Aplicação do MLTS (multilocus sequence typing) na Genotipagem de Giardia Lamblia

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1 Ana Rita Lopes Marques Aplicação do MLTS (multilocus sequence typing) na Genotipagem de Giardia Lamblia Monografia realizada no âmbito da unidade Estágio Curricular do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas, orientada pela Professora Doutora Maria Céu Rodrigues Sousa e apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra Setembro 2015

2 Ana Rita Lopes Marques Aplicação do MLTS (multilocus sequence typing) na genotipagem de Giardia lamblia Monografia realizada no âmbito da unidade Estágio Curricular do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas, orientada pela Professora Doutora Maria do Céu Rodrigues Sousa apresentada à Faculdade de Farmácia Universidade de Coimbra Setembro 2015

3 Eu, Ana Rita Lopes Marques, estudante de Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas, com o número de estudante de , declaro assumir toda a responsabilidade pelo conteúdo da Monografia apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra, no âmbito da unidade Estágio Curricular. Mais declaro que este é um trabalho original e que toda e qualquer afirmação ou expressão, por mim utilizada, está referenciada na Bibliografia desta Monografia, segundo os critérios bibliográficos legalmente estabelecidos, salvaguardando sempre os Direitos de Autor, à exceção das minhas opiniões pessoais. Coimbra, 11 de Setembro de (Ana Rita Lopes Marques)

4 Monografia com o tema Aplicação do MLTS (multilocus sequence typing) na genotipagem de Giardia lamblia elaborada no âmbito do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia Universidade de Coimbra. A Tutora (Professora Doutora Maria do Céu Rodrigues Sousa) A Aluna (Ana Rita Lopes Marques)

5 Primeiro que tudo tenho de agradecer à minha orientadora, Professora Maria do Céu Sousa, toda o apoio, prontidão e paciência que teve comigo. Á minha família, por ter tentado sempre ajudar quando me viram desmoralizada, mesmo não percebendo de todo o tema desta monografia. Aos meus amigos, por toda a paciência que mostraram ter comigo. Obrigada por todo o apoio e palavras de força, foi sem dúvida fundamental para mim.

6 Resumo Giardia lamblia é um parasita protozoário comum, com distribuição mundial, que coloniza e se reproduz no intestino delgado, causando uma infeção chamada de giardíase. Este parasita infecta uma ampla gama de hospedeiros vertebrados, incluindo o homem, animais domésticos e selvagens. Muitos têm sido os estudos feitos para tentar perceber não só as suas características morfológicas e de virulência mas também os padrões de especificidade do hospedeiro e de transmissão, e o tipo de sintomatologia que provoca. Muitas destas investigações também tentam relacionar as características genéticas de Giardia lamblia com a sua distribuição mundial. Giardia lamblia apresenta elevada diversidade genética e considera-se um complexo de pelo menos oito assemblages genéticos, morfologicamente idênticos, (denominados A a H). Os assemblages são distinguidos por reação em cadeia da polimerase (PCR) e por sequenciação de genes, tais como a pequena sub-unidade de RNA ribossómico (SSU-rRNA), β-giardin (bg), glutamato desidrogenase (gdh) e triose-fosfato isomerase (tpi). O homem é só infetado por parasitas pertencentes aos assemblages A e B. Existe uma extensa sub-estruturação genética dentro dos assemblages A e B, e os parasitas são diferenciados por sequenciação de múltiplos loci em pelo menos cinco subassemblages (AI,AII, AIII e BIII-BIV). Recentemente têm-se recorrido cada vez mais à genotipagem multilocus, em que genes constitutivos (housekeeping) do parasita são amplificados por PCR e sequenciados, permitindo assim fazer uma distinção não só entre os assemblages como também entre subtipos e estabelecimento de genótipos MLST. Apesar do uso deste método mais avançado e com resultados mais fiáveis, ainda não é unânime se algum dos assemblage que parasitam o homem está associado ou não à virulência e sintomatologia. Em relação ao seu potencial zoonótico, já existem dados suficientes para afirmar que se pode considerar a giardíase como uma zoonose. 1

7 Abstract Giardia lamblia is a common protozoan parasite, with worldwide distribution that colonizes and reproduces the small intestine, causing an infection called giardiasis. This parasite infects a wide range of vertebrate hosts, including humans, domestic and wild animals. There are many studies that try to understand not only their morphological characteristics and virulence but also the host specificity and transmission standards, and the symptoms it causes. These investigations also try to relate the genetic characteristics of Giardia lamblia with its worldwide distribution. Giardia lamblia has high genetic diversity and is considered a complex of at least eight genetic assemblages, morphologically identical (named A to H). The assemblages are distinguished by polymerase chain reaction (PCR) and sequencing of genes, such as the small subunit ribosomal RNA (SSU-rRNA), β-giardin (bg), glutamate dehydrogenase (GDH) and triose- phosphate isomerase (tpi). Man is only infected by parasites belonging to assemblages A and B. There is extensive genetic sub-structure within the assemblages A and B, and parasites are distinguished by sequencing multiple loci in at least five sub-assemblages (AI, AII, AIII, BIII and B IV). The multilocus genotyping has been using more and more, where constitutive genes (housekeeping) of the parasite are amplified by PCR and sequenced, allowing to distinguish not only between the assemblages as well as between subtypes and establish MLST genotypes. Despite the use of the most advanced method and with more reliable results, it is still not unanimous if any of the assemblage that parasitize humans shows associations with virulence and symptoms and what will be its worldwide distribution. In relation to its zoonotic potential, there are already enough data to say what could be considered giardiasis as a zoonosis. 2

8 Lista de abreviaturas PCR - Reação em cadeia da polimerase MLTS - Multilocus Sequence Typing MLG - Multilocus genotype SSU rrna - Subunidade menor do RNAr gdh - glutamato desidrogenase bg - beta-giardina ef1- - o fator de elongação 1-alfa tpi - triose-fosfato isomerase 3

9 Índice 1. Introdução O Parasita Giardia lamblia A doença 7 4. Genotipagem Multilocus sequence typing (MLTS) Potencial zoonótico Virulência e sintomas Giardia lamblia em Portugal Conclusão Bibliografia. 19 4

10 1. Introdução Giardia lamblia, também designada por Giardia duodenalis ou Giardia intestinalis, é um parasita protozoário unicelular e flagelado responsável pelas diarreias não virais e não bacterianas, sendo o parasita intestinal mais comum. Infecta tanto o homem como outros mamíferos e tem uma distribuição mundial, sendo mais frequente em áreas com higiene precária e sistema de tratamento de águas deficiente. (Huey et al., 2013) A infeção é designada como giardíase, sendo também conhecida por diarreia do viajante. É uma das doenças mais comum com origem em águas e alimentos contaminados e afeta por ano aproximadamente 280 milhões de pessoas em todo o mundo (Ankarklev et al., 2012). Devido ao aumento desta doença nos países em desenvolvimento e ao aumento de surtos principalmente em creches, levaram a que a Organização Mundial de Saúde incluísse a giardíase na lista de doenças negligenciadas (Savioli, Smith e Thompson, 2015). G. lamblia apresenta oito assemblages distintos (A-H), em que apenas o A e o B parasitam o homem e por isso têm sido os mais estudados. Estes assemblages são morfologicamente similares mas apresentam características fenotípicas e genéticas bastante heterogéneas. Para se conseguir um controlo efetivo e estratégias de prevenção adequadas, é necessário conhecer bem a epidemiologia da giardíase tal como os padrões de propagação e vias de transmissão (Siripattanapipong et al., 2011). Com este objetivo, têm-se vindo a usar ao longo da última década técnicas simples de PCR na caracterização genética de G. lamblia em amostras clínicas e ambientais. Mais recentemente, tem-se recorrido ao sequenciamento genético multilocus (MLTS), que permite obter resultados mais seguros uma vez que analisa mais do que um gene para definir o perfil genético do parasita. Na sua maioria, estes estudos pretendem diferenciar os subassemblages e os genótipos MLTS. 5

11 2. O Parasita Giardia lamblia Giardia lamblia é uma de seis espécies do género Giardia, sendo a única que parasita o homem. G. lamblia pode apresentar-se na forma de quisto ou trofozoíto (forma vegetativa). O quisto é responsável pela transmissão da doença, tem uma forma ovóide e pode sobreviver até vários meses no ambiente. É o trofozoíto que provoca a doença no organismo, tem flagelos que lhe permitem movimentar-se e desintegra-se facilmente fora do organismo. A transmissão é fecal-oral e ocorre com a ingestão de quistos que podem estar presentes em água ou alimentos contaminados. Os trofozoítos desenvolvem-se e multiplicam-se no intestino do mamífero infetado e completam o seu ciclo de vida com a emissão de quistos novamente para o ambiente pelas fezes, sendo o seu ciclo de vida monoxeno (Figura 1). Figura 1 Ciclo de vida de Giardia lamblia. ( consultado a 28/08/2015). 6

12 3. A doença A giardíase tem um grande impacto na saúde pública devido à sua alta prevalência e distribuição mundial. A infeção pode ser apenas assintomática ou pode apresentar sintomas como diarreia, flatulência, náuseas, vómitos, perta de peso e dores intestinais que, aparecendo de forma abrupta indicam que doença estará na sua fase aguda. No caso dos sintomas apenas aparecerem em determinados períodos indica que se está na fase crónica da doença (Yaoyu e Xiao, 2011). A presença dos trofozoítos no intestino pode alterar a permeabilidade celular e a absorção e diminuir a área de superfície da mucosa provocando, assim, a síndrome da má absorção e diarreia. Este parasita cosmopolita afeta principalmente crianças em creches, presos, idosos em lares ou pessoas que vivam com condições sanitárias deficientes. Afeta também viajantes que visitam zonas endémicas, sendo um dos agentes etiológicos da diarreia do viajante. No caso de esta infeção ser assintomática no viajante, pode ter um papel importante na sua disseminação. Existem múltiplos estudos que relacionam a presença da doença e o seu efeito na nutrição e crescimento das crianças: crianças infetadas apresentam um peso menor, níveis de ferro sérico e de zinco mais baixos em relação ao grupo de controlo (crianças sem giardíase) (Abou-Shady et al., 2011). A duração da infeção e a sua associação com diarreia é o fator mais importante para o atraso no crescimento (Huang e White, 2006), apesar de também acontecer em crianças assintomáticas (Prado et al., 2005). Existem também estudos que indicam efeitos no desenvolvimento cognitivo e inteligência das crianças (Simsek, Zeyrek e Kurcer, 2004). A variabilidade dos sintomas podem ter múltiplos fatores, entre eles fatores do hospedeiro, como o estado nutricional, a flora intestinal ou o tipo de resposta imune que poderá desenvolver, ou fatores do parasita como a virulência das estirpes que depende do tipo de proteínas de superfície ou proteases (Fisher, Estraño e Cole, 2013).Os diferentes genótipos existentes de G. lamblia podem também estar associados à sintomatologia da doença, pelo que é importante estudar as diferenças genéticas e o tipo de sintomas e severidade que provocam (Tungtrongchitr et al., 2010). 7

13 4. Genotipagem A biologia molecular veio permitir usar novos métodos para caracterizar Giardia, e para a análise de diferenças genéticas anteriormente desconhecidas, possibilitando assim um novo conhecimento da sua taxonomia, genética das populações e epidemiologia no homem e animais. Apesar de alguns ensaios simples de PCR terem sido utilizados para a deteção de Giardia em amostras clínicas e ambientais, a maioria das ferramentas moleculares recentes são utilizados para a diferenciação de Giardia nos níveis de assemblage e genótipo (Wielinga e Thompson, 2007). O estudo dos diferentes assemblages de G. lamblia poderá ser útil para conseguir perceber até que ponto é que influenciam não só a sintomatologia e gravidade da doença, como também a dinâmica da transmissão ou até mesmo para tentar rastear a fonte de contaminação. G. lamblia apresenta oito assemblages distintos (A-H), em que apenas o A e o B parasitam o homem (Tabela1). Contudo, os assemblages A e B parasitam também vários animais enquanto os outros assemblages são específicos. Os múltiplos estudos que comparam os assemblages focam-se principalmente no A e no B, pois são os únicos que afetam o homem e os animais, e conhecer a diferença entre eles pode ajudar a perceber o seu potencial zoonótico. A prevalência e distribuição é diferente de país para país e as designações dos vários subtipos não é unânime, pelo que serão abordados os mais comuns e que obtêm mais consenso. Tabela 1 Hospedeiros mais comuns de cada assemblage de Giardia lamblia. (Adaptado de Yaoyu e Xiao, 2011). Assemblage A B C D E F G H Hospedeiros principais Homem, primatas, ruminantes domésticos e selvagens, porcos, cavalos, cães, gatos e outros mamíferos Homem, primatas, cavalos, cães, coelhos e gado Cães Cães Porcos e ruminantes domésticos Gatos Ratos Focas 8

14 O sucesso dos métodos de diagnóstico molecular é determinado pelas técnicas selecionadas (ex. PCR-RFLP, qpcr; sequenciação), pelo número de loci utilizados na análise ou pelo gene alvo a analisar. Normalmente para o estudo da G. lamblia recorrem-se a sequências de genes da subunidade menor do RNAr (SSU rrna) e a vários genes constitutivos como o glutamato desidrogenase (gdh), a beta-giardina (bg), o fator de elongação 1-alfa (ef1 ), e da triose-fosfato isomerase (tpi). (Siripattanapipong et al., 2011) (Tabela 2). A utilização destes genes loci permite fazer a caracterização genética de G. lamblia. As taxas de substituição destas regiões conservadas diferem, pelo que a sua utilização para a classificação de Giardia é diferente. As taxas de substituição são de 0.01, 0.033, 0.06 e 0.12 para o SSU rrna, bg, gdh e tpi, respetivamente (Wielinga e Thompson, 2007). Assim, o gene SSU rrna é um bom diferenciador de espécies e assemblages. Apesar disso é preciso ter em atenção que o gene não é amplificado na sua totalidade e, portanto o fragmento amplificado, que depende dos primers usados, pode não diferenciar todos os assemblages de G. lamblia (Cacciò et al., 2008). O gdh e o tpi podem ser usados para identificar todos os assemblages e subtipos de G. lamblia, enquanto o bg os resultados não são conclusivos em relação aos subtipos do assemblage B (Siripattanapipong et al., 2011). Tabela 2 Gene-alvo, primers, especificidade e uso mais comum dos genes de Giardia lamblia. (Adaptado de Yaoyu e Xiao, 2011). Gene Primer (exemplos) (sequência [5-3 ]) Tamanho (bp) Especificidade Utilidade tpi AL3543 (AAATIATGCCTGCTCGTCG) AL3546 (CAAACCTTITCCGCAAACC) AL3544 (CCCTTCATCGGIGGTAACTT) 605 Especifica do género Genotipagem e Subgenotipagem gdh Ghd1 (TTCCGTRTYCAGTACAACTC) Gdh2 (ACCTCGTTCTGRGTGGCGCA) GDH1 (ATCTTCGAGAGGATGCTTGAG) GDH4 (AGTACGCGACGCTGGGATACT) Especifica do género Genotipagem e Subgenotipagem SSU rrna RH11 (CATCCGGTCGATCCTGCC) GiarF (GACGCTCTCCCCAAGGAC) GiarR (CTGCGTCACGCTGCTCG) Especifica do género Genotipagem bg G7 753 Genotipagem e bg (AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC) Desconhecida Sub- GiarF (GAACGAACGAGATCGAGGTCCG) 511 genotipagem 9

15 Os genes bg, tpi e gdh são os mais utilizados para a genotipagem de Giardia porque é possível obter uma boa amplificação através dos primers. Calculando o poder discriminatório de cada um individualmente e da combinação de dois loci é possível concluir que a classificação dos genótipos fica bastante melhorada (Siripattanapipong et al., 2011). Apesar disso, muitos dos resultados obtidos têm sido inconsistentes (Yaoyu e Xiao, 2011) Multilocus sequence typing (MLTS) A genotipagem multilocus é usada para estudos filogenéticos e envolve a amplificação dos genes constitutivos ou housekeeping por PCR, seguindo da sequenciação do DNA. Estes genes são conservados e essenciais para a manutenção de funções celulares básicas do organismo e são expressos em níveis relativamente constantes. No multilocus sequence typing (MLTS), as sequências de DNA são comparadas e as análises filogenéticas são realizadas com bases em matrizes de similaridade ou diretamente da sequência. Assim, as diferenças existentes nos nucleótidos num número variável de genes permitem fazer a distinção entre genótipos ou sub-genótipos, dependendo do grau de discriminação considerado (Cristina et al., 2011). Um estudo multilocus feito em fezes recolhidas de 484 crianças na Malásia, recorreu a genes tpi, bg e gdh para identificar e diferenciar os assemblages de G. lamblia (Tabela 3) (Huey et al., 2013). Das amostras recolhidas, 17% tinham o parasita (84 em 484) e dessas 71 foram sequenciadas com sucesso. A percentagem de amplificações bem-sucedida foi de 70% para o gene tpi, 45% para o gdh, e 33% para o bg. A partir deste método de genotipagem foi possível identificar 30 (42%) amostras pertencentes ao assemblage A e 32 (45%) ao assemblage B. Em relação à genotipagem por subassemblage apenas foram detetados o A2 e A3, que percebem ao subassemblage AII, o que confirma resultados obtidos noutros estudos que concluem que este é o subassemblage mais comum no homem. Em relação ao assemblage B as sequências obtidas mostraram nucleótidos heterogéneos nas posições que definem o subassemblage, não sendo possível fazer a sua diferenciação. Isto confirma que o assemblage B tem uma grande variação de nucleótidos. 10

16 Tabela 3 Distribuição dos assemblages A e B e de infeções mistas. (Adaptado de Huey et al., 2013). Genes Genótipos n (%) A B A + B Total tpi 34 (58) 25 (42) - 59 gdh 7 (18) 31 (82) - 38 bg 18 (64) 10 (36) - 28 MLGs a 3 (27) 8 (73) - 11 tpi-mixed b 1 (2) 23 (34) 43 (64) 67 a isolados com o mesmo genótipo identificados através do tpi, gdh e bg. b primers específicos para identificar infeções mistas. Um outro estudo, feito em crianças de creches em Madrid, para além do genótipo, comparou também algumas características das crianças. A infeção foi distribuída em crianças de todas as idades, embora as com meses apresentassem maior prevalência, a distribuição por géneros foi muito idêntica e apenas 17,6% apresentaram sintomas clinicamente compatíveis com a doença. As creches são locais onde o risco de contrair esta doença é relativamente alto, uma vez que as crianças estão mais suscetíveis à transmissão fecal-oral, não só devido a uma grande atividade mão-boca e aos poucos cuidados de higiene, como também ao seu sistema imunitário imaturo. (Mateo et al., 2014). Das amostras de G. lamblia caracterizadas, todas pertenciam ao subassemblage BIV e a crianças assintomáticas. Apesar do baixo número de amostras, o assemblage B parece ser o prevalente naquela área de Espanha. Num outro estudo realizado no Brasil, onde se recolheram amostras de hospitais, clínicas veterinárias, lares e de zonas ambientais importantes, foi feito a análise MLTS recorrendo-se aos genes bg, tpi e gdh. Desta análise obteve-se uma grande diversidade de assemblages presentes (A, B, C, D e E) (Tabela 4). Apenas dez MLGs foram identificados, sete pertencentes ao subassemblage AII e três pertencentes ao BIV (Durigan et al., 2014). 11

17 Tabela 4 Distribuição dos assemblages de Giardia relativamente aos diferentes genes utilizados para a sua caracterização. (Adaptado de Durigan et al., 2014). Assemblage bg tpi gdh A B C D E 1-1 Total Assemblage A: A maioria dos estudos divide este assemblage em dois subassemblages que são denominados AI e AII. Num estudo que compara o assemblage A e B foram utilizados os genes SSU rrna, tpi, bg e gdh (Cacciò et al., 2008). Destes quatro genes, apenas o SSU rrna não mostrou qualquer variabilidade entre os isolados do assemblage A, pelo que não é considerado um gene útil para diferenciar os subtipos. Os outros três genes apresentaram variação genética, que permitiram identificar dez MLGs diferentes para este assemblage, os quais foram incluídos no subassemblage AI e AII e designados por AI-1, AI-2, AII-1 a AII-7 e AIII-1 (Tabela 5). Tendo em conta a distribuição dos subassemblages, o AII é considerado antroponótico, enquanto os AI e AIII possuem potencial zoonótico uma vez que se encontram em gado e animais domésticos e selvagens. Assemblage B: O assemblage B é usualmente dividido nos subassemblages BIII e BI e, analogamente ao que se verificou relativamente ao assemblage A, o gene SSU rrna é o único que não apresenta variabilidade dentro do assemblage. O assemblage B, em comparação com o assemblage A, mostra ter uma diversidade genética significativamente maior o que torna muitas vezes difícil a classificação dos isolados em subassemblages BIII ou BIV (Siripattanapipong et al., 2011). Uma das razões para este polimorfismo pode ser a recombinação intra-assemblage que pode acontecer em infeções mistas ou devido a sequências alélicas heterozigóticas. Assim, seria importante considerar a hipótese de usar os genes mais conservados para 12

18 melhor definir os subassemblages B, pois devido ao fato de ser geneticamente bastante diversificado, esses genes que são constantes dentro do genótipo poderão permitir obter dados mais seguros em relação à classificação dos subassemblages B. Assim, seria importante tentar encontrar outras estratégias para fazer a sua genotipagem. Tabela 5 Sub-assemblage, MLG e genes do assemblage A de Giardia lamblia em isolados de origem humana e animal. (Cacciò et al., 2008). Subassemblage AI AII MLGs Genes bg tpi gdh Hospedeiro AI-1 A1 A1 A1 Homem, gado, búfalo, gato, cão e porco AI-2 A5 A5 A5 Homem e gato AII-1 A2 A2 A2 Homem AII-2 A3 A2 A3 Homem AII-3 A2 A2 A3 Homem AII-4 A3 A2 A4 Homem AII-5 A3 A1 A3 Homem AII-6 A3 A3 A3 Homem AII-7 A3 A4 A3 Homem AIII AIII-1 A6 A6 A6 Veado e javali Apesar de alguns estudos detetarem divergências na identificação dos genótipos entre os diferentes loci utilizados, indicando que têm informação genética diferente (Cacciò et al., 2008; Traub et al., 2004; Durigan et al., 2014), será sempre preferível a sua utilização relativamente ao uso de um único marcador. Embora já existam estudos que comparem o poder discriminatório dos vários marcadores genéticos, seria importante a existência de um protocolo que uniformizasse todos estes marcadores para o estudo molecular epidemiológico de G. lamblia (Siripattanapipong et al., 2011). 13

19 5. Potencial zoonótico Perceber até que ponto a giardíase humana se trata de uma doença zoonótica é muito importante, não só para perceber a doença, como se transmite e como evitar que se torne um risco para a saúde pública. Estudos apontam que o assemblage mais comum em gado, tanto no norte da América como na Europa, é o assemblage E (Sulaiman et al., 2003). Assim, os assemblages que são patogénicos para o homem tem de competir nestes animais com o assemblage E. Esta conclusão também pode ser válida para assemblages como o C e D que são mais comuns em animais como cães e gatos. O MLTS é muito usado para estudar o possível potencial zoonótico por ter um grande poder discriminatório. Um estudo feito na Suíça com o objetivo de estudar este potencial zoonótico analisou sequências de isolados em que estava presente a G. lamblia de 14 espécies diferentes de animais e comparou com genótipos que já tinham sido obtidos, também de diferentes espécies. Esta investigação concluiu que a maioria dos assemblages encontrados foram do C ao G, como seria de esperar, uma vez que têm como hospedeiros específicos diferentes espécies animais. Apesar disso, também foram encontradas as assemblages A e B em diversos animais, o que indica para o possível potencial zoótico da G. lamblia (Lebbad et al., 2010). Encontrar os mesmos assemblages ou subassemblages pelo método MLTS pode não ser conclusivo, por si só, de uma infeção zoonótica. Para confirmar que se está realmente perante uma transmissão zoonótica deve-se comparar isolados de humanos e animais que vivem no mesmo sítio ou que a fonte de origem da doença é a mesma. Contudo, estudos realizados nestas condições também não foram totalmente concordantes entre si. Numa zona endémica no Perú, foram analisados isolados humanos e de cães. Dos 167 de origem humana foram classificados como assemblage A e B e foi detetada a sua coexistência em famílias e indivíduos, onde também se verificou a existência de recombinação genética entre os isolados A2. Os 67 isolados de origem canina pertenciam aos assemblages C e D, concluindo este estudo que a infeção zoónica é incomum (Cooper et al., 2010). Pelo contrário, um estudo feito numa comunidade em Itália bastante carenciada, em que foram analisadas crianças e cães que apresentavam sintomatologia da doença e que de certo modo partilhavam o mesmo ambiente, mostrou que 99,5% das amostras foram identificados como o subassemblage AI, sendo o único encontrado (Marangi et al., 2010). 14

20 Num outro estudo bastante similar a este último, feito na cidade do Rio de Janeiro, no qual foram analisadas amostras humanas (adultos e crianças) e animais domésticos (cães e gatos) também demostrou que só o subassemblage AI estava presente (Volotão et al., 2007). Também na India foram encontrados os mesmos subassemblage, neste caso o AII, em humanos e cães que partilhavam o mesmo ambiente (Traub et al., 2004). Atualmente, considera-se que existem dados suficientes para considerar a giardíase uma zoonose. 6. Virulência e sintomas Muitos são os estudos que tentam relacionar os assemblage de G. lamblia com a virulência e com a sintomatologia da infeção. Os diferentes assemblages podem ser responsáveis pela produção de metabolitos e toxinas diferentes, o que poderá influenciar a patogenicidade de Giardia (Tungtrongchitr et al., 2010). Apesar de muitos, os estudos não têm sido concordantes em relacionar um dado assemblage com determinada sintomatologia. Um estudo feito na Suécia com amostras de fezes de 214 pessoas infetadas por G. lamblia, usou o MLTS de três loci (bg, gdh e tpi) (Lebbad et al., 2010). Dos resultados obtidos, concluiu-se que seis famílias foram infetadas com o genótipo A, oito com o genótipo B. A única correspondência detetada foi a presença de flatulência em crianças com o genótipo B, todos eles com idades compreendidas entre os 0 e os 5 anos. Também se verificou que nas famílias analisadas todos os membros tinham os mesmos MLGs, mas apenas alguns desenvolveram sintomas. Estes resultados reforçam as evidências de que fatores relacionados com o hospedeiro também são importantes no desenvolvimento ou não de sintomatologia (Lebbad et al., 2011). Outros estudos sugerem o assemblage A como o mais virulento, quando comparado com o assemblage B (Yaoyu e Xiao, 2011). Numa investigação feita em Londres, ambos os assemblages foram detetados em indivíduos com sintomatologia, mas o A foi significativamente mais associado à febre (Breathnach, McHugh e Butcher, 2010). O assemblage B é também mais vezes associado a infeções assintomáticas, como demonstrou um estudo feito em Espanha, no qual crianças com menos de 5 anos apresentaram uma infeção sintomática quando infetadas com o assemblage A (Sahagún et al., 2008). O mesmo aconteceu em crianças australianas na mesma faixa etária, em que as parasitadas com o assemblage A apresentaram diarreia com elevada frequência, 26 vezes mais relativamente às parasitadas com o assemblage B (Mikaberidze, 2007). 15

21 Contudo, outros estudos apresentam resultados contrários, como por exemplo um estudo feito em crianças na Arábia Saudita, verificou-se que as que apresentavam sintomas estavam parasitadas com o assemblage B e que apenas os subassemblages AI e AII foram identificados nas infeções assintomáticas (Al-Mohammed, 2011). Também o assemblage B foi associado mais significativamente a crianças e adultos da Etiópia com sintomas de giardíase (Gelanew et al., 2007). Outra investigação, feita no norte de Inglaterra, concluiu que o assemblage A é mais prevalente em pessoas mais velhas (Figura 2). O assemblage B apresentou 64% de prevalência, o A 33% e foram detetadas 3% de infeções mistas. Foi também possível identificar 17 MLG no assemblage B, mostrando assim a sua grande heterogeneidade das posições dos nucleótidos. A maioria dos isolados do assemblage A pertencia ao subassemblage AII. Em relação à associação dos assemblages com os sintomas, concluiu-se que os doentes com o assemblage B reportaram maior frequência de sintomas (Tabela 6). Figura 2 Distribuição do assemblage A e B por idade. (Adaptado de Minetti et al., 2015). Pacientes infetados com Giardia Sintomas lamblia Assemblage A Assemblage B Diarreia 49 (96,1) 89 (98.9) Dor abdominal 34 (71) 69 (79) Sangue nas fezes 5 (11.1) 1 (1.2) Tabela 6 Sintomas de pacientes com giardíase por assemblages (Adaptado de Minetti et al., 2015). 16

22 Vómitos 18 (40) 52 (61.2) Febre 19 (45.2) 40 (48) As discrepâncias entre os estudos reportados, relativamente à associação dos grupos genéticos e a sintomatologia, podem dever-se a vários fatores: variações nos subassemblages/genótipos-mlg; presença de infeções mistas onde os assemblages podem funcionar sinergicamente; características do hospedeiro (Robertson et al., 2010). 7. Giardia Lamblia em Portugal Em Portugal foram feitos vários estudos para estudar a distribuição dos assemblages de Giardia nas infeções humanas, animais e no ambiente. Numa dessas investigações foram recolhidas 190 amostras de crianças, das quais 7 estavam infetadas pelo parasita (3,7%). Destas amostras positivas, cinco delas pertenciam ao assemblage B e duas ao assemblage A (Almeida et al., 2006). Um outro estudo, realizado com amostras da zona norte e centro do país obteve 29 amostras positivas a Giardia. Das amostras que foram amplificadas com sucesso todas pertenciam ao assemblage AI, sendo este que aparentemente prevalece nesta região (Sousa et al., 2006). Uma outra investigação feita em gado no norte do país apontou para uma taxa de infeção de 9%. Das 14 amostras amplificadas, duas pertenciam ao assemblage A, uma ao B e onze ao E (Mendonça et al., 2007). Por último, um estudo feito em amostras de água de superfície ou subterrâneas recolhidas de vários pontos de estações de tratamento, na cidade de Lisboa, demonstrou a presença de G. lamblia em 67 das 175 amostras recolhidas (38%). Apenas foi detetado o subassemblage AI (Lobo et al., 2009). 17

23 8. Conclusão Giardia lamblia é um dos parasitas protozoários mais estudados, uma vez que tem uma distribuição mundial. O uso de técnicas de diagnóstico molecular veio responder as questões relacionadas não só com a transmissão de giardíase no homem e animais, mas também veio permitir uma melhor caracterização do parasita. Com os resultados obtidos de uma grande quantidade de estudos, pode-se considerar que a giardíase é uma zoonose. Atualmente recorre-se muito ao MLTS para fazer a caracterização de G. lamblia em isolados humanos e de animais de forma a conhecer as vias de transmissão do parasita. Deste modo, é possível determinar o potencial infecioso do parasita para o homem, dependendo do assemblage e subassemblage detetado. Apesar de ser um método útil ainda existem dificuldades, como a falta da padronização dos grupos genéticos e da nomenclatura. Existe também alguma dificuldade em conseguir uma boa amplificação dos loci utilizados, devido à quantidade e qualidade do DNA extraído das amostras e dos inibidores da PCR presentes nas fezes. Atualmente considera-se a existência de dois sub-grupos em cada um dos assemblage A e B de G. lamblia, denominados de AI e AII e BIII e BIV, respetivamente. Em relação à virulência, sintomas e distribuição mundial os resultados não são unânimes. Os vários estudos mostram que a prevalência mundial dos assemblages e subassemblages é diferente e a sua associação com a sintomatologia são contraditórios. Apesar do enorme número de estudos moleculares, ainda existem muitas questões para responder, como por exemplo, qual será o papel dos animais na transmissão da doença para o homem, qual o grau da doença nas infeções zoonóticas e qual o impacto das infeções com misturas de assemblages. 18

24 Estas questões podem ser abordadas de forma eficaz através de melhorias das ferramentas de diagnóstico molecular, a utilização mais sistemática destas ferramentas em estudos epidemiológicos e uma melhor compreensão da genética populacional de G. lamblia em vários hospedeiros sob diferentes condições socioeconómicas e ambientais. 9. Bibliografia ABOU-SHADY, Omaima et al. - Impact of Giardia lamblia on Growth, Serum Levels of Zinc, Copper, and Iron in Egyptian Children. Biological Trace Element Research.. ISSN :1 (2011) 1 6. doi: /s ALMEIDA, ANDRÉ A. et al. - Genotype Analysis of Giardia Isolated from Asymptomatic Children in Northern Portugal. Journal of Eukaryotic Microbiology.. ISSN :2006) S177 S178. doi: /j x. AL-MOHAMMED, Hamdan I. - Genotypes of Giardia intestinalis clinical isolates of gastrointestinal symptomatic and asymptomatic Saudi children. Parasitology Research.. ISSN :6 (2011) doi: /s ANKARKLEV, Johan et al. - Common Coinfections of Giardia intestinalis and Helicobacter pylori in Non-Symptomatic Ugandan Children. PLoS Neglected Tropical Diseases. San Francisco, USA.. ISSN (Print). 6:8 (2012). doi: /journal.pntd BREATHNACH, A S.; MCHUGH, T. D.; BUTCHER, P. D. - Prevalence and clinical correlations of genetic subtypes of Giardia lamblia in an urban setting. Epidemiology and infection.. ISSN :10 (2010) doi: /S CACCIÒ, S. M. et al. - Multilocus genotyping of Giardia duodenalis reveals striking differences between assemblages A and B. International Journal for Parasitology.. ISSN :13 (2008) doi: /j.ijpara

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