PRODUÇÃO DE PROBIÓTICOS DE CÉLULAS IMOBILIADAS DE LACTOBACILLUS POR FERMENTAÇÃO EM SORO DE LEITE

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1 PRODUÇÃO DE PROBIÓTICOS DE CÉLULAS IMOBILIADAS DE LACTOBACILLUS POR FERMENTAÇÃO EM SORO DE LEITE 1 Natália Mazzarioli Terra, 2 Verônica dos Santos Lopes, 3 Ubirajara Coutinho Filho, 4 Vicelma Luiz Cardoso 1 Bolsista de iniciação Científica FAPEMIG, discente do curso de Engenharia Química 2 Discente do curso de Engenharia Química 3 Professor da Faculdade de Engenharia Química da UFU/MG 4 Professora da Faculdade de Engenharia Química da UFU/MG 1,2,3 Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia. Av João Naves de Ávila, 2121, Bloco 1K, Campus Santa Mônica, Uberlândia - MG, CEP ) 3 ucfilho@fequi.ufu.br RESUMO - Probióticos e simbióticos têm uso regular importante na alimentação de humanos e animais. A produção de probióticos e simbióticos na forma de células imobilizadas representa uma melhora na qualidade do produto por tornar melhor a resistência das células do produto ao processo de produção e por aumentar a resistência do produto à ação dos fluidos biológicos gerados no processo de digestão. Há um interesse crescente na substituição de agentes antimicrobianos por probióticos o que pode ser constatado, por exemplo, pelo aumento das restrições e exigências referentes ao uso dos agentes antimicrobianos na produção de alimentos de origem animal. A produção de leite representa um dos segmentos mais importantes do agronegócio brasileiro e uso deste leite na produção de queijos gera grandes volumes de soro que em sua grande parte vira efluente, que pode ser aproveitado na produção de probióticos destinados à melhora da criação do gado leiteiro como, também, produção de outros alimentos de origem animal. Este trabalho avaliou a produção de probiótico de lactobacilos com células imobilizadas em alginato e os resultados mostram que as diferentes fermentações estudadas mostraram-se satisfatórias na geração de células imobilizadas, o processo de secagem é uma etapa fundamental para evitar contaminações, que a pré-concentração do soro conjunta ao uso de glicerina não foi capaz de gerar células mais estáveis e maior crescimento celular quando comparada com a concentração de soro normal. Palavras-Chave: probiótico, células imobilizadas, soro de leite INTRODUÇÃO Os probióticos e simbióticos são formulações contendo microrganismos vivos que exercem ação benéfica na flora microbiana de animais e humanos por estimularem a multiplicação de microorganismos necessários ao bom funcionamento do organismo, inibirem a proliferação de bactérias potencialmente prejudiciais e reforçarem os mecanismos naturais de defesa. As formulações probióticas para uso humano são utilizadas principalmente na alimentação, mas hoje o termo probiótico não é restrito apenas ao uso alimentar, mas também a outros usos como os que beneficiam a microbiota vaginal, respiratória e bucal. Embora o uso de probióticos na alimentação tenha se difundido primeiramente para alimentação humana, o uso os destas formulações está cada vez mais integrado a criação de animais, sendo que as respostas mais expressivas da administração dos mesmos são notadas nos animais estressados e em recém nascidos ou desmamados. Esta realidade faz com que o uso de probiótico seja cada vez mais frequente na alimentação de suínos adultos, leitões, aves de corte, gado criado em sistema de confinamento e, também, na piscicultura. Para estes animais os probióticos favorecem o crescimento animal (função promotora de crescimento animal) e reduz o uso de antibióticos e outros medicamentos necessários a manutenção dos animais em condição saudável (SANTOS, GIL-TURNES, 2005; WANG et al 2007). A última função apresentada, redução do uso de medicamentos como antibióticos, faz com que a produção de carne, leite, ovos e outros subprodutos animais sejam isentos de resíduos de medicamentos que são detectáveis e proibidos na legislação de diversos países importadores de alimentos. Na formulação de probióticos são adicionados a rações e preparados microrganismos gerados por fermentação de cepas aceitas pela legislação de forma que preparação final contenha em sua composição microrganismos na concentração de 10 5 a 10 6 células/g que sejam capazes de resistir a ação dos fluidos digestivos de forma a chegarem ao trato gastrointestinal na forma ainda viável para VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 27 a 30 de julho de 2009 Uberlândia, Minas Gerais, Brasil

2 garantir a adesão dos mesmos as paredes do intestino (RAYMENT et al 2009; SOUZA, SAAD, 2009). Pelo fato da viabilidade celular do produto ser parcialmente perdida durante o processo de produção, armazenamento e ação dos fluidos biológicos o uso de células imobilizadas representa uma forma de melhorar a viabilidade celular do produto cada vez mais utilizada, sendo que entre as técnicas de imobilização o uso de alginato de cálcio é bastante difundida pelo fato do fato algínico ser aceito como aditivo alimentar seguro e ser, também, eficiente na imobilização celular.( PIMENTEL-GONZÁLEZ et al 2009; NUNES et al 2009; PAN et al 2009 ). Segundo a legislação brasileira, os microrganismo aceitos para formulação de probióticos devem apresentar efeito probiótico cientificamente comprovado. Entre os diversos microrganismos aceitos para tal fim estão diversos lactobacilos ( Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei shirota, Lactobacillus casei variedade rhamnosus, Lactobacillus casei variedade defensis Lactobacillus paracasei, entre outros ) e bifidobactérias ( Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animallis, Bifidobacterium longum entre outras). Assim como diversas outras fermentações a fermentação destinada a produção de microrganismos probióticos tem o interesse em utilizar com matérias primas subprodutos e resíduos agroindustriais potencialmente capazes de poluir o ambiente. Neste sentido o soro de leite representa um subproduto de grande interesse, pois o leite representa um dos segmentos mais importantes do agronegócio brasileiro e o uso deste leite na produção de queijos gera grandes volumes de soro. Parte signficativa do soro gerado vira efluente que pode ser aproveitado na produção de probióticos de forma a reduzir os custos destinados ao tratamento deste efluente, reduzir a poluição ambiental associada ao descarte inadequado. Assim, tem-se o aproveitamento do alto valor nutritivo do soro ( na forma líquida ele é uma a solução aquosa contendo 50 a 60 g/l de lactose, 8 a 10 g/l de proteína, 0,6 g/l de lipídeos e sais minerais) (ALMEIDA et al 2009; ALVES FILHO 2002; COUTINHO FILHO et al 2007). Este trabalho tem como objetivo avaliar a influência concentração de glicerina, soro e tempo de Fermentação nas características das células de probióticos imobilizadas em alginato de cálcio. Fermentações bateladas foram conduzidas em escala de bancada em incubador rotativo com movimento orbital e controle de temperatura a 35 C e 200 rpm. Nas diferentes fermentações foi utilizada uma concentração celular inicial entre 10 6 a 10 7 células/ml de Lactobacillus acidophilus em mutualismo com mesma quantidade de Streptococcus thermophilus. Foram realizadas fermentações em soro de leite contendo em oito condições diferentes e réplicas de algumas das condições. Tais condições representam a combinação de diferentes quantidades de aditivo, soro e tempo de fermentação. Foi feito o uso de glicerina para avaliar a atuação da mesma na conservação das células em duas concentração distintas 5 e 50% (m/v); o soro de leite foi avaliado na condição equivalente a uma pré-concentração e outra situação correspondente ao soro in natura (concentração de matéria sólida de 60 e 90g/L); e o tempo do processo foi avaliado para um e dois dias de fermentação. A Tabela 1 apresenta as condições utilizadas os diferentes experimentos. Tabela 1- ensaios fermentativos para produção de células probióticas Ensaio Glicerina (% m/v) Soro (g/l) Tempo (dias) Quantificação de células viáveis Foi utilizado o método do número mais provável com três tubos. O meio de cultura utilizado foi o MRS em frascos de penicilina de 10mL. Na leitura do número mais provável foi utilizado um intervalo de confiança de 95%. Também foram quantificadas as células por massa seca obtida pela secagem das células ressuspensas em água que foram geradas por centrifugação a 12000g (por 5 minutos) do meio fermentado. MATERIAIS E MÉTODOS 1 Processos Fermentativos 3 Imobilização celular e avaliação da estabilidade das células imobilizadas

3 Foi feita a imobilização das células em gel alginato de cálcio gerado pela mistura de alginato de sódio e cloreto de cálcio em um sistema contendo células fermentadas padronizadas por contagem e diluição. As células geradas após a fermentação foram adicionadas a uma solução de alginato de sódio a 1% e esta solução foi gotejada em uma solução de cloreto de cálcio (0,2mol/L), o que gerou a oclusão das células em alginato de cálcio (BAILEY,, OLLIS, 1986).. A estabilidade das células imobilizadas foi avaliada pela quantificação da viabilidade celular após tratamento térmico destinado a gerar condições aceleradas de morte celular. Este ensaio acelerado foi realizado a 65 C por um tempo de 15 minutos. 4 Secagem dos produtos Em cada fermentação foi realizada a padronização das condições iniciais em termos de número de células e ao fim de cada fermentação foi feita secagem por uso de ar a 47 C e 27m/s em um sistema com retenção das partículas (para evitar o arraste das mesmas) e, também, pelo uso de estufa da secagem com circulação forçada temperatura máxima inferior a 50 C. Os diferentes produtos gerados foram armazenados em temperatura ambiente para avaliação da qualidade comparativa final. Figura 1 Células imobilizadas em alginato (Foto: autores). A Figura 2 mostra os diferentes produtos obtidos e a Figura 3 a aparência dos mesmos quando observados em detalhe. 5 Avaliação da qualidade dos produtos Os produtos secos foram avaliados em termos de células viáveis após o armazenamento por três semanas e pela avaliação de células viáveis após o ensaio de degradação acelerada de células por tratamento térmico a 65 o C por 20 minutos. Figura 2 Células imobilizadas já secas (Foto: autores). RESULTADOS E DISCUSSÕES 1 Produção das células imobilizadas A Figura 1 apresenta a aparência das células geradas após a oclusão em alginato de cálcio. Nesta fase do processo foi constatado que as células se contaminam facilmente, sendo assim, é necessária a rápida secagem logo após o processo de imobilização. Figura 3 Células imobilizadas secas em detalhe (Foto: autores).

4 A Figura 4 apresenta o perfil de temperatura durante a secagem em estufa sem circulação forçada de ar. A umidade inicial das células imobilizadas foi de 93% e ao final do processo foi inferior a 10%. Pode-se observar pelo tempo de processo que a secagem é bastante lenta para estas condições. minutos para diferentes concentrações de glicerina e soro de leite. É possível observar a boa estabilidade do produto, pois mesmo as condições drásticas de temperatura para aceleração da morte celular, o número de células viáveis ao fim da desativação térmica ainda foi elevado. O tratamento térmico não mostrou aumento de estabilidade significativo proporcionado pela uso da glicerina. Figura 4 Perfil de temperatura durante a secagem em estufa 5 Viabilidade celular Ao fim das fermentações foram obtidas concentrações celulares superiores a 7g/L, a Figura 5 mostra o número mais provável gerado nas diferentes fermentações. As fermentações que tiveram o menor crescimento, fermentações de número 7 e 8 são aquelas que utilizaram maior concentração de glicerina e menor tempo, ou seja, o tempo de fermentação não foi favorável para estas condições. Foi possível constatar também a ação inibitória do crescimento celular pela adição de glicerina na concentração de 50%. Figura 6 Crescimento celular após tratamento térmico a 65 C em dez ensaios CONCLUSÕES Neste presente trabalho é possível concluir que as diferentes fermentações estudadas mostraram-se satisfatórias na geração de células imobilizadas. O processo de secagem é uma etapa fundamental para evitar contaminações. A pré-concentração do soro não é uma opção capaz de gerar células mais estáveis e maior crescimento celular quando comparada com a concentração de soro normal, apesar de ter apresentado resultados satisfatórios. Há a necessidade de ensaios adicionais para melhor avaliação da estabilidade do produto e ação da glicerina nesta estabilidade. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Figura 5 Viabilidade celular nos diferentes ensaios 6 Estabilidade do produto A Figura 6 mostra as atividades celulares relativos após o tratamento térmico a 65ºC por 35 ALMEIDA, K.ETAMIME,. A.Y. OLIVEIRA, M.N. (2009) Influence of total solids contents of milk whey on the acidifying profile and viability of various lactic acid bacteria LWT - Food Science and Technology, Volume 42, Issue 2, p ALVES FILHO, M. A nata do soro, Jornal da Universidade Estadual de Campinas, p.2, 14 a 20 de outubro de BAILEY, J. E., OLLIS, D. F. (1986). Biochemical

5 engineering fundamentals (2 nd ed.). New York: McGraw-Hill. COUTINHO FILHO, U.; SANTOS, A. B.; CARDOSO, V. L. (2007) Estudo da desativação térmica de simbiótico de uso veterinário XVI Simpósio Nacional de Bioprocessos, p RAYMENT, P. WRIGHT, P.; HOAD, C.; CIAMPI, E. HAYDOCK, D.; GOWLAND, P.; BUTLER, M.L F. (2009) Investigation of alginate beads for gastro-intestinal functionality, Part 2: In vivo characterization Food Hydrocolloids, Volume 23, Issue 3, p NUNES, A. D.,HUEZA, I. M. RASPANTINI, L. E. R. ALBUQUERQUE, R.. (2009) Investigation of alginate beads for gastrointestinal functionality, Part 1: In vitro characterization Food Hydrocolloids, Volume 23, Issue 3, p NUNES, A. D.,HUEZA, I. M. RASPANTINI, L. E. R. ALBUQUERQUE, R. (2009) Protection of Lactobacillus acidophilus from bile salts in a model intestinal juice by incorporation into the inner-water phase of a W/O/W emulsion PIMENTEL-GONZÁLEZ,D.J. CAMPOS- MONTIEL, R.G. LOBATO-CALLEROS, C. PEDROZA-ISLAS,R. VERNON- CARTE.J. (2009) Encapsulation of Lactobacillus rhamnosus in double emulsions formulated with sweet whey as emulsifier and survival in simulated gastrointestinal conditions, Food Research International, Volume 42, Issue 2, p SANTOS, J. R. G.; GIL-TURNES, C. (2005) Probióticos em avicultura. Ciência Rural, Santa Maria, v.35, n.3, p SOUZA, C. H.B. SAAD, S.M.I. (2009) Viability of Lactobacillus acidophilus La-5 added solely or in co-culture with a yoghurt starter culture and implications on physico-chemical and related properties of Minas fresh cheese during storage LWT - Food Science and Technology, Volume 42, Issue 2, p WANG, YAN-BO; HAN JIAN-ZHONG (2007) The role of probiotic cell wall hydrophobicity in bioremediantion of aquaculture Aquaculture, v. 269, p PAN, X;CHEN,F; WU,T.; TANG,H; ZHAO,Z. (2009) The acid, bile tolerance and antimicrobial property of Lactobacillus acidophilus NIT Food Control, Volume 20, Issue 6, p