LZT Biotecnologia. Luiz Lehmann Coutinho Laboratório de Biotecnologia ESALQ USP

Transcrição

1 LZT Biotecnologia Luiz Lehmann Coutinho Laboratório de Biotecnologia ESALQ USP llcoutinho@usp.br

2 Organização do Curso Dois tópicos serão abordados durante o curso: Estratégias para identificação de genes de interesse biotecnológico Aplicações da biotecnologia Conteúdo: Aulas Seminários (2) Trabalho de revisão (1) Aulas práticas (disciplina optativa LZT0693 Técnicas experimentais em biotecnologia)

3 Programa 02/08 Introdução 12/08* Estratégias: Gene candidato; Como elaborar uma revisão de literatura 16/08 Estratégias: Mapeamento de QTL; Entrega do tema da revisão (Seminário 2) 23/08 Estratégias: Transcriptoma; 02/09* Estratégias: Proteoma 06/09 Feriado Semana da Pátria (não haverá aula); 13/09 Estratégias: Genoma 20/09 Estratégias: Integração; Apresentação do levantamento bibliográfico 27/09 Seminário 1: Trabalhos de identificação de genes de interesse; 04/10 Seminário 1: Trabalhos de identificação de genes de interesse; 11/10 Aplicações: Reprodução 21/10* Aplicações: Conservação; Entrega da primeira versão da revisão 25/10 Bioinformática 01/11 Aplicações: Transgenese Animal 08/11 Aplicações: Transgenese Vegetal; 15/11 Feriado 22/11 Patente 29/11 Seminário 2: Aplicação da Biotecnologia; 06/12 Seminário 2: Aplicação da Biotecnologia;

4 Avaliação semanal sobre textos; Dois seminários e um trabalho: Seminário 1 - Apresentação de seminário sobre identificação de genes de interesse. O tempo de apresentação será de 15 minutos por grupo. Cada grupo com 3 alunos. No dia da apresentação um aluno do grupo será sorteado para apresentar o seminário. Trabalho e Seminário 2: Trabalho de revisão de literatura sobre aplicação da biotecnologia. Cada grupo com 3 alunos. Etapas: Entrega do tema da revisão (dia 16/8); Apresentação do levantamento bibliográfico (20/09); Entrega da primeira versão (21/10); Entrega da versão final e Apresentação oral (29/11 e 06/12). Monitora: Simone Pértile s.pertile@zootecnista.com.br

5 Definição de Biotecnologia Ereky (1919): A ciência e os métodos que permitem a obtenção de produtos a partir da matéria-prima, mediante a intervenção de organismos vivos OECD - Organisation for Economic Co-Operation and Development: A aplicação dos princípios da ciência e da engenharia no tratamento de matérias por agentes biológicos na produção de bens e serviços (1982). OTA Office of Technology Assessment: Biotecnologia, de uma forma abrangente, inclui qualquer técnica que utiliza organismos vivos (ou partes deles) para obter ou modificar produtos, melhorar plantas e animais, ou desenvolver microrganismos para usos específicos (1984).

6 Definições de Biotecnologia EFB - European Federation of Biotechnology: Uso integrado da bioquímica, da microbiologia e da engenharia para conseguir aplicar as capacidades de microrganismos, células cultivadas animais ou vegetais ou parte dos mesmos na indústria, na saúde e nos processos relativos ao meio ambiente (1988). E.H. Houwink: o uso controlado da informação biológica (1989). Biotechnology Industry Organization: em sentido amplo, Biotecnologia é "bio" + "tecnologia", isto é o uso de processos biológicos para resolver problemas ou fazer produtos úteis (2003).

7 Qual a sua definição?

8 Campo da Biotecnologia

9 Setores da Biotecnologia ENERGIA: Etanol, biogás e outros combustíveis (a partir de biomassa) INDÚSTRIA: Butanol, acetona, glicerol, ácidos, vitaminas etc. Numerosas enzimas para outras indústrias (têxtil, de detergentes etc.) MEIO AMBIENTE: Recuperação de petróleo, biorremediação (tratamento de águas servidas e de lixo, eliminação de poluentes) AGRICULTURA: Adubo, silagem, biopesticidas, biofertilizantes, mudas de plantas livres de doenças, mudas de árvores para reflorestamento. Seleção genética, plantas com características novas incorporadas (transgênicas): maior valor nutritivo, resistência a pragas e condições de cultivo adversas (seca, salinidade, etc.)

10 Setores da Biotecnologia PECUÁRIA: Embriões, seleção genética, animais com características novas (transgênicos), vacinas e medicamentos para uso veterinário e humano ALIMENTAÇÃO: Panificação (pães e biscoitos), laticínios (queijos, iogurtes e outras bebidas lácteas), bebidas (cervejas, vinhos e bebidas destiladas) e aditivos diversos (shoyu, monoglutamato de sódio, adoçantes etc.); proteína de célula única (PUC) para rações, alimentos de origem transgênica com propriedades novas SAÚDE: Antibióticos e medicamentos para diversas doenças, hormônios, vacinas, reagentes e testes para diagnóstico, tratamentos novos etc

11 Biotecnologia: Um avanço ou um atraso? A biotecnologia é uma tecnologia. O que deve ser discutido é o uso que fazemos dela

12 Marcos da Biotecnologia: Antiguidade: Preparação e conservação de alimentos e bebidas por fermentação (pão, queijo, cerveja, vinho e vinagre) cultivo de plantas (batata, milho, cevada, trigo etc.), domesticação de animais tratamento de infecções (com produtos de origem vegetal tais como pó de crisântemo e derivados de soja com fungos).

13 Marcos da Biotecnologia: Idade Moderna: Início da produção comercial de cerveja; extração de metais por ação microbiana na Espanha; cultivo de fungos na França; Hooke descobre a existência de células (1665).

14 Marcos da Biotecnologia: Idade Contemporânea: Pasteur inventa um processo para conservar alimentos sem alterar suas propriedades organolépticas (Pasteurização, 1863), identifica a levedura como o agente responsável pela fermentação alcoólica (1876), usa microrganismos atenuados para obter vacinas contra o antraz e a cólera (1881), faz os primeiros testes de uma vacina contra a raiva (1881).

15 Marcos da Biotecnologia: 1928 F. Griffith descobre a transformação, isto é a transferência de informação genética de uma linhagem bacteriana a outra 1944 Produção em grande escala da penicilina (descoberta por Fleming em 1928, desenvolvida por Florey e Chain) 1951 Inseminação artificial de gado utilizando sêmen congelado

16 Marcos da Biotecnologia: 1953 Watson e Crick propõem um modelo da estrutura do ADN 1973 Havendo desenvolvido técnicas de corte e reunião do DNA, Cohen e Boyer transferem um gene a um organismo de outra espécie. Lançado no Brasil o programa de produção de álcool a partir de biomassa (Pró-Álcool)

17 Marcos da Biotecnologia: 1975 A Conferência de Asilomar pede ao National Institute of Health (NIH) que sejam estabelecidas normas para a regulação dos experimentos com DNA-recombinante, o que acontecerá meses mais tarde Utilização da técnica de hibridização molecular no diagnóstico pré-natal da alfa talassemia.

18 Marcos da Biotecnologia: 1978 Genentech, Inc., a primeira empresa biotecnológica obtém a somatostatina (hormônio de crescimento) mediante a tecnologia do DNA recombinante 1980 A Suprema Corte de Justiça dos EUA aprova o princípio de patentes para as formas de vida de origem recombinante. As primeiras patentes são de um microrganismo para biorremediação de petróleo

19 Marcos da Biotecnologia: 1980 Mullis inventa a técnica da Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) cuja patente será obtida por Cetus, Inc. em 1985 e vendida em 1991 a Hoffman-LaRoche, Inc. por 300 milhões de dólares A insulina humana recombinante da Genentech, Inc. é comercializada A primeira vacina de DNA-recombinante para o gado é comercializada na Europa.

20 Marcos da Biotecnologia: 1987 FDA aprova o fator ativador de plasminogênio recombinante para o tratamento de ataques cardíacos Harvard obtém patente de um rato transgênico para o estudo do câncer 1989 Criação do National Center for Human Genome Research e inicio do mapeamento do genoma humano.

21 Marcos da Biotecnologia: 1990 Primeira experiência de terapia gênica para uma doença rara (ADA) em uma menina de quatro anos Pfizer comercializa Chy-Max TM, enzima recombinante para a preparação de queijos GenPharm International, Inc. consegue uma vaca transgênica que produz no leite proteínas humanas para alimentação infantil

22 Marcos da Biotecnologia: 1993 Aprovada a utilização do hormônio de crescimento bovino rbgh/rbst, para aumentar da produção de leite (Monsanto) 1994 Lançamento no mercado do tomate FlavSavr, que, devido à inativação de um gene, amadurece na planta 1995 Decifrado o primeiro genoma de uma bactéria, Haemophilus influenzae.

23 Marcos da Biotecnologia: 1997 Nascem Dolly, uma ovelha clonada, e, meses mais tarde, uma segunda ovelha, Polly, clonada e geneticamente modificada O rascunho do sequenciamento do genoma humano é anunciado por Collins, do Consórcio do Genoma Humano, e Venter, da Celera Inc. Sequenciado o genoma de uma bactéria que ataca os citros (Xylella fastidiosa).

24 Marcos da Biotecnologia: 2003 A venda, como mascote, do GloFish, um peixe transgênico que brilha na escuridão, originalmente criado para detectar poluentes Pesquisadores japoneses desenvolvem a primeira rosa azul (OGM). Cultivam-se plantas transgênicas em 25 países, incluídos sete da União Européia Yamanaka anuncia a obtenção de células pluripotentes induzidas utilizando um plasmídeo como vetor Sequenciamento de nova geração

25 Pontos de discussão Filme 1) A situação relatada no filme é real? 2) No futuro? 3) Quais as fontes de material genéticos? 4) É possível sequenciar um genoma de um ser humano? E o custo? 5) Sequenciar o DNA resolve os problemas? 6) Qual o problema? 7) É possível predizer o futuro? 8) DNA determina o fenótipo? 9) Impacto no seguro saúde? 10) Qual a importância de biotecnologias da reprodução no filme? 11) Que outras aplicações poderiam surgir do sequenciamento de DNA

26 Como a biotecnologia pode continuar a auxiliar o nosso desenvolvimento?

27 Quais são os principais problemas? Qual é o fator limitante?

28 Fator limitante Quais são os genes que controlam as características de interesse?

29 Aplicação Uma vez identificado o gene de interesse, com utilizar esta informação?

30 O que poderia ser feito? Testes genéticos Seleção assistida por marcadores Produção in vitro de proteínas de interesse comercial Organismos geneticamente modificados

31 Como identificar os genes de interesse?

32 Estratégias: Genes candidatos Procura em todo o genoma Expressão gênica

33 Princípios

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39 Sequenciamento de DNA

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44 Atalho para 3D Animations - Disease Mutation Sickle Cell Dolan DNA Learning Center.lnk

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47 Gene candidato: Um exemplo de sucesso

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52 Polimorfismo: Cromossomo 5 ATAAC GCGC AAT CACACACA... CTGACTGATATGTA TATTGCGCGTTAGTGTGTGT...GACTGACTATACAT Cromossomo 5 ATAAC G T GC AAT CACACACA CACA CTGACTGATATGTA TATTGCACGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT

53 Cromossomo 5 RFLP ATAAC GCGC AAT CACACACA... CTGACTGATATGTA TATTGCGCGTTAGTGTGTGT...GACTGACTATACAT Cromossomo 5 ATAAC G T GC AAT CACACACA CACA CTGACTGATATGTA TATTGCACGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT Digestão com enzima que reconhece a seqüência GCGC: Cromossomo 5 GC AAT CACACACA... CTGACTGATATGTA CGTTAGTGTGTGT...GACTGACTATACAT ATAAC G C TATTGCG Cromossomo 5 ATAAC G T GC AAT CACACACA CACA CTGACTGATATGTA TATTGCGCGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT

54 Identificar genes responsáveis pela prolificidade em suínos. Estratégia: Genes Candidatos Análise de genes conhecidos com base em informações de fisiologia (hormônio ou receptores ligados a reprodução). Mutações observadas em outras espécies. Resultados observados em animais transgênicos.

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56 Prolificidade em suínos Animais da raça Meishan chinesa tem um maior número de leitões por leitegada. Investigação de genes ligados ao sistema reprodutivo, por exemplo: ESR1 Detecção do polimorfismo por PCR e digestão com enzima de restrição.

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58 1) Identificação da sequencia do gene. 2) Desenho de primers e amplificação do gene. 3) Sequenciamento em diversos indivíduos para detecção de polimorfimsos.

59 Detecção de SNP

60 5. Estudo do efeito do polimorfismo na prolificidade.

61 Bovino com fenótipo de musculatura dupla

62 Efeito da ausência de expressão do gene da miostatina em camundongos (McPherron et al., 1997)

63 Musculatura dupla em bovinos McPherron et al., Nature e PNAS 1997

64 Anemia Falciforme

65 Resultados e limitações Esta estratégia tem gerado bons resultados. Pode gerar muitos falso positivos Depende de um conhecimento prévio do gene de interesse.

66 Implicações Desenvolvimento de testes genéticos para diagnóstico Uso em seleção genética

67 Exemplos com humanos

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