Algumas considerações e perguntas sobre a organização dos Ácidos Nucléicos

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1 Biologia Celular e Molecular, Tecidual e do Desenvolvimento ROTEIROS PARA ESTUDO DIRIGIDO Das AULAS TEÓRICAS Biologia Molecular RESPONSÁVEL: Angela Kaysel Cruz O livro texto indicado para estudar os tópicos abaixo e responder às perguntas do estudo dirigido é o Lehninger - Principles of Biochemistry (edição: Terceira ou Quarta) David L. Nelson Michael M. Cox O livro Fundamentos em Biologia Celular de Alberts e Colaboradores pode servir como leitura básica. Na internet pode-se ter acesso a material didático bastante útil para compreender esses tópicos e aspectos da tecnologia do DNA recombinante, com animações, textos e esquemas em vários Sítios, alguns deles nós conferimos e sugerimos como fonte extra de consulta. Eles estão listados como Material Didático Suplementar entre os arquivos depositados na mesma homepage do Departamento. Algumas considerações e perguntas sobre a organização dos Ácidos Nucléicos Como repositório de toda a informação genética de uma célula ou organismo, os Ácidos Nucléicos estão presentes em todos os seres vivos. São responsáveis pelo fluxo desta informação pelos processos que vão culminar com a composição estrutural das biomoléculas presentes em uma célula, incluindo toda a maquinaria protéica e enzimática que permite o funcionamento harmônico da célula ou, em metazoários, das células que interagem. Assim, a informação e seu fluxo ocorrem de acordo com a programação estabelecida em última análise pela informação genética que os próprios ácidos nucléicos carregam.

2 Inicialmente é importante caracterizar os ácidos nucléicos, que podem ser de dois tipos: o ácido desoxiribonucléico, ou DNA, e o ácido ribonucléico, ou RNA, biopolímeros que têm como unidades monoméricas os nucleotídeos. 1. Desenhe um nucleotídeo e identifique cada um dos componentes 2. Identifique a diferença entre um desoxi e um ribonucleosídeo 3. Conheça a nomenclatura Há uma questão de nomenclatura que pode ser motivo de confusão posterior. Para diferenciar os carbonos participantes da molécula do açúcar dos mesmos que participam do anel das purinas e pirimidinas, aos carbonos das pentoses adiciona-se ao número (1, 2, 3, 4 e 5) uma (linha). Assim teremos os carbonos 1, 2, 3 etc. Numere os anéis do nucleotídeo que desenhou. Ao açúcar liga-se um grupo fosfato no carbono na posição 5. Um nucleotídeo como parte integrante de um ácido nucléico tem um único grupo fosfato, sendo portanto um nucleosídeo monofosfato. Por que a síntese do DNA (e RNA) depende da participação de um nucleosídeo trifosfato? Quais são as cinco bases nitrogenadas majoritárias? Existem outras? Onde são freqüentemente encontradas? Como indicam seus nomes, o DNA tem em seus monômeros uma desoxiribose e o RNA uma ribose de forma que a diferença entre eles está na existência de um grupo OH no carbono 2 (ribose) ou um hidrogênio nesta mesma posição (desoxiribose), além de uma base nitrogenada. Quais são as diferenças marcantes na química dos dois tipos de ácidos nucléicos decorrentes da diferença? É sempre importante lembrar que a estrutura e função das moléculas estão relacionadas, ou seja, a estrutura reflete e ao mesmo tempo é reflexo das funções da biomolécula, isso também é verdade para os Ácidos Nucléicos. Assim, o DNA, que tem como função única conhecida ser o repositório de toda a informação genética de um organismo vivo, tem uma estrutura, ainda que plástica, pouco variável. O RNA,

3 por sua vez, tem uma plasticidade muito mais ampla e veremos que as diferentes organizações estruturais alcançadas pela molécula são refletidas na amplitude de seus papéis funcionais. Voltaremos ao RNA, suas estruturas e funções em outra aula. Vamos primeiro fazer uma breve abordagem da história das pesquisas em genética molecular que permitiram a identificação do DNA como repositório da informação genética e como foi possível caracterizar sua estrutura como posto por Watson e Crick na década de 50, do século passado. Apesar de haver desde o final do século dezenove a confirmação da presença de ácidos nucléicos na célula, podemos considerar como um marco os experimentos de transformação realizados na década de 40 por Avery, MacLeod e McCarty que demonstraram, de forma quase definitiva que a informação genética estava no DNA. Nesta época havia ainda o debate se seriam os A. nucléicos ou as proteínas que carregariam a informação genética, já que parecia a muitos que uma molécula tão simples não poderia albergar tão complexa informação. Os experimentos realizados pelo grupo tinham como objetivo demonstrar (ou investigar se...) que a carga genética de um organismo residia em biomoléculas resistentes a desnaturação induzida por calor e que este fator poderia ser transferido de uma bactéria a outra (a transformação). Descreva e entenda o que o grupo de pesquisadores fez e a que conclusão chegou. Ainda assim havia ceticismo entre alguns pesquisadores que consideravam possível que alguma proteína pudesse ter resistido ao tratamento. Foi então após os experimentos de seguimento de uma cultura de E.coli infectada por bacteriófagos na presença de isótopos radioativos de enxofre (S 35 ) e fósforo (P 32 ). Quais foram seus resultados e porque essa foi considerada a demonstração definitiva de que eram os ácidos nucléicos as moléculas responsáveis pela manutenção da informação genética? Paralelamente, nesta época outros grupos estudavam a estrutura do DNA e as informações geradas foram importantes para que na década de 1950 Watson e Crick pudessem propor um modelo para a estrutura da molécula de DNA. O modelo foi construído unicamente com bastões e esferas tendo como base o conhecimento da

4 química dos componentes que participam do polímero. Eles usaram ainda as informações geradas por Chargaff que definiu como uma das regras da composição do DNA que o conteúdo de adeninas e timinas era sempre bastante semelhante, o mesmo ocorrendo com as guaninas e citosinas. Quais são as outras regras que Chargaff definiu? Além disso, Franklin e Wilkins haviam conduzido experimentos de difração de Raio X para compreender a estrutura do DNA e tinham demonstrado a existência de um padrão repetitivo e com dimensões definidas, que foram usadas como base para a construção do modelo. Watson e Crick construíram um modelo no qual se adaptariam bem as bases nitrogenadas, com sua característica planar. Qual a importância dessa característica para a estrutura do DNA? Qual a importância das interações por pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas? Ainda mais, o modelo, como definido, permitia que a regra de Chargaff fosse obedecida: a do pareamento perfeito. Quais são as interações que nomeamos pareamento perfeito? Qual diferença entre os pares formados é relevante para a formação e estabilidade do polímero? Nesse modelo as bases encontram-se empilhadas e paralelas a um longo eixo no qual as desoxirriboses dos nucleotídeos vizinhos estão ligadas. Que ligação é essa? Saiba quais os carbonos envolvidos e faça um esboço da ligação? Porque essas ligações do longo eixo levam à polaridade da cadeia? Que polaridade é essa? Mostrea em um esboço, apontando as extremidades livres (e suas características). Este esqueleto é hidrofílico? Por quê? Quem empresta o caráter ácido ao DNA? As bases nitrogenadas, como você já deve saber, apresentam-se em posição que permite a formação de ligações de hidrogênio com suas bases ditas complementares (A com T e G com C) de uma outra fita (dita, portanto, complementar), desde que a outra cadeia simples esteja posicionada em situação antiparalela para permitir o encaixe espacial. O que é o antiparalelismo? A estrutura do DNA permite o empilhamento entre as bases internamente em cada fita, e por causa dos ângulos formados entre as bases complementares que

5 interagem, as duas fitas antiparalelas adquirem uma distribuição helicoidal que ser parece com uma escada em caracol. Nela, segundo o modelo, a cada volta completa da hélice (que é voltada para a direita) encontraremos 10 e meio pares de bases e a hélice forma um sulco profundo e um sulco raso, também em função da arquitetura e distribuição dos componentes. Este modelo era também compatível com a periodicidade e dimensões encontradas no padrão de difração de Raio-X. Qual a importância que os sulcos raso e profundo adquirem na atividade funcional do DNA? Por que? O modelo valeu aos pesquisadores o prêmio Nobel e à comunidade uma estrutura robusta do ponto de vista conceitual e que foi experimentalmente comprovada à exaustão. Esta estrutura ainda explica uma série de características funcionais da molécula. Assim, a molécula de DNA tem polaridade 5-3, é formada por duas fitas antiparalelas e o esqueleto hidrofílico de pentoses e grupos fosfato fornecem o caráter ácido ao polímero. Quais são e quem exerce as forças de repulsão e coesão que sofre uma longa cadeia de DNA? inclua as forças intrínsecas e extrínsecas ao DNA, que devem ocorrer in vivo. É importante frisar que a estrutura do DNA como proposta por Watson e Crick é denominada forma B do DNA. Ela pode sofrer alterações regionais em função de condições iônicas ou ainda que em função de algum viés de composição primária a hélice pode encontrar-se voltada para a esquerda, o conteúdo específico de regiões também pode alterar a forma B. Saiba dizer quais são as principais formas alternativas e aponte uma possível função para algumas dessas alterações. O equilíbrio entre as forças de repulsão e atração é fundamental para a plasticidade necessária para que a molécula de DNA possa cumprir seu papel. Saiba exemplificar e explicar essa afirmativa. Qual o principal fator (que advém da estrutura do DNA) determinante da fidelidade do processo de cópia, ou réplica, do DNA? O uso de uma fita como molde é possível pela arquitetura da molécula, como previsto no modelo, já que uma desnaturação da dupla fita é possível pela plasticidade

6 emprestada pelas forças de atração e repulsão. A manutenção da complementariedade por um processo de cópia significaria fidelidade e conservação da informação genética. Watson e Crick também postularam que a cópia da dupla fita seria semiconservativa. Você deve entender esse conceito. Ao final da década de 50 Meselson e Stahl demonstraram experimentalmente que a replicação do DNA era semiconservativa, como foi feita essa demonstração? É importante lembrar que o DNA na célula não se contra nu, mas é acompanhado de um grupo grande de proteínas básicas (principalmente as histonas) que vão colaborar para que seu empacotamento ocorra, de forma a permitir que o DNA caiba dentro da célula a que pertence, uma vez que na forma livre e estirada o conteúdo será sempre maior do que o continente (desde os vírus até as células de metazoários). De novo, temos que considerar que a organização estrutural está inerentemente ligada à função desempenhada e que, embora o empacotamento de ordens crescentes de formação de espiras sobre espiras - guiada e dividida principalmente pelas histonas e o DNA, que participam da composição dos nucleossomos e de ligações entre nucleossomos consecutivos até ordens superiores de empacotamento seja altamente complexa, ela deve ser principalmente dinâmica e plástica para permitir que o DNA seja sintetizado no momento celular preciso. O processo deve ocorrer de forma rápida e fiel para que os organismos se mantenham geneticamente íntegros ao longo das gerações. Assim, o DNA em sua organização, tem que permitir que a maquinaria de replicação tenha acesso às regiões definidas (as origens de replicação) e que o processo possa prosseguir sem interrupções ou incorreções. Estudos da maquinaria de síntese de DNA nos mais diversos organismos mostra que existe uma conservação estrutural muito grande entre as proteínas que interagem formando complexos protéicos que realizam a cópia. A catálise do processo é sempre feita (aliás no DNA ou RNA) por uma Polimerase que vai SEMPRE sintetizar uma nova molécula usando como blocos os deoxinucleosideos trifosfato (dntps) no e suas ligações de alta energia, e vai SEMPRE depender de uma fita MOLDE do polímero, para produzir uma cópia da cada fita. O mecanismo de síntese ocorre na dependência da presença de um iniciador que tem que fornecer o grupo OH livre da extremidade 3 da pentose, que fará o ataque nucleofílico ao fosfato da posição alfa do (d)ntp desfazendo uma ligação anidrido fosfórica e refazendo uma fosfodiéster, a reação inclui ainda a

7 hidrólise de um pirofosfato inorgânico, o que na soma energética final torna a síntese termodinamicamente favorável. O DNA é repositório da informação genética e molde para a transcrição de um RNA, seja para que esse cumpra seu papel como molécula funcional e terminal no processo, ou para servir de molde pelo qual uma molécula de proteína específica será traduzida tendo como base o código genético que é representado por trincas de nucleotídeos que representam aminoácidos específicos. Mas este é um tópico para outra discussão. Replicação do DNA - Metabolismo do DNA O que denominamos Metabolismo de DNA envolve o processo de síntese ou Replicação do DNA, o conjunto de diferentes processos que compõem o Reparo do DNA, fundamentais para a alta fidelidade da transferência da informação genética através das gerações e por fim os processos de Recombinação Genética. É fundamental que você tenha a visão de que a manutenção da integridade da informação genética depende não só das características intrínsecas ao processo de replicação do DNA e de sua complexa maquinaria enzimática, mas dos diversos processos de reparo do DNA, fundamentais para resolver a enorme gama de injúrias à qual o DNA pode ser submetido. Os processos de recombinação são variados mecanismos que desempenham diversas funções, desde sofisticados sistemas de reparo do DNA que sofreu danos extremos, passando pela promoção da segregação ordenada dos cromossomos, na primeira etapa da meiose, quando provê a ligação física transiente entre as cromátides, até conferência de um aumento da diversidade genética de uma população. Os temas Reparo e Recombinação serão abordados na disciplina de Genética Humana, e não em nossa disciplina mas é interessante que você tenha a noção do conjunto e da interação destes processos. Será adequado, portanto, que você os estude como um conjunto. Finalmente, é importante que você entenda que as descobertas seminais sobre o metabolismo de DNA foram feitas em E.coli, sendo que sua maquinaria (mais enxuta ) e seus mecanismos da replicação, reparo e recombinação são nela melhor

8 compreendidos em seu conjunto, o que a torna um paradigma. Compreendendo estes processos e mecanismos na E.coli você terá aprendido as regras básicas, válidas para os mais diversos organismos, procariotos e eucariotos. 1. Você deve entender a importância da fidelidade de um processo de replicação do DNA. Por que as duas fitas anti-paralelas, do modelo de Watson e Crick, auxiliaram a compreender o processo de síntese de DNA? 2. Você deve conhecer as três regras fundamentais que governam a replicação do DNA. Saiba descrevê-las. Você deve entender: O que foi feito e qual o significado dos experimentos de Meselson & Stahl? O que é forquilha de replicação? E origem de replicação? Em que direção cresce a fita de DNA? O que são os fragmentos de Okasaki? O que são as fitas líder e lerda? 3. Saiba qual a função das nucleases. Como age uma exonuclease e uma endonuclease? E as polimerases? Qual sua função? 4. Estudos pioneiros de Arthur Kornberg e colaboradores levaram à descoberta e descrição da primeira polimerase, a DNA polimerase I de E.coli. Os estudos revelaram algumas características desta enzima que posteriormente mostraram-se extensivas às outras polimerases conhecidas. Quais são estas características? 5. Ainda com relação às polimerases você deve saber o que é processividade. Como é alcançado o alto grau de fidelidade do processo de replicação? Quais as características das polimerases (DNA polimerase I) que permitem que discriminem um pareamento de bases correto de um incorreto? Você deve entender o mecanismo de editoração (proofreading) intrínseco a todas as DNA polimerases conhecidas; que tipo de atividade enzimática envolve e qual sua contribuição para a fidelidade do processo de replicação.

9 6. Qual a contribuição (estimativas numéricas) de cada uma das etapas para a fidelidade do processo? Como se chega à ordem de um erro a cada 10 9 a nucleotídeos incorporados ao final do processo de replicação? 7. Saiba quais são as outras polimerases de E.coli, as diferenças e semelhanças entre elas no que se refere à complexidade estrutural e funcional e o papel de cada uma delas. Saiba como se organizam. Que tipos de atividade nucleásica podem estar associadas às DNA polimerases? Para que servem cada uma delas? Quanto às atividades nucleásicas as DNA polimerases conhecidas são semelhantes ou diferentes? Quais os desdobramentos funcionais destes achados? 8. Passe agora a estudar e entender o processo de replicação em si, e como um todo. Tendo novamente a E.coli como exemplo, saiba nomear as enzimas e proteínas que são fundamentais para a replicação do DNA e o papel conhecido para cada uma delas. 9. A seguir, e considerando que o processo de replicação pode ser dividido em três estágios: iniciação, elongação e terminação saiba descrever cada um dos estágios (como são compreendidos pelos estudos in vitro empregando a maquinaria da E.coli), os elementos envolvidos, suas reações e enzimas requeridas. Ao final deste processo, ao analisar as figuras esquemáticas que explicam cada uma destas etapas, você deve ser capaz de entender as características de cada um dos elementos (sejam DNA, RNA, enzimas ou proteínas) e sua importância no contexto do processo. 10. Saiba quais são as semelhanças e diferenças entre os processos de replicação do DNA de bactérias, como a E.coli, e de células eucarióticas. 11. Uma das marcantes diferenças entre os cromossomos da maioria das bactérias e células eucarióticas reside no fato de que os cromossomos dos eucariotos são lineares. Por muitos anos foi um enigma como as extremidades dos cromossomos lineares poderia ser replicada sem perdas sucessivas. Saiba explicar porque este era um problema, como as extremidades são replicadas, a enzima responsável por isso, seu mecanismo de ação e porque é essencial na biologia de uma célula qualquer.

10 12. Existe alguma relação entre telomerase e câncer, e telomerase e envelhecimento celular? Transcrição - Metabolismo do RNA Devemos ressaltar que o termo Metabolismo do RNA envolve mais do que o processo de síntese de RNA a partir de um DNA molde, ou seja, a transcrição. No fluxo de eventos que transformam a informação genética estocada na forma de DNA em um produto funcional final (seja este produto um RNA ou um polipeptídeo), além do processo de síntese é importante lembrar que as moléculas de RNA seletivamente transcritas podem sofrer diversas modificações pós sintéticas, conhecidas coletivamente como Processamento de RNA e que têm também funções distintas ou desconhecidas. Além disso, os ainda pouco compreendidos mecanismos de degradação de RNA também são fator fundamental e diferencial na disponibilização de classes ou transcritos específicos em momentos definidos. Síntese do RNA 1. Tendo estudado recentemente o processo de síntese de DNA seria interessante que você inicialmente fizesse uma análise comparativa entre o primeiro processo e o de síntese de RNA que tem como molde o DNA. 2. As RNA polimerases DNA-dependentes, são as enzimas que polimerizam uma molécula de RNA a partir de um DNA-molde, quais são suas principais características? 3. Você deve conhecer alguns termos usados como convenção, faça um esquema com uma seqüência hipotética: fita de DNA +, fita de DNA -, molde ou não molde, e suas seqüências em relação à seqüência do transcrito correspondente. Saiba como se referir ao primeiro nucleotídeo a ser transcrito (para um dado gene/qualquer um), e como se referir aos nucleotídeos que estão nas posições anteriores a ele (sempre pensando no sentido 5'- 3' da fita molde) e abaixo dele na fita. Sabendo que regiões selecionadas do genoma são transcritas e que somente uma das fitas de DNA é empregada como molde você deve saber o que define o sítio para o início de um dado transcrito.

11 4. Em seguida, saiba definir o que é um promotor e o que vem a ser uma seqüência consenso. Saiba como se organiza uma região promotora típica de E.coli. 5. Você deve entender como se organiza a RNA polimerase de E.coli e o processo através do qual se liga a uma determinada região promotora. Saiba descrever o processo de ligação e o passo seguinte que é a iniciação da transcrição neste organismo. E a elongação como procede? o que se sabe sobre o processo de terminação (em E.coli)? 6. Sabendo que a disponibilidade de um dado produto gênico é variável e dependente das condições celulares ou do estágio de desenvolvimento, os níveis de um dado transcrito devem refletir esta necessidade e podem ser controlados anteriormente ao início da transcrição, em diferentes etapas no próprio processo ou posteriormente. Este controle pode ser feito através das regiões promotoras? Como? 7. Assim como na replicação, existem algumas regras gerais que são válidas e comuns aos processos de transcrição de procariotos e eucariotos. Considerando que você tem uma idéia clara sobre como o processo ocorre e quais os elementos envolvidos no processo de transcrição de E.coli, você deve agora procurar entender o processo e os elementos (conhecidos) que participam dele em células eucarióticas, tendo em mente que a complexidade do processo e de elementos envolvidos é muito mais elevada nos eucariotos. Quais as RNA polimerases conhecidas de células eucarióticas e qual as funções conhecidas para cada uma delas? O que são fatores de transcrição? O que são os fatores de transcrição basais? Como são os promotores conhecidos em eucariotos? Qual é a organização básica do complexo RNA polimerase, fatores de transcrição e promotor (já estabelecida) nas células eucarióticas

12 Processamento do RNA 8. Saiba quais são as modificações que um mrna sofre, e que são conhecidas como Processamento do RNA. Relembre as questões já levantadas em capítulos anteriores sobre a questão da colinearidade entre DNA, RNA e polipeptídeo. Entenda agora o que é um transcrito primário, maduro e o que é o splicing. 9. Saiba nomear cada uma das classes de introns que existem e os principais aspectos do mecanismo de excisão de cada um deles, quais tipos de RNAs sofrem o splicing e através de que mecanismos. Saiba caracterizar em qual dos tipos de excisão e religação o processo é catalisado por moléculas de RNA (ribozimas). 10. O que são os pequenos RNAs nucleares (small nuclear RNAs, snrnas)? O que é o spliceossomo (ou emendossomo)? 11. O que vem a ser processamento diferencial de RNA? Qual a sua importância? 12. Você deve conhecer ainda outros dois processos de modificação pelos quais os mrnas passam. Quais são eles, como ocorrem e qual as suas funções? 13. E as outras classes de RNAs conhecidas também sofrem processamento? Como? 14. mrnas celulares são degradados e este processo é finamente controlado. Saiba descrever alguns aspectos deste processo e sua importância. Síntese de RNA e DNA dependente de RNA. 15. Existem vários exemplos nos quais a síntese de RNA e DNA é feita utilizando como molde o RNA. Você deve saber o que é uma transcriptase reversa, onde é encontrada.

13 Metabolismo de Proteínas Tradução O termo metabolismo de proteínas envolve três etapas: o processo de síntese (tradução), os vários processos de modificações pós-traducionais e os diversos processos de degradação. A função central desta aula é que você conheça a maquinaria, as etapas e mecanismos dos processos de tradução. Os processos posteriores de sinalização de seqüências polipeptídicas para que sejam transportadas para os compartimentos corretos bem como os mecanismos específicos de degradação protéica deverão ser abordados em outros tópicos de diferentes disciplinas. 1. É importante que você tenha a noção dos gastos energéticos envolvidos no processo de síntese das cadeias polipeptídicas e da maquinaria envolvida no processo. Isso deve ser um indicativo da importância central do processo para a função celular. 2. Você deve saber quais são e compreender a importância das três principais descobertas que em meados do século passado foram fundamentais para a compreensão que se tem atualmente sobre o processo de síntese protéica. 3. Como foi decifrado o código genético? Saiba descrever os princípios empregados na realização dos experimentos que permitiram a sua elucidação. Você deve saber o que é um codon e uma fase de leitura. O que é uma fase aberta de leitura (open reading frame - ORF)? 4. Você deve saber quais são as principais características do código genético. Descreva-as. 5. Você deve saber esquematizar como ocorre o pareamento entre codon e anti-codon, qual a base que permite o pareamento mais frouxo. Qual a importância disso para o processo de síntese? 6. Existem casos conhecidos de genes que se sobrepõem empregando a mesma região genômica em diferentes fases de leitura?

14 7. Como nos dois processos sintéticos de macromoléculas que você já conhece, também o processo de síntese protéica pode ser dividido, para fins didáticos, em estágios. Antes da síntese propriamente dita, temos o processo de ativação dos precursores. Seguem-se a iniciação, elongação e terminação. Por fim, ocorrem os processos pós-sintéticos específicos para os diferentes polipeptídeos. Você deve entender cada uma das etapas, seus mecanismos enzimáticos e as moléculas envolvidas. 8. Saiba descrever as principais características dos elementos envolvidos neste processo sintético. Como é composto um ribossomo? Quais suas principais atividades enzimáticas. Quais os tipos de interação que ocorrem entre eles e os outros elementos que participam do processo? Mais uma vez, saiba analisar comparativamente a maquinaria de células pró e eucarióticas. 9. Quais as características estruturais dos trnas? Como eles podem ser aminoácido específicos? Quem lhes confere esta propriedade? Como ocorre a aminoacilação de um trna? Em que etapa se dá e qual a enzima responsável pelo processo de proofreading que impede que um aminoácido seja ligado ao trna incorreto? 10. Porque a interação entre aminoacil-trna sintetase e um trna é denominado o segundo código genético? 11. Quais são as principais modificações que podem sofrer um polipeptídeo recém sintetizado?