OBTENÇÃO DE WHISKERS DE CELULOSE A PARTIR DAS FOLHAS DE CAPIM ELEFANTE PARA APLICAÇÃO EM NANOCOMPÓSITOS POLIMÉRICOS

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1 OBTENÇÃO DE WHISKERS DE CELULOSE A PARTIR DAS FOLHAS DE CAPIM ELEFANTE PARA APLICAÇÃO EM NANOCOMPÓSITOS POLIMÉRICOS Sandra Américo do Nascimento, Camila Alves Rezende Universidade Estadual de Campinas Cidade Universitária Zeferino Vaz - Barão Geraldo, Campinas - SP, sandra.nascimento@iqm.unicamp.br RESUMO Neste trabalho, foram isolados whiskers de celulose e nanocelulose fibrilar a partir da biomassa das folhas de capim elefante com um rendimento de 15,4% e 3,8% (m/m biomassa), respectivamente. Os whiskers apresentaram um comprimento médio de 150 ± 44 nm e um diâmetro médio de 5 ± 1 nm. A análise por difractometria de raios-x mostrou que os nanocristais de celulose apresentaram cristalinidade de 77% e a nanocelulose fibrilar de 76%. Estes resultados indicaram as características promissoras destas nanopartículas para serem aplicadas como agentes de reforço em matrizes poliméricas. Antes da obtenção de whiskers, as folhas de capim elefante foram mercerizadas e em seguida branqueadas, as fibras branqueadas apresentaram concentrações de celulose, hemicelulose e lignina de 74,1% ± 0,5, 12,9% ± 0,3 e 9,9% ± 0,2, respectivamente, determinadas por cromatografia líquida de alta eficiência (HLPC). Palavras chaves: Capim elefante, whiskers de celulose, nanocelulose fibrilar INTRODUÇÃO A nanocelulose vem sendo incorporada, em baixas concentrações, como fase dispersa em matrizes poliméricas orgânicas atuando como agente de reforço, formando materiais compósitos transparentes e com melhores propriedades mecânicas. Os chamados compósitos verdes são produzidos quando a 9073

2 nanocelulose é incorporada em matrizes poliméricas biodegradáveis como o poli(ácido lático), o amido e copolímeros como o poli(ácido lático)-co-(ácido glicólico), melhorando suas propriedades mecânicas (1,2). A maioria dos trabalhos publicados que tratam da obtenção de whiskers para a produção de nanocompósitos, utilizaram matrizes já enriquecidas em celulose como polpa celulósica, celulose microcristalina ou fibras (3). No presente trabalho, os whiskers são obtidos a partir de uma fonte renovável de biomassa, o capim elefante. Além disso, celulose nanofibrilar é também obtida como um co-produto do processo e o material líquido hidrolisado, obtido nas etapas de pré-tratamento da biomassa, é rico em acúcares fermentáveis, que podem ser aproveitados para a produção de bioetanol e outros produtos químicos, dentro do conceito integrado de biorefinarias, agregando sustentabilidade ao processo. O capim elefante (Pennisetum purpureum) é uma gramínea amplamente empregada na produção de pastos no Brasil e destaca-se por sua capacidade de produzir grandes volumes de biomassa. Além disso, ele apresenta alta capacidade de adaptação, baixa demanda por nutrientes e resistência a climas severos (4). A biomassa do capim elefante pode ser usada como matéria prima na produção de biocombustíveis, produtos químicos, energia e na obtenção de micro e nanoestruturas para produção de materiais compósitos (4). A biomassa lignocelulósica é formada principalmente por celulose, hemicelulose e lignina. A hemicelulose e a lignina são polímeros amorfos enquanto a celulose é um polímero semicristalino formado pela união de microfibrilas de celulose (5,6). Para obtenção de nanocelulose, primeiramente, a biomassa é deslignificada através de pré-tratamentos físicos e químicos isolados ou combinados, capazes de remover hemicelulose e lignina, tornando a biomassa menos recalcitrante. Na literatura, aplica-se a denominação de nanocelulose de uma forma geral, para designar tanto a celulose nanofibrilar, quanto os whiskers de celulose. A celulose nanofibrilar consiste de um conjunto de cadeias de celulose, sendo que é a menor unidade estrutural da fibra. Possui regiões de domínios amorfos e cristalinos, módulo de elasticidade em torno de GPa e alta razão de aspecto, uma vez que seu diâmetro possui dimensões que variam de 5-60 nm e seu comprimento 9074

3 possui diversos micrômetros. Ela geralmente é obtida submetendo a polpa celulósica a tratamentos mecânicos que requerem alto consumo de energia (6,1), mas nesse trabalho, foi obtida como um co-produto da obtenção de whiskers. Os whiskers de celulose também conhecidos como celulose nanocristalina ou nano-whiskers, têm dimensões em escala nanométrica com diâmetro que varia de 5 a 70 nm e comprimento de 100 a 250 nm. Os whiskers de celulose são obtidos pela clivagem longitudinal das microfibrilas através da hidrólise ácida, utilizando o ácido sulfúrico em concentrações entre 60-65% sob aquecimento (7). Esta clivagem ocorre nas regiões amorfas onde as cadeias de celulose estão desordenadas e, portanto, mais suscetíveis ao ataque ácido. Como a parte amorfa da fibrila é majoritariamente consumida no processo de síntese, essas partículas apresentam alto grau de cristalinidade, que varia de 54-84%, de acordo com dados de difração de raios x, e módulo de elasticidade de GPa. Tanto seu grau de cristalinidade, quanto sua morfologia dependem da fibra vegetal utilizada e das condições e técnicas experimentais empregadas (6,2). MATERIAIS E MÉTODOS Biomassa e pré-tratamentos As amostras de capim elefante guaçu foram gentilmente doadas pelo Instituto de Zootecnia (IZ) da cidade de Nova Odessa. Foi feita a separação das folhas e colmos, seguida de secagem a 60 C por 24 h em estufa com circulação de ar (Tecnal TE-394/3 MP) e moagem em moinho de facas (Thomas Scientific, USA), passando por peneira de 2 mm. Os reagentes empregados no pré-tratamento das fibras de capim e isolamento de whiskers de celulose foram: ácido sulfúrico 98%, peróxido de hidrogênio 29%, hidróxido de sódio, todos da marca Synth. O pré-tratamento foi realizado em duas etapas: mercerização (1), seguida de branqueamento (2). Durante o processo de mercerização, as folhas moídas foram tratadas como uma solução alcalina (NaOH 5% m/v) sob agitação mecânica por 2 h a 70 C, com uma razão fibra:solução de 1:10 (g/ml). As fibras mercerizadas foram branqueadas com uma solução 1:1 de peróxido de hidrogênio 24% (v/v) e hidróxido de sódio 4% (m/m), sob temperatura de 60 C e agitação mecânica por 2 h, sendo que este procedimento foi repetido duas vezes. Após cada tratamento, a suspensão 9075

4 foi filtrada e as fibras lavadas com água até ph neutro. Em seguida, as fibras foram secas em estufa a 60 C por 48 h. Obtenção de whiskers de celulose e nanocelulose fibrilar Para a obtenção de whiskers, as fibras branqueadas foram moídas em moinho de facas até passarem por peneira de 0,5 mm. Em seguida, foram hidrolisadas com uma solução de H2SO4 60% (m/m) sob agitação com um bastão de vidro por 1 minuto a cada 10 minutos durante um tempo total de 60 minutos a 45 C, obedecendo a uma proporção fibra:solução ácida de 1g:30mL. A reação foi parada adicionando-se água gelada e gelo. A remoção do ácido foi feita através de lavagens sucessivas com água utilizando centrifugações a 5000 RPM por 15 min em uma centrifuga da marca Sorval RC-3B até obtenção da suspenção de whiskers de celulose em ph 6-7. Caracterização dos materiais A quantificação de celulose, hemicelulose e lignina das folhas In natura e prétratadas foi realizada conforme o protocolo do NREL (National Rggenewable Energy Laboratory) (8). As imagens das fibras in natura, das pré-tratadas e das nanofibrilas de celulose foram obtidas utilizando-se o microscópio eletrônico de varredura FEI Quanta 650 FEG, operando a 5 kv. O mesmo encontra-se disponível no Laboratório Nacional de Nanotecnologia (LNNano), localizado em Campinas/SP. As amostras foram fixadas com fita adesiva condutora no porta-amostras e, em seguida, recobertas por uma fina camada de ouro (~16 nm), usando um metalizador Sputter Coater (Baltec), operando a uma corrente de 40 ma por 60 segundos.. As imagens dos whiskers foram obtidas em um de microscópio eletrônico de transmissão Modelo LIBRA120 da Carl Zeiss. A preparação dos whiskers para TEM foi feita diluindo a suspensão de whiskers em água deionizada em uma proporção 1:1 e sonificando-a por 2 min. Cerca de 3 L dessa suspensão foram depositados sobre o porta-amostra (tela de cobre de 400 mesh recoberta com filme suporte de parlódio e carbono amorfo). Após 1 minuto, o excesso da suspensão foi seca com papel de filtro. Para contrastação, foi depositada sobre a amostra uma gota de acetato de uranila a 2% v/v. Depois de 30 segundos, o excesso de acetato de 9076

5 uranila foi removido e a tela foi lavada através da deposição de uma gota de água deionizada. O excesso de água também foi seco com papel de filtro. A tela foi analisada por TEM após completa secagem por 2 h em dessecador à temperatura ambiente. As análises de DRX das fibras antes e após tratamentos e da nanocelulose foram realizadas utilizando um difratômetro Shimazu modelo XRD 7000 (alvo de Cu, com radiação K com λ = 0,15406 nm, operando a 40kV e 30mA). As medidas foram feitas em temperatura ambiente em intervalo angular de 2ϴ entre 5 e 60 com taxa de varredura de 2 mim -1. O índice de cristalinidade (IC) das fibras e da nanocelulose foram obtidos usando a equação: (I002 - IAM) / I002 x 100. Onde I002 é o valor de intensidade do pico próximo a 2θ = 22,6, o que representa a cristalinidade do mateiral enquanto IAM é a intensidade de alo amorfo em 2θ = 18 (9). RESULTADOS E DISCUSSÃO Deslignificação e análise morfológica da biomassa Para determinar quais constituintes da biomassa estão sendo removidos noas etapas de obtenção dos whiskers, foram feitas quantificações de açúcares constituintes da celulose e da hemicelulose por HPLC e também determinações de lignina total (solúvel e insolúvel) por UV-VIS nos sólidos resultantes dos prétratamentos. A Tabela 1 mostra os percentuais de celulose, hemicelulose, lignina, cinzas e o fechamento de massas total em amostras de folha de capim elefante in natura e após as duas etapas de pré-tratamento. Observa-se um crescente aumento no teor de celulose após cada prétratamento, assim como a diminuição das concentrações de hemicelulose e lignina (Tabela 1). O tratamento com NaOH 5% m/v foi responsável pela remoção da maior parte de lignina, cujo teor caiu de 28,0% para apenas 13,7% após esse tratamento. O mesmo foi observado para a porcentagem de hemicelulose, que mostrou uma redução de 24,8% para 16,8%. O tratamento com peróxido alcalino apresentou também um efeito significativo sobre a remoção de hemicelulose e de lignina das amostras de folhas de capim, embora os percentuais de diminuição sejam menores do que na primeira etapa de pré-tratamento. Esse efeito é coerente com o fato dessa ser a segunda etapa do processo, responsável por remover os componentes mais recalcitrantes da parede celular, que já resistiram ao primeiro tratamento. 9077

6 Tabela 1: Quantificação de celulose, hemicelulose, lignina e cinzas nas folhas de capim elefante por HPLC. Amostra Celulose (%) Hemicelulose (%) Lignina (%) Cinzas (%) Total (%) In natura 41,8± 0,2 24,8 ± 1,0 28,0 ± 1,5 2,05 ± 0,46 96,7 ± 2,3 NaOH 5% 66,9 ± 0,4 16,8 ±0,1 13,7 ±0,4 0,20 ± 0,05 97,6 ± 0,2 NaOH4%: H2O2 24% 74,1 ± 0,5 12,9 ± 0,3 9,9 ± 0,2 0,10 ± 0,01 97,0 ± 1,2 Os extrativos foram retirados das folhas in natura conforme a metodologia descrita em trabalho anterior do grupo (10). As folhas continham 12,3 0,2% de extrativos. A remoção de constituintes amorfos como hemicelulose e lignina após cada etapa do pré-tratamento (Tabela 1) foram acompanhadas de alterações morfológicas das fibras. A Figura 1 mostra imagens de elétrons secundários obtidas por FESEM na superfície das folhas de capim elefante antes e após pré-tratamento com NaOH 5% (mercerização) e com peróxido alcalino (branqueamento). A morfologia das folhas de capim elefante in natura (Figura 1) mostra uma superfície compacta, onde as fibras de celulose estão unidas e recobertas por material particulado. As fibras tratadas com NaOH 5% apresentaram uma superfície rugosa, praticamente sem material particulado. Após o tratamento alcalino, observa-se uma morfologia menos compacta e uma superfície característica de um sólido que teve constituintes removidos, com fibrilas de celulose evidentes. Já a etapa de branqueamento foi responsável por descompactar ainda mais a parede celular, levando a uma morfologia ainda mais rugosa e com fibrilas evidentes e mais cheia de reentrâncias. Figura 1: Imagens de elétrons secundários obtidas por FESEM na superfície de folha de capim elefante: in natura; tratada com hidróxido de sódio 5% (mercerizada) e tratada com peróxido alcalino (branqueada). 9078

7 Obtenção de whiskers de celulose e nanocelulose fibrilar Whiskers de celulose em dispersões aquosas foram obtidos através da hidrólise, com ácido sulfúrico 60% (m/m), das folhas de capim elefante já branqueadas. Na Figura 2 é mostrada uma micrografia de TEM dos whiskers obtidos, revelando a presença de feixes alongados em forma de agulhas. A hidrólise ácida das fibras branqueadas por 60 minutos resultou em um rendimento dos whiskers de celulose de 52,7%em relação as fibras branqueadas e de 15,4 % em relação as fibras In natura. Esses whiskers apresentam comprimento médio de 150 ± 44 nm, largura de 5 ± 1 nm, razão de aspecto L/D de 30 e índice de cristalinidade de 77% o que indica a aplicabilidade desses whiskers como reforço na produção de nanocompósitos. Figura 2: Imagens de TEM dos whiskers de celulose obtidos após hidrólise de fibras branqueadas de capim elefante após 60 minutos de hidrólise. A análise de FESEM do resíduo sólido resultante do processo de obtenção dos nanocristais de celulose por centrifugação revelou também a presença de nanonocelulose fibrilar (Figura 6), que é obtida como um co-produto da produção de whiskers. A nanocelulose fibrilar foi obtida com um rendimento de 12,7 % em relação as fibras branqueadas e de 3,8% em relação as fibras In natura, com índice de cristalinidade (IC) de 76 %, um resultado que é importante, porque fornece um caminho para produção combinada de diferentes tipos de nanocelulose, reduzindo os custos energéticos de produção da nanocelulose fibrilar, a qual é comumente obtida por processos mecânicos que requerem alto consumo energético. 9079

8 Com base nesses resultados podemos deduzir que a hidrólise ácida promoveu a desfibrilação da parede celular vegetal através da quebra das ligações de hidrogênio entre as fibras cristalinas, liberando assim as nanofibrilas de celulose. Os whiskers são formados quando ocorre a clivagem hidrolítica das ligações glicosídicas do tipo (β - 1,4) das regiões amorfas das nanofibrilas, mas no caso de uma hidrólise parcial, sobram fibrilas não hidrolizadas. Figura 3: Imagens de FESEM mostrando a nanocelulose fibrilar obtida após hidrolise ácida de fibras branqueadas de capim elefante por 60 minutos: a) barra de escala de 10 m e b) barra de escala de 2 m. Análise por difração de raios X das fibras e da nanocelulose Foram comparados os difratogramas de raios x das diferentes amostras (fibra in natura, mercerizada, branqueada, whiskers de celulose e nanocelulose fibilar) para avaliar os efeitos do pré-tratamento e da hidrolise sobre a cristalinidade dos sólidos obtidos. Esta análise é importante, já que a obtenção dos whiskers utilizando ácido sulfúrico (60% m/m) só foi possível quando as amostras atingiram uma cristalinidade de 66% (9). Observam-se três picos na amostra in natura em 2θ = 15,5, 22,6 e 35, que são atribuídos aos planos cristalográficos (101), (002) e (040), respectivamente, os quais são característicos de celulose microcristalina (11). Os difratogramas de raios X apresentados na Figura 4 mostram uma melhor definição dos picos cristalinos nas amostras após os pré-tratamentos em comparação com a amostra in natura. Em especial, o ombro que aparece em 15,5 e o pico em 35 na amostra in natura, tornam-se picos mais definidos nos sólidos após tratamento com NaOH e com 9080

9 Intensidade 22º CBECiMat - Congresso Brasileiro de Engenharia e Ciência dos Materiais peróxido alcalino.o pico que aparece em 30 é atribuído a alteração química e estrutural da celulose após remoção de hemicelulose e lignina Os difratogramas demostraram assim, a remoção de constituintes amorfos das folhas de capim elefante, como a hemicelulose, a lignina e a celulose amorfa. Calculando-se índice de cristalinidade (IC), observou-se um aumento significativo na cristalinidade dessas amostras, que passa de 46% nas folhas in natura, para 56% nas amostras tratadas com NaOH 5% (mercerizadas) e para 66% nas amostras tratadas com peróxido alcalino (branqueadas). A estrutura cristalina típica de celulose nativa (celulose tipo I) com picos em 2θ = 15 e 22,6 é mantida (12) (002) IC= 56% IC=66% 1 Fibra In natura 2 Fibra mercerizada 3 Fibra branqueada (101) IC= 46% (040) (graus) Figura 4: Difratogramas de raios X das folhas de capim elefante in natura (curva 1) e pré-tratadas por mercerização (curva 2) e por branqueamento (curva 3). As curvas estão deslocadas no eixo y para melhor visualização, de modo que os valores de intensidade indicados em y são relativos. Os difratogramas dos whiskers de celulose e da nanocelulose fibrilar quando comparados com o da fibra branqueada (Figura 5) mostraram um aumento na intensidade dos picos cristalinos, que parecem mais definidos e intensos com o aumento do tempo de hidrólise. Observou-se a presença de picos característicos de celulose tipo I (2θ = 15 e 22,6 ) tanto no difratograma dos whiskers, quanto nos da fibra branqueada, indicando que não houve modificação na estrutura cristalina da celulose nativa após a hidrólise ácida. As fibras branqueadas apresentaram um grau de cristalinidade de 66%, como já discutido anteriormente. Já os whiskers e a 9081

10 Intensidade 22º CBECiMat - Congresso Brasileiro de Engenharia e Ciência dos Materiais nanocelulose fibrilar obtidos após 60 minutos de hidrólise, apresentaram cristalinidade de 77 % e 76%, respectivamente. Esses valores estão de acordo com os relatados na literatura para whiskers de celulose obtidos a partir de outras espécies de gramíneas, como bagaço de cana e milho (12,13). Altos valores de cristalinidades são desejáveis nessas amostras, pois estão associados à sua elevada rigidez, que é um fator importante para sua aplicação como reforço em matrizes poliméricas (3) (101) (002) 1 Fibra branqueada 2 Nanocelulose fibrilar 60 min 3 Whiskers 60 min IC= 77% IC= 76% IC= 66% Theta ( ) Figura 5: Difratogramas de raios X da fibra branqueada (curva 1), da nanocelulose fibrilar (curva 2) e dos whiskers de celulose (curva 3) após 60 minutos de hidrólise. *As curvas estão deslocadas em relação ao eixo y. CONCLUSÕES A metodologia empregada nesse trabalho permitiu obter whiskers de celulose por mercerização, branqueamento e hidrólise ácida de folhas de capim elefante. O rendimento whiskers de celulose e de nanocelulose fibrilar em relação as fibras In natura foi de 15,4% e de 3,8%, respectivamente. Os whiskers obtidos nesse processo apresentaram um comprimento médio de 150 ± 44 nm, largura de 5 ± 1 nm e razão de aspecto L/D de 30. Os whiskers e a nanocelulose fibrilar apresentaram índices de cristalinidade próximos de 77 e 76%, respectivamente. Essas nanopartículas apresentam, assim, boas propriedades para serem utilizadas como agente de reforço em matrizes poliméricas. A caracterização das amostras ao longo 9082

11 do processo de obtenção de whiskers permitiu observar que os pré-tratamentos foram removendo gradativamente material amorfo das folhas de capim elefante e observou-se um aumento no grau de cristalinidade de 46% nas amostras in natura para 56% nas amostras só mercerizadas e para 66% nas amostras mercerizadas e tratadas com peróxido alcalino. As análises por FESEM mostraram que, após o branqueamento, as fibrilas de celulose estavam mais expostas e a matriz celulósica apresentava cavidades devido à remoção de outros constituintes da parede celular, como hemicelulose e lignina. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem o apoio financeiro do CNPq (bolsa de doutorado e projeto pesquisa /2013-9) e da Fapesp (proc. 2016/ ), assim como o apoio do Instituto de Química da UNICAMP. Agradecemos também o INCT-INOMAT e o LNNano/CNPEM pelo apoio técnico para as análises de microscopia eletrônica. REFERÊNCIAS 1. Siró, I. & Plackett, D. Microfibrillated cellulose and new nanocomposite materials: a review. Cellulose 17, (2010). 2. Habibi, Y., Lucia, L. A. & Rojas, O. J. Cellulose Nanocrystals: Chemistry, Self- Assembly, and Applications. Chem. Rev. 110, (2010). 3. Siqueira, G., Bras, J. & Dufresne, A. Cellulosic Bionanocomposites: A Review of Preparation, Properties and Applications. Polymers 2, (2010). 4. Lima, M. A. et al. Evaluating the composition and processing potential of novel sources of Brazilian biomass for sustainable biorenewables production. Biotechnol. Biofuels 7, 10 (2014). 5. Sheltami, R. M., Abdullah, I., Ahmad, I., Dufresne, A. & Kargarzadeh, H. Extraction of cellulose nanocrystals from mengkuang leaves (Pandanus tectorius). Carbohydr. Polym. 88, (2012). 6. Abdul Khalil, H. P. S. et al. Production and modification of nanofibrillated cellulose using various mechanical processes: A review. Carbohydr. Polym. 99, (2014). 7. Bras, J., Viet, D., Bruzzese, C. & Dufresne, A. Correlation between stiffness of sheets prepared from cellulose whiskers and nanoparticles dimensions. Carbohydr. Polym. 84, (2011). 8. Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass: Laboratory Analytical Procedure (LAP) (Revised July 2011) pdf. Available at: (Accessed: 2nd October 2016) 9. Segal, L., Creely, J. J., Martin, A. E. & Conrad, C. M. An Empirical Method for Estimating the Degree of Crystallinity of Native Cellulose Using the X-Ray Diffractometer. Text. Res. J. 29, (1959). 9083

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