EPIDEMIOLOGIA DA TOXOPLASMOSE EM ANIMAIS DOMÉSTICOS DE DIFERENTES REGIÕES DO ESTADO DE SÃO PAULO

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1 Débora Picanço Aureliano EPIDEMIOLOGIA DA TOXOPLASMOSE EM ANIMAIS DOMÉSTICOS DE DIFERENTES REGIÕES DO ESTADO DE SÃO PAULO Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências da Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo para obtenção do Título de Mestre em Ciências. Área de Concentração: Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública Orientador: Prof. Dr. José Eduardo Tolezano São Paulo 2009

2 FICHA CATALOGRÁFICA Preparada pelo Centro de Documentação Coordenadoria de Controle de Doenças/SES-SP reprodução autorizada pelo autor, desde que citada a fonte Aureliano, Débora Picanço Epidemiologia da toxoplasmose em animais domésticos de diferentes regiões do Estado de São Paulo Débora Picanço Aureliano - São Paulo, Dissertação (mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Ciências da Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo. Área de concentração: Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública Orientador: José Eduardo Tolezano 1. Toxoplasma 2. Epidemiologia 3. Animais domésticos 4. Testes sorológicos/métodos 5. Vigilância de evento sentinela SES/CCD/CD-217/09

3 DEDICATÓRIA Este trabalho é dedicado aos que amo incondicionalmente: Minha querida mãe Irene,meu pai José,minha vóvis Dona Rosa e aos meus queridos e estimados irmãos Fê e Edu. Aos meus imprescindíveis e pra lá de bem humorados amigos Islane e Rogério, que sem a força dessa GRANDE amizade, durante essa jornada, eu não teria conseguido. Vocês fazem com que eu acredite que estou lutando por uma vida menos ordinária! Aquele que plantou fundo o grão da ciência e da pesquisa em minha vida Prof. Dr. Ângelo Carpinelli. O senhor me transformou numa pessoa muito melhor, pois me fez entender que eu posso. Obrigado!

4 PREFÁCIO A vida não é fácil para nenhum de nós. Mas e daí? Nós devemos ter perseverança e sobretudo a confiança em nós. Devemos acreditar que nós seremos agraciados por algo e que esta coisa deve ser alcançada." Marie Sklodowska-Curie

5 AGRADECIMENTOS Minha querida mãe sempre me diz que ser grato é uma das coisas mais importantes da vida. Reconhecer que nunca estamos sozinhos e que precisamos estender a mão e encontrar outra em apoio é fundamental para tudo! Por isso AGRADEÇO a TODOS, que me ajudaram no desenvolvimento desse projeto e principalmente: Ao Instituto Adolfo Lutz e Seção de Parasitoses Sistêmicas que me acolheu no desenvolvimento desse trabalho. Ao Prof. Dr. José Eduardo Tolezano, pela orientação científica, e principalmente por ter me estendido a mão em um momento de dificuldade. Obrigada. Ao Prof. Dr. Roberto Mitsuyoshi Hiramoto, por toda orientação científica imprescindível, por me transmitir conhecimento, acreditar em mim, me dar oportunidades e lições de vida! Mas do que um orientador, um mestre, um grande amigo! Ao Prof. Dr. Heitor Franco de Andrade Junior, por toda orientação científica fundamental ao desenvolvimento deste trabalho. Ao Msc.Thiago Martini Pereira, o Thi, meu amado, amigo e companheiro. Por todos os momentos em que necessitei e você sempre esteve lá, me apoiando, acalmando, ouvindo, ajudando e principalmente amando. Muito obrigado meu amor! Ao Massami Kawarabayashi, o Mário San, pelos ensinamentos transmitidos desde o meu ingresso como aprimoranda até o mestrado. Obrigado pela paciência, carinho e amizade.

6 À Roselaine Pereira Alvim Cardoso, a Rose, do Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo, pelos ensinamentos transmitidos, por poder contar com sua valiosa ajuda e principalmente pela amizade. À Maria Lúcia Raymundo, a Lucinha, pelo apoio técnico imprescindível e pela grande amizade. À Helena Hilome Tanigushi, pelo apoio técnico de campo, toques profissionais, ajuda na revisão do trabalho. Pela amizade, risadas e balas. À equipe de campo, Rui Larosa, Carlos Roberto Elias, José Eduardo Raeffray Barbosa, José Augusto Raeffray Barbosa e Edson Bueno dos Anjos, pelo apoio técnico na coleta do material utilizado nesse trabalho. À Maria Cristina Gomes Carvalho, a Cris, pelo apoio técnico no desenvolvimento desse trabalho. À Kelly de Souza Siqueira, Keli Qui, pelo apoio técnico fundamental nos momentos de correria, pelo companheirismo, amizade e risadas. À Patrícia de Araújo Santos, pelo apoio técnico no desenvolvimento desse trabalho. À Thaís Alves da Costa, pelo apoio técnico no desenvolvimento desse trabalho. À Alessandra Gutierres, a Alê, por me ajudar na fundamental revisão de texto. Pelo companheirismo, compreensão, ombro de todas as horas e pela muitas gargalhadas e grande amizade. Obrigada!!! Ao Sansão da Rocha Westphalen, pelas fotos gentilmente tiradas para este trabalho.

7 Aos estimados amigos conquistados nesses anos de Lutz: Gabriela, Kelly, Alessandra, Isabelle, Thaís, Cristina, Fábio, Jefferson, Rafael, Juliana, Patrícia, Maíra. Valeu pela amizade e por todas as risadas. Essa caminhada foi ainda melhor com vocês ao meu lado! Ao Prof. Dr. Antonio Marcos de Apparecida Levy, pela ajuda na revisão final do texto e por alguns conselhos importantíssimos num momento especialmente difícil. Obrigada. Aos membros da banca de qualificação, Prof.ª Dr.ª Adriana Pardini Vicentini Moreira, Prof.ª Dr.ª Aparecida Helena de Souza Gomes e Prof. Dr. Heitor Franco de Andrade Junior, pelas valiosas sugestões que enriqueceram este trabalho. Às diferentes equipes dos Centros de Controle De Zoonoses de Caraguatatuba, Bauru, Itupeva, Sorocaba e Mogi das Cruzes, pelo apoio técnico. À CAPES, pelo apoio financeiro deste projeto. E por fim a todos que direta ou indiretamente auxiliaram na realização deste projeto.

8 Débora Picanço Aureliano teve bolsa de estudo cedida pela Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Este trabalho teve apoio financeiro da Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

9 RESUMO Toxoplasma gondii é um coccídio conhecido por causar doenças de impacto em saúde pública. Seu ciclo biológico inclui animais silvestres, domésticos e o homem como hospedeiros. De maneira geral a toxoplasmose pode ser adquirida como resultado de costumes e comportamentos que incluem tanto ingestão de carne crua ou mal cozida, contendo cistos teciduais, quanto o contato com meio ambiente contaminado por oocistos. Entre os animais domésticos, cães e eqüinos atuam como hospedeiros intermediários de T. gondii. Os cães, por serem onívoros, podem ser utilizados como prováveis indicadores da contaminação ambiental e conseqüentemente de risco da contaminação humana. De outra parte, os eqüinos, por apresentarem hábito alimentar menos diversificado, podem auxiliar na verificação da possível contaminação do solo, pastos e água. Neste estudo objetivou-se determinar e analisar a prevalência da infecção por T. gondii entre cães errantes das cidades de Caraguatatuba (302), Bauru (171), Itupeva (60), Sorocaba (50) e Mogi das Cruzes (99) e de eqüinos do município de Caraguatatuba (89). Para tanto foram utilizadas as técnicas de Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), Aglutinação Modificada (MAT) e Ensaio Imunoenzimático (ELISA) com intervalo de confiança de 95%. Na RIFI foram observados os seguintes valores de soroprevalência de anticorpos anti-t. gondii em amostras caninas: 59,60% (180) em Caraguatatuba; 46,67% (28) em Itupeva; 30,18% (51) em Bauru; 16% (8) em Sorocaba e 19,19% (19) em Mogi das Cruzes. Nos eqüinos a RIFI revelou uma soroprevalência de 24,7% (22). No teste de ELISA a soropositividade canina foi: 57,3% (173) em Caraguatatuba; 43,33% (26) em Itupeva; 43,2% (73) em Bauru, 14% (7) em Sorocaba e 13,13% (13) em Mogi das Cruzes enquanto os eqüinos apresentaram 31,5% (28). O teste MAT foi aquele que revelou maior soropositividade entre os animais de todos os municípios. Tanto o ELISA como o MAT apresentaram boa sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo comparados com a RIFI, teste gold standard nesse estudo.

10 ABSTRACT Toxoplasma gondii is a coccidian knew to cause diseases of high impact on the public health. Its biological cycle includes wild and domestic animals and the man as hosts. The toxoplasmosis may be acquired mainly by habits and behaviors such as consumption of raw or undercooked meat with tissue cysts and contact with environment contaminated by oocysts. Among the domestic animals, dogs and horses are intermediate hosts of T. gondii. The dogs, being omnivorous, can be used as indicators of environmental contamination and consequently the risk of human contamination.the equids present less diversity feed and might help to check the contamination of soil, pasture and water. The aim of this study was to analyze the prevalence of infection by T. gondii in stray dogs of counties from Caraguatatuba (302), Bauru (171), Itupeva (60), Sorocaba (50) and Mogi das Cruzes (99) and the equids from Caraguatatuba (89). Indirect Immunofluorescence (IFI), Enzymatic Assay (ELISA) and Modified Agglutination Test (MAT) were used to measure the prevalence of T. gondii infection with 95% confidence interval. The immunologic tests were standardized for each species using appropriate and reproducible indices. Using the IFI was observed the following values of anti-t. gondii antibodies seroprevalence on canine samples: 59,60% from Caraguatatuba; 46,67% from Itupeva; 30,18% from Bauru; 16% from Sorocaba and 19,19% from Mogi das Cruzes and on equids revealed a seroprevalence of 24,7%. Canine seropositivity by ELISA was 57,28% from Caraguatatuba; 43,33% from Itupeva; 43,2% from Bauru; 40% from Sorocaba and 32,32% from Mogi das Cruzes while the equids revealed 31,5%. MAT was the test that showed highest seropositivity among the animals from all counties. ELISA and MAT showed good sensibility, specificity, positive predictive value and negative predictive value that compared with IFI, the gold standard test in this study.

11 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal CCZ- Centro de Controle de Zoonoses D.O. Densidade ótica ELISA Enzime Linked Immuno Sorbent Assay (Ensaio Enzimático) et al. e colaboradores FITEC Isotiocianato de fluoresceína g aceleração da gravidade g gramas HAART Highly active antiretroviral therapy (terapia anti-retroviral) Hab habitantes HIV Human immunodeficiency virus (vírus da imunodeficiência humana) I.P. - Intraperitoneal IBGE - Instituto brasileiro de geografia e estatística RIFI Reação de Imunofluorescência Indireta M - Molar MAT Técnica de aglutinação modificada mm Milimetros NaCl Cloreto de sódio PBS Tampão fosfato salino PBSTL - Tampão fosfato salino contendo detergente Tween 20 e leite ph Concentração de hidrogênio iônico IC Intervalo de Confiança

12 LISTA DE TABELAS E FIGURAS Figura 1: Esquema representativo das formas do T. gondii...20 Figura 2: Ciclo biológico do T. gondii...22 Figura 3: Mapa do Estado de São Paulo com os Municípios...45 Figura 4: Esquema da lâmina para Reação de Imunofluorescência Indireta com as diluição utilizadas para amostras caninas...51 Figura 5: Esquema da lâmina para Reação de Imunofluorescência Indireta com as diluição utilizadas para amostras eqüinas...51 Figura 6: Controle Positivo da Reação de Imunofluorescência Indireta...53 Figura 7: Controle Negativo da Reação de Imunofluorescência Indireta...53 Figura 8: Foto da placa com o esquema do MAT...56 Figura 9: Soroprevalência de anticorpos IgG anti-t. gondii em cães provenientes do município de Caraguatatuba, Estado de São Paulo, coletados nos anos de 2006 a 2008, detectados por RIFI, ELISA e MAT...58 Figura 10: Distribuição das amostras de soros caninos, provenientes dos municípios de Caraguatatuba, Bauru, Itupeva, Sorocaba e Mogi das Cruze...59 Tabela1: Detecção de anticorpos IgG anti-t. gondii, pelo método da Imunofluorescência Indireta segundo título de anticorpos (1/16 e 1/1024), nos soros de cães do município de Caraguatatuba, São Paulo, Tabela 2: Detecção de anticorpos IgG anti-t. gondii, utilizando o MAT, segundo título de anticorpos (1/16, 1/256, 1/1024, 1/2048, 1/4096), em soros de cães do município de Caraguatatuba, São Paulo, Figura 11: Soroprevalência de anticorpos IgG anti-t. gondii em eqüinos provenientes do município de Caraguatatuba, Estado de São Paulo, coletados no ano de 2008, detectados por RIFI, ELISA e MAT...61 Tabela 3: Detecção de anticorpos IgG anti-t. gondii, pela técnica de Imunofluorescência Indireta, segundo título de anticorpos (1/16, 1/256, 1/1024, 1/2048, 1/4096), em soros de eqüinos do município de Caraguatatuba, São Paulo, Tabela 4: Detecção de anticorpos IgG anti-t. gondii, utilizando o MAT, segundo título de anticorpos, em soros de eqüinos do município de Caraguatatuba, São Paulo,

13 Figura 12: Soroprevalência de anticorpos IgG anti-t. gondii em cães provenientes do município de Bauru, Estado de São Paulo, coletados nos anos de 2007 e 2008, detectados por RIFI, ELISA e MAT...63 Tabela 5: Detecção de anticorpos IgG anti-t. gondii, utilizando a técnica de Imunofluorescência Indireta, segundo título de anticorpos (1/16, 1/1024), em soros de cães do município de Bauru, São Paulo, Tabela 6: Detecção de anticorpos IgG anti-t. gondii, utilizando o MAT, segundo título de anticorpos (1/16, 1/256, 1/1024, 1/2048, 1/4096), em soros de cães do município de Bauru, São Paulo, 2007 e Figura 13: Soroprevalência de anticorpos IgG anti-t. gondii em cães provenientes do município de Itupeva, Estado de São Paulo, coletados nos anos de 2007 e 2008, detectados por RIFI, ELISA e MAT...65 Tabela 7: Detecção de anticorpos IgG anti-t. gondii, através da Reação de Imunofluorescência Indireta segundo título de anticorpos (1/16, 1/1024), em soros de cães do município de Itupeva, São Paulo, 2007 e Tabela 8: Detecção de anticorpos IgG anti-t. gondii, utilizando o MAT, segundo título de anticorpos (1/16, 1/256, 1/1024, 1/2048, 1/4096), em soros de cães do município de Itupeva, São Paulo, Figura 14: Soroprevalência de anticorpos IgG anti-t. gondii em cães provenientes do município de Sorocaba, Estado de São Paulo, coletados no ano de 2007, detectados por RIFI, ELISA e MAT...67 Tabela 9: Detecção de anticorpos IgG anti-t. gondii, utilizando a técnica de Imunofluorescência Indireta segundo título de anticorpos (1/16, 1/1024), em soros de cães do município de Sorocaba, São Paulo, Tabela 10: Detecção de anticorpos IgG anti-t. gondii, utilizando o MAT, segundo título de anticorpos (1/16, 1/256, 1/1024, 1/2048, 1/4096), em soros de cães do município de Sorocaba, São Paulo, Figura 15: Soroprevalência de anticorpos IgG anti-t. gondii em cães provenientes do município de Mogi das Cruzes, Estado de São Paulo, coletados no ano de 2006, detectados por RIFI, ELISA e MAT...69 Tabela 11: Detecção de anticorpos IgG anti-t. gondii, pela técnica de Imunofluorescência Indireta segundo título de anticorpos (1/16, 1/1024), em soros de cães do município de Mogi das Cruzes, São Paulo, Tabela 12: Detecção de anticorpos IgG anti-t. gondii, utilizando o MAT, segundo título de anticorpos (1/16, 1/256, 1/1024, 1/2048, 1/4096), em soros de cães do município de Mogi das Cruzes, São Paulo,

14 Tabela 13: Detecção de anticorpos IgG anti-t. gondii, utilizando a RIFI, segundo título de anticorpos (1/16 e 1/1024), nos soros de cães provenientes dos municípios de Caraguatatuba, Bauru, Itupeva, Sorocaba e Mogi das Cruzes, São Paulo...71 Tabela 14: Detecção de anticorpos IgG anti-t. gondii, utilizando o MAT, segundo título de anticorpos (1/16, 1/256,1/1024, 1/2048 e 1/4096), nos soros de cães provenientes dos municípios de Caraguatatuba, Bauru, Itupeva, Sorocaba e Mogi das Cruzes, São Paulo...72 Figura 16: Soroprevalência de anticorpos IgG anti-t. gondii, detectados por RIFI, em cães provenientes dos municípios de Caraguatatuba, Bauru, Itupeva, Sorocaba e Mogi das Cruzes, Estado de São Paulo, coletados entre os anos de 2006 e Figura 17: Soroprevalência de anticorpos IgG anti-t. gondii, detectados por ELISA, em cães provenientes dos municípios de Caraguatatuba, Bauru, Itupeva, Sorocaba e Mogi das Cruzes, Estado de São Paulo, coletados nos anos de 2006 a Figura 18: Soroprevalência de anticorpos IgG anti-t. gondii,detectados por MAT, em cães provenientes dos municípios de Caraguatatuba, Bauru, Itupeva, Sorocaba e Mogi das Cruzes, Estado de São Paulo, coletados no ano de 2007 e Tabela 15: Correlação entre os resultados obtidos por RIFI, ELISA e MAT, com o sexo dos cães...77 Figura 19: Concordância entre RIFI, ELISA e MAT, nas amostras dos cães dos municípios de Caraguatatuba, Bauru, Itupeva, Sorocaba e Mogi das Cruzes, Estado de São Paulo, coletados nos anos de 2006 a Figura 20: Índices de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativos do ELISA e MAT em relação ao teste gold standard RIFI...79

15 1. INTRODUÇÃO Histórico Morfologia e ciclo biológico Toxoplasmose em Humanos Toxoplasmose Congênita Toxoplasmose Ocular Toxoplasmose em Paciente Imunocomprometido Infecções por Toxoplasma gondii em Animais Toxoplasmose em Suínos Toxoplasmose em Ovinos Toxoplasmose em Caprinos Toxoplasmose em Bovinos Toxoplasmose em Felinos Toxoplasmose em Equinos Toxoplasmose em Cães Diagnóstico Laboratorial Diagnóstico por Métodos Sorológicos Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) Ensaio Imunoenzimático (ELISA) Teste de Aglutinação Modificado (MAT) Hemaglutinação Indireta (HI) Teste de Sabin-Feldman Diagnóstico por Método Molecular Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) Diagnóstico por Métodos Parasitológicos Diagnóstico Histológico Isolamento do Toxoplasma Isolamento de Oocisto OBJETIVOS Objetivo Geral Objetivos Específicos MATERIAL E MÉTODOS Características geo-climáticas e econômico-produtivas dos municípios estudados... 43

16 3.2. Coleta de Amostras Animais de Experimentação Cepas de Toxoplasma gondii Manutenção e obtenção da Cepa RH e ME Taquizoítos Peritoneais da Cepa RH tipo I Purificação dos Parasitas Cistos Teciduais Produção de Antígenos de T. gondii para RIFI, ELISA e MAT Antígeno Formolizado de T. gondii para Reação de Imunoflorescência Indireta - RIFI Antígeno Lisado Bruto de T. gondii para Ensaio Imunoenzimatico ELISA Antígeno Formolizado de T. gondii para Reação de Aglutinação Modificada MAT Descrição das Reações Sorológicas Reação de Imunofluorescência Indireta RIFI Reação Imunoenzimática ELISA Técnica de Aglutinação Modificada MAT Análise Estatística RESULTADOS Resultado da Soroprevalência das Amostras de Cães dos Municípios de Caraguatatuba, Bauru, Itupeva, Sorocaba e Mogi das Cruzes Análises dos Animais do Município de Caraguatatuba Análise dos Soros de Cães Análise dos Soros de Eqüinos Análises dos Animais do Município de Bauru Análises dos Animais do Município de Itupeva Análises dos Animais do Município de Sorocaba Análises dos Animais do Município de Mogi das Cruzes Resultados da Soroprevalência Através dos Títulos de RIFI e MAT nos Soros de Cães dos Municípios de Caraguatatuba, Bauru, Itupeva, Sorocaba e Mogi das Cruzes Análise Estatística das Amostras de Cães... 72

17 Análise das Amostras pela Reação de Imunofluorescência Indireta - RIFI Análise das Amostras pelo Ensaio Imunoenzimatico - ELISA Análise das Amostras pela Reação de Aglutinação Modificada MAT Análise Estatística das Amostras Correlacionadas ao Sexo Análise Estatística da Concordância entre RIFI, ELISA e MAT Análise dos Indicadores de Desempenho dos Testes Imunológicos ELISA e MAT DISCUSSÃO CONCLUSÃO BIBLIOGRAFIA ANEXOS Anexo 1 Aprovação de Ética em Pesquisa do Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo Anexo - Trabalhos Científicos Públicados Anexo - Trabalho Científico em Redação...106

18 1. INTRODUÇÃO 1.1. Histórico Toxoplasma gondii é um protozoário da ordem Eucoccidia que tem como hospedeiro definitivo os felinos e os outros animais de sangue quente como hospedeiros intermediários (Frenkel et al., 1970). T. gondii foi descrito na Tunísia por Nicolle e Manceaux, em 1908, ao encontrar um roedor (Ctenodactylus gondii) infectado, e, quase simultaneamente, por Afonso Splendore, no Brasil, em coelhos mantidos em laboratório (Coura, 2005; Souza et al., 2009). No Brasil, importantes contribuições relacionadas ao parasita, doença e diagnóstico foram acrescentadas por Torres, em 1927, que fez as primeiras descrições anatomo-patológicas da doença, e por Delascio, em 1956, com detalhadas informações sobre a forma congênita (Coutinho e Vergara, 2005). Entretanto, a frequência da infecção humana só foi descoberta a partir de 1948, com a introdução do teste de Sabin - Feldman. Essa reação ajudou tanto na realização de inquéritos epidemiológicos, como no diagnóstico sorológico da toxoplasmose. Neste mesmo ano, Frenkel introduziu o teste de sensibilidade cutânea à toxoplasmina. Em 1957 foi introduzida a reação de hemaglutinação pelos pesquisadores Jacob e Lunde. Em 1962 o clássico teste de imunofluorescência indireta foi desenvolvido por Kelen (Amato Neto et al., 1995) Morfologia e ciclo biológico T. gondii é um parasita cosmopolita e que se encontra amplamente distribuído em quase todas as regiões do mundo. Esse protozoário é capaz de infectar uma excepcional e ampla gama de hospedeiros, tanto quanto diferentes células nucleadas e tecidos (Tenter et al., 2000; Dubey e Beattie, 1988). Os coccídeos em geral possuem ciclos de vida complexos, sendo transmitidos por ciclos feco-oral. T. gondii pode também ser transmitido via transplacentária, por carnivorismo, transplante de órgãos e contato com sangue (Dubey, 2004). 18

19 Existem três formas infectantes para todos os hospedeiros: taquizoítos (livres), bradizoítos (dentro de cistos teciduais) e os esporozoítos (dentro de oocistos), como mostra a Figura 1 (Tenter et al., 2000; Dubey, 1996). Os taquizoítos geralmente possuem o formato de lâmina crescente e medem 2 µm de largura por 6 µm de comprimento. São considerados formas rápidas de multiplicação, entrando nas células hospedeiras por penetração ativa através da membrana celular. Os taquizoítos multiplicam-se assexuadamente por repetidas divisões (endodiogenia) até que a célula do hospedeiro se rompa. Após um desconhecido número de divisões, os taquizoítos atingem outro estágio chamado cisto tecidual (Tenter et al., 2000; Dubey et al., 1998). Esses cistos teciduais crescem e se mantêm intracelular. Eles possuem uma variação de tamanho dos 5 ao 70 µm de diâmetro. Podem possuir em seu interior, dependendo do seu tempo de desenvolvimento, de duas a algumas centenas de bradizoítos. Embora esses cistos possam se desenvolver em órgãos como pulmões, fígado e rins, eles são mais prevalentes em tecido neural e muscular, incluindo cérebro, olhos, músculo cardíaco e esquelético. Os cistos teciduais alojados e intactos dentro do hospedeiro não causam nenhum dano e podem permanecer por toda a vida do mesmo sem causar resposta do sistema imunológico (Tenter et al., 2000; Dubey et al., 1998). Os cistos teciduais estão presentes nas infecções crônicas e congênitas (Duarte e Andrade Jr., 1994). Dentro dos cistos teciduais encontram-se os bradizoítos, que possuem formato de lâmina crescente, medindo 7 µm de largura x 1,5 µm espessura. Os bradizoítos são morfologicamente similares ao taquizoítos, diferindo em algumas características: seu núcleo encontra-se posicionado na parte posterior do parasita enquanto que nos taquizoítos o núcleo tem posição mais central, além de apresentarem forma de multiplicação bem mais lenta que os taquizoítos. Os bradizoítos são mais delgados que os taquizoítos e menos suscetíveis a destruição por enzimas proteolíticas (Dubey, 2004; Hill et al., 2005). Os oocistos são as formas de resistência ambiental no ciclo de vida dos coccídeos. Os oocistos do T. gondii são formados somente nos felinos, seus hospedeiros definitivos. Essas formas medem 10 µm x 12 µm de diâmetro e, 19

20 quando esporulados, contêm em seu interior dois esporocistos com quatro esporozoítos cada, podendo permanecer viáveis no meio ambiente por longos períodos em condições adversas, que variam de meses a anos (Hill e Dubey, 2002; Speer et al., 1998). Os gatos eliminam nas fezes os oocistos após a ingestão de qualquer uma das formas infectivas (taquizoítos, bradizoítos ou esporozoítos) (Speer et al., 1998; Weiss et al., 2000). Porém, menos de 30% deles liberam oocistos após a ingestão de taquizoítos ou bradizoítos, enquanto que praticamente todos os felinos que ingerem cistos teciduais liberam oocistos no meio ambiente (Dubey e Frenkel, 1976; Speer et al., 1998). Figura 1 Formas infectantes do T. gondii. A Taquizoítos; B Cisto Tecidual; C Cisto Tecidual; D Merozoítos; E Gametas; F Oocisto não esporulado; e G Oocisto esporulado. Fonte: Hill et al., O ciclo biológico do T. gondii é heteroxênico facultativo. Além do gato, seu hospedeiro definitivo, esse ciclo inclue hospedeiros intermediários dentre os quais podemos citar o homem, aves, canídeos, ovinos, caprinos e bovinos (Figura 2). Muitos autores relatam uma gama imensa de animais silvestres (Dubey e Jones, 2008), o que enfatiza sua característica de zoonose e importância médica mundial (Dubey e Jones, 2008). A fase sexuada do ciclo ocorre quando o gato jovem tem seu primeiro contato com o protozoário por meio da ingestão de cistos teciduais. As paredes destes cistos são digeridas por enzimas proteolíticas no estômago e intestino delgado do gato. Os bradizoítos liberados penetram nas células epiteliais do 20

21 intestino delgado dando início ao desenvolvimento de várias fases assexuadas e originando os gametas masculinos e femininos. Ao ocorrer a fertilização do gameta feminino pelo masculino, inicia-se a formação da parede do oocisto em volta do gameta fertilizado. Assim que os oocistos tornam-se maduros, são liberados pela ruptura das células epiteliais no lúmen do intestino do animal (Hill et al., 2005; Dubey, 1998; Tenter et al., 2000). Os oocistos são liberados nas fezes por um período curto (1-2 semanas) da vida dos felinos, contudo o número enorme de oocistos veiculados pelas fezes garante uma contaminação ambiental eficiente (Hill e Dubey, 2000). Nos hospedeiros intermediários, a infecção pode acontecer pela ingestão de oocistos maduros encontrados no solo, verduras, água e por carnes mal cozidas ou cruas contendo cistos teciduais com bradizoítos. Os parasitas penetram no intestino do hospedeiro e iniciam um processo de multiplicação assexuada dentro do vacúolo parasitóforo denominado endodiogenia, processo pelo qual cada núcleo divide-se formando duas células-filhas enquanto o resto da célula mãe se degenera. Estas se multiplicam rapidamente até a ruptura da célula hospedeira liberando os taquizoítos para invadir outras células. Com o desenvolvimento da resposta imune-humoral, ocorre a lise de taquizoítos extracelulares por meio de uma combinação de anticorpos e complemento (Beaman et al., 1995). Alguns parasitas intracelulares podem permanecer por algum tempo na medula espinhal e no cérebro (Dubey, 1993). 21

22 Figura 2 - Ciclo biológico do T. gondii. Fonte: Hill et al.,

23 1.3. Toxoplasmose em Humanos A infecção em humanos está amplamente difundida e sua prevalência varia com a localidade e o aumento da idade dos indivíduos expostos. Nos Estados Unidos e na Inglaterra, estima-se que 16 a 40% da população encontram-se infectada (Dubey e Beattie, 1988), enquanto que na América Central, América do Sul e no continente Europeu, a taxa de prevalência varia entre 50 a 80% (Dubey e Beattie, 1988; Tenter et al., 2000; Jones et al., 2001). A infecção em adultos saudáveis costuma ser assintomática. Porém, uma pequena parcela destes indivíduos desenvolve sinais clínicos da doença e graves enfermidades. Ainda é desconhecido se a severidade da toxoplasmose em hospedeiros imunocompetentes é devido ao tipo de cepa do parasita, variabilidades nos hospedeiros ou outros fatores ainda não estudados (Dubey e Jones, 2008). Acredita-se que um indivíduo infectado permanecerá por toda sua vida nessa condição e a menos que algum tipo de imunossupressão ocorra em seu organismo, manifestando a reativação do parasita, a grande probabilidade é de que esse indivíduo permaneça assintomático (Dubey e Jones, 2008, Hill et al., 2005; Dubey, 2004; Frenkel, 1970). Estudos indicam que a toxoplasmose crônica em pacientes imunocompetentes pode influenciar no desenvolvimento de esquizofrenias (Yolken e Torrey, 2008), no desempenho motor dos indivíduos parasitados (Flegr, 2007), no auto-controle psicológico e na auto-imagem de pacientes de ambos os sexos (Lindová et al., 2006). No Brasil, a primoinfecção, na maioria das vezes, ocorre na primeira década da vida, sendo assintomática nos indivíduos imunocompetentes em 80-90% dos casos (Remington, 1974). As manifestações clínicas costumam ser, em geral, a associação de linfodenopatia com febre, fadiga, dores musculares, dor de garganta e dores de cabeça (Dubey e Jones, 2008; Dubey 2004, Hill et al. 2005, Coura, 2005; Montoya e Liesenfeld, 2004; Okolo, 1985; Durlach et al. 2003). Contudo, podem ocorrer manifestações graves da doença, sendo classificadas em: toxoplasmose congênita, adquirida ou reativada em pacientes imunocomprometidos e toxoplasmose ocular em pacientes imunocompetentes (Montoya, 2002). 23

24 Toxoplasmose Congênita Toxoplasmose congênita geralmente ocorre quando a mulher é infectada pelo T. gondii durante a gravidez. O risco da infecção congênita de grande severidade é maior quando ocorre no primeiro trimestre da gestação e diminui quando a infecção ocorre durante o terceiro trimestre. A infecção congênita pode permitir uma ampla variedade de manifestações no feto e no recémnascido incluindo aborto espontâneo, natimortos e graves seqüelas da infecção aguda intra-uterina (Hill et al., 2005; Dubey e Jones, 2008; Coura, 2005) Nas crianças que sofreram infecção congênita, a manifestação mais leve consiste na quase imperceptível diminuição da visão, ao passo que crianças gravemente afetadas podem desenvolver sintomas clássicos definidos como tétrade de Sabin que são a retinocoroidite, hidrocefalia, convulsões e calcificações intracerebrais. (Hill et al., 2005; Dubey e Jones, 2008; Coura, 2005; Montoya e Liesenfeld, 2004). Os nascidos nessa condição, mas sem manifestações graves, na maioria das vezes são aparentemente saudáveis, embora exista a necessidade de acompanhamento clínico e laboratorial, porque é grande a probabilidade de manifestarem sintomas e sinais clínicos de toxoplasmose congênita (Bosch- Driessen et al., 2002; Coura, 2005). No Brasil, a ocorrência de toxoplasmose congênita varia de 0,2 a 2% (Neto et al., 2000). Entretanto, um estudo realizado na região noroeste do estado do Rio Grande do Sul, composto por gestantes, mostrou que a taxa total de transmissão congênita da infecção por T. gondii foi de 6% num grupo de 50 dessas mulheres, sendo que 2% das crianças após o nascimento apresentaram sintomatologia característica da infecção congênita (Spalding et al., 2003). No estado de São Paulo, região metropolitana, estima-se que nascem cerca de 230 a 300 crianças infectadas por ano, ou seja, provavelmente cerca de 1 a cada 1000 partos (Guimarães et al., 1993) Toxoplasmose Ocular A retinocoroidite é a lesão mais freqüentemente associada à toxoplasmose. É a conseqüência de uma infecção aguda com a presença de 24

25 taquizoítos ou crônica com a presença de cistos contendo bradizoítos localizados na retina. A toxoplasmose ocular ativa consiste em um foco coagulativo e necrótico bem definido na retina. Além disso, pode estar presente uma inflamação difusa da retina e da coróide (Neves, 2005). As coriorretinites toxoplásmicas podem ser observadas em pacientes que adquiriram a toxoplasmose após o nascimento ou congenitamente como resultado da infecção aguda ou reativação por imunossupressão (Montoya e Liesenfeld, 2004; Montoya, 2002). A predominância da doença adquirida sobre a doença congênita varia de região para região (Vallochi et al., 2002). Nos Estados Unidos, mais de 2% de pessoas saudáveis infectadas com T. gondii desenvolveram doenças oculares, usualmente retinocoroidites (Holland, 2004; Dubey e Jones, 2008). No Brasil, existe um dos maiores índices de toxoplasmose ocular na região noroeste do Estado do Rio Grande do Sul, área essa colonizada por descendentes de migrantes europeus, principalmente italianos, alemães e poloneses. Essa região possui estrutura econômica associada à agropecuária, com a cadeia produtiva ligada ao processamento de suínos. A região apresenta a maior ocorrência mundial de toxoplasmose ocular, atribuída à forma de retinocoroidite toxoplásmica adquirida, com a prevalência de 17,7% na população rural de Erechim (Spalding et al., 2003; Silveira et al.,1988) Toxoplasmose em Paciente Imunocomprometido Os pacientes imunocomprometidos com infecções latentes previamente adquiridas podem levar à reativação da toxoplasmose com a manifestação de encefalites. Encefalites toxoplásmicas, toxoplasmose disseminada, meningoencefalites ou lesão tumoral com efeito de massa têm sido observadas em pacientes nestas condições devido a várias causas, tais como a Doença de Hodgkin s, pacientes com o vírus HIV ou terapias imunossupressoras necessárias em virtude de outras doenças (Montoya e Liesenfeld, 2004; Borges e Figueiredo, 2004; Hill et al., 2005). A toxoplasmose disseminada pode também ocorrer por transplantes de órgãos ou de medula óssea, originadas de doadores infectados pelo T. gondii a receptores suscetíveis ou da reativação do T. gondii latente em receptores 25

26 devido aos tratamentos de imunossupressão (Tenter et al., 2000; Dubey, 2004). Dos pacientes com AIDS e infectados pelo parasita, de 10% a 30% sucumbirão à doença e em 40% ocorrerá a neurotoxoplasmose (Tenter et al., 2000). Contudo, com o advento da terapia anti-retroviral altamente ativa (HAART) e a reconstituição da imunidade do indivíduo, a incidência da neurotoxoplasmose em pacientes acometidos pela AIDS está em declínio em muitos países, e a reativação ou a infecção latente pode também ser prevenida profilaticamente através de medicamentos como a sulfametazol trimetofim (Tenter et al., 2000) Infecções por Toxoplasma gondii em Animais Toxoplasmose é uma doença zoonótica que afeta provavelmente todos os animais de sangue quente. O homem e os animais podem ser infectados através da ingestão de uma das formas infectantes do protozoário, presente na água e em alimentos contaminados, carne crua contendo cistos teciduais ou congenitamente, podendo desenvolver graves seqüelas. A infecção nos animais pode causar mortes embrionárias e reabsorção, morte fetal e mumificação, abortos e natimortos. Em cabras e carneiros observa-se a morte da cria logo após o nascimento. Surtos de toxoplasmose em suínos causam maior mortalidade nos animais jovens do que nos adultos (Dubey, 2004). Em coelhos, martas, pássaros entre outros animais silvestres e domésticos podem ocorrer surtos esporádicos de toxoplasmose em várias regiões (Dubey, 2004). Entre os animais de estimação, o desenvolvimento da toxoplasmose de curso fatal pode ocorrer em cães que possuem algum tipo de imunossupressão causada pela infecção com vírus Distemper (Moretti et al.,2006). Nos gatos, a toxoplasmose pode levar à morte em qualquer idade, porém os mais suscetíveis a esse acontecimento são os filhotes (Dubey e Jones, 2008). 26

27 Toxoplasmose em Suínos A maioria das infecções causadas pelo T. gondii em porcos são subclínicas. A ocorrência de casos e surtos de toxoplasmose em suínos e/ou rebanhos de suínos costuma ser rara, o que não exclui significativa prevalência em algumas regiões do mundo (Dubey et al., 1986). Diante disso, e considerando que os produtos derivados dos suínos podem ser importante fonte de infecção humana, muitos estudos são realizados com o intuito de entender essa prevalência (Edelhofer, 1994). Nos Estados Unidos a carne suína é considerada, dentre as fontes de proteína animal, a maior fonte de T. gondii. Num estudo nacional desenvolvido com animais, 23% apresentaram anticorpos anti-t. gondii (Dubey, 1997). Outro estudo realizado nos Estados Unidos, em 43 fazendas do Estado de Illinois, associa a criação de suínos como fator de risco à contaminação com o parasita e conseqüentemente, o aumento da soropositividade em moradores e trabalhadores dessas áreas (Weigel et al., 1999). Entretanto, um estudo realizado na Argentina, em leitões natimortos, encontrou soroprevalência de 2% de 738 amostras, soroprevalência essa considerada baixa (Dubey et al., 1999). Na Holanda, outro fator atualmente investigado é a influência do sistema de criação dos animais em sua contaminação. No sistema convencional, onde o animal é mantido sob confinamento, a soroprevalência foi negativa, enquanto que animais criados sob o sistema Animal Friedly Production System, onde possuem acesso a áreas externas e livres, foram detectados índices de soroprevalência de 2,9% em 1295 animais investigados (Kijlstra et al., 2004). No Brasil, foi realizado em Londrina um estudo com trabalhadores envolvidos na produção de lingüiça fresca à base de carne suína e com o produto. Foram coletadas 149 amostras de lingüiça fresca à base de carne suína e bioensaiadas em camundongos, no qual 8,7% dos animais apresentaram anticorpos anti-t. gondii. Nos trabalhadores, dos 47 soros coletados, encontrou-se 59,9% de soropositividade (Dias et al., 2005). Existe a necessidade de considerar que a diferença de soropositividade de região para região, nesses animais, pode variar de acordo com o modo de 27

28 criação, os hábitos de higiene, idade do animal e a metodologia empregada para a análise desses estudos sorológicos (Edelhofer, 1994) Toxoplasmose em Ovinos A toxoplasmose ovina foi descrita pela primeira vez por Hartley et al. (1954). Sua incidência ainda é difícil definir, porém estudos realizados no Reino Unido responsabilizaram a toxoplasmose por perdas anuais de 1 a 2% nesses rebanhos (Buxton et al., 2007). A toxoplasmose ovina ocorre por uma primo-infecção da fêmea já prenha provocada pela ingestão de oocistos esporulados. Estes alcançam o intestino delgado e, aproximadamente após 40 dias, os taquizoítos podem ser encontrados multiplicando-se nos linfonodos mesentéricos. Os taquizoítos podem ser encontrados na circulação sanguínea durante 10 dias seguintes à exposição (Buxton et al., 2007). Devido à gestação, a ovelha encontra-se com sua resposta imunológica branda, para a instalação do feto. Esse mecanismo, ao mesmo tempo em que permite uma gestação de sucesso, também permite a instalação do parasita no organismo. Desse modo, o T. gondii que circula pelo sangue encontrará facilidade em se estabelecer na placenta do animal e, conseqüentemente, infectar as células do feto. Os sinais clínicos da toxoplasmose ovina são verificados na metade da prenhez da ovelha que foi infectada nos primeiros meses (Buxton et al., 2007; Dubey e Lindsay, 2006; Dubey e Jones, 2008). A infecção ocorrida no primeiro período de gestação pode resultar em aborto, reabsorção do feto, natimortos, nascimento de animais fracos e fetos mumificados. No segundo período de gestação os animais podem nascer infectados, mas como já possuem seu sistema imune relativamente bem desenvolvido, nascerão normais e imunizados (Buxton et al., 2007; Dubey e Lindsay, 2006; Dubey e Jones, 2008). A carne ovina e seus derivados acabam tornando-se fontes de infecção humana, principalmente nos países Europeus. Estudos de soroprevalência realizados na França, no distrito de Haute-Vienne, examinaram as amostras de soro de 164 cordeiros e 93 ovelhas, sendo encontrada a soroprevalência, respectivamente de 22% e 65,6%. O resultado indica alta contaminação desses 28

29 animais por T. gondii e potencial risco de transmissão para os seres humanos (Dumètre et al., 2006). No Estado de São Paulo, nas cidades de Botucatu, Pratânea, Bauru e São Manoel, uma investigação em 597 ovinos resultou na determinação de uma soroprevalência de anticorpos anti-t. gondii de 34,7% (Figliuolo et al., 2004) Toxoplasmose em Caprinos A principal forma clínica da toxoplasmose nos caprinos naturalmente infectados está relacionada a distúrbios na esfera reprodutiva, como abortos, fetos mumificados e natimortos. Nos fetos, as lesões mais encontradas são encefalite, miocardite e pneumonia (Dubey e Beattie, 1988). Mesmo pouco freqüente, a morte por toxoplasmose aguda disseminada é relatada em adultos caprinos, sendo descritas encefalite, edema e congestão pulmonar, infarto renal, muitos focos necróticos no fígado e baço, enterite, cistite e abomasite (Mehdi et al., 1983, Dubey, 1987). A toxoplasmose em caprinos é mais severa do que em ovinos (Hill et al., 2005). Na Itália, pesquisa realizada na região da Sardinia, em fazendas, detectou o DNA do T. gondii, através da técnica de PCR, em 13% de fetos abortados, o que sugere uma contaminação considerável nesses rebanhos (Masala et al., 2007). Em geral, os seres humanos utilizam a carne e o leite desses animais como fonte de alimento. Em alguns países como no Brasil, Tailândia e Itália, a importância, tanto na economia quanto como fonte alimentícia, demonstra-se muito maior do que em países como os Estados Unidos (Dubey e Jones, 2008; Masala et al., 2007; Jittapalapong et al., 2005; Neto et al.,2008). Nesses países, onde a importância desses animais como fonte de carne e leite são consideravelmente grandes, o consumo de alimentos derivados destes é fator de risco para a contaminação dos seres humanos (Dubey e Jones, 2008). Um estudo de soroprevalência na província de Satun, Tailândia, demonstrou que, de 176 animais sorologicamente testados, 27% foram positivos para anticorpos anti- T. gondii (Jittapalapong et al., 2005). No Brasil, os maiores rebanhos de caprinos encontram-se concentrados na região 29

30 nordeste do país. Um estudo desenvolvido no Rio Grande do Norte, na microrregião do ocidental Seridó, constatou a soroprevalência de anticorpos anti-t. gondii em 30,6% das 366 amostras de caprinos coletadas (Neto et al.,2008) Toxoplasmose em Bovinos O gado é considerado um hospedeiro menos suscetível ao T. gondii, além de mais resistente aos sinais clínicos da toxoplasmose do que muitas espécies criadas em rebanhos e para alimentação humana (Dubey, 1985; Dubey e Lindsay, 2006; Dubey e Jones, 2008). Embora a infecção com oocistos de T. gondii no gado seja bem sucedida, o parasita é eliminado ou reduzido de forma quase indetectável no organismo do animal em poucas semanas (Dubey e Lindsay, 2006; Dubey, 1986). Alguns estudos realizados no Brasil destacam a importância do leite de vaca na contaminação humana. Hiramoto et al. (2001) analisaram a infectividade e resistência do cisto de T. gondii da cepa ME-49 em leite e queijo infectados artificialmente. Seu estudo apontou que a infectividade dos cistos de T. gondii da cepa ME-49 foi mantida no leite por mais de 20 dias e no queijo processado caseiramente por um período de 10 dias enquanto mantidos sob mesmas condições de temperatura (2 a 8 C). Estudos sorológicos realizados no Brasil apontam uma considerável soroprevalência de anticorpos anti-t. gondii no gado (Dubey, 1985; Albuquerque et al., 2005; Ogawa et al.,2005; Santos et al.,2009). Uma análise sorológica desenvolvida no estado de São Paulo destaca que, de 200 animais avaliados, 11% apresentaram sorologia positiva para T. gondii (Meireles et al., 2003). No Rio de Janeiro, na micro-região do Vale do Paraíba, foram coletadas amostras de 589 animais, desses foram encontrados 14,8% de soros reagentes (Albuquerque et al., 2005). Um estudo realizado na região norte do Estado do Paraná, com gado leiteiro, sugere que a toxoplasmose está disseminada nesses rebanhos, onde foram encontrados 26% de soroprevalência ao T. gondii (Ogawa et al.,2005). 30

31 Toxoplasmose em Felinos Os felinos são fundamentais no ciclo de vida do Toxoplasma gondii porque eles são os únicos hospedeiros que podem disseminar diretamente o parasita no meio ambiente. A infecção pelo T. gondii em gatos é de fundamental importância clínica e epidemiológica (Dubey et al., 2004; Dubey e Jones, 2008). Os felinos de várias espécies costumam infectar-se com o T. gondii através da ingestão de oocistos que se encontram no meio ambiente ou pela ingestão de cistos teciduais provenientes dos hospedeiros intermediários (Tenter et al., 2000). A infecção em felinos é normalmente assintomática e a transmissão vertical não costuma ocorrer com freqüência. Entretanto a infecção pelo T. gondii em estado latente no animal é comum em gatos domésticos e selvagens em várias regiões do mundo (Tenter et al., 2000). Ainda assim, os felinos podem desenvolver a toxoplasmose e apresentar depressão, anorexia e morte súbita sem sinais clínicos evidentes da doença. A pneumonia é a manifestação clínica mais importante seguida de outros sintomas como hepatite, necrose pancreática, miocardites, uveítes, dermatites e encefalites. Importante destacar que a doença manifesta-se de forma mais intensa em filhotes infectados congenitamente (Dubey e Jones, 2008). Alguns estudos sorológicos realizados no Brasil demonstram a prevalência sorológica de anticorpos anti-t. gondii nesses animais. Meireles et al. (2004) descreveram que a pesquisa sorológica em gatos de vida livre e errantes nas áreas urbanas, que estão expostos sem nenhuma proteção a todas as formas infectantes do parasita, podem ser utilizadas como sentinelas ambientais. Neste estudo, foram analisadas 100 amostras de soro de felinos provenientes da cidade de São Paulo, destes, 40% apresentaram soropositividade ao T. gondii. Outra pesquisa realizada no Estado de São Paulo com 237 amostras de soro de felinos apresentou soroprevalência de 35,4% nessas amostras (Pena et al., 2006). Algumas áreas no Brasil apresentam altas prevalências de anticorpos anti-t. gondii em felinos. Um exemplo é a região de Santa Isabel do Ivaí, no Estado do Paraná. Nesta região, após um surto de toxoplasmose aguda em uma parcela da população causado pela contaminação do reservatório de água 31

32 da cidade, apontou-se que 84,4% dos felinos examinados apresentaram positividade (Dubey et al., 2004) Toxoplasmose em Equinos Os eqüinos costumam se apresentar resistentes a infecção pelo T. gondii e quando ocorre uma infecção, em geral, esta se apresenta de curso subclínico (Dubey e Jones, 2008; Güçlü et al., 2007). A principal forma de transmissão de T. gondii para os seres humanos é a ingestão de alimentos contendo oocistos, um dos mais destacados é a carne, na qual a dos eqüinos já foi citada contendo cistos teciduais viáveis de T. gondii (Dubey, et al.,1999). Dubey et al. (1987) realizaram um trabalho no qual vários eqüinos foram oralmente infectados com oocistos de T. gondii. Estes animais não desenvolveram sintomas clínicos da doença, porém, em alguns deles foram encontrados altos títulos de anticorpos anti-t. gondii. A toxoplasmose eqüina tem como seu maior instrumento de diagnóstico os métodos sorológicos. Alguns estudos de soroprevalência têm sido realizados na tentativa de esclarecer as melhores técnicas a serem utilizadas nessas investigações e quais as prevalências nesses animais em diversas regiões do mundo. O primeiro estudo realizado em eqüinos, na Argentina, demonstrou que das 76 amostras de soro pesquisadas para anticorpos anti-t. gondii, 13,1% foram positivas (Dubey et al., 1999). Outro estudo, na América do Norte, avaliou a soroprevalência de anticorpos contra T. gondii em amostras de soros de eqüinos abatidos para o consumo de carne. Dessas amostras, 6,9% apresentaram-se positivas pela técnica de aglutinação modificada (MAT) (Dubey et al., 1999). Em cavalos utilizados na prática de esportes na província de Ankara,Turquia, encontrou-se 28% de soroprevalência para anticorpos anti- T. gondii de 100 animais testados (Güçlü et al., 2007). No Egito, Ghazy et al. (2007) pesquisaram anticorpos anti-t. gondii em eqüinos. Dos 420 soros testados, foi encontrada uma soropositividade de 48,1% no MAT. Em contrapartida, estudo realizado em eqüinos na Suíça, demonstrou soroprevalência de 0,5% de 414 animais pesquisados (Jakubek et al., 2006). Prevalência inferior a essa foi verificada em cavalos selvagens na região 32

33 central de Wyoming, nos Estados Unidos, onde, de 276 animais sorologicamente pesquisados, somente 1 apresentou anticorpos contra T. gondii. As diferenças sorológicas encontradas nos dados acima apontam que existe ainda a necessidade de melhor conhecer a prevalência do T. gondii em eqüinos, bem como a dinâmica de contaminação e, dessa maneira, melhor avaliar os teste sorológicos utilizados para os estudos de soroprevalência de anticorpos anti-t. gondii nestes animais Toxoplasmose em Cães A toxoplasmose clínica em cães foi relatada pela primeira vez no Brasil por Carini em Desde então a toxoplasmose canina vem sendo descrita por diversos países, abordando inúmeros temas dos quais podemos destacar a sorologia, sintomatologia clínica e a detecção de cepas (Pimenta et al., 1993). A doença primária em cães costuma ser rara, no entanto, casos graves da doença em animais adultos são relatados quando este se apresenta ao mesmo tempo contaminado pelo vírus imunossupressor Distemper. O vírus Distemper canino é conhecido como o causador da cinomose canina. (Dubey e Jones, 2008; Moretti et al.,2006). Bresciane et al. (1999) descreveram através de um ensaio realizado com cadelas, que pode ocorrer a transmissão congênita do T. gondii quando infectadas durante o período gestacional. As manifestações mais graves da doença costumam aparecer nos filhotes caracterizadas por sintomas neuromusculares, respiratórios e gastrointestinais. Quando a infecção é generalizada, surgem os sintomas de deterioração neurológica como ataxia, mudanças de comportamento, tensão, paralisia, paraplegia, contrações musculares e tremores (Moretti et al., 2006; Dubey e Jones, 2008; Pimenta et al.,1993). Estudos têm sido realizados em vários países descrevendo a soroprevalência de anticorpos anti-t. gondii em cães. Muitas vezes o foco dessas investigações são animais provenientes dos Centros de Zoonoses que foram entregues a essas entidades ou capturados nas cidades. Altas prevalências têm sido descritas em Ankara,Turquia, investigação na qual

34 animais foram testados e 62% apresentaram soropositividade (Aslantas et al., 2005). Em Trinidade e Tobago, no Caribe, foi encontrada soroprevalência de 32% e em países como a Tailândia, na área metropolitana de Bangkok, 9,7% de soropositividade foi descrita avaliando 427 soros de cães errantes (Ali, et al.,2003; Jittapalapong et al., 2007). No Brasil, alguns dados demonstram a relevante soroprevalência encontrada em cães. No estado de Minas Gerais, 369 amostras de soros de cães coletadas no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Uberlândia, em clínicas veterinárias particulares e no Centro de Zoonoses, apresentaram 30,3% de positividade para T. gondii (Mineo et al., 2004). Um grupo de estudos na cidade de Botucatu, em São Paulo, analisou 780 soros de cães coletados durante uma campanha de vacinação anti-rábica, no qual se observou 33,1% de positividade para T. gondii (Langoni et al.,2006). Resultados semelhantes foram encontrados na cidade de Campo Grande, Paraíba, onde, de 286 amostras analisadas, 45,1% foram positivas para T. gondii (Azevedo et al., 2005). Na região norte do Brasil, na cidade de Monte Negro, em Rondônia, 157 amostras de cães foram avaliadas; elas apresentaram 76,40% de soropositividade para T. gondii (Cañón-Franco et al., 2003 a). No sul do país, município de Jaguapitã, Paraná, soros de 189 animais coletados desta zona rural apresentaram 84,1% de positividade (Garcia et al., 1999). Na cidade de São Paulo, Meireles et al. (2004 a) avaliaram a soroprevalência de antígenos anti-t. gondii em 200 soros de cães coletados do Centro de Controle de Zoonoses da cidade, que apresentaram 50,5% de soropositividade. Além de estudos sorológicos, a transmissão mecânica de oocistos de T. gondii por cães tem sido abordada em estudos científicos. Sabe-se que o T. gondii não realiza ciclo enteroepitelial nos cães e que esses animais não costumam ser utilizados, na maioria dos países, como fonte de alimento. Essas situações provavelmente excluiriam os cães de estarem envolvidos na transmissão do T. gondii aos seres humanos. Contudo, dados da literatura demonstram a ocorrência de contaminação de crianças pelo T. gondii, ocasionada por filhotes de cães que entram em contato com gatos, além da demonstração de que oocistos esporulados podem atravessar o trato intestinal desses animais e serem excretados através das fezes em estágio infectante 34

35 (Lindsay et al., 1997). Um estudo comparativo realizado no Panamá indicou que, entre o contato com gatos e cães, o contato com cães foi muito mais correlacionado com o aumento de soroconversão em crianças panamenses (Frenkel et al., 1995). Fatores que influenciam nessa condição podem ser os costumes de coprofagia que os canídeos apresentam, sua capacidade olfativa e os hábitos de procurar e de rolar em fezes de gatos contaminando seus pêlos com esses dejetos (Frenkel et al., 2003, Etheredge et al., 2004). Observando esses aspectos descritos em estudos, há muito se discute a importância dos animais de companhia, domésticos e para alimentação que podem ser particularmente valiosos sentinelas para medir a exposição humana a riscos. Isso porque o homem e esses animais dividem o mesmo meio ambiente. Pode ocorrer também dos animais de estimação estarem mais expostos a determinados fatores que seus donos, devido ao grande contato com o solo e a abrigos sujos. Muitos estudos indicam particularmente os cães como apropriados marcadores biológicos, pois homens e cães podem sofrer doenças similares quando submetidos aos mesmos fatores de risco, o que os torna úteis ferramentas em estudos sorológicos (Backer et al., 2001; Rabinowitz et al., 2007; Meireles et al., 2004) Diagnóstico Laboratorial O diagnóstico laboratorial da toxoplasmose humana baseia-se principalmente na procura de anticorpos das classes IgG e IgM contra o parasita (Ferreira e Ávila, 2001). Métodos como a amplificação de seqüências específicas de ácidos nucléicos (PCR), a pesquisa histológica do parasita ou o isolamento do T. gondii são de grande valor diagnóstico, auxiliando ou corroborando com o diagnóstico imunológico da doença (Ferreira e Ávila, 2001; Montoya, 2002; Hill e Dubey, 2002; Cantos, 2000) No homem, os principais grupos que necessitam de diagnóstico são: mulheres gestantes, fetos e crianças recém-nascidas que adquiriram a infecção congênita, pacientes imunocomprometidos e pacientes com retinocoroidite (Remington et al., 2004). Nos animais como gatos, ovinos, bovinos, suínos, eqüinos e cães, as técnicas sorológicas são também as ferramentas mais utilizadas para a 35

36 detecção de anticorpos IgG (Hill e Dubey, 2002; Dubey, 1986; Hill et al., 2005). Essas técnicas são amplamente aplicadas em inquéritos epidemiológicos nessas populações, porém, os métodos moleculares (PCR), bioensaios e métodos parasitológicos de flotação para a procura de oocistos nas fezes de gatos são também utilizados nesses estudos (Dubey, 2008; Hill et al., 2005; Minho et al., 2004; Hill e Dubey, 2002; Garcia et al., 1999 a; Garcia et al., 1999 b; Dubey, 1986) Diagnóstico por Métodos Sorológicos Existem dois tipos principais de testes sorológicos: os que usam organismos inteiros como antígenos e aqueles que utilizam extrato antigênico de parasitas lisados. Os primeiros são representados pelo teste de Sabin- Feldman, pela reação de imunofluorescência indireta e pelo ensaio de aglutinação, que demonstram principalmente anticorpos dirigidos contra os antígenos da membrana do parasita, enquanto o ensaio imunoenzimático que utiliza o extrato antigênico de parasitas lisados, indica os anticorpos de aparecimento mais tardio (Uchôa et al., 1999, Duffy et al, 1989). Atualmente, os métodos destacados na literatura e que são usados para o diagnóstico no homem e nos animais são: Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) A Reação de Imunofluorescência Indireta substituiu o Teste de Sabin- Feldman. Essa reação imunológica apresenta bons índices de especificidade e sensibilidade, comparável ao teste de Sabin-Feldman, sendo de execução rápida e simples (Ferreira e Ávila, 2001, Okolo, 1985). Atualmente a RIFI é aplicada no diagnóstico da toxoplasmose como teste gold standard e tem a vantagem de utilizar toxoplasmas preservados, fixados em lâminas de microscopia, o que a torna muito mais prática e segura para a rotina laboratorial. Além disso, este teste permite a identificação dos anticorpos segundo as classes de imunoglobulinas. No entanto, pode apresentar resultados falso-positivos para a imunoglobulina M pela 36

37 interferência de fatores reumatóides, eventualmente presentes no soro (Camargo et al., 1972; Ferreira e Ávila, 2001) Ensaio Imunoenzimático (ELISA) O ELISA foi desenvolvido como alternativa ao radioimunoensaio, para a detecção de antígenos e anticorpos (Ag/Ac), pois além de possuir sensibilidade comparável, não apresenta os problemas com a utilização de radioisótopos (Ferreira e Ávila, 2001). Hoje o ELISA é conhecido como teste padrão para muitas doenças parasitológicas, sendo aplicado tanto em estudos epidemiológicos como na rotina laboratorial (Venkatesan e Wakelin, 1993). Essa técnica utiliza Ag/Ac imobilizado em placa de polímero de carbono e anticorpo conjugado a uma enzima, a qual, após agir sobre seu substrato em presença de substância cromógena, amplificará a detecção da interação Ag/Ac através da formação de cor (Venkatesan e Wakelin, 1993; Ferreira e Ávila, 2001). Esse método é caracterizado por elevada sensibilidade e especificidade, bem como a objetividade de leitura e versatilidade de uso (Ferreira e Ávila, 2001) Teste de Aglutinação Modificado (MAT) O teste de aglutinação para anticorpos anti-t. gondii foi inicialmente desenvolvido por Fulton em 1965, que utilizou taquizoítos íntegros e formolizados na reação. Desmonts e Remington, em 1980, aperfeiçoaram a técnica utilizando 2-mercaptoetanol nos soros a serem analisados. Isso aumentou a especificidade e sensibilidade por inativar os possíveis anticorpos da classe IgM existentes na amostra, impedindo os de se ligarem ao antígeno e competirem com os anticorpos da classe IgG. Posteriormente, Dubey e Desmonts, em 1987, modificaram o teste utilizando o 2-mercaptoetanol na preparação do antígeno ao invés de colocá-lo diretamente no soro e o chamaram de teste de aglutinação modificado, atualmente conhecido como MAT. 37

38 Essa reação tem sido muito usada em inquéritos epidemiológicos e no diagnóstico da toxoplasmose em animais, pois não necessita de conjugados espécie específicos para o procedimento. A reação é simples e de baixo custo, consiste na formação do imunocomplexo, ou seja, quando a amostra analisada apresenta anticorpos IgG contra o toxoplasma, estes se ligarão ao antígeno formolizado (Dubey, 2008; Dubey 1997) Hemaglutinação Indireta (HI) Com a finalidade de aumentar o leque de reações usadas no diagnóstico da infecção toxoplásmica, em 1957, Jacobs e Lunde, preconizaram a reação de hemaglutinação. Esta era realizada com hemácias de carneiro recobertas por componentes do parasita, desse modo apresentava baixa sensibilidade e especificidade. Posteriormente o teste foi implementado com a utilização de hemácias de aves recobertas com antígenos completos do parasita, que se aglutinam na presença de anticorpos IgG e IgM (Camargo et al., 1986; Ferreira e Ávila, 2001). A Hemaglutinação demonstra eficiência com baixo custo e costuma ser usada tanto em estudos soroepidemiológicos quanto na triagem laboratorial (Camargo et al., 1986) Teste de Sabin-Feldman O teste de Sabin-Feldman é fundamentado em princípio imunológico, no qual os parasitas expostos a um soro contendo anticorpos anti-toxoplasma sofrem lise da membrana citoplasmática após a reação Ag/Ac e ativação do complemento, sendo corados por azul de metileno. Quando não existem anticorpos contra o parasita no soro, este não se cora (Sabin e Feldman, 1948). Apesar de ser um teste de alta especificidade e sensibilidade, seu uso se tornou restrito em decorrência da complexidade técnica empregada e do risco de contaminação com os antígenos vivos de Toxoplasma gondii (Remington, 2001). 38

39 Diagnóstico por Método Molecular Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) A primeira detecção do DNA de T. gondii proveniente de um único taquizoíto usando o gene B1 na reação em cadeia de polimerase foi descrita por Burg et al. (1989). Atualmente o uso dessa reação tem sido considerada bem sucedida para o diagnóstico de pacientes com toxoplasmose congênita, ocular, cerebral, mas principalmente em pacientes imunocomprometidos. A detecção de DNA do T. gondii ocorre através dos fluídos e/ou tecidos corporais, sendo possível detectar o DNA do microorganismo (Remington et al., 2004; Montoya e Liesenfeld, 2004). A reação de polimerase em cadeia é de grande sensibilidade e especificidade e, em muitos casos, têm sido preferível aos testes sorológicos (Montoya et al., 2004; Remington et al., 2004; Cantos et al., 2000). Porém, a técnica de PCR necessita de ampla aparelhagem, reagentes e cuidados especiais para evitar a contaminação durante o seu desenvolvimento (Montoya e Liesenfeld, 2004) Diagnóstico por Métodos Parasitológicos Diagnóstico Histológico A demonstração dos taquizoítos de T. gondii é possível utilizando cortes de biópsias ou esfregaço de fluídos corporais (sangue, líquor, saliva, leite, escarro, líquido amniótico, lavado brônquico-alveolar) de pacientes que se encontram na fase aguda da infecção (Montoya 2002; Montoya e Liesenfeld, 2004). Métodos como a coloração de Giemsa que é utilizada nos cortes de tecidos e/ou esfregaços ou as técnicas de imunohistoquímica aplicadas em preparos histológicos, apresentam consideráveis índices de sensibilidade e especificidade (Montoya, 2002). Essas metodologias são ferramentas aplicadas 39

40 principalmente no diagnóstico da toxoplasmose em pacientes imucomprometidos (Montoya, 2002; Montoya e Liesenfeld, 2004) Isolamento do Toxoplasma O isolamento do parasita utilizando fluídos corporais e/ou tecido de pacientes inoculados por via intraperitoneal em camundongos também é realizado. A positividade do exame é observada pela soroconversão do animal, pela presença de taquizoítos no líquido peritonial e lesões nos órgão do mesmo. Os resultados são obtidos a longo prazo, mas essa desvantagem é compensada pela alta sensibilidade que este apresenta (Okolo, 1985; Ferreira e Ávila, 2001; Neves, 2006; Montoya e Liesenfeld, 2004) Isolamento de Oocisto O isolamento de oocistos é utilizado para verificar a presença desta forma excretada nas fezes dos felinos. A detecção é realizada pela técnica de flotação fecal, na qual as fezes do felino são emulsificadas em solução de sucrose concentrada, filtrada e centrifugada. O material obtido é examinado por microscopia. Esta técnica é principalmente aplicada em estudos epidemiológicos, não apresentando boa sensibilidade e especificidade devido ao pequeno espaço de tempo em que os oocistos são liberados nas fezes desses animais (Hill e Dubey, 2002; Salant et al., 2007; Pena et al., 2006). A presente introdução descreveu o protozoário T. gondii esclarecendo, através da literatura científica, suas características morfológicas, biológicas e epidemiológicas, relatando principalmente os estudos de soroprevalência realizados nos animais que o homem utiliza para criação, consumo, diversão e estimação, e que ainda não possuem total esclarecimento em muitas regiões do mundo. Verificamos que muito ainda necessita ser compreendido em relação à distribuição e soroprevalência do T. gondii, assim como sobre a utilização dos melhores métodos de diagnóstico da toxoplasmose em animais domésticos. Diante disso, há necessidade de mais estudos epidemiológicos 40

41 que esclareçam sobre a prevalência e distribuição da toxoplasmose nas diversas regiões desse país. 41

42 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo Geral Estudar a epidemiologia da toxoplasmose, zoonose parasitária de interesse em Saúde Pública através do diagnóstico da infecção natural em animais domésticos em diferentes regiões do Estado de São Paulo Objetivos Específicos Estudar a resposta imune humoral, pela detecção de anticorpos IgG anti-t. gondii específicos no soro de cães dos municípios de Caraguatatuba, Bauru, Itupeva, Sorocaba e Mogi das Cruzes utilizando diferentes técnicas diagnósticas (MAT, RIFI e ELISA). Analisar os dados obtidos na sorologia dos cães das diferentes regiões. Estudar a resposta imune humoral, pela detecção de anticorpos IgG anti-t. gondii específicos no soro de eqüinos do município de Caraguatatuba, utilizando diferentes técnicas diagnósticas (MAT, RIFI e ELISA). Analisar os dados obtidos na sorologia dos eqüinos do município de Caraguatatuba. Analisar os indicadores de desempenho, no caso, a sensibilidade, a especificidade, o valor preditivo positivo e o valor preditivo negativo dos testes imunológicos ELISA e MAT. 42

43 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Características geo-climáticas e econômico-produtivas dos municípios estudados As áreas escolhidas, onde se localizam os CCZs, para a coleta das amostras deste estudo são (Figura 3): 1) Caraguatatuba localiza-se no litoral norte do estado de São Paulo, na microrregião de mesmo nome. A população aferida na contagem do censo de 2007 foi de habitantes, distribuídos por uma área de 484 km². Região coberta por vegetação de Mata Atlântica com clima tropical atlântico. A temperatura média anual varia em torno 25 C com índice pluviométrico anual de 1400mm. Caraguatatuba é um dos 15 municípios paulistas considerados estâncias balneárias pelo Estado de São Paulo, por cumprirem determinados pré-requisitos definidos por Lei Estadual. Trata-se de um município urbanizado, cujo turismo, pesca e comércio são as principais atividades econômicas. O terceiro setor também é bastante desenvolvido e voltado ao turismo (Instituto brasileiro de geografia e estatísticas, site: Prefeitura municipal da estância balneária de Caraguatatuba, site: 2) Bauru - encontra-se a oeste do estado de São Paulo, possui área de 673,488 km 2 e população de habitantes de acordo com as informações do último censo do IBGE de Sua vegetação primitiva era definida como mata atlântica, atualmente é considerada cerrado. O clima é o tropical de altitude com verão quente e chuvoso e inverno ameno e seco. A temperatura média anual fica em torno dos 22ºC com índice pluviométrico de 1500 mm. Bauru é o principal centro econômico e maior município do Oeste Paulista. O município é centro de comercialização de animais (bovinos, eqüinos e suínos), refletindo o peso da pecuária na atividade econômica regional turismo (Instituto brasileiro de geografia e estatísticas, site: Prefeitura municipal de Bauru, site: 43

44 3) Itupeva localizada na parte sudoeste do estado de São Paulo, possui área de 201 km 2 e população de habitantes de acordo com as informações do censo de 2007 realizado pelo IBGE. Sua vegetação é constituída de fragmentos de floresta da Mata Atlântica com áreas de cerrado e de reflorestamento. O clima da região é tropical com temperatura média anual de 21 C e índice pluviométrico em torno de 1400 mm. Itupeva é principalmente constituída por área rural com acentuado desenvolvimento do turismo ecológico e rural (Instituto brasileiro de geografia e estatísticas, site: Prefeitura municipal de Itupeva, site: 4) Sorocaba - encontra-se na parte sudoeste do estado de São Paulo, com uma área de 456 km². Sua população estimada em 2007 no censo do IBGE é de habitantes. A vegetação da região é composta de fragmentos de Mata Atlântica e cerrado com clima subtropical e média da temperatura anual na casa dos 20ºC, sendo o mês mais frio Julho e o mais quente Fevereiro. O índice pluviométrico fica em torno de 1400 mm. O município de Sorocaba possui grande diversidade econômica com indústrias e comércio bem desenvolvidos (Instituto brasileiro de geografia e estatísticas, site: Prefeitura municipal de Sorocaba, site: 5) Mogi das Cruzes município que faz parte da região metropolitana de São Paulo e é o maior município, em área, da Grande São Paulo, com 725 km². A população, no censo de 2007 é estimada em habitantes. O município possui a segunda maior reserva florestal de Mata Atlântica do estado de São Paulo. Seu clima é subtropical com verão pouco quente e chuvoso e inverno ameno e subseco. A média de temperatura anual é de 20ºC, com índice pluviométrico anual em torno de 1300 mm. Mogi das Cruzes constitui-se pólo econômico do local fazendo parte do cinturão verde, com grande produção de hortifrutigranjeiros escoados principalmente para a capital (Instituto brasileiro de geografia e estatísticas, site: Prefeitura municipal de Sorocaba, site: 44

45 Figura 3 - Mapa do estado de São Paulo com os municípios selecionados para as coletas de amostras dos animais. 45

46 3.2. Coleta de Amostras O quadro abaixo apresenta a espécie, o local e a quantidade de amostras coletadas: Espécie Local (município) Quantidade (n) Canis familiaris Caraguatatuba 302 Canis familiaris Bauru 171 Canis familiaris Itupeva 60 Canis familiaris Sorocaba 50 Canis familiaris Mogi das Cruzes 99 Equus caballus Caraguatatuba 89 Esses municípios foram selecionados para as coletas por se apresentarem relativamente afastados entre si, cobrindo várias regiões do estado, com áreas urbanizadas, áreas entre urbanas e rurais e zona litorânea. A Seção de Parasitoses Sistêmicas, que procedeu à coleta, já desenvolvia trabalhos conjuntos com os CCZs desses municípios, o que colaborou no planejamento das coletas. As amostras de sangue dos cães e eqüinos foram obtidas por punção venosa, no volume de 3 (três) a 5 (cinco) ml por animal, em tubo seco estéril (Labor Import). Essas foram transportadas em geladeiras térmicas com gelo reciclável, para a manutenção da temperatura, ao Instituto Adolfo Lutz da cidade de São Paulo, centrifugadas a 500g (centrifuga 80-2B Centribio) por 15 minutos e o soro armazenado a 20 C até o momento de sua utilização. Os trabalhos realizados com os animais seguiram os Princípios de Ética em Experimentação Animal (COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal) Animais de Experimentação Foram utilizados 230 camundongos machos não isogênicos Swiss, com peso entre 20 e 22g, fornecidos pelo Biotério Central do Instituto Adolfo Lutz, sendo mantidos em gaiolas de plástico com maravalha de pinho autoclavada, recebendo ração comercial e água ad libitum. 46

47 Previamente à inoculação dos camundongos para a produção dos antígenos da RIFI, ELISA e MAT, um animal de cada lote (10 animais /lote) foi avaliado quanto a sua resposta a antígenos de T. gondii pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), sendo utilizados os lotes nos quais os animais analisados apresentavam resposta negativa. A manipulação dos animais, antes e durante os ensaios, foi conduzida de acordo com as regras de cuidados de animais de laboratório (Clark, 1996) e com os Princípios de Ética em Experimentação Animal (COBEA) Cepas de Toxoplasma gondii Utilizou-se as cepas de referência RH, do Tipo I, altamente virulenta, não cistogênica e de rápida multiplicação (Dubey, 1993) e ME-49 do tipo II, produtora de cistos teciduais (Howe e Sibley, 1995). As cepas foram gentilmente cedidas pelo Laboratório de Protozoologia do Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo e mantidas no biotério de experimentação do Instituto Adolfo Lutz Manutenção e obtenção da Cepa RH e ME Taquizoítos Peritoneais da Cepa RH tipo I Os taquizoítos da cepa RH do tipo I de T. gondii são mantidos rotineiramente no Laboratório de Experimentação do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo por meio de passagens sucessivas em camundongos Swiss (não isogênicos). Os animais previamente infectados, pelo período de cinco a seis dias, são sacrificados por asfixia em câmara de CO 2 e o peritônio lavado com 5ml de solução salina estéril NaCl 0,15M, contendo gentamicina (40 mg/ml). Após contagem em câmara de Neubauer, os taquizoítos são diluídos e cada animal recebeu inóculo de 1X10 5 taquizoítos por inóculo intraperitoneal (i.p). Os parasitas são mantidos também em estabilato de nitrogênio líquido (-199 o C) na Seção de Parasitoses Sistêmicas do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo. 47

48 Purificação dos Parasitas Os taquizoítos da cepa RH do tipo I foram retirados por lavagem peritoneal de animais previamente infectados, com salina estéril, sendo posteriormente purificados em filtro ISOPORE com poros 3.0 µm de 47 mm de diâmetro (Millipore). A preparação foi observada utilizando microscópio de contraste de fase (Nikon Eclipse E4000) para contagem dos parasitas e de eventuais células contaminantes. Preparações com contaminações maiores que 1 (uma) célula do hospedeiro para 100 taquizoítos foram desprezadas Cistos Teciduais Cistos da cepa ME-49 foram mantidos através de sucessivas passagens, com intervalos de 30 a 45 dias, em camundongos Swiss. Os animais utilizados receberam, por via oral, uma suspensão de 10 cistos/animal obtidos do macerado de cérebro de camundongos Swiss anteriormente infectados em 3 ml de solução fisiológica tamponada 0,01M ph 7.2 (PBS) estéril. A quantificação dos cistos foi realizada utilizando cerca 10µl da suspensão cerebral, observados entra lâmina e lamínula, em microscópio de luz empregando objetiva 40X (Nikon Eclipse E4000). Essa infecção foi realizada com o intuito de obtenção de soro controle de animais com infecção crônica para uso na reação sorológica MAT Produção de Antígenos de T. gondii para RIFI, ELISA e MAT Antígeno Formolizado de T. gondii para Reação de Imunoflorescência Indireta - RIFI Os taquizoítos coletados do peritônio dos camundongos foram filtrados com descrito no item e posteriormente centrifugados a 1800 g durante 10 minutos(centrifuga 80-2B Centribio). O sobrenadante foi desprezado e o precipitado ressuspenso em formol 2% tamponado com fosfato de sódio 0,02M ph 7,2, permanecendo em estufa a 37 o C por 30 minutos, sendo homogeneizado a cada 10 minutos. A seguir, o material foi novamente 48

49 centrifugado a 1800 g (centrifuga modelo 80-2B Centribio), o sobrenadante descartado e o precipitado ressuspenso em PBS ph 7,2. Em lâminas limpas, próprias para a RIFI, cada uma contendo 10 poços, foram adicionados 10µl (10000 parasitas) do preparado em cada poço e deixadas para secar à temperatura ambiente. Após a secagem, as lâminas foram envoltas isoladamente em papel vegetal e acondicionadas em papel alumínio, colocadas em caixas seladas e mantidas a 20 o C até o momento do uso, segundo o protocolo sugerido por Kawarabayashi (Kawarabayashi et al., 2007) Antígeno Lisado Bruto de T. gondii para Ensaio Imunoenzimatico ELISA Para o preparo do extrato do antígeno bruto, a suspensão de taquizoítos obtida como descrito no item , foi centrifugada para sua sedimentação, seu sobrenadante descartado e no precipitado acrescentado 3 ml de água destilada. O sedimento então foi submetido à sonicação por ultrasom (Thornton INPEC Eletrônica S/A), a 10 ciclos por 5-10 períodos de 5 minutos cada com intervalos de 2 minutos, em banho de gelo, até a lise completa dos taquizoítos. A desintegração dos parasitas foi observada através de microscópio óptico empregando objetiva de 40X (Nikon Eclipse E4000), nos intervalos dos ciclos. Após a lise total, acrescentou-se 3 ml de solução de NaCl 0,3M para tornar isotônica a suspensão. Em seguida, essa solução foi centrifugada a g por 30 minutos a 4 o C, em centrífuga refrigerada. O sobrenadante resultante da centrifugação foi utilizado como antígeno e a proteína total desse extrato salino foi determinada pelo método de Bradford, (Bradford, 1976). O antígeno foi aliquotado e estocado a - 70ºC até o momento de sua utilização Antígeno Formolizado de T. gondii para Reação de Aglutinação Modificada MAT Segundo o protocolo de Desmonts e Remington (1980) com algumas modificações, a obtenção dos taquizoítos para a reação de Aglutinação Modificada requereu a utilização de células de Sarcoma TG180, para a 49

50 potencialização da produção dos taquizoítos no peritônio dos animais. O líquido ascítico tumoral contendo as células de sarcoma TG180 foi gentilmente cedido pelo Laboratório de Protozoologia do Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo. Os taquizoítos foram obtidos como descrito no item 3.5.1, contados em Câmara de Neubauer e diluídos na concentração 1X10 6 taquizoítos/ml. As células de Sarcoma TG180 foram contadas em Câmara de Neubauer e diluídas na concentração de 2X10 6 células/ml. As células de sarcoma murino e os taquizoítos foram misturados nas concentrações acima citadas e essa solução completada com salina estéril a 0,9% até 1 ml de líquido. Camundongos Swiss não isogênicos foram inoculados por via intraperotinial (i.p.) com 1ml da supensão de sarcomatg180 e taquizoítos de T. gondii. Após três dias da inoculação, o exsudato peritonial dos camundongos Swiss foi coletado com 10 ml de solução salina estéril a 0,9%. Os taquizoítos coletados dos animais foram purificados, com a retirada das células de sarcoma, utilizando filtro ISOPORE 3.0 µm, 47 mm de diâmetro (Millipore) e misturado volume a volume com uma solução de formalina a 12%, diluída em solução fisiológica estéril 0,9%. Essa mistura foi mantida em temperatura ambiente e deixada overnight. Em seguida, essa solução foi centrifugada a 600g por 10 minutos e o sedimento ressuspendido em 50 ml de solução salina estéril a 0,9%. Repetiu-se mais 3 lavagens com salina estéril para a remoção do formaldeído e o precipitado final foi ressuspendido entre 7 e 10 ml de solução tampão borato ph 8,7. A suspensão final, contendo 1X10 8 parasitas/ml foi conservada a 4ºC até o momento do uso Descrição das Reações Sorológicas Reação de Imunofluorescência Indireta RIFI A reação foi realizada segundo Camargo e Leser (1976), com antígeno formolizado de T. gondii para pesquisa de anticorpos da classe IgG. Em todos os testes foram utilizados controles negativos e positivos. Retirou-se do freezer 20ºC as lâminas contendo o antígeno, mantendo-as em temperatura ambiente. Para as amostras e controle de soro 50

51 canino, as diluições empregadas foram 1:16 e 1:1024, conforme Figura 4. Nas amostras e controles de soro eqüino as diluições foram 1:16, 1:256, 1:1024, 1:2048 e 1:4096, conforme Figura 5. Figura 4- Desenho esquemático da lâmina para Reação de Imunofluorescência Indireta com as diluições utilizadas para amostras caninas. Figura 5- Desenho esquemático da lâmina para Reação de Imunofluorescência Indireta com as diluições utilizadas para amostras eqüinas. 51

52 As diluições dos soros, previamente realizadas, foram depositadas em cada orifício da lâmina; seguiu-se incubação em câmara úmida por 30 minutos a 37 o C. Após a primeira incubação, as lâminas foram lavadas 2 vezes em PBS ph 7,2 por 10 minutos. Em seguida, cada orifício foi recoberto, dependendo dos soros que estavam sendo testados na reação, com conjugado anti-igg de cães (Sigma) e ou anti-igg de cavalos (Sigma), marcados com Isotiocianato de Fluoresceína-FITC, diluídos em solução de Azul de Evans 0,01% em PBS ph 7,2 utilizando a diluição de 1:200 no conjugado anti-igg de cães e equinos. Nova incubação foi realizada a 37 o C, ao abrigo da luz, por 30 minutos. As mesmas foram novamente lavadas 2 vezes em PBS ph 7,2 por 10 minutos, para remoção do excesso de conjugado, secas e montadas com preservativo (Glicerol-PBS 9:1 contendo 1 mg/ml de p-fenilenodiamina) sob lamínula para observação. A observação foi feita em microscópio de epifluorescência com lâmpada de mercúrio de 100 V (Nikon Eclipse E4000), com sistema de filtros para fluoresceína, sendo considerada positiva a diluição em que os taquizoítos apresentassem uma clara fluorescência verde na membrana celular, contra o fundo vermelho das formas coradas pelo Azul de Evans (Figura 6). Foram consideradas negativas as amostras que não apresentaram fluorescência nas membranas dos taquizoítos ou apresentaram fluorescência na região apical (Figura 7). O título foi considerado o inverso da maior diluição de soro com reação positiva. 52

53 Figura 6 - Controle positivo da Reação de Imunofluorescência Indireta Figura 7 - Controle negativo da Reação de Imunofluorescência Indireta 53