o facto e, apesar e muitas vezes a forma as moléculas os bacilos e outras espécies lineares ser aproximaa à e uma esfera, estes comportam se, numa separação cromatográfica, e maneira iferente. A ifusão e macromoléculas ou o fluxo e nanopartículas num meio poroso é acompanhaa por efeitos relacionaos com a topologia e poros e a natureza a nanopartícula; alguns factores e interacção são apresentaos e imeiato: -relação o tamanho a nanopartícula para o tamanho e poro ou efeito e obstáculo; -efeito e constrição como uma muança ramática na área e corte transversal o poro. Tanto para bastonetes rígios como para nanopartículas a constrição funciona como um factor e orenação e orientação axial; -tortuosiae ao longo o canal na forma e curvas; -viscoelasticiae como um prouto a geometria o poro, natureza a nanopartícula como também as conições e fluxo. Vão aprofunar-se, seguiamente, alguns os aspectos atrás referios. 17

19 Introução Porosiae A porosiae é uma as proprieaes mais básicas e um meio poroso [35]. Poe ser efinia como a razão o volume e espaços vazios ( V ) pelo volume total ( V ), como se encontra explicao na Figura e escrito na Equação (1.4.4). e T Figura Porosiae. Os espaços em branco entre as partículas esféricas constituem os espaços vazios. Ve ε = (Equação 1.4.4) V T Em muitos estuos constatou-se que a porosiae e leitos compostos por misturas e partículas está epenente a forma como os leitos são formaos. evio à natureza aleatória as misturas e partículas esféricas assim como aos iferentes métoos e obtenção os empacotamentos, estes exibem uma oscilação o valor a porosiae, mesmo em misturas monocomponente [36, 37]. Recorreno a processos e empacotamento e esferas aequaos, estes poem emonstrar características regulares ou aleatórias [38]. A caa tipo e empacotamento regular correspone um número e coorenação, N c, bem efinio, representano este o número e pontos e contacto e caa esfera com as esferas vizinhas. epeneno o processo e construção o leito, poem ser obtios ois tipos e empacotamento aleatório [37]: empacotamento o tipo enso e folgao. No empacotamento enso, o número méio e pontos e contacto ( N ) com as esferas vizinhas é superior ao existente no empacotamento o tipo folgao. O empacotamento enso poer-se-á obter a partir o empacotamento aleatório o tipo folgao, por compactação posterior o leito [37]. c Os efeitos e paree observam-se quano o iâmetro as partículas é próximo o iâmetro a coluna utilizaa para a construção o leito e são esprezáveis quano o iâmetro a coluna é pelo menos ez vezes superior ao iâmetro as partículas [34]. Este efeito eve-se à formação e um empacotamento orenao junto às parees a coluna [37]. Nas zonas em que os efeitos e paree são esprezáveis, os valores e porosiae típicos para misturas monocomponente o tipo folgao situa-se no intervalo.4 a.4, enquanto para o empacotamento o tipo enso esse intervalo é e, aproximaamente,.36 a.38 [37]. 18

20 Introução Em misturas multicomponente, a porosiae a mistura epene os tamanhos as partículas que compõe o leito, a porosiae inicial os componentes, a composição a mistura e o tipo e empacotamento [33]. Yu e Stanish [35] efiniram ois mecanismos e construção e leitos para misturas binárias e partículas esféricas. Um mecanismo enomina-se por enchimento, one a aição e um componente ao seguno, não altera o esqueleto ou o número e pontos e contacto as partículas o último. Este, enominao por componente controlaor, terá na mistura a mesma porosiae enquanto puro. O seguno mecanismo esigna-se por ocupação ou mistura, resultano a introução e um componente, a alteração o esqueleto formao pelas partículas o outro. Existem nesta zona, interacções entre as partículas e iferente tamanho, seno os ois componentes controlaor o sistema. Os autores referem aina que estas uas zonas se encontram os ois laos e um valor e rácio crítico, δ c =.154, entre os tamanhos as partículas o sistema binário. O mecanismo e enchimento ocorrerá em larga extensão para um valor e rácio δ =,154 em que e são, respectivamente, os iâmetros as partículas e menor c e maior imensão no empacotamento. O mecanismo e ocupação ocorre em grane extensão para um rácio δ >.154. Para o caso extremo e δ = a porosiae e um sistema binário e partículas esféricas poe ser efinia por [35, 39]: ε ε ( 1 x ) ε = 1 ε x 1 ε x = 1 x [, x min ] (Equação 1.4.5) x [ x, 1] (Equação 1.4.6) min em que a porosiae mínima ε = ocorre para uma fracção volúmica e partículas e ε ε maior imensão, x min : x min 1 ε = (Equação 1.4.7) 1 ε ε ε e ε são, respectivamente, a porosiae os leitos monocomponentes as partículas e maior e menor imensão. A porosiae é representaa neste moelo por ois ramos (Figura 1.4..). O ramo ireito, Equação (1.4.6), encontra-se enriquecio com partículas e maior imensão, formano estas um esqueleto com porosiae ε e partículas e menor imensão até se atingir o ponto (. Este esqueleto mantém-se inalterao com a aição x min, min ε ). 19

21 Introução Aições e partículas e menor imensão para além este ponto afastam as partículas maiores, estruino o esqueleto as mesmas. Entra-se este moo no ramo esquero o moelo, Equação (1.4.5), rico em partículas menores, encontrano-se estas agrupaas com porosiae ε. Amitino ε e ε igual a.4, virá por (1.4.7), x min =.71, e por ε =, min ε ε ε min =.16. Na Figura 1.4.., a intersecção os ois ramos representa o ponto (.71;,16). Figura Representação a Equação e para e iguais a.4, em que o tracejao representa o ramo esquero e a linha cheia trauz o ramo ireito. iferino δ e zero haverá que introuzir funções e correcção no moelo anterior, o que foi feito por Tokumitsu em 1964 [39]. Para uma mistura enriquecia com partículas e pequena imensão, a Equação (1.4.5) originou: ε ε ε one φ + f ( δ ) 1 x = 1 c e c ( 1 x ) ε ( ( 1 φ 1 ε ) = (Equação 1.4.8) f = 1, para δ =.5; f c = 1. para δ =,5; f c = 1.4 quano δ,5. Para uma mistura enriquecia com partículas e maior imensão, (1.4.6) eu origem a: one r β s = δ, = 1/ 1 ε ε = 1 (Equação 1.4.9) x ( 1+ β β ) 3 s c 1 x r para partículas esféricas e β c = x As porosiaes obtias por (1.4.8) e (1.4.9) são ligeiramente superiores às calculaas por (1.4.5) e (1.4.6).

22 Introução Tortuosiae A tortuosiae os meios porosos é o único parâmetro e composição os meios porosos capaz e reflectir a anisotropia o material e não poe ser incluía ou comparaa irectamente com meições experimentais [4]. A tortuosiae é classicamente efinia por: L e τ = L (Equação 1.4.1) one L e é o comprimento realmente atravessao pelo fluio através o meio poroso e L o comprimento o leito na irecção macroscópica o fluxo [4]. O caso mais simples é consierao um meio poroso composto por um feixe e capilares. O caso a tortuosiae e poros curvos ifere o anterior pela curvatura os canais o poro. Neste caso, τ aumenta com o aumento o comprimento o poro, evio ao aumento e L e. O aumento o comprimento o poro implica o aumento corresponente a ifusão no percurso as moléculas ifusionais. Usualmente para este tipo e poro, não é vália a conição e iâmetro e poro constante ou secção transversal constante. O perfil e corrente e fluxo não é equiistante. Com poros curvos os efeitos e inércia e e constrição poem-se tornar significativos para a ifusão macromolecular [4]. A tortuosiae e a composição o meio são relacionaas, usualmente recorreno à porosiae. Mota et al. [41] estuaram misturas binárias e partículas esféricas com δ =,1, oneδ é a razão os iâmetros entre as partículas e menor imensão e partículas e maior imensão em misturas binárias. Nas suas experiências encontraram valores experimentais e tortuosiae entre, aproximaamente, 1,45 e 1,71, variano a porosiae aproximaamente entre,4 e,6, respectivamente. Os aos sobre a tortuosiae para o mesmo tipo e meios porosos são um pouco ispersos, encontrano-se na literatura valores que variam entre 1,4 e 4. Tal ispersão é evia ao facto a tortuosiae não poer ser encaraa como uma constante física, epeneno e outras características o meio poroso para além a porosiae, como a homogeneiae o mesmo, processo e empacotamento, iâmetro os poros e forma os canais. A tortuosiae, relativamente à porosiae, é antes uma função complexa e vários factores. A compressão ou expansão o meio, eposição e partículas ou macromoléculas no interior os canais e o tipo e materiais a ser transferio (percolação) poerão influenciar o valor e tortuosiae obtio, seno que a tortuosiae eterminaa para a ifusão e um gás e para a ifusão e macromoléculas no mesmo meio poroso, poerá ser iferente [4]. Significa isto que, como tem sio ao a entener, a interpretação a tortuosiae clássica é uma aboragem simplificaa, não seno sempre vália [4]. Uma análise mais 1

23 Introução etalhaa mostra que esta efinição não se aplica a toos os casos, uma vez que poem ser encontraos muitos caminhos com o mesmo comprimento L e tortuosiaes. Os seguintes exemplos explicam a ieia: L e, mas iferentes A B C Figura Trajectórias com o mesmo comprimento L e curvaturas [41]. L e e iferente número e e facto, consierano os quatro caminhos acima ilustraos, é fácil perceber que caa um, e A a, tem o mesmo comprimento total ( L ), assim como a mesma espessura o meio ( L ) (os pontos e partia e chegaa estão na mesma posição nos vários casos). Contuo, o número e curvas aumenta e ois em A para oito em ano, esse moo, origem a um aumento na tortuosiae a esquera para a ireita. Assim, para melhor escrever e estimar a tortuosiae terá e ser levaa em conta a configuração os poros [4]. Poem ser encontraos vários tipos e configurações para poros: -poros com simetria recta e uma área e secção transversal variável. Embora o poro tenha um comprimento igual à espessura o meio poroso, o percurso méio e uma molécula ou corrente não é igual à espessura o meio. Neste caso, os poros poem ser caracterizaos pela razão entre os iâmetros maior e menor, pela área e secção transversal, ou pela trajectória mais baixa a corrente. Para este tipo e poro, poem ser esperaos vários tipos e efeitos: inércia, constrição relativa às trajectórias e curva, constrição relativa a uma muança a área e secção transversal o poro. -curvas simétricas os poros com área e secção transversal variável. A curvatura o poro aumenta os ois primeiros efeitos escritos anteriormente. -poros encrespaos (frisaos). Neste caso, um novo efeito caracterizao pela amplitue e frequência os frisos, é aicionao aos efeitos mencionaos anteriormente. O tipo e poros com frisos regulares é obtio se a frequência as curvas a paree o poro aumentar; -poros com canais aleatórios. É o tipo e poro mais complicao, com as parees o canal a assumirem configurações aleatórias e com uma variação casual o comprimento o canal [4]. Algumas conclusões gerais poem ser colocaas em eviência: -a tortuosiae é eviente ou latente em toos os moelos e transferência e massa em meios porosos; -a tortuosiae não é uma constante física e epene em primeiro lugar as características o meio poroso, tais como porosiae, iâmetro o poro, forma o canal, etc.; e

24 Introução -a tortuosiae epene muitas vezes e processos que ocorrem urante a transferência e massa tais como: compressão ou expansão o meio poroso; fenómeno e eposição e partículas ou macromoléculas entro o canal o poro até à base o poro; -a tortuosiae epene também o tipo e material que está a ser transferio (fenómeno e percolação). Por exemplo, a tortuosiae eterminaa por ifusão e gás e por ifusão macromolecular através e alguns meios porosos, poe ser iferente. Para um melhor entenimento o impacto a tortuosiae na transferência e massa e em processos e separação, tratano-se e um problema bastante complexo, é necessário investigar moelos e meios porosos mais simples. Nesse contexto eve ser consierao o estuo e leitos e misturas binárias e ternárias e partículas esféricas. Em misturas binárias e partículas esféricas, Mota et al. [44] representaram a tortuosiae total, τ, por uas componentes. A primeira, enominaa por macro tortuosiae, τ, é geraa pelos vazios o esqueleto as partículas e maior imensão. A seguna representa a tortuosiae geraa pelas partículas e menor imensão que se encontram agrupaas no interior o esqueleto as partículas e maior imensão, seno enominaa por micro tortuosiae, τ. A tortuosiae total é aa pelo prouto a macro e micro tortuosiae. Este conceito é estenio a misturas ternárias, surgino aicionalmente a componente a tortuosiae geraa pelas partículas e tamanho interméio, τ M Para valores bastante pequenos e δ, e ao que as partículas são esféricas, os autores propuseram para a região a máxima tortuosiae que binários) e τ τ τ (sistemas τ τ M τ τ (sistemas ternários), seno τ a tortuosiae os componentes puros e consieraa igual para toos os componentes. Previram assim uma 3 tortuosiae máxima total em sistemas binários e ternários igual a τ e τ, respectivamente. A influência a tortuosiae no movimento e macromoléculas em meios porosos tem sio menos investigaa que outros factores, como por exemplo, a relação o tamanho a nanopartícula para o tamanho o poro ou efeito e obstáculo. Em geral, o factor e tortuosiae combina o percurso percorrio com o factor forma o canal o poro. Poe-se especular que um caminho tortuoso com conições apropriaas para um objecto em forma e bastonete cria algum impulso e esorem. Este facto poe reuzir a velociae e fluxo o bastonete ou nanopartícula, em comparação com partículas esféricas e peso semelhante. A partir este ponto é legítimo colocar a hipótese e que nanopartículas lineares se movem e moo mais lento o que as esféricas, nas mesmas conições. Este fenómeno poe ser interessante para processos e bio separação; sistema e entrega e meicamentos no sangue, filtração em leitos profunos; movimento e nanopartículas (vírus, etc.) em meios porosos. Parece que a tortuosiae, geraa através as banas o poro, é preferível a outros factores e tortuosiae como muar e área e corte transversal o poro, aspereza a paree 3

25 Introução o poro e assim por iante. Na Figura o esboço o movimento e uma partícula em forma e bacilo num canal tortuoso é mostrao. Figura Meios porosos, preferencialmente, não evem ser super tortuosos mas super obraos na maior escala o comprimento a macromolécula. Caa vez que uma partícula linear rígia atravessa o canal e um poro com a forma e curva, isto provoca alterações como o aparecimento o factor e esorem as linhas e fluxo e orientação axial. O movimento e nanopartículas nos canais os poros poe ser consierao como um regime e "slalom" one o efeito e retaramento principal é a força e fricção quano a partícula passa a região a curva com muança e orientação no espaço. A orientação mais "lucrativa" e partículas com a forma linear é ao longo a linha e fluxo (A) ou o graiente a força motora (B). Na região a curva as linhas e fluxo e as principais irecções o eixo a partícula são esviaas: partículas como os bacilos expõem uma maior área e corte transversal que aumenta a força e fricção e resulta no fenómeno e retaramento. Se for assumio que o empacotamento consiste em partículas esféricas e tamanho p e que a tortuosiae nos canais os poros afecta o fluxo e nanopartículas pelo meio e curvas, Figura , então poe-se calcular o número e saltos. Figura Canais os poros. O parâmetro e escala o empacotamento poe ser escolhio como seno igual ao tamanho a partícula p. Ippolito et al. [43] executaram um estuo experimental as proprieaes e ispersão e partículas esféricas iniviuais e tamanho, moveno-se sob graviae num empacotamento aleatório seco e esferas granes e tamanho p. A razão os iâmetros / p situava-se abaixo o valor crítico.1547 sobre o qual as esferas mais pequenas ficam empilhaas entro o empacotamento. Foi escoberta ifusão em paralelo e 4

26 Introução transversal às irecções e velociae méia seno governaa, essencialmente, pelo iâmetro p e esferas acumulaas e não pelo tamanho as partículas pequenas móveis. Outra conição e limite eve ser relacionaa com a nanopartícula e a razão o tamanho a molécula com o tamanho o poro, λ = / mol pav, já escrita atrás. A razão λ eve estar no intervalo one se possa evitar a ifusão interior completamente esenvolvia mas o comprimento a macromolécula esteja na mesma escala que o tamanho o poro. é Se H é a espessura o leito e a tortuosiae o caminho comum, e comprimento τ = L e / H, então o número e curvas n b vem ao por: n = L / = τ H / (Equação ) b e p p L e Por exemplo, num empacotamento com apenas um tipo e esferas com H =.3 m (assumino que τ = 1.4), e 4.9 µm o número e curvas é n b = 8.6E+4. p = 1.33 µm o número e curvas é n b = 3.4E+4; para p = O número e curvas poe ser aumentao com a aplicação e um leito com uma mistura e partículas seguno Mota et al. [34]. Como foi referio anteriormente, os mesmos autores consieram que para uma mistura binária e partículas com tamanho, significativamente, iferente, a tortuosiae total o leito τ torna-se o prouto a micro e macro tortuosiae τ e τ, respectivamente, [34, 44, 45], ou seja, τ = τ τ. A fórmula (1.4.11) para empacotamentos binários, nesse caso, poe ser escrita como: H H nb = τ = τ τ (Equação 1.4.1) p A macro tortuosiae τ (fracção e partículas granes e tamanho ) aumenta o comprimento o caminho pela coluna, enquanto a micro tortuosiae τ (fracção e partículas e tamanho ) é responsável por um aumento o número e curvas por uniae e comprimento e poro ou espessura e leito. Agora para H =.3 m e número e curvas poe ser escrito como n =.5E+4 τ b = p = 1.33 µm o. Para uma razão grane e partículas e tamanho maior ( / 1 e até 15) é possível assumir um empacotamento e esferas binárias τ = τ = 1.45 e, finalmente, a tortuosiae total o empacotamento é igual a τ = 1.45 =.1, que á origem a n b(binary) = 5.1E+4. Mais efectivo, o ponto a tortuosiae, é a aplicação e partículas e tamanho e forma conhecia como a fracção e partículas e tamanho pequeno, que permite obter uma maior tortuosiae global. 5

27 Introução 1.5. Construção e meios porosos Tipos e meios porosos usaos em cromatografia Na cromatografia são aplicaos ois tipos principais e empacotamento: bi porosos e mono porosos. Os leitos bi porosos são constituíos por partículas microporosas enquanto os leitos mono porosos são formaos por partículas não porosas. Os empacotamentos bi porosos são, extensamente, usaos, por exemplo, no gel a cromatografia e exclusão molecular (SEC) one, epeneno o tamanho as moléculas a separar, são usaas partículas micro ou macroporosas [46]. Para melhorar a separação e proteínas é esenvolvia uma fase estacionária com granes poros. Por exemplo, o gel Sephacryl S-1 Superfine fornece um limite e exclusão a partícula tão alto quanto 3 nm a 4 nm [14]. Com base em experiências para partículas macroporosas, Pfeiffer e os seus colaboraores [47], escobriram que uma estrutura intra partículas não se comporta como um leito e microesferas uniformemente acumulaas, mas como uma assembleia não homogénea e micropartículas. Formalmente, poe-se consierar este leito como um empacotamento e micropartículas soltas com algum grau e agregação. O problema mencionao, acima, poe ser solucionao, parcialmente, com a aplicação e partículas não porosas cobertas por microesferas finas, ficano o empacotamento com uma estrutura aproximaa à e um empacotamento binário e partículas granes e pequenas não porosas. A investigação e processos incluino o fluxo através e granes poros, inica que o efeito máximo e convecção só poe ser alcançao se tuo o que estiver presente na fase móvel for forçao a fluir através o meio poroso [47]. Há ois moos e levar a cabo esta conição: usano meios porosos monolíticos (estrutura homogénea) ou aplicano partículas não porosas. No primeiro caso o problema o controlo a tortuosiae é eliminao. No seguno é necessário reunir as conições para construir um empacotamento com uma istribuição o tamanho os poros estreita. Um exemplo e aplicação material fibroso para a fase estacionária é ao no trabalho e Hamaker et al. [48]. As fibras que compõem a fase estacionária têm uma estrutura, relativamente, não porosa que minimiza o efeito e ifusão o poro Empacotamento binário com proprieaes controlaas Partino a eterminação o coeficiente e permeabiliae k, o coeficiente e Kozeny K e a tortuosiae méia τ, Mota et al. [34, 4] estuaram o efeito e x, a fracção volúmica e partículas esféricas e maior imensão e e ε, a porosiae e leitos e mistura, na permeabiliae e na tortuosiae. 6

28 Introução Em geral, num empacotamento binário ε, ser escrito que [4]: seno ( av ( x )) ( 1 ε ) ( τ ( )) 3 ε k = 36K ε pav e τ epenem e x, pelo que poe (Equação 1.5.1) av o iâmetro méio as partículas a mistura e ao por [34]: 1 x (1 x + ) = (Equação 1.5.) av Por vários raciocínios chega-se à conclusão e que [34]: com: ε F (5 4 δ ) (1 (1 ε ) x ( ε + (1 ε ) x ) (Equação 1.5.3) = F x /( /(1 + 1/ exp(.3))) (Equação 1.5.4) = A Equação representa a contínua muança na porosiae e leitos e mistura binária, assumino que ε =, e permite o cálculo a porosiae total a mistura ε conheceno a razão o tamanho as partículas δ e x. O moelo proposto é simples e usar para proprieaes controlaas como a permeabiliae. Em leitos e mistura a tortuosiae é muitas vezes assumia como constante [34]. Contuo, quano a porosiae a mistura se aproxima à região e valores mínimos ( x =.7), esta consieração não é vália. Baseano-se no coeficiente e Kozeny ( K ), K = K τ para iferentes razões e tamanhos e partículas. A tortuosiae para a razão apresentaa na Figura , a tortuosiae foi calculaa / = 1. é τ Figura Tortuosiae experimental (círculos) versus fracção volúmica e partículas esféricas e maior imensão, Tortuosiae calculaa pela função polinomial τ = x, para uma mistura binária com τ 1/ ε.4 / = 1. [4]. 1 ; Tortuosiae calculaa pela função x.9331x x.655x. 7

29 Introução A curva a traçao representa a aproximação polinomial: τ = x.9331x x.655x a um intervalo e valores e τ escritos na literatura. A tortuosiae poe também ser relacionaa com a porosiae por uma função o tipo: τ 1/ε α. Para as misturas experimentaas a melhor aproximação é conseguia quano α =.4, que á à tortuosiae a 1/ ε.4 τ. expressão: A epenência a permeabiliae com a fracção volúmica e partículas e tamanho maior na mistura, x, é mostraa na Figura 1.5., para a porosiae moelaa pela Equação.4 τ 1/ ε e a tortuosiae pela expressão: O aumento a razão / conuz a um aumento a curvatura a curva e permeabiliae. Esta conclusão é importante porque, normalmente, o efeito o aumento e não é tio em consieração. Um aumento espontâneo numa magnitue e orem é observao para a permeabiliae quano x >.7. Ao valor x x =.7 correspone, aproximaamente, o valor máximo e τ e o ponto e viragem (mínimo para máximo) na curva e k. Figura Permeabiliae, k, versus a fracção volúmica e partículas esféricas e maior imensão, x. aos experimentais (pontos) e cálculos pelo moelo proposto, Equação e 1/ ε.4 τ. 1 / = 1., / = 6.37, 3 / = 3.33 [4]. Finalmente a função ( ε /τ ) incluía na permeabiliae foi calculaa pela Equação , permitino construir o gráfico a Figura Para comparação, são mostraas curvas para o caso e tortuosiae constante (inepenente a porosiae), que é verificaa no caso e leitos com um único tipo e partículas eτ Os resultaos obtios inicam que a ifusiviae é mais sensível à tortuosiae o que a permeabiliae. Por outro lao, o impacto a variação a tortuosiae evio à presença e leitos binários eve ser tomao em consieração aquano os fenómenos e transporte nos leitos granulares. epois e comparar alguns valores, põe-se até 8

30 Introução a hipótese e issociação a tortuosiae a ifusiviae, se for escolhio um valor apropriao e x. (ε/τ) Figura Função ( ε /τ ) versus x para as curvas 1 / = 1.985; / = 3.33, 3 / = 6.37; 4 / = 1. e 5 / α. As curvas a traçao corresponem τ =1.45, [4]. Confrontaos com os resultaos alcançaos, surge a questão e saber one estes evem ser empregues. Uma as sugestões e aplicação relaciona-se com o uso e misturas binárias em meios e filtração one a proporção as partículas maiores seja superior a,7, sem variação significativa a permeabiliae. Um tipo particular e filtração foi esenvolvio. Leitos com cerca e 4 cm e espessura formaos por um esqueleto e esferas e viro (com iâmetro méio,3375 mm) e iferentes lamas e kieselguhr (e 1 µm a 5 µm). Foi experimentaa uma suspensão e leveuras e paeiro, teno sio escolhia uma concentração e 6 g/l e peso seco. A razão este valor prene-se com o facto e ser esta a concentração típica o microrganismo em bebias alcoólicas como o vinho e a cerveja. A suspensão foi filtraa através o meio filtrante a uma pressão constante e 8 kpa. A presença e células no filtrao foi analisaa irectamente por microscópio e pelo cultivo as amostras em meio malte agar. Não foram etectaas células. A efectiviae a filtração foi comparaa com a traicional filtração num bolo e kieselguhr não teno sio registaas quaisquer iferenças. As esferas e viro foram epois lavaas em fluxo contra corrente, fluiizaas e usaas cinquenta vezes (corresponente ao número e ensaios) sem sofrerem anos. A quantiae e kieselguhr era cerca e cinco vezes inferior o que o usual, com vantagens significativas quer em termos e protecção o filtro quer a níveis elevaos e poluição. Na investigação que é agora apresentaa foi estuaa a filtração e microrganismos com formas iferentes num leito binário, teno-se epois utilizao leitos uniformes e esferas o mesmo tamanho para termo e comparação. A fracção volúmica e partículas esféricas e maior imensão no leito binário, foi e x =.7, evio ao conjunto e estuos e Mota et al. e e Yu e Stanish, seguno os quais a este valor atinge-se um valor e porosiae e permeabiliae mínimas no leito com mistura binária. 9

31 Introução A razão e se ter aplicao um leito binário está relacionaa com o facto e, além o benefício o uso estes leitos a nível e análise e fenómenos e transporte em meios granulares, estes leitos poerem ser facilmente utilizaos em processos e engenharia. Os leitos binários são bons simulaores e uma larga gama e leitos naturais, e poem ser aplicaos e/ou observaos, por exemplo, na filtração em leitos profunos para purificação a água e beber [34], em cromatografia hiroinâmica, na migração e partículas finas, na contaminação sub solo, no fluxo e emulsões estáveis iluías, e na ifusão interior menos acessível em membranas. Na tentativa e perceber o que se passa nos sistemas ambientais, são regularmente simulaas em laboratório experiências sobre o transporte e colóies e bactérias. Essas experiências permitem o controlo em vários parâmetros para que as variáveis que estejam a ser analisaas possam no ser em separao o resto o sistema. O factor chave nestas experiências laboratoriais é mesmo a escolha e a preparação o meio poroso. As uas principais metas na escolha e preparação os meios porosos são a representação realística o sistema ambiental e interesse e a reproutibiliae entre os ensaios. Infelizmente, estas uas metas entram muitas vezes em conflito [49] Mistura e empacotamento e misturas Geralmente, o métoo e construção e um leito e partículas e tamanho não uniforme no interior e um recipiente envolve uma mistura inicial os componentes no exterior o mesmo, seno epois vertios para o seu interior. Na etapa final, as partículas são compactaas. É possível, no entanto, encontrar aboragens bastante istintas na obtenção e um empacotamento e partículas. Wright et al. [49] realizaram a mistura e ois tamanhos e esferas, colocano pequenas quantiaes nas proporções pretenias num balão e viro conteno um agitaor magnético. epois e agitação, urante 3 minutos, a mistura era vertia para uma coluna. O leito total era assim construío por aições sucessivas e pequenas quantiaes pré misturaas no exterior a coluna. Mconal et al. [36], e moo a evitar bolhas e ar no empacotamento, urante a eterminação a permeabiliae, colocavam previamente água numa coluna. Para minimizar a formação e regiões heterogéneas no empacotamento, as partículas esféricas eram aicionaas em cinco partias pré misturaas. Após caa aição, o tubo era batio lateralmente, e moo a aumentar a ensiae o empacotamento. Para uma melhor compreensão o impacto a tortuosiae na transferência e massa e processos e separação, é necessário investigar meios porosos simplificaos, como é o caso e misturas binárias [4]. A ispersão os valores observaos na literatura, para parâmetros como a tortuosiae e a porosiae, em leitos porosos com as mesmas características evese, portanto, em parte, aos iferentes métoos e mistura e empacotamento utilizaos na construção os leitos [34, 36, 37]. 3

32 Introução 1.6. Importância o estuo as proprieaes os meios porosos e tortuosiae Uma melhor compreensão os fenómenos que ocorrem na transferência e fluxos ao longo e meios porosos, a porosiae e a tortuosiae poem permitir melhorar, em termos e eficiência e em termos económicos, importantes operações unitárias em vários processos inustriais. As áreas abrangias são tão iferentes como o processamento alimentar, a ifusão e poluentes, a libertação e agro-químicos em solos, a catálise heterogénea, a quimioterapia. Por exemplo, na área a agricultura, um conhecimento mais completo a inâmica o fluxo que circula através e um meio poroso insaturao seria útil para o esenvolvimento e um sistema eficaz a entrega a água e os nutrientes para o crescimento as plantas no espaço [5]. A eterminação e coeficientes e ifusão, na fase aquosa, os solutos nos meios porosos é também essencial para compreener e moelar o transporte e um contaminante. A preição e coeficientes e ifusão em zonas saturaas e insaturaas requer o conhecimento e factores e tortuosiae e e constrição. Nenhum métoo está isponível para uma meia irecta estes factores, que são empíricos na sua efinição. Tenta-se actualmente etermina-lo a partir e uma efinição nova para o factor e tortuosiae, como a razão a superfície interfacial real e a interfacial ieal a área [51]. O crescimento e biomassa microbiana em meios porosos saturaos provoca a muança a porosiae e conutiviae hiráulica o que é normalmente esignao por biofouling. Experiências recentes mostram que o crescimento e bactérias poe criar estruturas que muam constantemente, resultano no esenvolvimento e caminhos preferenciais ou zonas estagnaas. Estas muanças físicas afectam os mecanismos primários o transporte e poluentes como a velociae a água no poro e a ispersão hiroinâmica. Ocorre uma muança no esenvolvimento as proprieaes em ois estágios: no começo, pequenas muanças na velociae o fluxo e na ispersão; mais tare, o crescimento as microcolónias aumenta o bioentupimento alterano o fluxo e uniforme para não uniforme, e mostrano um efeito e ifusão por retaramento [5]. Além o crescimento a biomassa, o transporte e colóies ao longo os meios porosos começa agora a ser iscutio (Figura 1.6.1) [53]. Figura Transporte e estino e partículas coloiais em meios porosos saturaos [53]. 31

33 Introução No cérebro, os coeficientes e ifusão as moléculas neuro activas, no espaço intra e extracelular, são também relacionaos geralmente por um factor o tortuosiae, que representa o aumento no comprimento e trajecto num meio poroso, que envolve o tecio o cérebro [54]. O estuo o movimento e microrganismos em leitos porosos é importante para compreener muitos problemas práticos que variam ese a patogeniciae e uma oença à biorremeiação e esperícios perigosos no ambiente. Neste omínio o papel a tortuosiae na ifusão ou percolação é caa vez mais tio em consieração. A forma as células, que é quantificaa pela sua largura e comprimento, afecta o transporte e microrganismos através e meios porosos. Um grane número e factores físicos (tal como o tamanho os constituintes o leito, o tamanho os poros), químicos (a superfície o meio poroso, força iónica o poro com água), e biológicos (tamanho a célula, carga superficial a célula, hirofobiciae a superfície celular, mobiliae), por exemplo, afectam fortemente o transporte e bactérias em aquíferos. Mesmo que em formações geológicas tenham sio encontraas bactérias com forma istinta, que vão ese formas filamentosas a espirais, bacilos, elipsóies, ovóies e cocos, o tamanho as bactérias tem sio analisao num grane número e estuos, e não tem sio prestaa a evia atenção ao efeito a forma no transporte e células [56]. Nesta investigação tenta-se avaliar o efeito a forma as células no transporte e bacilos (L. bulgaricus) e leveuras (S. cerevisiae) na separação ao longo e um meio granular. e antemão, sabe-se que há um efeito cromatográfico na forma as células, com as formas esféricas a serem favorecias no transporte. Isto sugere que os moelos e transporte tenham e ser ajustaos à forma a célula [55]. 3

34 Materiais e Métoos. Materiais e Métoos epois e se terem efinio os objectivos a investigação, iniciou-se o trabalho experimental..1. Características a coluna No princípio utilizou-se uma coluna e troca iónica Pharmacia Biotech, moelo XK 6/7, com uma altura e 6.5 cm e iâmetro.5 cm. Uma as vantagens que esta coluna oferece é a possibiliae e colher amostras, ao longo o tempo, num colector automático. Além isso, como no epartamento e Engenharia Biológica estão isponíveis esferas e viro com tamanhos istintos e inferiores a.5 cm, a aplicação estas esferas, para formar o leito a coluna, evitaria o aparecimento e efeitos e paree, escritos na secção Porosiae, a introução. Embora esta coluna apresentasse algumas vantagens, o facto e ter uma camisa para controlo e temperatura, ser bastante alta e eter no topo e na base um aaptaor, foi muito ifícil o empacotamento o leito, o qual era, praticamente, impraticável remover bolhas e ar que nele estivessem contias. Seno assim, optou-se por construir uma coluna transparente, em acrílico, com 4 mm e iâmetro e 5 cm e altura, uas válvulas no topo e uma na base, conteno como suporte o leito tela metálica Haver & Boecker com malha quaraa e abertura.63 mm (ver Figura.1.1.). Legena: Recipiente com água - Bomba peristáltica 3,4,7- Válvulas 5- Coluna 6- Saía a coluna com torneira para recolha a amostra 8- Eppenorf Água Empacotamento Figura.1.1. Esquema a instalação experimental para realização e ensaios e separação e microrganismos e respectiva legena. 33

35 Materiais e Métoos.. Empacotamento, porosiae e tamanho os poros o leito PARTE I, II e III Com base nos conceitos apontaos na Introução, relativos à porosiae, e consierano que um os leitos a estuar seria constituío por uma mistura binária e esferas e viro, efiniram-se as conições para o empacotamento: -razão e esferas com rácio δ.1.1 = / 1 = / ; -fracção volúmica ou mássica as partículas e maior imensão x =.7. Para cumprir a primeira conição foram utilizaas esferas com os iâmetros méios: -esferas e maior imensão (esferas Sigmun Linner Tipo S): = 1.15 mm -esferas e menor imensão (microesferas e viro Sovitec AF): =.1115 mm Pelo último ponto concluiu-se que a massa o leito a utilizar tinha e ser tal que tivesse 7% (ou 68%) as esferas e maior tamanho e 3% (ou 3%) as e menor tamanho. A maioria os leitos binários foi construía com uma massa total e 4 g, o que significa: -massa e esferas e maior imensão: m =,7 4= 8 g -massa e esferas e menor imensão: m =,3 4= 1 g Estas conições permitem a formação e um leito, com altura próxima e 15 cm. O tamanho méio as partículas presentes na mistura, poe ser calculao pela equação: 1 x (1 x + Neste caso vem que: ) = (Equação..1) av 1 av =,7 1,15 ( 1,7) +,1115 av av, seguno Mota et al. [34], = 3µ m Para construir o leito com uma mistura e esferas e iferentes tamanhos (mistura binária) procee-se o moo a seguir escrito. Num goblé coloca-se uma massa total e 4 g e esferas, com a composição esejaa. 34

36 Materiais e Métoos Prepara-se uma solução e 9 % (v/v) e glicerol em água que funciona como ligante entre as partículas e iferentes imensões. Aiciona-se então ao goblé a solução e glicerol e forma a obter-se uma mistura com 15% (m/m) a solução. Este passo, na prática, consiste em aicionar aos poucos glicerol a 9% (v/v), até obter uma boa pasta uniforme, o que se consegue mexeno bem com uma vareta e viro. Verte-se, cuiaosamente, a pasta para a coluna, raspano as parees o goblé e lavano com um esguicho para entro a coluna e moo que as 4 g e esferas fiquem entro a coluna. eve-se ter o cuiao e não mexer o leito, uma vez que se trata e uma coluna e acrílico e esse proceimento aumentará probabiliae e aparecimento e bolhas e ar. Ao longo esta operação convém também ir compactano o leito (bater com a coluna, suavemente, no chão na irecção vertical). Este pequeno mas importante pormenor permite obter um empacotamento mais homogéneo ao mesmo tempo que reuz a presença e bolhas. Pono um pano fino humeecio no chão para os batimentos, tem-se melhores resultaos. Com ajua e um tubo e silicone anexao a uma seringa, aiciona-se cuiaosamente água estilaa à coluna estapaa e moo a não estruir a superfície superior o empacotamento, até se obter uma altura e água na coluna próxima o topo a mesma. A válvula a base a coluna (saía) mantém-se fechaa urante esta operação. No passo imeiato fecha-se a coluna no topo com uma tampa e veante e silicone. Uma tubagem flexível é ligaa a uma as válvulas aí existente, enquanto a outra válvula permanece fechaa. Através a válvula unia à tubagem preenche-se, completamente, a coluna com água. Ao abrir a válvula a base, as esferas são lavaas o glicerol com um caual elevao e água estilaa. A forma mais correcta e confirmar que a coluna está lavaa poe ser feita por refractometria. A refractometria baseia-se no facto e que quano um raio luminoso passa obliquamente e um meio para outro, com ensiae óptica iferente, sofre uma alteração na sua irecção e propagação. efine-se ínice e refracção, e um ao meio, como seno a razão entre a velociae a luz no vácuo e a velociae nesse meio. O ínice e refracção, para o conjunto e ois meios, epene a temperatura, o comprimento e ona a luz e a pressão no caso os gases. Se estes factores se mantiverem constantes, o ínice e refracção é uma constante característica o meio a que iz respeito. Poe-se, assim, entre outros, usarse na ientificação e eterminação o grau e pureza e muitas substâncias. O ínice e refracção e uma solução e glicerol 9% (v/v) é, aproximaamente, 1.49, enquanto o e água estilaa é e Meino os ínices e refracção constatase ao longo o volume filtrao uma iminuição o ínice, poeno ar-se a lavagem por terminaa quano este situar-se à volta os Ve = Como foi referio na Introução a porosiae, ε, é efinia por: ε. Uma forma e estimar o volume e poros poe ser feita com a injecção e um corante. Para isso abre-se a válvula a base até a água baixar ao nível o empacotamento. Com a V T 35

37 Materiais e Métoos ajua e um tubo e silicone anexao a uma seringa, aicionam-se 1 ml e uma mistura conteno 15 ml e azul extrano a g/l e 85 ml a solução aquosa e glicerol a 3% (v/v). Abre-se e novo a válvula a base a coluna e recolhe-se o filtrao (a coluna fica com um aspecto semelhante ao a Figura..1.), terminano assim que apareça a primeira gota azul. O volume recolhio equivale ao volume e poros. Figura..1. Instalação experimental urante um ensaio e eterminação a porosiae com uma solução e azul extrano. Com a altura o empacotamento e área a transversal a coluna poe-se calcular o volume total a coluna e assim, eterminar a porosiae. eterminaa esta forma, na primeira parte a investigação, a porosiae foi igual a,17, na parte II e III igual a,7. O tamanho méio os poros, pav que se formam no leito, seguno Perry et al. [56] é ao por: ε = 3 1 ε pav av (Equação..3) e poe ser calculao, neste momento, para o leito binário em estuo, no caso em queε =,7:,7 pav =..3 59µm. 3 1,7 36

38 Materiais e Métoos O tamanho mínimo os poros é calculao pela mesma equação, assumino uma mistura com partículas pequenas ( =.1115 mm) o mesmo tamanho (ε =.36), obteno-se p min 41.8 µm. PARTE IV e V Nas partes seguintes o trabalho foram experimentaos leitos conteno partículas e um único tamanho. A construção estes empacotamentos é bastante mais simples o que a construção e leitos e misturas binárias ou ternárias. A forma mais simples e obter o leito, neste caso, consiste em encher a coluna com água, preencheno-a epois, e forma lenta, com a massa e esferas apropriaa. Tal como no caso anteriormente explicao, eve-se ir bateno a coluna, lentamente, para eliminar bolhas que se possam ter formao entretanto. Aqui já é possível, e é até recomenao, agitar o leito com uma vareta e viro, por exemplo. Na parte IV estuou-se o esempenho e um empacotamento constituío por microesferas e viro Sovitec AF com.1115 mm e iâmetro, ou seja, as esferas utilizaas na mistura binária a parte I, II e III com iâmetro. Uma vez que estas partículas contêm uma percentagem e pó significativa, a construção o leito implicou a lavagem as mesmas com uma quantiae muito grane e água estilaa. A quantiae e esferas aplicaa foi e 1 g (iêntica à o leito binário), e assim que a água e saía apresentava um aspecto límpio (antes era turvo) eu-se a construção o leito por terminaa, teno 5.6 cm e altura. O volume e poros meio foi e 9,6 ml, obteno-se uma porosiae ε igual a.381.com os valores isponibilizaos obtém-se pav = 46 µm. A última parte implicou a construção e um leito com 8 g e esferas e 1.15 mm e iâmetro, Sigmun Linner Tipo S, que são as esferas e maior imensão,, que marcaram presença no empacotamento binário a parte I, II e III. Nestas conições formou-se um empacotamento com ε =.385 e1.1 cm e altura, a que correspone um valor e pav = 47 µm...1. Características o empacotamento binário utilizao A partir as porosiaes e caa um os leitos com partículas o mesmo tamanho e assumino um valor e porosiae esses leitos igual à sua méia, ou seja, ε = ε =.383 poe-se, neste momento, apresentar, graficamente, as características o empacotamento binário utilizao. Como á para ver pela Figura... a uma fracção volúmica e x =.7 tem-se um leito binário com porosiae ε =.7, para x =, a que correspone um leito com partículas e um único tamanho, obtém-se um valor e porosiae ε =

39 Materiais e Métoos,4,35,3 ε,5,,15,,1,,3,4,5,6,7,8,9 1, x Figura... epenência os aos experimentais (círculo) e previstos (curva) a porosiae ε o empacotamento binário com a fracção volúmica e partículas esféricas e maior imensão, x. A curva foi eterminaa pela Equação para δ = / =. 1 e ε =.383. A representação o tamanho os poros quano a porosiae é função o conteúo ( fraccionário o empacotamento x )..3. ε = ε e acoro a Equação á origem à Figura pav, µm = 59µm Leito a coluna 4 3,,1,,3,4,5,6,7,8,9 1, x Figura..3. Variação os aos experimentais (círculo) e previstos (curva) o tamanho os poros o empacotamento, pav, com a fracção volúmica e partículas esféricas e maior imensão, x. foi estimao pela Equação 1.5.., seno = / =. 1 pav δ e ε =.383. A x =.7 o tamanho méio os poros é maior o que no empacotamento e partículas e menor tamanho, assim como a tortuosiae os poros o empacotamento binário τ = 1/ ε é maior comparativamente com o valor e 1.47 para o empacotamento e partículas e tamanho pequeno,. A influência a fracção volúmica as partículas e maior tamanho na permeabiliae, e acoro com o moelo e Mota et al. [34], representao atrás pela Equação e assumino 38

40 Materiais e Métoos que a tortuosiae é aa por na Figura..4. 1/ ε.4 τ = leva à construção e um gráfico como o apresentao Como é possível verificar na curva 4, a permeabiliae o empacotamento binário usao nas experiências, em que a porosiae o empacotamento a.7, está perto a o leito e partículas menor imensão. x =.7 é cerca e ε ~ 1E / = - / = / = / = / = k*1 6, m E-4,,,4,6,8 x Figura..4. epenência a permeabiliae k com a fracção volúmica e partículas esféricas e maior imensão, x, para iferentes razões e partículas /, baseaa no moelo a Equação O círculo correspone à situação experimental em que δ = / =.1 e ε =.383. Nas iferentes curvas, por simpliciae, a porosiae ε =.4 foi assumia em toas as funções e 1 a 5. com Estas observações vêm evienciar e provar a utilização e um empacotamento binário x =.7 e uma fracção / = Crescimento e Lactobacillus bulgaricus Em termos microbiológicos, no iogurte estacam-se bactérias as espécies Streptococcus termophillus e Lactobacillus bulgaricus. Como os próprios nomes inicam, as primeiras têm forma esférica ou ovóie (iâmetro e.5 µm a. µm), as segunas forma e bastonete (com comprimento 1. µm a 1. µm e altura.5 µm a 1. µm) [58]. No início a investigação tentaram-se isolar Lactobacillus bulgaricus a partir o iogurte, e acoro com o protocolo a isciplina e Microbiologia Aplicaa e Neves [59] apresentao no Apênice A. A forma os principais microrganismos a flora o iogurte é iferente, no entanto, na análise microscópica verificou-se sempre um omínio os cocos. Juntano este factor ao facto as imensões serem aproximaas e o facto e ambos corarem e violeta na coloração e 39

41 Materiais e Métoos Gram (são células Gram positivas), não foi possível isolar os microrganismos pretenios os bacilos. Optou-se então por comprar amostras e Lactobacillus bulgaricus à biblioteca belga e microrganismos BCCM/LMG, one os microrganismos são isponibilizaos na forma liofilizaa. Para promover a sua multiplicação procee-se como inicao no Apênice C. Inicialmente a reproução foi feita em placas e Petri, one o crescimento era escasso. Mais tare fez-se o armazenamento por congelamento a cultura em eppenorfs e acoro também com o Apênice C. Esta técnica, contuo, não parece ser muito inicaa quano são exigios graus elevaos e pureza as culturas e quano estas são bastante sensíveis à temperatura. Além isso, estas células são anaeróbias facultativas, e por vezes microaerofílicas, o que significa que crescem pouco na presença e ar e melhor na presença e uma tensão reuzia e oxigénio. Por este motivo, a partir e Abril e 4, o crescimento os bacilos passou a ser estimulao em slants com meio MRS, a 37 ºC numa atmosfera e 5% e ióxio e carbono (CO ). Inicialmente os Lactobacillus bulgaricus apresentavam um comprimento méio e 4,3 µm. Na seguna parte o trabalho esse valor subiu para, aproximaamente, 6,8 µm, seno o iâmetro e,54 µm, o que correspone a um volume e 1,56 µm 3. Figura.3.1. Imagem e Lactobacillus bulgaricus, coraos com violeta cristal, captaa com uma objectiva e 4 PHACO no microscópio Leitz o Laboratório e Imagem o EB. No leito e mistura binária, consierano o comprimento os bacilos, a razão o tamanho a molécula com o tamanho o poro, λ, para a parte II vem então aa 6.8µ m = = 59µ m por: λ Para empacotamentos e partículas com mesmo tamanho obtêm-se os valores e λ iguais a.148 e.14, para pequenas e granes esferas, respectivamente. É também útil saber o valor a relação ( 1 λ) como se verá na secção seguinte. Obtém-se um valor e ( 1 λ) =.783 para o leito binário, ( 1 λ) =.76 para o leito com esferas e iâmetro e ( 1 λ) =.97 para o leito com esferas e maior iâmetro,. Se se consierar o 4

42 Materiais e Métoos iâmetro os bacilos (.54 µm) obtém-se o valor e λ =.9 para o leito binário,.1 para partículas e menor imensão e.1 para partículas e maior imensão..98 é o valor que se aquire e ( 1 λ) para pequenas e granes partículas. para o leito e mistura, seno.976 e.998, respectivamente, o valor.4. Crescimento e Saccharomyces cerevisiae As leveuras Saccharomyces cerevisiae, mais conhecias como fermento e paeiro, são usaas, hoje em ia, em grane escala, na inústria alimentar para proução e vários materiais, vinhos, e cervejas e alimentares. Na inústria e panificação esempenham um papel tão crucial que é já mesmo possível encontrar nos hipermercaos saquetas que contêm estas leveuras na forma granular. A sua manipulação não oferece muitos cuiaos e o seu genoma encontra-se completamente sequenciao, pelo que estão também fortemente envolvias em investigação. São unicelulares, globulares e/ou por vezes alongaas na forma, verificano-se aina, consoante o estao e crescimento e o meio e cultura, a presença e gémulas. A inução o seu crescimento é possível e inúmeras formas e epene, sobretuo, o estino one se querem aplicar. Neste trabalho interessava que as leveuras tivessem uma forma circular e um iâmetro aproximao e 5 µm. Numa primeira fase utilizou-se fermento instantâneo Fermipan. epois e experimentar iferentes meios e cultura, por análise e imagem, chegou-se à conclusão que a forma mais eficaz e simples e o crescer consistiria em inoculá-lo urante três horas, a 3º C, com ligeira agitação, num meio esterilizao conteno cloreto e sóio (NaCl) 8 g/l e uma pequena quantiae e glucose (C 6 H 1 O 6 ) 3. g/l para as células ficarem mais frescas. Nessas conições obtinham-se imagens como a Figura.4.1. Figura.4.1. Imagem e S. cerevisiae, coraas com violeta cristal, captaa com uma objectiva e 4 PHACO no microscópio Leitz o Laboratório e Imagem o EB. 41

43 Materiais e Métoos Para um maior controlo a assepsia optou-se epois por inocular estas leveuras em placas e petri conteno meio Yeast Extract Peptone extrose YEP (escrito no Apênice B). A cultura e leveuras é renovaa mensalmente numa nova placa. Sempre que se efectua um ensaio e filtração na coluna, com a ajua e uma ansa, inoculam-se as leveuras em meio YEP líquio. As Saccharomyces cerevisiae, e forma esférica, mantiveram ao longo e toa a investigação, um iâmetro méio aproximao e 4,47 µm, que correspone a um volume e 46,77 µm 3. Para as leveuras no leito e mistura binária a razão o tamanho a molécula com o 4.47µ m tamanho o poro, λ, calcula-se fazeno: = = µ m λ. Em leitos e partículas com mesmo tamanho obtêm-se os valores e λ iguais a.97 e.1, para pequenas e granes esferas, respectivamente. Como foi efectuao para os bacilos, é necessário ter conhecimento o valor e ( 1 λ). Obtém-se um valor e ( 1 λ) =.85 para o leito binário, ( 1 λ) =.815 para o leito com esferas e iâmetro e ( 1 λ ) =.98 para o leito com esferas e iâmetro,..5. Proceimento experimental nos ensaios e filtração com microrganismos e outras partículas PARTE I Antes e ar início à filtração e células eciiu-se que, para acautelar o, eventual, crescimento e biofilme na coluna, everia retirar-se o meio e cultura one estas crescem (por centrifugação). Construiu-se a curva e calibração e biomassa para caa um os microrganismos, como é inicao no Apênice. Estano estimaas, com o auxílio as escalas e lâminas micrométricas e o programa Image Pro Plus, as principais imensões as células em questão (no caso as S. cerevisiae o iâmetro méio, no caso os L. bulgaricus o iâmetro e a altura méios), nos primeiros três ensaios e filtração proceeu-se e acoro com o esquema a Figura.5.1. Inicialmente não se fazia ieia acerca o valor razoável e concentração a empregar e caa um os microrganismos, sabeno-se apenas que esta tem e ser igual e moo a que estes estejam nas mesmas conições. Acabou-se por experimentar uma concentração méia e trabalho e 5g biomassa/ L, o que analisao na câmara e Neubauer corresponia, aproximaamente, a uma concentração e,65e+7 células/ml para as leveuras e e 5,71E+7 células/ml para os bacilos. 4

44 Materiais e Métoos O começo e um ensaio e filtração tem um proceimento muito semelhante ao usao e já escrito para eterminar a porosiae. Abre-se a válvula o topo a coluna que á ligação ao ar e a válvula a base até a água baixar ao nível o empacotamento. Nesta fase a investigação, com a ajua e um tubo e silicone unio a uma seringa, colocavam-se os ml a combinação homogeneizaa as uas culturas. eixava-se escer, e novo, o líquio até ao nível o empacotamento. Preenchia-se agora com água a coluna até à linha referência e fechava-se a válvula o topo. O processo e separação iniciava-se com a abertura a válvula a base a coluna e a injecção e água estilaa pela outra válvula o topo. epois e passar um volume que fosse equivalente ao volume e poros, iniciava-se a recolha as amostras e em ml. A avaliação o número células no final e caa um estes ensaios, como está evienciao na Figura.5.1., foi feita pelo métoo e contagem irecta, com a câmara e Neubauer. Os cálculos envolvios encontram-se eluciaos no Apênice E. Crescimento e S. cerevisiae em meio conteno NaCl e C 6 H 1 O 6 Crescimento e Lactobacillus bulgaricus em meio MRS eterminação a concentração (g/ L) as leveuras por.o. e iluição para que Conc. leveuras = Conc. bacilos eterminação a concentração (g/l) os bacilos por.o. e iluição para que Conc. bacilos = Conc. leveuras Centrifugação e ressuspensão as células em tampão. Centrifugação e ressuspensão as células em tampão. 1 ml 1 ml Homogeneização a mistura no vórtex Coluna com ε =,17 Recolha e amostras e em ml Contagem as células na câmara e Neubauer ao microscópio Figura.5.1. Esquema o proceimento experimental realizao nos ensaios e filtração a PARTE I. 43

45 Materiais e Métoos PARTE II Uma as muanças foi apontaa na secção.4., e está relacionaa com a moificação o meio e crescimento as leveuras para meio YEP. Outra foi o início a utilização e formaleío para fixar e conservar as células. O formaleío é um fixaor e células comercializao, normalmente, a 37% (v/v). A solução aquosa é conhecia como formol ou formalina e a concentração mais usaa em patologia é e 4% (v/v). Tem penetração rápia nos tecios sem os enurecer, tem poer coagulante sobre as proteínas e requer, relativamente, pouco tempo e fixação, seno portanto um bom fixaor. Também é bom conservante, pois sabe-se que os tecios poem nele permanecer por mais e ez anos sem granes moificações nas suas estruturas [6]. Quano se observavam ao microscópio algumas amostras os microrganismos constatava-se a presença e aglomeraos e células, sobretuo e bacilos, pelo que a aplicação e ultra-sons se tornou também uma etapa importante na preparação e caa ensaio e filtração. A aplicação os ultra-sons é feita por aparelhos, vulgarmente esignaos por sonicaores. Consistem num geraor que fornece energia eléctrica e alta-frequência (cerca e KHz) a um transutor piezo-eléctrico, o que transforma esta energia em vibrações mecânicas na sona (haste-metálica) à qual está acoplao. Esta vibração origina a formação e onas sónicas ou ultrasónicas (acima os 16KHz) que causam no meio áreas alternaas e pressão negativa e positiva. Isto trauz-se na formação e milhões e bolhas microscópicas fenómeno esignao por cavitação que se expanem no ciclo e pressão negativa e colapsam no ciclo e pressão positiva, ano origem a milhões e onas e choque. Ou seja, estas bolhas formam turbilhões miniatura, que promovem uma maior transferência e massa e e calor no seio o líquio, originano, também tensões e corte, uma vez que inuzem graientes e velociae. A sona que emite os ultra-sons é mergulhaa na suspensão a esintegrar e eve ser perfeitamente lisa para fornecer a máxima potência sónica [9]. No caso as leveuras aplicou-se a sona, em geral, cerca e 1 segunos à potência 5. Para os bacilos repetiu-se três vezes o ciclo e aplicação a sona urante 1 segunos à potência 5 seguio e 5 segunos e repouso. eve-se notar que o tempo e utilização a sona foi sempre extremamente curto pois o objectivo era separar os microrganismos e não matá-los ou remover os seus constituintes intracelulares. No sentio e facultar a contagem e a istinção os microrganismos aicionou-se um volume e 18 µl o corante cristal violeta,3 g/ml a caa uma as amostras a examinar, teno o cuiao e filtrar o corante, previamente, para remover os cristais que este forma ao longo o tempo. A muança mais importante tem a ver, contuo, com a eterminação a concentração os microrganismos. Nos primeiros testes a concentração no início e caa ensaio era eterminaa pelo métoo e turbiimetria e no final era calculaa com base nas imensões a câmara e Neubauer. A partir este momento, a concentração os microrganismos passou a ser avaliaa e igual forma no início e no final o ensaio. Cessou-se e utilizar a câmara e 44

46 Materiais e Métoos Neubauer para empregar lâminas e lamelas simples. Assumiu-se que a gota (e volume sabio) que é colocaa na lâmina, fica espalhaa, uniformemente, por toa a lamela (com área conhecia). No microscópio começaram a captar-se várias fotografias em pontos iferentes a lamela, e passou-se a calcular a concentração e caa amostra e microrganismos como está exemplificao na parte II o Apênice E Além e toas as alterações já apontaas, as imensões principais os microrganismos passaram a ser calculaas com o auxílio o Programa Sigma Scan Pro 5, como é também emonstrao na parte II o Apênice E. Algumas as muanças são esquematizaas na Figura.5.. Uma vez que na PARTE I a investigação a concentração e trabalho empregue pareceu ser muito elevaa, nesta seguna parte, a concentração méia e trabalho para as Saccharomyces cerevisiae e os Lactobacillus bulgaricus foi e,8e+6 células/ml (cerca e ez vezes inferior). S. cerevisiae L. bulgaricus Sonicação, centrifugação, iluição e ressuspensão as células numa solução e tampão e formaleío 4% (v/v) Sonicação, centrifugação, iluição e ressuspensão as células numa solução e tampão e formaleío 4% (v/v). eterminação a concentração (nº células/ ml) ao microscópio e iluição para que Conc. leveuras = Conc. bacilos eterminação a concentração (nº células/ ml) ao microscópio e iluição para que Conc. bacilos = Conc. leveuras 5 ml 5 ml Homogeneização a mistura no vórtex Coluna com ε =,7 Aição e 18 µl e cristal violeta,3 g/ml Recolha e amostras e 1 em 1 ml Contagem as células na lamela ao microscópio Figura.5.. Esquema o proceimento experimental realizao nos ensaios e filtração a PARTE II. 45

47 Materiais e Métoos PARTE III epois e realizar os ensaios com a mistura e leveuras e bacilos, pareceu importante testar o comportamento e células com uma forma semelhante à as leveuras (circular), mas volume aproximaamente igual ao os bacilos. eciiu-se então avaliar a filtração e microesferas num leito binário iêntico ao a parte I e II. A investigação e Saccharomyces cerevisiae e microesferas poe ser também útil evio à sua aplicação como traçaores no sub-solo [4]. No mercao estão isponíveis microesferas e látex, que são as que interessam no caso e um empacotamento e esferas e viro para minimizar interacções. Partino este pressuposto eterminou-se o iâmetro aproximao que as microesferas everiam ter e ter para apresentar um volume iêntico ao os bacilos. Nos ensaios anteriores, encontraram-se os valores méios: { iâmetro. méio 4.47 m} S. cerevisiae = µ Lbulgaricus {iâmetro méio =,54 µm; altura méia = 6,8 µm} Seno assim: 3 3 4Πr V S. cerevisiae = = Π = 33, 5µ m V 3 3,54 3 L. bu lg aricus = Πr h = Π 6,8 = 1, 44µ m Para as microesferas terem o mesmo volume que os bacilos: 4Πr 1,44 = 3 3 r 3 1,44 3 = r 4Π 3 =,3397 r =,6978 = 1,4µ m Optou-se por aquirir esferas e iâmetro 1 µm, em vez e 1,4 µm, para garantir que o volume estas seria igual ou inferior ao os bacilos. As microesferas fluorescentes emitem cores luminosas e istintas quano iluminaas por luzes com pequenos comprimentos e ona. Esta proprieae resulta num elevao contraste e visibiliae em relação a materiais e funo. Além isso os proutos fluorescentes oferecem uma melhor sensibiliae quano empregues numa vasta área e métoos analíticos. As microesferas fluorescentes poem ser etectaas com um microscópio e epifluorescência, num microscópio confocal, num espectrofotómetro e fluorescência ou num contaor e células com fluorescência activa. As partículas poem ser observaas, irectamente, na matriz ou no meio a serem testaas, ou poem ser colhias em filtros membranares para posterior examinação no microscópio. Neste trabalho usaram-se microesferas, em solução aquosa, e poliestireno vere fluorescente monoisperso, a uke Scientific Corporation, com referência G1. Estas 46

48 Materiais e Métoos apresentam uma massa específica e 1,5 g/cm 3, uma concentração e 1.8 x1 1 microesferas /ml e um ínice e refracção e 1,59 a 589 nm. Como proprieaes espectrais apresentam excitação máxima a 468 nm e emissão máxima a 58 nm. Como foi anteriormente explicao o seu iâmetro méio é 1 µm [61]. O proceimento nos ensaios e filtração estas esferas foi semelhante ao cumprio para a mistura e Saccharomyces cerevisiae e Lactobacillus bulgaricus. Como foi referio a concentração inicial é 1.8 x1 1 microesferas /ml, que é um valor muito elevao. Uma vez que as esferas são menores o que as leveuras, para a massa ser, aproximaamente, a mesma que se usou nos ensaios anteriores, é necessário usar uma concentração e microesferas superior. Sabe-se que: m = V ρ (Equação.5.1) em que ρ é a massa específica as esferas, m e V são a massa e o volume as esferas, respectivamente. euz-se a partir aqui que: m = ρ. V m p V Π m p 6 3 V V leveuras esferas 5 = 1 3 = 15 m m leveuras esferas = 15 m = 15m leveuras esferas Como a concentração méia celular usaa nos ensaios a parte II foi e,8e+6 células/ml, a concentração e esferas a usar evia ser e 15.8E E + 8 microesferas /ml. Na prática a concentração méia e microesferas empregue foi e.7e+8 microesferas /ml. Figura.5.3. Imagem e microesferas e poliestireno vere fluorescente monoisperso, em solução aquosa iluía, captaa com uma objectiva e 4 PHACO no microscópio Leitz o Laboratório e Imagem o EB. 47

49 Materiais e Métoos As microesferas, que poem ser visualizaas na Figura.5.3., são simples e manusear e o principal cuiao que carecem é não poerem ser misturaas com solventes orgânicos, já que estes removerão o corante o interior as partículas. Esta incompatibiliae fez com que, por exemplo, aquano a filtração e uma mistura e esferas e e bacilos, os últimos não estivessem conservaos em formaleío, mas em tampão PBS (cuja preparação é inicaa no Apênice B). A eterminação a concentração e microesferas nas várias amostras recolhias epois e um ensaio foi feita no espectrofotómetro ELISA a 468 nm, epois e verificar a possibiliae e meição a fluorescência em iferentes aparelhos (como está apresentao no Apênice F). A curva e calibração, bem como o aparelho one esta foi eterminaa, são escritos na parte III o Apênice F Observações Experimentais. A razão o tamanho a molécula com o tamanho o poro, λ, para as microesferas no µ m µ m 1. leito e mistura binária é igual a λ = = Nos leitos e partículas com mesmo tamanho obtêm-se os valores e λ iguais a.1 para pequenas esferas e. para granes esferas. Obtém-se um valor e ( 1 λ) =.966 para o leito binário, ( 1 λ) =.958 para o leito com esferas e iâmetro e ) =.996 para o leito com esferas e iâmetro,. ( 1 λ Ao analisar o comportamento, em leitos porosos, e Saccharomyces cerevisiae, e Lactobacillus bulgaricus e microesferas, acabou por testar-se a filtração e partículas com iferentes tamanhos, formas e volumes, que poem ser esquematizaos seguno a Figura.5.4. Legena: L. bulgaricus S. cerevisiae Microesfera Figura.5.4. Esquema o tamanho, forma e volume e Lactobacillus bulgaricus, Saccharomyces cerevisiae e microesferas e poliestireno vere fluorescente. 48

50 Materiais e Métoos Por que neste trabalho era interessante ter como termo e comparação o comportamento e um traçaor, realizaram-se também vários testes com o azul extrano. Os extranos são polissacários (caeias e açúcares simples) compostos por monómeros e glicose. Estruturalmente, os extranos apresentam uma coluna e uniaes e glicose unias, sobretuo, pela ligação α (1 6). As proprieaes químicas e físicas o extrano variam com os métoos e proução, assemelhano-se, muitas vezes, a um colóie [6]. Actualmente, são prouzios e comercializaos, em larga escala, por tecnologia enzimática. Quano libertaos por bactérias Leuconostoc caracterizam-se pelo peso molecular elevao, boa solubiliae em água e baixa toxiciae. Os extranos têm uma grane varieae e aplicações. São portaores efectivos para corantes, inicaores e grupos reactivos. Em eterminaos casos são usaos como ilataores e volume o plasma o sangue. O extrano e ferro é usao para combater anemia e eficiência e ferro. A inústria fotográfica emprega extrano, operações mineiras consomem extrano, houve até sugestões para que o extrano puesse contribuir em problemas artríticos. Muitos mais usos e aplicações continuam a ser investigaos. Além e tuo isto, extranos (não carregaos) continuam a ser utilizaos e a contribuir para a caracterização e processos e cromatografia e exclusão molecular (SEC) [63]. O azul extrano é um grane polissacário (a massa molar comum é aproximaamente ois milhões e altons -,, a) que contém o corante clorotriazina, Cibacron Blue. É, frequentemente, usao na meição o volume e espaços vazios em colunas e filtração e gel [64]. O tamanho e estimação e uma molécula e extrano não é consensual na literatura e talvez por isso não se encontre facilmente. Seksek et al. [65] apontam um tamanho e, aproximaamente, 8 nm, 54 nm é o valor apontao por Pluen et al. [66] e 63 nm também aparece na bibliografia [67], que está perto a méia e [65] e [66]. Estes valores inicam que o extrano se encontra numa gama e tamanho muito inferior à as outras partículas analisaas. A curva e calibração o azul extrano, a 6 nm, e as conições para a sua eterminação, estão expostas na parte III o Apênice F Observações Experimentais. O moo como foram feitos os ensaios e filtração o azul extrano, com uma concentração aproximaa e 1 mg/l, foi praticamente igual ao proceimento usao com as microesferas. Note-se que ao preparar a solução com a concentração esejaa eve ter-se o cuiao e issolver bem o extrano em solução. Poe-se também estimar a razão o tamanho a nanopartícula com o tamanho o poro 63µm λ que é igual a λ = = , para o leito e mistura binária, para o 59 leito e partículas e menor imensão e para o leito e partículas e maior imensão. Os valores e ( 1 λ) na mesma orem são: 11386, e

51 Materiais e Métoos PARTE IV e V O proceimento as filtrações nos leitos com enchimentos e partículas com o mesmo tamanho, parte IV (.1115 mm) e V (1,15 mm), assemelhou-se ao efectuao nas partes II e III. É relevante acrescentar que a partir a parte IV a separação os microrganismos (leveuras e bacilos) passou a ser efectuaa em separao e que a eterminação a sua concentração passou também a ser feita por absorvência a 6 nm, no espectrofotómetro ELISA. As curvas e calibração e apoio para as microesferas e o azul extrano são iênticas às escritas na parte III (e são visíveis no Apênice F). As curvas e calibração os bacilos e leveuras necessárias na parte IV e V encontram-se apresentaas no Apênice F Observações Experimentais. PARTE I, II, III, IV e V Nos istintos testes realizaos a bomba a instalação experimental encontrou-se na posição 4, a que correspone um caual volumétrico e F =,1 ml/s. ao que a superfície e escoamento é aa por: 4, S = π r = π cm = 13,854. cm a velociae é igual a: F,1. ml / s u ap = = = 8,86E 3. cm / s S 13,854. cm Esta velociae é, contuo, afectaa pelas partículas e viro que estão na superfície e por isso, uma velociae aparente, velociae real e é aa por: u ap. A velociae que trauz essa influência esigna-se por u ap w = (Equação.5.) ε 8,86E 3. cm / s one vem que: w = = 3,9E. cm / s para o empacotamento,7 binário, w =.31 cm /s para o empacotamento com partículas e menor imensão e w =.8 cm /s para o empacotamento e partículas e imensão. 5

52 Apresentação e iscussão os Resultaos 3. Apresentação e iscussão os Resultaos Vão agora apresentar-se e iscutir-se os resultaos alcançaos em caa uma as partes. 3.1 Resultaos obtios com o empacotamento binário PARTE I Na primeira parte o trabalho, realizaram-se três ensaios num leito e mistura binária com um empacotamento com uma fracção volúmica as partículas e maior imensão e.7, uma razão as partículas e.1 e uma porosiae e ε =.17. Analisano, previamente, o gráfico obtio em A, B e C, apresentaos no Apênice F, eviencia-se uma grane semelhança entre os ois últimos. Partino este facto, calculou-se o valor méio a concentração e caa um os microrganismos, ao longo o volume recolhio, para os ensaios B e C. O resultao é apresentao no gráfico a Figura Nº méio e células (ensaio B ec) /ml v, ml Figura 3.1. Gráfico que trauz a variação a concentração e 1 Saccharomyces cerevisiae ( ) e Lactobacillus bulgaricus (x) ao longo o volume recolhio no ensaio B e C a parte I. A Figura 3.1. eviencia a presença e ois picos: um bem efinio, simétrico e com boa resolução logo no início a separação (1) e outro com base alargaa, também simétrico, para volumes maiores (). O primeiro pico é relativo aos microrganismos circulares, o outro aos microrganismos lineares. O iâmetro méio as leveuras, nesta fase, foi e 5. µm e o comprimento e bacilos 4. µm. Usou-se uma concentração e.575e+7 células/ml para as leveuras e 5.11E+7 células/ml para os bacilos 51

53 Apresentação e iscussão os Resultaos e acoro com vários estuos anteriormente efectuaos neste laboratório, na área e filtração e separação, neste contexto, a forma celular tem um papel ecisivo. Por este motivo, embora os bacilos possuam imensões mais pequenas, a sua forma vai conicionar o movimento ao longo os poros. Pelo contrário, as leveuras são favorecias ao longo o processo, eveno conseguir esembaraçar-se o leito poroso mais rapiamente. Uma primeira análise os resultaos pareceu inicar que, na verae, a forma afecta fortemente a migração e microrganismos e as leveuras beneficiam a sua forma reona. O processo e filtração e as variáveis que nele participam, contuo, tiveram e ser ajustaos, seno os resultaos apresentaos nas partes seguintes. Nesta fase aina, quano as leveuras eram observaas ao microscópio encontravamse separaas, no entanto, o aparecimento e gémulas era também muito comum e inesejao. Para solucionar este inconveniente, em vez e usar fermento e leveura instantâneo, passouse a utilizar fermento e paeiro, e crescer as células em meio estéril YEP, como foi inicao na secção Materiais e Métoos. Outra as muanças que ocorreu, e também apontaa na secção.5., foi no processo e contagem celular. Nestes ensaios o apuramento foi feito recorreno à câmara e Neubauer. A câmara e Neubauer permite quantificar o número total e células por observação irecta ao microscópio. Caracteriza-se por ser um métoo preciso. É, contuo, estatisticamente questionável, a menos que seja efectuao um grane número e observações. Além isso, por vezes, é também preocupante porque epene muito o local one se retirou a amostra, o tratamento que esta sofreu (eve ser fortemente agitaa para homogeneizar) e a sua injecção na câmara (eveno aguarar-se 1 minuto até proceer à contagem). No caso em estuo, embora as células tenham uma morfologia istinta, poe também ter acontecio que os bacilos estivessem a ser captaos e topo e serem contaos como leveuras. No sentio e evitar esta úvia, e avaliar melhor a imensão e o contorno as células, estas passaram a ser coraas com cristal violeta urante poucos minutos. Nos ensaios cujos resultaos se irão apresentar e seguia a concentração celular e partia os microrganismos passou a ser inferior. Uma concentração e células na orem as ezenas e milhões por mililitro é um valor muito elevao e poe ter efeitos negativos como a acumulação e células nas esferas e viro. Esta conclusão foi tiraa epois e se ter calculao a percentagem e microrganismos que ficou retia no interior a coluna, valor este muito elevao. PARTE II e III As partes II e III referem-se às experiências efectuaas numa coluna e empacotamento binário. O empacotamento foi formao por uma mistura e esferas e viro e 1.15 mm e.1115 mm, a uma fracção volúmica e tamanho maior e.7, tal como o empacotamento a parte I, e porosiae.7. 5

54 Apresentação e iscussão os Resultaos Na parte II filtraram-se Saccharomyces cerevisiae com iâmetro méio 4.47 µm e Lactobacillus bulgaricus e 6.8 µm e comprimento e.54 e iâmetro, com a concentração méia e.8 E+6 células/ml. Na parte III filtraram-se as microesferas vere fluorescentes e poliestireno e 1 µm e iâmetro, teno por comparação o comportamento o traçaor azul extrano. Os resultaos e caa um os ensaios realizaos estão escritos no Apênice F Observações Experimentais. Uma vez que se tornaria exaustiva a análise e caa um, acharam-se os valores méios e construiu-se o gráfico a Figura 3.. No caso os microrganismos os valores méios que são apresentaos foram estimaos conjuntamente com os valores obtios na parte I. 1, 1, 1 3,8 C N,6,4,, Figura 3.. Resultaos a separação as partículas: 1 microesferas com concentração inicial méia C = 1.9 g/l ( ), Saccharomyces cerevisiae com concentração inicial méia C =.358 g/l ( ) e 3 Lactobacillus bulgaricus com concentração inicial méia C =.71 g/l (x), ao longo o volume v, no empacotamento binário. Os aos estão representaos na forma e concentração normalizaa C N que é igual à razão a concentração e um ao ponto com a concentração máxima. As curvas são uma aproximação a istribuição e Gauss. v, ml Na observação a Figura 3.. salientam-se, nitiamente, três picos e concentração normalizaa. e acoro com a orem e eluição o primeiro correspone às microesferas, o seguno às leveuras e o terceiro aos bacilos. À partia, os resultaos vão e encontro com aquilo que era esperao e que já foi, previamente, conseguio nos ensaios a parte I, ou seja, os microrganismos com a forma circular são favorecios para estas conições e separação. Quano comparao o comportamento e separação partículas com forma iêntica, o volume tem um papel significativo, levano a melhor as microesferas, que têm um volume menor. Algumas as características principais este gráfico são apontaas na Tabela

55 Apresentação e iscussão os Resultaos Tabela 3.1. Características a separação as partículas no empacotamento binário: microesferas ( ), Saccharomyces cerevisiae ( ) e Lactobacillus bulgaricus (x), retiraas a partir a Figura 3.. Partículas Pico aos, ml = t r / t τ λ Microesferas ( ) Saccharomyces cerevisiae ( ) ; Lactobacillus bulgaricus (x) (.9) O tempo e retenção τ apresenta-se calculao com base na razão o tempo e eluição o pico e concentração a partícula filtraa com o tempo e eluição o marcaor azul extrano. A razão o tamanho a molécula com o tamanho o poro λ, no caso os bacilos, é apresentaa para as uas principais imensões, corresponeno o valor entre parêntesis ao valor e λ calculao com o iâmetro estes microrganismos. Ao aumento o volume e eluição os picos correspone uma tenência crescente o tempo e retenção τ, pela seguinte orem: microesferas ( ), Saccharomyces cerevisiae ( ) e Lactobacillus bulgaricus (x). Esta variação verifica-se também com a razão o tamanho a molécula com o tamanho o poro λ, consierano-se como imensão principal o comprimento. Apresentam-se, e seguia, as Figuras 3.3a. e 3.3b. 1, 1, 1,,8,8 C N,6 1 C N,6 1,4,4,,, v, ml Figura 3.3a., v, ml Figura 3.3b. Figura 3.3a. Resultaos a separação e 1 azul extrano com concentração inicial C = 1. g/l ( ) e Lactobacillus bulgaricus com concentração inicial C =.333 g/l (x) ao longo o volume v, no empacotamento binário. Os aos estão representaos na forma e concentração normalizaa C N. As curvas são aproximações pela istribuição e Gauss. Figura 3.3b. Resultaos a separação e 1 microesferas com concentração inicial C = 1.9 g/l ( ) e Lactobacillus bulgaricus com concentração inicial C =.8 g/l (x) ao longo o volume v, no empacotamento binário. Os aos estão representaos na forma e concentração normalizaa C N. As curvas são aproximações pela istribuição e Gauss. 54

56 Apresentação e iscussão os Resultaos No que iz respeito ao gráfico a Figura 3.3a. o traçaor apresenta o pico e concentração normalizaa aos 9.6 ml, enquanto para os bacilos esse pico é visível aos ml pelo que τ =.8. No gráfico a Figura 3.3b. para as microesferas o pico é atingio aos 8.4 ml e τ =.913, para os bacilos obtém-se o pico aos 1.3 ml eτ =.315. No caso a Figura 3.4. para o azul extrano o pico verifica-se aos 9. ml eτ = 1. Para as microesferas o pico é atingio aos 8.1 ml e τ =.88. Foi a partir os gráficos as Figuras 3.3a., 3.3b. e 3.4. que se alcançaram os valores t o traçaor utilizaos para eterminar λ na Tabela ,4 1, 1, 1,8 C N,6,4,, Figura 3.4. Resultaos a separação e 1 microesferas com concentração inicial C = 1.9 g/l ( ) e azul extrano com concentração inicial C = 1. g/l ( ) ao longo o volume v, no empacotamento binário. Os aos estão representaos na forma e concentração normalizaa C N. As curvas são aproximações pela istribuição e Gauss. v ml A observação as Figuras 3.3a. e 3.4. revela que o comportamento o azul extrano é, ligeiramente iferente as outras partículas, nas mesmas conições conuzino ao aparecimento e picos e base larga. Este facto faz com que haja um esvio o pico e azul extrano a função Gaussiana e está relacionao, provavelmente, com o efeito e partição em zonas com regime e fluxo e estagnação. A Figura 3.4. mostra aina que o pico e eluição as microesferas ( ) é inferior ao pico o azul extrano ( ). Esta não era uma situação esperaa. Era previsto que o corante eluísse primeiro. Como foi apontao na secção Materiais e Métoos não existe um consenso, na literatura, relativamente ao tamanho as moléculas e extrano, no entanto, poe-se estabelecer um valor méio e 63 nm. A orem e graneza em relação às microesferas e aos microrganismos é, portanto, e moo grosseiro, cerca e 1 vezes inferior. 55

57 Apresentação e iscussão os Resultaos No estuo e Rehmann et al. [5] é relataa uma situação iêntica, transpono o caso as microesferas para vírus. Como os meios porosos tornam-se, crescentemente, heterogéneos (isto é, como σ f aumenta, seno σ f a variância a gama e ln. K, K a conutiviae hiráulica o meio), foi observao por estes autores que o transporte e um vírus poe ser facilitao a tal um grau que a chegaa e vírus precee a chegaa e um traçaor. O aumento e σ f implica uma quantia crescente e meios porosos pertenceno às cauas elevaas e baixas a istribuição ln. K, reflectino a presença e canais com maior e menor conutiviae. A interpretação este resultao é que são excluíos vírus as regiões e baixa conutiviae por causa os tamanhos restritivos os poros em materiais finamente granulaos, relativamente ao iâmetro o colóie (por exemplo, são excluíos vírus e certas argilas e a porosiae interna intra-grânulos) mas eles são capazes e se moverem pelas banas e conutiviae maiores, que são caracterizaas por velociaes e fluxo pelo poro mais altas. Assim, o aumento o grau e heterogeneiae resulta numa inovação mais rápia o transporte e vírus pelos meios até ao topo mais elevao a istribuição ln. K. Poe-se supor que, tal como aquilo que se passa com os vírus, as microesferas, em conições menos favoráveis ao seu movimento, acabam também por ser excluías eslocano-se para zonas e maior conutiviae one são mais facilmente transportaas. Relativamente às partes I e II é preciso aina acrescentar que há uma iferença notória entre os volumes e eluição eterminaos para os microrganismos Saccharomyces cerevisiae e Lactobacillus bulgaricus. Na primeira parte obtiveram-se os picos e concentração a.5 ml para as células e fermento e 1.8 ml para os bacilos, enquanto na parte II esses valores foram e 13.4 ml e 19. ml. Em termos gráficos, na seguna parte, houve um eslocamento e ambos para a ireita. Poem ser enunciaas algumas razões que tenham levao a esta muança, como por exemplo, a existência e canais preferenciais no primeiro empacotamento. Contuo, foram vários os parâmetros muaos na seguna parte: a concentração as soluções empregue, a forma como esta foi meia, entre outras, que tornam ifícil escobrir a veraeira razão. Note-se que toas as alterações entre a parte I e II visaram optimizar e tornar mais creíveis os resultaos obtios. 3. Resultaos obtios com os empacotamentos com partículas e um único tamanho PARTE IV e V Na parte IV e V foram utilizaos empacotamentos simples, construíos a partir as partículas o leito e mistura binária. Foi estuaa, em separao, a filtração o traçaor azul extrano, e microesferas e poliestireno vere fluorescente monoisperso, e Saccharomyces cerevisiae e e Lactobacillus bulgaricus. O estuo foi realizao nesta mesma 56

58 Apresentação e iscussão os Resultaos orem, por forma, a evitar que os leitos colmassem com as células maiores, sobretuo no caso o leito constituío por partículas e menor imensão, tamanho. Nestes ensaios, tal como se tinha proceio no empacotamento binário, utilizou-se uma velociae e fluío aparente u =.88 cm/s Leito formao pelas partículas menores a fracção e tamanho =.1115 mm O empacotamento a aborar nesta secção foi construío com esferas e.1115 mm e iâmetro e com a mesma massa que tinha sio empregue no empacotamento binário, ou seja, 1 g. Como é possível imaginar estas esferas são muito pequenas, assemelhano-se, e moo físico, a um pó fino teno-se formao um leito com espessura 5.6 cm. A porosiae o empacotamento eterminaa foi e.381. Poe-se achar a partir aqui o valor e V total / V = 1/ε =.65, a velociae real o fluío através e w = u / ε =.3 cm/s, bem como o tamanho os poros pav = 46. µm. As partículas a percolar apresentam, nestas conições, as características: microesferas λ =.; Saccharomyces cerevisiae λ =.97; Lactobacillus bulgaricus assumino um comprimento e 6.8 µm, λ =.148, assumino o iâmetro e.54 µm, λ =.1. Reunino os resultaos a filtração e uma solução e azul extrano com concentração inicial 1.5 g/l e uma solução e microesferas com concentração inicial 15 g/l, obtém-se o gráfico a Figura 3.5. C N 1,1 1,,9,8,7,6,5,4,3,,1 1, v, ml Figura 3.5. Resultaos a separação e 1 azul extrano com concentração inicial C = 1.5 g/l ( ) e microesferas com concentração inicial C = 15. g/l ( ) ao longo o volume v, na coluna empacotaa com partículas o tamanho.1115 mm. Os aos estão representaos na forma e concentração normalizaa C N. As curvas são aproximações pela istribuição e Gauss. 57

59 Apresentação e iscussão os Resultaos Uma vez que a espessura este leito é menor o que a a mistura binária os volumes e eluição alcançaos são também menores. O traçaor azul extrano apresenta o pico e concentração normalizaa aos 4.55 ml, as microesferas aos 4.3 ml pelo que τ =.945. Este valor o tempo e retenção para as microesferas é ligeiramente superior ao encontrao no caso o empacotamento binário (τ =.87). Se se calcular a percentagem o substrato que atravessou o leito para caa um os casos vem: azul extrano 1%, microesferas 79 % e Lactobacillus bulgaricus %, Tabela 3.. Tabela 3.. Percentagem e partículas que atravessaram a coluna com empacotamento e esferas e menor imensão (.1115 mm) com tamanho e poro por = 46 µm na fase ispersa. Partículas Valor méio e % Gama em % λ Microesferas ( ) Saccharomyces cerevisiae ( ) Lactobacillus bulgaricus (x).148 (.11) As primeiras partículas apresentam valores e recolha bastante satisfatórios. Em relação às células lineares, ao cumprir os testes o que aconteceu é que não se notou variação o valor a absorvência, o que quer izer que os bacilos não foram capazes e atravessar o leito e partículas e menor imensão. A causa mais provável para o suceio é que, os bacilos tentam atravessar na forma longituinal (em comprimento) e não na forma vertical. epois, embora o iâmetro as partículas ( ) seja igual a µm e o iâmetro os poros verifique av pav = 46. µm, que são imensões bastante superiores à os bacilos (relembrano o comprimento méio é 6.8 µm e o iâmetro.54 µm), no funo, há um efeito e sufoco as esferas e viro pequenas que coniciona o movimento os bacilos. A presença e um efeito e sufoco o leito, e a não existência e granes úvias em relação ao comportamento as leveuras, foram as razões que levaram a avançar para o empacotamento com partículas e tamanho Leito formao pelas partículas maiores a fracção e tamanho = 1.15 mm O empacotamento e esferas e viro e maior imensão, com 1.15 mm e iâmetro foi construío com massa iêntica à que tinha sio empregue no empacotamento binário, ou seja, 8 g. Em comparação com as partículas e.1115 mm, estas esferas são visíveis a olho nu, teno ao origem a um leito com 1.1 cm e altura, e com um tamanho e poros bem 58

60 Apresentação e iscussão os Resultaos maior o que o verificao nos empacotamentos anteriores e igual a pav = 47. µm. A porosiae o empacotamento eterminaa foi e.385 e vem que V total / V = 1/ =.597, a velociae real o fluío w = u / ε =.8 cm /s. Para este empacotamento tem-se as razões o tamanho a partícula com o tamanho o poro: microesferas λ =.; Saccharomyces cerevisiae λ =.1; Lactobacillus bulgaricus assumino um comprimento e 6.8 µm, λ =.14, assumino o iâmetro e.54 µm, λ =.1. Os resultaos a filtração e uma solução e azul extrano com concentração inicial 1 g/l são apresentaos na Figura 3.6. ε 1,,8,6 C N,4,, v, ml Figura 3.6. Resultaos a separação e azul extrano ( ) com concentração inicial C = 1. g/l ao longo o volume v, na coluna empacotaa com partículas o tamanho 1.15 mm. Os aos estão representaos na forma e concentração normalizaa C N. O iâmetro os poros este leito é muito grane pav = 47 µm comparativamente ao os outros empacotamentos experimentaos pelo que se previram volumes e eluição mais elevaos. O corante apresenta o pico e concentração normalizaa a um volume e 11.4 ml, ou seja, t = 11.4 ml. Os resultaos aquirios com as microesferas, com as células e fermento e paeiro e os bacilos são apresentaos nas Figuras 3.7., 3.8. e 3.9. Ao esenhar os picos nota-se que a sua forma tem uma base alargaa. C N 1, 1,,8,6,4 C N 1, 1,,8,6,4 C N 1, 1,,8,6,4,,,, v, ml, Figura 3.7. Figura 3.8. Figura 3.9. Figura 3.7. Resultaos a separação e Saccharomyces cerevisiae ( ) com concentração inicial C =.4 g/l, ao longo o volume v, no empacotamento com partículas o tamanho 1.15 mm. Os aos estão representaos na forma e concentração normalizaa C N. v, ml, v, ml 59

61 Apresentação e iscussão os Resultaos Figura 3.8. Resultaos a separação e microesferas ( ) com concentração inicial C = 15 g/l, ao longo o volume v, no empacotamento com partículas o tamanho 1.15 mm. Os aos estão representaos na forma e concentração normalizaa C N. Figura 3.9. Resultaos a separação e Lactobacillus bulgaricus ( ) com concentração inicial C =.351 g/l, ao longo o volume v, no empacotamento com partículas o tamanho 1.15 mm. Os aos estão representaos na forma e concentração normalizaa C N. No caso as leveuras, pela Figura 3.7. verifica-se o máximo e C N aos 18.3 ml e τ = Para as microesferas consierano um valor méio os ensaios efectuaos, o pico e C N é conquistao aos 1.75 ml (Figura 3.8.) e τ =.943. Este valor é praticamente iêntico ao valor achao para o empacotamento com esferas e menor imensão (.945) e está próximo o valor.87 obtio no empacotamento binário, seno eviente, e novo, o aparecimento este pico antes o pico para o azul extrano (embora agora a iferença seja bem menor). Na situação os bacilos, Figura 3.9., os picos são obtios a um valor méio e 19.5 ml a que correspone, respectivamente,τ = e forma a simplificar a análise reuniu-se o conjunto os resultaos na Tabela 3.3. e na Figura 3.1. Como o tamanho e poros é elevao, a razão o tamanho a molécula com o tamanho o poro λ manifesta valores inferiores, em cerca ez vezes, aos verificaos no empacotamento binário. Apesar isso a variação e τ com λ é iêntica, isto é, a orem e eluição as partículas filtraas é semelhante à que tinha sio constataa no empacotamento binário e portanto a eluição ocorre na posição: microesferas, leveuras e bacilos. Tabela 3.3. Características a separação as partículas no empacotamento com esferas e imensão : microesferas ( ), Saccharomyces cerevisiae ( ) e Lactobacillus bulgaricus (x). O tempo e retenção τ apresenta-se calculao com base na razão o tempo e eluição o pico e concentração a partícula filtraa com o tempo e eluição o marcaor azul extrano. A razão o tamanho a molécula com o tamanho o poro λ, no caso os bacilos, é apresentaa para as uas principais imensões, corresponeno o valor entre parêntesis ao valor e λ calculao com o iâmetro estes microrganismos. Partículas Pico aos, ml = t r / t τ λ Microesferas ( ) Saccharomyces cerevisiae ( ) Lactobacillus bulgaricus (x) (.1) 6

62 Apresentação e iscussão os Resultaos No empacotamento que se está a estuar, seno o tamanho os poros folgao (47 µm) em relação ao tamanho os bacilos, era e esperar que se esse um fenómeno oposto ao verificao no empacotamento binário, e estes se esembaraçassem antes as leveuras. A análise a Figura 3.1. mostra que isto não aconteceu. Salienta-se, no entanto, que agora a iferença os volumes os picos para os microrganismos é muito menos significativa 1. ml. 1, 1,,8 3 C N,6 1 4,4,, v, ml Figura 3.1. Conjunto e resultaos a separação e: 1 azul extrano com concentração inicial C = 1. g/l ( ), microesferas com concentração inicial C = 15 g/l ( ), 3 Saccharomyces cerevisiae com concentração inicial C =.4 g/l ( ) e 4 Lactobacillus bulgaricus com concentração inicial C =.351 g/l (x), ao longo o volume v, na coluna empacotaa com partículas o tamanho 1.15 mm. Os aos estão representaos na forma e concentração normalizaa C N Análise total os aos obtios no empacotamento binário e nos empacotamentos com partículas o mesmo tamanho Nos moelos mais comuns e ifusão uma molécula é consieraa, em geral, como uma esfera e raio r. Nesse caso a equação e Stokes Einstein para a ifusão no limite e um líquio poe ser escrita como: kt = (Equação 3.1) 6πηr em que é o coeficiente e ifusão no seio o líquio, k é a constante e Boltzmann, T é a temperatura absoluta, η é a viscosiae o solvente e r é o raio equivalente e Stokes Einstein a molécula a ser ifunia. 61

63 Apresentação e iscussão os Resultaos O movimento e moléculas em meios porosos é caracterizao, em comparação com a ifusão no meio, por ser uma ifusão mais interior, menos acessível e por isso, mais ifícil. Para esta ifusão a suposição e um líquio isotrópico eixa e ser válio e a natureza os movimentos a molécula no espaço e um poro estreito juntamente com o efeito e constrição tem que ser consieraa [68]. A ifusão restringia reflecte-se num coeficiente e ifusão efectivo e reuzio evio a efeitos físico químicos e e conformação a molécula. Os moelos e ifusão menos acessível são construíos, usualmente, com base numa aproximação o poro cilínrico liso embora a passagem o soluto seja tortuosa [69]. Para a ifusão em meios porosos, quano o tamanho o poro for significativamente maior o que o tamanho a molécula, a ifusiviae poe ser representaa na forma: e / = ε /τ (Equação 3.) one ε é a porosiae e τ é o factor e tortuosiae que conjuga proprieaes topológicas o meio poroso, isto é, a forma méia e uma secção transversal o canal o poro, a tortuosiae o poro, etc. Transpono a situação e uma ree e canais e poros para apenas um canal, quano o tamanho molecular fica insignificante ao iâmetro o poro, é legítima a expressão: e =. e / =1/τ (Equação 3.3) Formalmente, se o canal representar um cilinro linear, a tortuosiae é unitária e então Quano o tamanho o canal se aproxima ao iâmetro a molécula, o efeito e ifusão provocao por um obstáculo é consierao como uma função a razão: λ = / pav, como foi apontao na secção 1. a Introução. No caso a ifusão restringia o coeficiente e ifusão efectiva e um soluto no canal e F ( λ ) [7]: é composto por uas funções e correcção. F 1 ( λ ) e e = F1( λ) F ( λ) (Equação 3.4) O parâmetro F 1 ( λ ) é o coeficiente e partição conformacional, que, por sua vez, é efinio como a secção e área transversal o poro isponível para a molécula o soluto iviio pela secção e área transversal total o poro e efinio através a equação: λ = λ (Equação 3.5) F 1 ( ) ( 1 ) O factor e correcção F ( λ ) têm em conta o efeito a paree o poro nas proprieaes o solvente (um aumento local na viscosiae o solvente perto a paree o poro) e frequentemente é representao por umas séries polinomiais ou uma função exponencial. 6

64 Apresentação e iscussão os Resultaos Nos moelos mais comuns e ifusão, como foi referio, uma molécula é consieraa, como uma esfera rígia, no entanto, bacilos ou proteínas e peso molecular elevao não se comportam como esferas rígias. Por este motivo, tentativas para preizer os coeficientes e ifusão e moléculas com esta forma baseaas na equação e Stokes Einstein, com um iâmetro e esfera rígio, não é sempre satisfatório. As proteínas poem ser bastante flexíveis em solução [9] e poem até mesmo exibir um comportamento hiroinâmico semelhante ao e uma molécula com a caeia fortuitamente enrolaa. Neste caso faz too o sentio substituir na Equação 3.1 o raio equivalente hiroinâmico a esfera r, pelo raio efectivo r eff (que está relacionao com o raio rotação a macromolécula r g ). No processo e ifusão molecular além e ser necessário ter em atenção a forma a molécula, se esta é rígia ou flexível, importa também atener à topologia o poro. Consierou-se que uma macromolécula ifune-se, frequentemente, no poro cilínrico linear ou pouco cilínrico como uma esfera rígia e poe ser caracterizaa e forma hiroinâmica pelo raio e Stokes Einstein. Esta suposição, provavelmente, não será vália num canal curvao quano a macromolécula passar regiões e elevaa curvatura. Até mesmo para o caso mais simples, consierano a macromolécula como um corpo rígio, nesta região exporá ao fluxo uma secção e corte transversal méia maior que em fluxo paralelo. Significa tuo isto que existe uma grane quantiae e aproximações à Equação 3.4, geraas pela iversiae topológica os sistemas e poro molécula, que se reflecte numa gama extensiva e possíveis valores preitos e e / para o mesmo valor e λ. São mostraos na Figura exemplos a epenência a ifusiviae e / com λ. 1,,8 e /,6,4 Figura epenência e, 7 6, e / λ com λ. Foram usaas as seguintes equações: 1 e / = exp(.λ) [71]; e ε λ = m ( 1 1.5λ +.611λ.96λ ) λ = λ m [7]; 3 = ( 1 λ) assumino T l e ; 4 / exp ( 3.89λ ) e = [73]; 5 ( ) 5 / exp. e = 46λ [73]; 6 63

65 Apresentação e iscussão os Resultaos / e ( ) [ = ] λ λ λ λ, com a conição λ 5. [73]; 7 ( ) e/ = 1+ 9 λln λ 154. λ, assumino λ 1. [74]; e / = (1 1.83λ λ )exp( 6.5 ) [74]; 9 / = (1 λ) (1.1 λ+.1 λ.95 ) λ e [75]. λ Como á para ver nas relações referias na figura, há aqui uma iferença significativa na ifusiviae prevista, presumivelmente evio à contribuição e efeitos aicionais como a flexibiliae a molécula, não esfericiae, asorção, etc. Em toos os moelos pronunciamse efeitos e restrição observaos na gama λ >.1 que ficam bem além as necessiaes e escala para interacções físico químicas. A curva 3 a Figura representa o componente e partição ou e conformação a ifusiviae na relação convencional e e / versus λ, mas quano tem lugar a ifusão e moléculas semi-flexíveis e com formas iferentes, este componente sofre alterações e moelação significativas, Figura 3.1. Na Figura 3.1. esboça-se o complexo e partição a partir o moelo e equações similar ao a curva 6 e mantém-se a mesma numeração e curvas a Figura Como poe ser visto, o complexo F ( ) sofre fortes muanças a 1 λ curva convencional (curva 3) para cumprir alguns aos experimentais. 1,,8,6 7 e /,4 8, 3 Figura 3.1. epenência e, e / λ com λ com relevo para a epenência a função a componente e conformação a molécula F ( ), Equação (3.4) em λ a iferentes moelos 1 λ similares ao moelo a equação a curva 6. O número as curvas é semelhante ao as curvas a Figura Poe-se supor, e acoro com a Equação 3.3, que o valor o tempo e retenção τ é proporcional à razão / e, ou seja: 64

66 Apresentação e iscussão os Resultaos t m τ = (Equação 3.5) t e Ao longo esta investigação foram seno meios os volumes e eluição, seno que: V V m t m t = τ (Equação 3.6) Vão apresentar-se, e seguia, os resultaos obtios no empacotamento binário e nos empacotamentos com partículas o mesmo tamanho. Por toos os pressupostos anteriores, tomano em consieração os valores o tempo e retenção τ que foram seno referios na análise as secções 3.1, 3..1 e 3.., e os valores a razão o tamanho a molécula com o tamanho o poro, λ, os resultaos serão apresentaos na forma gráfica e τ versus λ. As curvas referias nas legenas e caa gráfico corresponem a tentativas e aproximação os aos experimentais aos moelos e retenção e ifusão apontaos quer na secção Introução quer nesta breve aboragem. Note-se só aina que o moelo e exclusão para partículas não Brownianas baseao na razão o tamanho as partículas com o tamanho o poro poe ser formulao, em geral, como: τ n = A /( 1 λ) (Equação 3.7) em que A é proporcional à tortuosiae τ e o parâmetro n = 1, ou 3 epene o reconhecimento e espaço pelo movimento as partículas no espaço o canal e meios porosos. Por exemplo, num fluxo e canal ao longo e placas paralelas, sem granes τ [76]; para um poro cilínrico τ ~ 1/(1 λ) one a orem a potência restrições: ~ 1/(1 λ) igual a poe ser consieraa como a imensão e espaço que poe ser testaa pela partícula; e para um poro triimensional mencionaa a função ou mesmo 4.. F ( λ) λ) 3 τ ~ 1/(1 λ). Além estas relações, foi já z = (1, one para correlacionar alguns aos se usa z = 3.5 ao que, para o caso e um canal e um poro 1 e = τ, e agora tem-se τ versus λ, nos resultaos apresentaos, em breve, as curvas manifestam uma tenência inversa à verificaa nas Figuras e 3.1. Consierano os resultaos eterminaos com o empacotamento binário e o empacotamento com partículas e imensão vem então, Figura Neste gráfico, os pontos (x) para λ =, como está inicao, trauzem a situação no empacotamento e partículas e menor imensão em que houve retenção os bacilos. Aina em relação às células lineares, os valores que são apresentaos a uma razão o tamanho a 65

67 Apresentação e iscussão os Resultaos molécula com o tamanho o poro menores (.18) são os que trauzem a razão λ teno como imensão o iâmetro. A curva 1 trauz um moelo e separação hiroinâmica para as microesferas. A curva ajusta o comportamento os bacilos ao efeito e exclusão, tal como a curva 3 faz esse ajuste para os bacilos. 3, 4,5, 1.7/(1-λ) 3 τ 1,5 1./(1-λ) 1, 1/(1+λ cλ ),5 retenção e 1% e bacilos no leito e partículas 1 HC, 1E-3,1,1 1 λ Figura Tempo e retenção τ versus λ para os sistemas e empacotamento binário e empacotamento com partículas e menor imensão. ( ) Microesferas (no leito com partículas e pequena imensão), ( ) Microesferas (empacotamento binário), (x) Lactobacillus bulgaricus (empacotamento binário), calculaos em uas variantes: razão o iâmetro ou comprimento com o tamanho e poro, ( ) Saccharomyces cerevisiae (empacotamento binário). Curvas: 1 Moelo e separação e cromatografia hiroinâmica, HC, equação τ = 1/(1 + λ Cλ ), seno C =.8, Efeito e exclusão, τ = 1./(1 λ), 3 Efeito e exclusão, τ = 1.7 /(1 λ) e 4 valor e λ consierano como imensão o comprimento para partículas e menor imensão quano toos os bacilos foram retios no empacotamento. Removeno agora os pontos a situação o empacotamento e partículas e menor imensão em que houve retenção os bacilos e aicionano aos aos anteriores as microesferas, os bacilos e as leveuras os pontos corresponentes aos resultaos com o empacotamento e partículas e tamanho vem, Figura Ao acrescentar os pontos o empacotamento com partículas e maior imensão foram efinias novas curvas e forma a ajustar melhor os aos experimentais. Chamo atenção para a curva corresponente ao fermento e paeiro que, em vez o moelo e exclusão, passou a ser melhor ajustaa pelo moelo e separação e cromatografia hiroinâmica com 66

68 Apresentação e iscussão os Resultaos um coeficiente e 1.6. Os bacilos são aproximaos pelas funções 3 e 3 que se aaptam bem ao moelo e exclusão. 3, 4,5, Leito binário 3 τ 1,5 1, Leito com partículas 3,5 Leito binário Leito com partículas 1 HC, 1E-3,1,1 1 λ Figura Tempo e retenção τ versus λ para os sistemas e empacotamento binário e empacotamentos com partículas e menor e maior imensão. ( ) Microesferas (leito com partículas e menor e maior imensão), ( ) microesferas (empacotamento binário), (x) Lactobacillus bulgaricus com λ calculao em uas variantes: o comprimento e o iâmetro, ( ) Saccharomyces cerevisiae. No caso as microesferas, leveuras e os bacilos são os pontos que estão assinalaos através e setas que corresponem ao empacotamento e partículas e maior imensão. Curvas: 1 τ = 1/(1+ λ.8λ ) ; τ = 1.6/(1+ λ.8λ ) ; 3 τ = 1.7/(1 λ) ; 3 τ 3 = 1.55/(1 λ) ; 4 valor e λ, consierano como imensão o comprimento, para partículas e menor imensão quano toos os bacilos foram retios no empacotamento. epois a análise e toos os gráficos é bem eviente que os valores e τ são superiores nos Lactobacillus bulgaricus, o que significa um retaramento estas células com a forma e bacilos em relação às outras experimentaas. O facto as curvas que melhor se ajustam aos aos experimentais serem erivaas o moelo e exclusão é também outro ponto interessante. Antes e analisar o fluxo e nanopartículas na forma e bacilos, é importante estuar algumas características as macromoléculas flexíveis com o propósito e escobrir alguma analogia útil com as partículas rígias. Para macromoléculas flexíveis a inução o alongamento pelo fluxo acontece quano a caeia é sujeita a forças hiroinâmicas maiores, 67

69 Apresentação e iscussão os Resultaos em magnitue, que as forças e relaxamento e caeia que surgem o movimento e Brown. O poer e caa uma as forças poe ser relacionao pelo número e eborah e. O número e eborah, como já foi apontao na Secção 1., é efinio como a razão as forças hiroinâmicas para as forças e Brown ou, equivalentemente, como a relação o tempo e relaxamento o polímero com o tempo e convecção o fluxo. Por outro lao e é a razão entre o tempo e relaxamento o polímero θ e o tempo urante o qual a molécula o polímero fica exposta à eformação θ p [77]. e = θ / θ p (Equação 3.8) A expressão exacta o número e eborah epene o moo e cálculo e θ e θ p. Na revisão e Savins [77] são referias as fórmulas: θ = (1µ M ) /( π CRT ) (Equação 3.9) θ = α ε u (Equação 3.1) p p / em que µ é a viscosiae limite à velociae e corte zero, M é o peso molecular o polímero, C é a concentração o polímero, R é a constante universal, T é a temperatura absoluta, ε é a porosiae, p é o iâmetro a partícula, e α é um coeficiente numérico. Alguns investigaores usam θ = p p / u. Quano α é assumio como 1., o número e eborah vem ao por: uθ e = ε p (Equação 3.11) Para partículas na forma bacilar a estimação o tempo e relaxamento θ é importante. O moelo molecular e Hoaglan assume para macromoléculas flexíveis a forma linear elástica ou e haltere e Hookean [17]. No moelo a macromolécula consiste em ois centros e resistência hiroinâmica ligaos por uma fonte linear sem atrito. A expressão o tempo e relaxamento para moléculas e polímeros flexíveis, seguno Hoaglan et al. [17, 78], é: θ = Cλ [ µ ] µ sm /( RT ) (Equação 3.1) one C λ é uma constante e orem 1, [ µ ] é a viscosiae intrínseca, µ s é a viscosiae o solvente. A partir a cromatografia hiroinâmica e macromoléculas flexíveis e rígias foi escoberto que ambos os tipos e partículas fornecem meias e tamanho molecular que epenem fortemente a taxa e fluxo a coluna [17]. A posição o pico o polímero eluío, 68

70 Apresentação e iscussão os Resultaos neste caso, é uma função a imensão transversal a molécula para o eixo o poro, Figura ef ef irecção Flow irection o fluxo Figura Macromolécula flexível no canal e um poro, seguno Hoaglan et al. [17]. Para taxas e fluxo muito baixas, o tamanho molecular meio por cromatografia hiroinâmica é proporcional ao iâmetro e equilíbrio a caeia. Foi assumio que o iâmetro é, sensivelmente, o obro a raiz quaraa méia o raio e rotação o polímero em equilíbrio, [17]. 1/ S / (Equação 3.13) ef one 1/ S é a raiz quaraa méia o raio e rotação o polímero e ef é o tamanho efectivo a molécula. Finalmente, seguno os mesmos autores o número e eborah poe ser efinio como: e = a u 6.1µ sφ RT p 8 3 ef (Equação 3.14) com Φ o parâmetro e Flory-Fox e que é igual a mol -1, µ s a viscosiae o solvente e o valor nominal sugerio e a = 6. Esta imensão transversal é erivaa, com base absoluta, e uma curva e calibração para a coluna obtia por experiências com esferas e látex bem caracterizaas. O iâmetro o polímero ef que o polímero. está efinio pelo iâmetro as partículas e látex que eluem à mesma posição e acoro com os aos obtios para as células e fermento (iâmetro ~ 5 µm) e bacilos (comprimento ~ 6.8 µm), Figura 3.14., a efinição acima mencionaa é vália para valores e λ próximos e.1, no caso o empacotamento com partículas e maior imensão, se fosse assumio que para as bactérias o iâmetro efectivo é igual ao seu comprimento. Contuo, na aproximação e λ para valores ao reor e.1, observa-se a ivergência entre as leveuras e a retenção os bacilos: as células e fermento seguem um comportamento e HC enquanto os Lactobacillus bulgaricus se comportam pela lei e exclusão. 69

71 Apresentação e iscussão os Resultaos Poem ser feitas algumas observações acerca as proprieaes reológicas e suspensões e partículas com forma e bacilos e fibras em fluios Newtonianos, sujeitos a eformação a nível a sua extensão. O movimento e uma partícula com forma e bacilo num fluxo ao longo a sua extensão é bastante iferente o movimento num fluxo e corte [8]. Num fluxo e corte um bacilo isolao roa enquanto é levao pela corrente principal. Num fluxo ao longo a sua extensão ele gira até que o seu eixo maior coincia com o eixo principal e extensão e então fica nessa forma [75]. Além isso, num fluxo e corte uma célula bastonete passa a maioria o seu tempo, aproximaamente, paralela às linhas e fluxo, posição na qual tem menos efeito no fluxo. Em contraste, num fluxo e extensão uma célula este tipo está, permanentemente, na posição na qual tem um efeito máximo no fluxo, pelo que ocorre um aumento a viscosiae. Como mencionao no trabalho e Muganga et al. [8], é irreal tentar esenvolver uma teoria baseaa na orientação e movimento iniviual e fibras. Uma aproximação mais útil é aquela que introuz uma função e probabiliae e ensiae, cujo valor para uma eterminaa orientação á a probabiliae que uma fibra tem aquela orientação particular [7]. Além isso, o moelo e fluxo e fibras é influenciao através o nível e concentração e fibras [8, 84]. Uma suspensão é consieraa iluía se φ r < 1; semi iluía se 1 < φ r < r ; concentraa se r < φ r, one φ é a fracção e volume a fibra e neste caso r = l / é a razão e aspecto a fibra (l e são, respectivamente, o comprimento a fibra e o iâmetro). Uma vez eterminaa a orientação a fibra, é possível escobrir a contribuição a fibra para o stress total [83]. A solução o problema biimensional tem a seguinte forma [81]: η 4 φ r = 3 + (Equação 3.15) µ 3 ln( π / ) φ one η é a viscosiae ao longo a extensão. Esta fórmula sugere que embora φ seja pequeno, o factor r poe provocar aumentos substanciais em η / µ três vezes acima o valor e Newton no caso e partículas e elevaa razão [85]. Como consequência, a questão os efeitos e orientação e fibras no fluxo o canal e empacotamento é, nesta fase, um problema aberto. Embora nanopartículas rígias com a forma e bacilos não causem efeitos reológicos ramáticos, quano comparaas com polímeros flexíveis, a orientação os polímeros lineares urante o fluxo em pequenas passagens a coluna poe também ser etectaa por estar epenente o comportamento o fluxo e eluição e caracterizaa pelo tempo e relaxamento rotacional [17]. A experiência foi levaa a cabo numa resina e troca e iónica com partículas e tamanho 11 µm empacotaas numa coluna e cromatografia e 1. cm e iâmetro e 4.8 cm e altura. A taxa e fluxo em ml/min variou e, aproximaamente,.1 até 1. ois tipos 7

72 Apresentação e iscussão os Resultaos e macromoléculas foram investigaos: o vírus e mosaico o tabaco (TMV) com a forma e bacilo (comprimento.69 µm e iâmetro.15 µm) e o polissacário xantano (Kelco) e peso molecular a 4 milhões. O xantano representa o tipo e macromolécula intermeiária (semirígio) mas Chauvetean [] consierou uma macromolécula e xantano e peso molecular MW (concentração a solução 4 ppm em solução e 5 g/l NaCl, e ph 7) como um bacilo rígio e comprimento 1 µm e largura, cerca e, nm. Os resultaos obtios a partir os aos o xantano e o TMV [17] são apresentaos na Figura 3.16a. e b, respectivamente. O tempo e relaxamento rotacional achao para o xantano, com peso nominal molecular E+6, foi θ =,14 s. A taxa e alongamento foi calculaa a partir a equação Γ = 1 / θ = au /, a =6. p p Figura 3.16a. Figura 3.16b. Figura 3.16a. Tamanho efectivo o xantano conforme a variação a taxa e fluxo [17]. Estes aos poem ser interpretaos em termos o moelo e haltere rígio, com uma porção e fluxo epenente a curva orientação reflectia no campo e fluxo. O eclive a curva neste regime é muito perto o valor teórico e.5 para bacilos em alongamento uni axial fixo. Figura 3.16b. Tamanho efectivo e TMV conforme a variação a taxa e fluxo [17]. Consierano que a partícula e TMV é rígia, a epenência e fluxo tem que surgir a orientação no campo e fluxo. A teoria e haltere rígio preiz um eclive e.5, muito próximo o que é observao. O tamanho efectivo o haltere rígio urante o fluxo por um poro será fortemente relacionao a uma projecção a função e istribuição e orientação sobre um plano perpenicular à irecção ao fluxo [17]. O valor máximo esta projecção vai qualitativamente escrever a extensão transversal o haltere orientao. e acoro com Hoaglan et al. [17], o moelo conuz a uma preição teórica para ef. ef = L, θ Γ < 1/9 (Equação 3.16) (9 1/ ef = L θ Γ, Γ ) θ > 1/9 (Equação 3.17) one L é o comprimento o haltere e Γ = 1 / θ = au /, a = 6. p p 71

73 Apresentação e iscussão os Resultaos Como foi referio na secção Introução a influência a topologia o poro é aa pelo número e curvas. Se H é a espessura o leito e a tortuosiae o caminho é aa pela expressão clássica τ = L e / H em que L e é o comprimento o caminho atravessao, então o número e curvas n b é ao por (tal como está apresentao na Equação ): n = L / = τ H / b e p Por exemplo, no empacotamento com partículas e maior tamanho que foi experimentao, como H.13 m (assumino que τ = 1.4), para curvas é n b = 16. p p = 115 µm o número e Também como foi escrito anteriormente, o número e curvas poe ser aumentao com a aplicação e um leito com uma mistura e partículas seguno Mota et al. [34]. Consierano a tortuosiae o leito τ o prouto a micro e macro tortuosiae respectivamente, [34, 44, 45], ou seja, (Equação 1.4.1): A macro tortuosiae n b τ e τ, τ = τ τ, para empacotamentos binários, vem H = τ p H = τ τ τ (fracção e partículas granes e tamanho ) aumenta o comprimento o caminho pela coluna, enquanto a micro tortuosiae τ (fracção e partículas e tamanho ) é responsável por um aumento o número e curvas por uniae e comprimento e poro ou espessura e leito. Agora para H =.15 m e número e curvas poe ser escrito como = p = µm o n b = xτ. Para uma razão e partículas e tamanho maior ( / 1) é possível assumir um empacotamento e esferas binárias τ = τ = 1.45 e, finalmente, a tortuosiae total o empacotamento é igual a τ = 1.45 =.1, que á origem a n b(binary) = Este valor é 17 vezes superior ao empacotamento e partículas e maior imensão com uma quantiae igual e esferas e 4 vezes maior o que com uma quantiae igual e partículas e tamanho pequeno ( n b(small) = 7, H = 5.6 cm). A iferença qualitativa poe-se ver na Figura para bacilos nos empacotamentos: largo e e mistura. A respeito a Equação 1.4.1, teria sio interessante ter experimentao outras velociaes e fluxo, o que permitiria tirar mais conclusões e mais creíveis. O efeito o número e curvas no retaramento a nanopartícula poe também ser calculao por um valor e frequência e curvas f, consequentemente: 7

74 Apresentação e iscussão os Resultaos f = n b / t R (Equação 3.18) one t R é o tempo e retenção a nanopartícula. Por exemplo, se t R = 6 s (1 min) e b 1.9x1 4, então f = 18 1/s. n = O valor 1 / f = θ é o tempo que uma única curva afecta a retenção e continuano o p exemplo numérico acima consiera-se θ f = 5.6x1-3 s. p = 1/ O tempo θ p quano uma nanopartícula e forma bacilar é exposta ao efeito e istorção ao passar uma curva, epene a velociae e fluxo, Equação (3.1), e poe ser estimao para o empacotamento binário como θ /( 6u) =.48 s quano a velociae e fluxo é p =.39 cm/s. Para o empacotamento com partículas e maior tamanho θ p =.815 s (velociae o fluío =.9 cm/s). Usano a Equação 3.14 para o empacotamento binário para o valor mínimo e ef =.54 µm (iâmetro os bacilos), que correspone ao bacilo completamente orientao o número e eborah e =. (θ =.98 s). O valor e =. está próximo o valor convencional crítico e =.5 que se verifica quano o efeito e retaramento é significativo para macromoléculas flexíveis. Para o empacotamento e partículas e maior tamanho com ef =.54 µm tem-se e = θ / θ p =.98/.815 =.1. Não obstante, é necessária a investigação a eterminação correcta e θ (Equação 3.14) para bacilos rígios que são separaos no leito. Por exemplo, partino as Equações 3.16 e 3.17 tem-se e =.> 1/9 e com base na Equação 3.17 obtém-se a estimação e ( ef ) = 5/(9*.)^.5 = 3.73 µm que resulta num valor extremamente elevao e = 83, e a Equação 3.14 eixa e ter um significao físico. Uma similar falta e sentio aparece para o empacotamento e partículas e tamanho maior se se usar 9.8/.815 = 1. ef = 5 µm (θ = 9.8 s): e = É importante notar que o efeito e istorção gerao pela curvatura o canal na forma e curvas conuz à relevância as principais características o bacilo: o comprimento e o iâmetro. Esta especulação segue-se o facto e que no canal o bacilo sofre movimentos e translação e rotação o que significa que ambas as características geométricas participam testano o espaço o canal. O iâmetro o bacilo efine a área e superfície o mesmo e, consequentemente, a força e fricção responsável no fenómeno e relaxamento no número e. O comprimento o bacilo caracteriza o volume espacial o canal, λ. A Figura á, 73

75 Apresentação e iscussão os Resultaos precisamente, particular ênfase para os aos e partículas com a forma e bacilo, epenente o parâmetro e escala: comprimento ou iâmetro o bacilo. 3, /(1-λ) 35 3,5, τ 1,5 1, 3',5 1 HC, 1E-3,1,1 1 λ Figura Tempo e retenção τ versus razão o tamanho a molécula com o tamanho o poro, λ para os sistemas e empacotamento binário e empacotamento com partículas e maior e menor imensão. ( ) Microesferas (coluna com partículas e maior e menor imensão), ( ) microesferas (empacotamento binário), (x) Lactobacillus bulgaricus, calculaos em uas variantes: razão o iâmetro ou comprimento com o tamanho e poro, ( ) Saccharomyces cerevisiae. Curvas: 1 τ = 1/(1+ λ.8λ ) ; 3 τ = 1.6/(1+ λ.8λ ) ; 3 τ = 1.7/(1 λ) ; 3 τ = 1.55/(1 λ) ; 4 valor e λ para partículas e menor imensão quano toos os bacilos foram retios no empacotamento. Na situação em que se tem (x) no interior e elipses λ é efinio como a razão o comprimento o bacilo com o tamanho o poro. Mas se se usar λ como a razão o iâmetro o bacilo com o tamanho o poro, os aos movem-se para a posição inicaa pelas setas e a função e aproximação fica enorme. A curva corresponente nesta situação é aa por: τ 35 = 1.55/(1 λ). O coeficiente o móulo (1 λ) é extremamente elevao e não faz qualquer sentio. Conclui-se aqui que o comprimento é a característica mais apropriaa. A mesma conclusão foi tiraa por Tyn e Gusek [86] com testes efectuaos a iversas proteínas flexíveis em solução, como a TMV. Nos seus ensaios verificaram também que com o aumento o tamanho as macromoléculas biológicas a forma a molécula na sua separação torna-se caa vez mais complicaa, assim como o problema o comportamento num poro não linear e áspero (rugoso). Para aumentar o impacto as curvas no fluxo e macromoléculas através e um meio poroso evem ser controlaos os seguintes parâmetros: aumentar a tortuosiae total (ao contrário o HPLC) pelo número e curvas e a velociae e fluxo a fase móvel. 74

76 Apresentação e iscussão os Resultaos Em relação ao aumento a tortuosiae, para a migração e microrganismos em meios porosos uffy et al. [87] aplicou um algoritmo e trajecto aleatório em simulação juntamente com a relação e Einstein, empregue para calcular o coeficiente e ifusão bacteriano efectivo. Foi calculaa uma tortuosiae como uma função o tamanho a partícula e comparaa com resultaos experimentais isponíveis a migração e Pseuomonas putia em colunas e areia. Foi escoberta nesta investigação que a tortuosiae aumenta com o ecréscimo o iâmetro e obstáculos, que estava e acoro com os resultaos experimentais. eve ser realçao que com a reução a escala e curvas em comparação com o tamanho as partículas, o efeito oposto poe ser esperao. Concluino, para aumentar o impacto as curvas no fluxo e macromoléculas através e um meio poroso evem-se controlar os seguintes parâmetros: aumentar a tortuosiae total (ao contrário o HPLC) pelo número e curvas e a velociae e fluxo a fase móvel e reuzir o tamanho as partículas e a razão a escala curvas/partículas. Em relação ao facto as células lineares sofrerem um efeito e retaramento em relação às células e leveuras, poem-se aina analisar outros estuos realizaos na mesma área. O comportamento os bacilos não é semelhante ao comportamento e macromoléculas, e qualquer forma existem vários parâmetros que poem ser comparaos. A separação e proteínas numa coluna Sephaex G- com o raio e Stokes meio pelo métoo cromatográfico e um coeficiente e seimentação eterminao através e centrifugação o graiente e ensiae foi investigaa por Siegel e Monty, [88]. Foi mostrao que a orem e eluição e proteínas a coluna Sephaex G- se correlaciona bem com o raio e Stokes e não epene, funamentalmente, o peso molecular (comportamento e ferritina e fibrinogénio, ver Tabela 3.4.). Por exemplo, o fibrinogénio tem uma forma completamente iferente (bacilo com relação e eixos (por viscosiae) - 9 (por ifusão) [89]) o que outras proteínas mencionaas nessa tabela. Tabela 3.4 Parâmetros moleculares e proteínas stanar [88]. Espécies Raio e Stokes, nm Peso Molecular Volume e eluição, ml Coeficiente e istribuição K Fibrinogénio , 88.3 Ferritina 7.9 1,3, Urease (monómero) , 13. Catalase 5. 5, Hemoglobina.4 3, 4.58 Soro e Albumina Bovina , Scopes [46] é também e opinião e que o volume e eluição está relacionao com o raio e Stokes, não com o tamanho ou o peso molecular. Poe-se especular que uma aproximação o raio e Stokes á bons resultaos quano a forma macromolecular está perto 75

77 Apresentação e iscussão os Resultaos a forma e esfera e o processo e separação, como a SEC, por exemplo, é governao pelo fenómeno e partição entre poros micro (intra partículas) e poros inter partículas. Neste caso granes macromoléculas ou nanopartículas são repartias por um volume e poros inter partículas one a razão entre tamanho e partícula e o tamanho o poro, λ, é muito pequena para o efeito topológico no movimento a partícula. Se a iferença entre os tamanhos a partícula e o poro não poe ser ignoraa então a aproximação o raio e Stokes precisa e uma correcção. Cannel e Ronelez [75] meiram a ifusão e caeias e poliestireno mono ispersas, e peso molecular 11, 33, 39, e 6 ka através e membranas (Nuclepore Corp.) conteno pequenos poros quase cilínricos. A ifusiviae efectiva e iminui assim que o raio o polímero enrolao se aproxima o iâmetro o poro o que é bem explicao, igualmente, pela equação e Renkin para solutos sólios (Equação 3.19) ou por relações recentemente esenvolvias para soluções e polímeros (Equação 3.), r / r >.1: 3 5 e / = (1 λ) (1.1λ +.1λ.95 ) (Equação 3.19) / e λ / 3 3 = α ( kr / r ) exp[ ( kr / r ) 5 / ] (Equação 3.) Flory por Flory por H por em que λ = r / r H por, r H é o raio hiroinâmico ou o raio e Stokes-Einstein; r Flory é a raiz méia quaraa a istância e uma ponta à outra a caeia ou o raio e Flory; α = 1/.64, e k é o coeficiente proporcional. Uma melhor aproximação para soluções e baixa concentração foi alcançaa quano λ =1.45r H / r por (Equação 3.19) e kr Flory / rpor foi substituío por 4 r H / rpor (Equação 3.), respectivamente. Poe-se consierar a esvantagem o coeficiente ser 1. na expressão λ = r / r como um sinal e "não esfericiae" a macromolécula enrolaa no termo e raio hiroinâmico. É possível assumir que algumas partículas a caeia estejam fora o raio e Stokes-Einstein. H por Em resumo, para as bactérias conclui-se que, e moo formal, um retaramento significativo o bacilo poe ser o resultao o efeito e asorção esorção nos meios porosos. Contuo, uma força iónica baixa [76] e a ausência e um efeito e caua seguiamente ao pico abre uma possibiliae para excluir as razões acima mencionaas. Naturalmente, poe-se especular sobre a interacção os Lactobacillus bulgaricus com a topologia os poros. Quanto ao comportamento as microesferas, comparano o volume estas com o volume as leveuras, e porque neste caso a forma as partículas é a mesma, é simples e compreener que estas migrem mais rapiamente a coluna, nos vários empacotamentos testaos. No moelo e retenção e cromatografia hiroinâmica, a migração o polímero é 76

78 Apresentação e iscussão os Resultaos escrita pelo valor e retenção τ como função a razão λ [16, 5], apresentaa já atrás pela τ = = + λ λ Equação 1..1.: / t 1/(1 C ) t m Num leito empacotao numa coluna e cromatografia hiroinâmica são recomenaos os seguintes valores e C :.698 [6],.7 [16],.8 [7]. A curva e aproximação τ = 1/(1+ λ.8λ ) apresentaa na Figura ajusta-se muito bem aos aos experimentais as microesferas. Quer isto izer que as microesferas sofrem separação e acoro com o princípio e HC. Elas são separaas com base no seu tamanho epeneno o esenho a filtração a taxa e fluxo (não experimentaa) e o tamanho as partículas o empacotamento. Williams e Varela et al. [18] estuaram o mecanismo e separação a cromatografia hiroinâmica num analisaor a istribuição o tamanho e partículas (PL PSA) e uma mistura. Esse mecanismo é inepenente a ensiae as partículas e o aparelho utilizao poe ser empregue numa vasta gama e iferentes tipos e partículas. A Figura mostra o gráfico e calibração e Rf em função a raiz quaraa o iâmetro e partículas e látex e poliestireno, sílica e melanina, cujos valores e ensiae são: partículas e látex e poliestireno ρ = 1.5 g/ cm 3, sílica ρ =. g/ cm 3 e melanina ρ = 1.51 g/ cm Figura Universaliae a calibração e tamanhos na HC ( Rf versus raiz quaraa o iâmetro a partícula) para iferentes tipos e partículas. O parâmetro Rf é ao por: Rf Tempo. e. retenção. o. marcaor = (Equação 3.1) Tempo. e. retenção. a. amostra No caso esta investigação tem-se microesferas e látex e poliestireno com ρ = 1.5 g/ cm 3 e parão e tamanho nominal 1 µm = 1 nm (uke Scientific). No empacotamento binário τ =.87, no caso o empacotamento com partículas e maior imensão τ =.943, para a coluna com partículas e menor imensão τ =.945. Poe-se tentar comprovar o 77

79 Apresentação e iscussão os Resultaos comportamento HC, representano o valor a raiz quaraa o iâmetro as microesferas que é ao por: = 1nm = 31.6nm A representação o valor a raiz quaraa o iâmetro as microesferas, conuz a um valor teórico e, aproximaamente, 1.3. Os valores e Rf obtios experimentalmente para os iferentes empacotamentos testaos são: Rf mistura 1/ 1 = = e. Rftamanho Rftamanho = 1.6 Como se poe ver, nenhum estes valores correspone ao valor teórico. Este resultao não põe em causa o facto e que as microesferas são separaas e acoro com o princípio HC. Uma possível causa para explicar o esvio à curva e calibração é que os autores usam colunas com um iâmetro menor. O que acontece, nestas colunas é que há uma maior fricção e o perfil e velociaes e fluxo que se estabelece é mais esenvolvio o que o perfil esencaeao na coluna experimentaa nesta investigação, com 4 mm e iâmetro. Nesta última ocorre uma menor separação e uma menor resolução contuo, os resultaos obtios com as microesferas são bastante satisfatórios, seno bem compensaos na Equação (1..1), para um valor C igual a.8, que é, aliás, o coeficiente com que alguns autores compensam a utilização e um iâmetro pequeno. No trabalho testou-se um empacotamento binário, e com a mesma quantia e as mesmas esferas usaas neste leito estuou-se a influência e um empacotamento e partículas e tamanho e um empacotamento e partículas e tamanho. O empacotamento e partículas e maior tamanho testao apresentou um tamanho e poro extremamente elevao pav = 47 µm pelo que o valor e λ é e, aproximaamente,.1, seno o valor e λ e trabalho recomenao maior. Teria sio interessante analisar um leito largo mas com um iâmetro e poros méio menor. Comparano os empacotamentos, pelas Figuras 3.., 3.5. e 3.1. conclui-se que a separação é melhoraa pela aplicação e um leito e mistura. É este o que oferece maior resistência e maior selectiviae às partículas testaas, e permite obter picos mais efinios. No funo, o empacotamento binário oferece maior resistência o que o torna, para o objectivo proposto, o mais interessante e, consequentemente, mais importante a nível inustrial. 3.3 Análise e aos obtios pelo fluxo e partículas e viro através e poros com partículas o mesmo tamanho Os aos que se vão apresentar nesta secção foram obtios num outro estuo mas são e grane interesse e servem e comparação com os resultaos atrás apresentaos. 78

80 Apresentação e iscussão os Resultaos A coluna utilizaa neste estuo tinha 8. cm e iâmetro e 3 cm e altura. Foi empacotaa com esferas e viro o mesmo tamanho, teno-se experimentao iferentes tamanhos: p = 1.15 mm (equivalente ao empacotamento e esferas e imensão ), =.875 mm, p =.375 mm e p =.15 mm. As suspensões e partículas e viro filtraas apresentavam um iâmetro e 4 µm, 19 µm (intervalo as partículas 1 6), e 6 µm (intervalo as partículas 4 8), teno-se partio e uma concentração as partículas em suspensão C = g/l. A fase líquia constou e uma solução e água e glicerol, 7% (m/m). O fluío circulou a uma velociae e ~.6x1-4 m/s. Filtraram-se suspensões com C = g/l e partículas e tamanhos 4 µm (Figura 3.19.), 19 µm (Figura 3..), e 6 µm (Figura 3.1.). Caa empacotamento com partículas o mesmo tamanho foi testao.os empacotamentos com partículas o mesmo tamanho são apresentaos nas Figuras a 3.1. como curva mm;.875 mm; mm. p,35,5,5,3,5 3,,,,15 1,15 1 C, g/l,15,1,5 1 C, g/l,1,5 3 C, g/l,1,5,,5 1, 1,5,,5 3, 3,5, 1, 1,5,,5 3,, 3,5 1, 1,5,,5 3, 3,5 4, V/ V V/ V V/ V Figura Figura 3.. Figura 3.1. Figura Filtração e partículas e 4 µm ( C = g/l) através e um empacotamento com partículas o mesmo tamanho: mm ( );.875 mm ( ); mm ( ). Espaços vazios a coluna V = 55 ml, porosiae ε =.38, / V = 1/ ε V total =.63. Para a situação 1 τ = 1.73 (1.354), λ =.87; τ = 1.776, λ =.11; 3 τ = 1.776, λ =.6. Figura 3.. Filtração e partículas e 19 µm ( C = g/l) através e um empacotamento com partículas o mesmo tamanho: mm ( );.875 mm ( ); mm ( ). Espaços vazios a coluna V = 55 ml, porosiae ε =.38, / V = 1/ ε V total =.63. Para a situação 1 τ = 1.45 (1.477), λ =.41; τ = (1.54), λ =.53; 3 τ = (1.7), λ =.14. Figura 3.1. Filtração e partículas e 6 µm ( C = g/l) através e um empacotamento com partículas o mesmo tamanho: mm ( );.875 mm ( ); mm ( ). Espaços vazios a coluna V = 55 ml, porosiae ε =.38, / V = 1/ ε V total =.63. Para a situação 1 τ = 1.9, λ =.13; τ = 1.18; λ =.1677; 3 τ = 1.6 (~.6), λ =

81 Apresentação e iscussão os Resultaos Estes resultaos poem também ser apresentaos na forma inversa, obtios a partir as Figuras a 3.1. Quer isto izer, para a coluna empacotaa por partículas com o tamanho 1.15 mm (Figura 3..),.875 mm (Figura 3.3.), e.375 mm (Figura 3.4.), filtraram-se suspensões com C = g/l e partículas e tamanhos: 1 4 µm; 19 µm; 3 6 µm. C, g/l,5,,15,1,5 3, V, ml C, g/l,18,16,14,1,1,8,6,4, 3 1, Figura 3.. Figura 3.3. Figura 3.4. Figura 3.. Filtração e suspensões ( C = g/l) e tamanhos: 1 4 µm ( ); 19 µm ( ); 3 6 µm ( ) através o empacotamento e partículas e tamanho 1.15 mm. Espaços vazios a coluna V = 55 ml. Figura 3.3. Filtração e suspensões ( C = g/l) e tamanhos: 1 4 µm ( ); 19 µm ( ); 3 6 µm ( ) através o empacotamento e partículas e tamanho.875 mm. Espaços vazios a coluna V = 55 ml. Figura 3.4. Filtração e suspensões ( C = g/l) e tamanhos: 1 4 µm ( ); 19 µm ( ); 3 6 µm ( ) através o empacotamento e partículas e tamanho.375 mm. Espaços vazios a coluna V = 55 ml. V, ml C, g/l,35,3,5,,15,1,5 3 1, V, ml A análise as Figuras a 3.1. e 3.. a 3.4. mostra que com o aumento e λ a quantia e partículas retias pelo empacotamento aumenta evio ao efeito e filtração. A teoria e filtração num leito profuno foi construía a partir a simples base e que a remoção e partículas é uma muança a concentração (C ) numa profuniae ( L ) e é governaa por um coeficiente e filtração ( k ) que é afectao através e vários parâmetros [9]: f C = k f C (Equação 3.) L Contuo, evem ser consieraos os importantes mecanismos e transporte: intercepção, ifusão, seimentação, e efeitos e fluxo hiroinâmicos. Em processos e separação com envolvimento e meios porosos a tortuosiae o meio poe afectar a eficiência o filtro através e moos iferentes, Figura

82 Apresentação e iscussão os Resultaos Figura 3.5. Esboço e filtração num meio poroso profuno. Possíveis influências a tortuosiae: efeito e inércia, seimentação, asorção. o ponto e vista o efeito e exclusão a partícula, os aos apresentaos na Figura 3.6. mostram que a retenção τ aumenta com a iminuição o tamanho as partículas. Como foi referio anteriormente para um capilar cilínrico a relação entre τ e λ é efinia por: τ = 1/(1 λ), one a orem a potência igual a ois poe ser consieraa como a imensão e espaço que poe ser testaa pela partícula. O coeficiente numérico na equação apresentaa poe ser correlacionao com a tortuosiae o caminho a partícula. 4, 3,5 3, τ,5, 1 3 1,5 C 1,,5 A B λ =.5, 1E-3,1,1 1 Figura 3.6. Variação o tempo e retenção τ com a razão o tamanho a molécula com o tamanho o poro λ para partículas e viro e 4 µm ( ); 19 µm ( ) e 6 µm ( ), obtia para colunas com empacotamentos e partículas iguais com o tamanho: A 1.15 mm, B.875 mm, e C.375 mm. Curvas: 1 τ = 1. 55/ (1 λ) ; τ = 1.35/( 1 λ) ; 3 τ = 1/ (1 λ). λ Na Figura 3.7. são mostraos alguns efeitos que poem afectar o movimento e partículas e são aas, a seguir, explicações qualitativas observaas nos resultaos a Figura

83 Apresentação e iscussão os Resultaos pav Figura 3.7. Esquema o poro e iâmetro méio partículas granes e pequenas. Zona estagnante av com movimento escenente e Por causa a variação a secção transversal a passagem o fluxo estão presentes no canal zonas estagnantes. As partículas maiores (partículas com 6 µm) são mais afectaas pela força a graviae e movem-se perto a linha central o canal (sofrem um efeito e exclusão mais significativo assim como também encontram/tornam alguns poros inisponíveis). Partículas menores (com 4 µm e 19 µm) têm mais espaço e, em comparação com as partículas maiores seguem, em méia, um caminho mais tortuoso. Para partículas e tamanho 6 µm os aos experimentais aproximam-se à fórmula τ = 1/ (1 λ) o que significa, teno em conta os efeitos atrás mencionaos, que os poros e filtração e partículas são testaos como um espaço e imensão e, respectivamente, o comprimento o caminho se aproxima a valores mínimos. As leveuras têm uma forma circular, tal como as esferas e viro. Por esta razão, é curioso comparar o comportamento estas partículas que tem a mesma forma mas ensiaes iferentes. Na Figura 3.8. são comparaos resultaos obtios para esferas e viro com os resultaos a filtração e Saccharomyces cerevisiae. O tamanho as leveuras ( = 4.6 µm) é próximo o tamanho as partículas e 4 µm mas a ensiae as primeiras é cerca e.5 vezes inferior à as esferas e viro e observam-se comportamentos, completamente iferentes que poem ser escritos pelo moelo e cromatografia hiroinâmica (HC) com um coeficiente e 1.6: 1.6/(1.8 ) τ = + λ λ. τ = 1.6, seno τ, O coeficiente poe ser consierao como proporcional na fórmula nesta relação, o parâmetro tortuosiae. Consequentemente, a tortuosiae situa-se perto o valor e Esta suposição conuz à equação e HC moificaa na forma: τ = A /(1 + λ.8λ ) e A τ. Poe-se consierar esta conclusão como o seguinte: o efeito e HC poe ser observao a certas conições (presumino a iferença significativa e 8

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