UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE CENTRO DE SAÚDE E TECNOLOGIA RURAL CAMPUS DE PATOS-PB CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA MONOGRAFIA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE CENTRO DE SAÚDE E TECNOLOGIA RURAL CAMPUS DE PATOS-PB CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA MONOGRAFIA Avaliação do sangue total e suas frações no diagnóstico de erliquiose canina pela reação em cadeia da polimerase em nested (nested PCR). Elane Maria Camboim Lustosa 2010

2 1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE CENTRO DE SAÚDE E TECNOLOGIA RURAL CAMPUS DE PATOS-PB CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA MONOGRAFIA Avaliação do sangue total e suas frações no diagnóstico de erliquiose canina pela reação em cadeia da polimerase em nested (nested PCR). Elane Maria Camboim Lustosa Graduanda Profª. Drª. Marcia Almeida de Melo Orientadora Patos, PB Abril de 2010

3 2 FICHA CATALOGADA NA BIBLIOTECA SETORIAL DO CAMPUS DE PATOS - UFCG L972a 2010 Lustosa, Elane Maria Camboim. Avaliação do sangue total e suas frações no diagnóstico de erliquiose canina pela reação em cadeia da polimerase em nested (nested PCR) / Elane, Maria Camboim Lustosa. - Patos - PB: CSTR, UFCG, p. Inclui bibliografia. Orientadora: Márcia Almeida de Melo Monografia (Graduação em Medicina Veterinária) Centro de Saúde e Tecnologia Rural, Universidade Federal de Campina Grande. 1 Diagnóstico Laboratorial - Monografia. 2 Erliquiose cão. - I Título. CDU:

4 3 UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE CENTRO DE SAÚDE E TECNOLOGIA RURAL CAMPUS DE PATOS-PB CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA ELANE MARIA CAMBOIM LUSTOSA Graduanda Monografia submetida ao curso de Medicina Veterinária como requisito parcial para obtenção do grau de Médica Veterinária APROVADO EM.../.../... MÉDIA: BANCA EXAMINADORA Profª. Drª. Marcia Almeida de Melo ORIENTADORA Prof. Dr. Adriano Fernandes Ferreira EXAMINADOR Profª. Drª. Rosângela Maria Nunes da Silva EXAMINADOR

5 A Deus, meu amor supremo, ao meu pai Diral (in memorian) a quem eu amei e dediquei a minha vida; a minha mãe Salete que tenho um amor imensurável e ao meu noivo Abraão Lyncolly amor da minha vida por tornar meus dias mais felizes, dedico. 4

6 5 AGRADECIMENTOS A Deus pelo seu amor, proteção, misericórdia e bondade sobre mim desde que nasci, por permitir que eu chegasse até aqui, me dando força para suportar as perdas da vida e os obstáculos, não me deixando desistir nem enfraquecer, colocando-me em seus braços, curando minhas feridas, sendo meu amigo nos momentos de aflição em que eu me senti sozinha, colocando em meu caminho pessoas especiais para realizar em mim a sua obra. A ti meu amado Deus, a minha eterna gratidão e adoração. A meu pai (in memorian) pela sua dedicação a minha vida, por seu amor incondicional aos seus filhos, por todos os esforços sem medida durante sua vida para a nossa criação, por sua vontade de me ver vencer, por todos os ensinamentos deixados em minha memória. Saudades! À minha mãe por todo amor e dedicação que foram essenciais me servindo de base nos momentos difíceis, contribuindo para o meu crescimento pessoal e por toda sua preocupação em me ver feliz. Aos meus irmãos Edvânia e Ewerton, meus cunhados Geovannio e Renata, por todo carinho e atenção e força nesta caminhada, me estimulando a seguir em frente e não desistir nas horas difíceis, a todos eles a minha gratidão. Ao meu grande amor Abraão Lyncolly pela sua presença constante em todos os momentos desde que nos conhecemos, sua dedicação, amor, carinho, cuidado, compreensão, exemplo, que me ensinou o verdadeiro sentido do amor. A minha família paterna, em especial minha avó Leca que é até hoje a minha referência, e aos meus tios Edilbelto (in memorian), Edilênia, Edmone e Edilpia a quem devo meus verdadeiros valores de vida. A minha família materna: minha avó Maria José, meus tios Naldo, Antônio, Sebastião, França, Fátima, em especial Lúcia, que sempre me apoiaram e torceram por mim. À família do meu noivo Lyncolly que considero minha nova família: Diassis e Auxiliadora, meus sogros, a quem tenho grande admiração, meus cunhados Adão, Andrei, Jaciara e Juliermson seu esposo pela amizade, apoio e carinho que sempre tiveram por mim. A minha orientadora Profª Drª. Marcia Melo e ao seu esposo Prof. Dr. Paulo de Andrade e ao Fauzinho (alegria do laboratório) por todos os ensinamentos profissionais e pessoais, pela amizade, apoio, acolhimento, por terem acreditado na minha capacidade, e por todo exemplo que são para mim. Vocês foram fundamentais em minha vida. A Tereza Emanulle que foi peça fundamental, trabalhando comigo em todos os momentos deste estudo, partilhando seus conhecimentos, sendo acima de tudo amiga, sem a sua presença não seria possível à realização deste trabalho.

7 6 A toda equipe do laboratório (Aline, Tereza, Expedito, Arthur, Kamila, Gilzane e Maurina), pela amizade construída, pela troca de ensinamentos e por todos os dias em que compartilhamos com alegria trabalhando juntos. As todas as minhas primas em especial as mais presentes em minha vida Savanna e Clarissa, obrigada por todo apoio e amizade que vocês têm a mim. A todos os meus colegas de veterinária da turma , a cada um em particular pela convivência de cinco anos, formando uma nova família que será guardada no meu coração para sempre, em especial Giulianna que sempre esteve em meu coração e a Gilzane ao verdadeiro laço de amizade que surgiu entre nós, por tudo que ela me ensinou como pessoa e o sentimento sincero que ela extraiu dentro de mim; a Andréa que sempre estudou comigo desde ainda criança mantendo a mesma amizade e consideração; a Siduane e Maurina que me conquistaram com suas amizades. As minhas amigas Claúdia, Rachel, Karla, Nanita, Verônica, Katyany e Herta que desde sempre estiveram presentes seja por um telefonema ou visita, nunca perdendo o contato, estando nos momentos mais precisos, me escutando, me aconselhando, torcendo sempre por mim. A todos do Centro Médico Veterinário (Dr. Leonardo, sua esposa Sibele, Drª. Aline, Diná, Rodrigo e Ramon), pela amizade, acolhimento, confiança e ensinamentos contribuindo para a minha vida profissional. A todos os professores da Medicina Veterinária que deixaram não só ensinamentos profissionais, mas principalmente ensinamentos para vida. A todos os funcionários que direta ou indiretamente foram essenciais nesta etapa da minha vida, em especial Tereza e Damião. Ao professor Sérgio pelo apoio na análise estatística, se disponibilizando em todas as vezes que lhe procurava para tirar uma dúvida. Aos professores Dr. Adriano Ferreira e Drª. Rosângela Maria que participaram da banca examinadora, mesmo não tendo sido meus professores durante o curso teve maior respeito e cuidado na avaliação do meu trabalho. A todos que participaram desta etapa da minha vida direta e indiretamente me apoiando e acreditando na minha capacidade.

8 7 SUMÁRIO Pág 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Etiologia Histórico Taxonomia Epidemiologia Principais espécies que acometem o cão Ehrlichia ewingii (EGC) Ehrlichia platys (ETC) Ehrlichia canis (EMC) Transmissão, clínica e patogenia da infecção por Ehrlichia canis Principais métodos de diagnósticos utilizados na detecção de Ehrlichia MATERIAL E MÉTODOS Local de Execução Amostras de Ehrlichias Esfregaço Sanguíneo Extração do DNA Nested PCR Análise Estatística RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA... 34

9 8 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Fotomicrografias de esfregaços de papa leucocitária de sangue de cães positivos na nested PCR para Ehrlichia canis e/ou PCR para Anaplasma platys... Figura 2 - SepCell:LGC Reagente para isolamento in vitro de linfócitos Figura 3 - Eletroforese em gel de agarose apresentando os resultados da nested 30 PCR para detecção do gene 16S RNA ribossômico de Ehrlichia canis... Pág 22

10 9 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Esquema de classificação antiga e atual das principais espécies do gênero Ehrlichia, Anaplasma e Neorickettsia com suas respectivas células alvos e hospedeiros... Tabela 2. Sequência de primers selecionados para amplificação do fragmento do gene 16S RNA ribossômico de Ehrlichia, pela reação em cadeia da polimerase em nested (nested PCR)... Tabela 3. Resultados do esfregaço sanguíneo e da nested PCR das frações sanguíneas das amostras do ácido desoxirribonucleico (DNA) dos cães com sinais de Erliquiose... Tabela 4. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e esfregaço sanguíneo na detecção de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica de hemoparasitoses... Tabela 5. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e de mononucleares (M) no diagnóstico de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica... Tabela 6. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e de granulócitos (G) no diagnóstico de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica... Tabela 7. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e papa leucocitária (PL) no diagnóstico de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica... Tabela 8. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e coágulo de sangue (CS) no diagnóstico de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica... Pág

11 10 RESUMO LUSTOSA, ELANE MARIA CAMBOIM. Avaliação do sangue total e suas frações no diagnóstico de erliquiose canina pela reação em cadeia da polimerase em nested (nested PCR). Patos, UFCG. 2010, 41 p. (Monografia de conclusão do Curso de Medicina Veterinária). A erliquiose é uma hemoparasitose distribuída mundialmente e transmitida por carrapatos aos cães. Em cães, tem como agentes etiológicos a Ehrlichia spp. e a Anaplasma platys, que formam corpúsculos de inclusão denominados de mórulas. Em função do baixo custo, a visualização das inclusões em esfregaço sanguíneo é utilizada como diagnóstico de rotina, mas a sensibilidade é baixa. O sangue é utilizado como fonte de ácido desoxirribonucléico (DNA) para a reação em cadeia da polimerase (PCR), mas apesar das espécies infectarem várias células, não há avaliação do uso de frações celulares sanguíneas na tentativa de aumentar a sensibilidade da técnica. Desta forma, este trabalho objetivou avaliar o aumento da sensibilidade da nested PCR no diagnóstico de erliquiose canina com DNA proveniente de diferentes frações sanguíneas. Foram utilizadas amostras de sangue de 22 cães com sintomatologia clínica sugestiva de erliquiose, provenientes da rotina médica dos Hospitais Veterinários da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), da Universidade Federal de Campina Grande (UFCG) e do Centro Médico Dr. Leonardo Torres, localizados nos municípios de Recife (PE) e Patos (PB). O DNA foi extraído de sangue total (ST), granulócitos (G), mononucleares (M), papa leucocitária (PL) e coágulo sanguíneo (CS). A amplificação do DNA de Ehrlichia e/ou Anaplasma pela nested PCR de ST foi confirmada em 15/21 (71,4%) amostras, apenas 6/21 (28,5%) foram negativas. Entre os 15 positivos, em 7 (46,4%) foi amplificado DNA de Ehrlichia canis e apenas 1 (6,6%) para Anaplasma platys. Entre as 14 (63,6%) amostras negativas no esfregaço sanguíneo, 8 (57,15%) foram falso negativas, apresentando-se positivas na nested PCR de ST. Em 7 (46,6%) amostras não houve amplificação na segunda reação de PCR, não sendo possível identificar a espécie. Quando o resultado do sangue total foi comparado com os das frações de M e PL, a sensibilidade foi de 42,86% e de 21,43% e 33,33% com as frações de G e C, respectivamente. O sangue total é a melhor fonte de DNA para o diagnóstico de Ehrlichia pela nested PCR. Ressalta-se que essa é a primeira evidência molecular do envolvimento de Anaplasma platys em infecção de cães no Estado da Paraíba. Palavras-chaves: sangue, riquétsias, diagnóstico molecular, Nordeste, Brasil.

12 11 ABSTRACT LUSTOSA, ELANE MARIA CAMBOIM. Evaluation of blood cell fractions in the diagnosis of canine ehrlichiosis by nested PCR (Polymerase Chain Reaction). Patos, UFCG. 2010, 41 p. (Monograph of the Course of Veterinary Medicine). Erlichiosis is a worldwide disease transmitted by ticks to dogs. The disease is caused by Ehrlichia spp. and Anaplasma platys, which form inclusion bodies called morulae. Due to the low cost, the identification of inclusion on blood smear is used as a routine diagnosis, but the sensitivity is low. Blood is used as source of DNA for PCR, but despite leukocytes be infected by different species, there is no evaluation about the use of blood cell fractions in an attempt to increase the sensitivity. Thus, this study aimed to evaluate the nested PCR sensitivity in the diagnosis of canine ehrlichiosis with DNA from different blood cell fractions. The samples were collected from 22 dogs with ehrlichiosis suggestive signs. The animals were treated at the Veterinary Teaching Hospitals, Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) and Universidade Federal de Campina Grande (UFCG), and at the Veterinary Medical Center Dr. Leonardo Torres, in Recife (PE) and Patos (PB). DNA was extracted from whole blood (WB), granulocytes (G), mononuclear cells (M), buffy coat (BCT) and blood clot (BCL). Ehrlichia and / or Anaplasma DNA was amplified in ST in 15/21 (71.4%) samples. Ehrlichia canis DNA was amplified in 7 (46.4%) animals and 1 (6.6%) for Anaplasma platys. Among 14 (63.6%) negative smears samples, 8 (57.15%) were false negative, but presented positive results in ST nested PCR. There was no amplification in the second PCR reaction in 7 (46.6%) samples. When whole blood result was compared with M and BCT fractions, the sensitivities were 42.86% and 21.43%, respectively, and 33.33% to G and C fractions. Whole blood (WB) is the best DNA source for diagnosis of Ehrlichia by nested PCR. It is worth noting that this is the first molecular evidence of the involvement of Anaplasma platys infection in dogs at the State of Paraiba. Key words: blood, rickettsiae, molecular diagnostic, Northeast, Brazil.

13 12 1 INTRODUÇÃO A erliquiose é uma enfermidade infecciosa ocorrida em animais domésticos e silvestres, podendo acometer o homem. Tem como agente etiológico a Ehrlichia spp., bactéria gram-negativa, intracelular obrigatória dos leucócitos ou trombócitos. Trata-se de uma hemoparasitose distribuída no mundo inteiro, principalmente em países tropicais e subtropicais, transmitida entre os cães com mais freqüência pelo carrapato Rhipicephalus sanguineus. A doença se caracteriza por diferentes alterações clínicas e hematológicas, compreendendo as fases: aguda, subclínica e crônica. Sendo os sinais mais comuns febre, apatia e anorexia, associados à trombocitopenia, anemia e leucopenia. O diagnóstico definitivo da erliquiose tem sido baseado na combinação de sinais clínicos, achados hematológicos e exames laboratoriais. O esfregaço de sangue e papa leucocitária é a técnica mais utilizada na rotina clínica que identifica mórulas de Ehrlichia. Essas espécies são de difícil detecção devido à curta parasitemia, que são vistas com mais freqüência apenas no estágio agudo da doença, podendo induzir resultados falsos negativos, além de parasitar diversos tipos de células, confundindo a espécie demonstrada, mesmo tendo predileção por algumas espécies. Outros métodos, como ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA), reação de imunofluorescência indireta (RIFI), western blothing, cultivo em células, reação em cadeia da polimerase (PCR) e a reação em cadeia da polimerase em nested (nested PCR), têm sido utilizados para detectar Ehrlichia spp.. A sorologia é bastante utilizada nos hospitais veterinários, porém testes sorológicos podem apresentar resultados falsos positivos, devido à presença de anticorpos que podem permanecer por muito tempo no organismo do animal, mesmo o agente tendo sido eliminado. A PCR tem apresentado maior sensibilidade e especificidade quando utilizada como diagnóstico para Ehrlichia, pois permite determinar a presença de co-infecção por duas ou mais espécies. No entanto a nested PCR tem melhorado a especificidade e a eficiência da reação, pois a mesma diferencia as espécies de Ehrlichia spp.. Tecidos como sangue venoso e periférico, medula óssea, baço, fígado, rim e linfonodos têm sido avaliados em vários estudos na perspectiva de descobrir a melhor amostra para demonstrar Ehrlichia através de técnicas moleculares.

14 13 Tendo em vista que não existem estudos anteriores que avaliem frações sanguíneas qualificando a melhor fonte de ácido desoxirribonucléico (DNA) para se diagnosticar as diferentes espécies de Ehrlichia, e que atualmente técnicas moleculares têm sido mais eficientes no diagnóstico de erliquiose é que se realizou através deste trabalho um estudo que avalia o sangue total e suas frações (sangue total, papa leucocitária, granulócito e coágulo de sangue) pela nested PCR a fim de identificar em qual destas, o DNA de Ehrlichia pode ser mais facilmente detectado, facilitando assim o diagnóstico da doença, além de comparar a nested PCR ao esfregaço sanguíneo, confirmando a baixa sensibilidade da segunda técnica vista em estudos anteriores.

15 14 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Etiologia As erliquioses caninas figuram entre as mais graves doenças infecciosas que acometem os cães, causadas por bactérias do gênero Ehrlichia, principalmente pela espécie Ehrlichia canis, agente etiológico da Erliquiose Monocítica Canina (DUMLER et al., 2001). Erlíquias são bactérias gram negativas, organismos cocóides a elipsoidais imóveis, que podem ser encontradas isoladas ou em colônias denominadas mórulas. Parasitam obrigatoriamente as células hematopoiéticas maduras ou imaturas, em especial as do sistema fagocitário mononuclear, tais como monócitos e macrófagos e, para algumas espécies, em células mielóides, como neutrófilos (DUMLER et al., 2001; BRITO, 2006). 2.2 Histórico A primeira espécie Rickettsia canis foi descrita em um cão Pastor Alemão, na Argélia, por Donatien e Lestoquard, em 1935, reclassificada como Ehrlichia canis, em 1945, por Mashkovsky. Primeiro caso de erliquiose canina descrito nas Américas, na região das Antilhas Holandesas foi descrito em 1957, associado à Babesia canis (ALMOSNY, 2002; MACHADO, 2004). A década de 60 foi marcada por uma doença em cães de etiologia desconhecida caracterizada por hemorragia severa, que recebeu vários nomes, entre eles o de Pancitopenia tropical canina, abrangendo países como Singapura (1960), Estados Unidos (1963 e 1969) e Inglaterra (1968); no entanto, esta enfermidade só foi estabelecida como causada por Ehrlichia canis no final da mesma década (ALMOSNY, 2002; ETTINGER & FELDMAN, 2004). Somente na década de 1980, com o reconhecimento da erliquiose como possível doença zoonótica fatal, intensificou-se as pesquisas para caracterização do organismo e definição da patofisiologia do agente (COHN, 2003; PADDOCK & CHILDS, 2003). O primeiro caso de erliquiose canina no Brasil foi descrito em Belo Horizonte-MG, por Costa et al., em 1973, e logo após em várias cidades como Rio de Janeiro-RJ, Santa Maria-RS e Curitiba-PR (ALMOSNY, 2002). As espécies descritas no Brasil até o

16 15 momento são Ehrlichia canis e Anaplasma platys (AGUIAR et al., 2007; RAMOS et al., 2009). 2.3 Taxonomia A erliquiose é uma doença causada por bactérias pertencentes à ordem Rickettsiales, família Anaplasmataceae e gêneros Ehrlichia e Anaplasma (DUMLER et al., 2001). A diferenciação entre as espécies parasitas foi primeiramente baseada no tipo de célula parasitada, distribuição geográfica e severidade da doença; mais tarde esta classificação entrou em conflito com o esquema de genogrupos: através dos métodos moleculares de identificação, três genogrupos foram caraterizados em Ehrlichia canis (I), Ehrlichia phagocytophila (II) e Ehrlichia sennetsu (III). O genogrupo Ehrlichia canis inclui Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, Ehrlichia muris e a Cowdria ruminantium; o genogrupo Ehrlichia phagocytophila compreende erlíquias como a Ehrlichia equi, Ehrlichia platys e o agente da erliquiose granulocítica humana; e o genogrupo Ehrlichia sennetsu consiste em Ehrlichia risticii e Neorickettsia helminthoeca (ALMOSNY, 2002; ETTINGER & FELDMAN, 2004). A reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida de seqüenciamentos genéticos de espécies encontradas em várias regiões do mundo permitiu novos agrupamentos e classificações taxonômicas das erlíquias (DAGNONE et al., 2001). A classificação foi então modificada reorganizando o gênero Ehrlichia em outros gêneros, tendo como base análises do ácido desoxirribonucleico (DNA) dos parasitos (DUMLER et al., 2001). Conforme a reclassificação realizada, o genogrupo 1 manteve o nome genérico Ehrlichia, enquanto membros do genogrupo 2 mudaram de Ehrlichia para Anaplasma, e membros do genogrupo 3 tornaram-se Neorickettsia (MACHADO, 2004). As espécies dentro do gênero Ehrlichia foram divididas em formas monocíticas (Ehrlichia canis, Ehrlichia risticii), granulocíticas (Ehrlichia ewingii e Ehrlichia equi) e trombocíticas (Anaplasma platys), embora essa divisão demonstre limitações, pois a infecção por uma espécie pode ocorrer em mais de um tipo celular (COHN, 2003). A classificação definitiva das erlíquias foi baseada no sequenciamento do gene 16S do RNA ribossômico (DAGNONE et al., 2001). Algumas espécies do gênero Ehrlichia,

17 16 Anaplasma e Neorickettsia com suas respectivas células alvos e hospedeiros principais são demonstradas na Tabela 1 de acordo com a classificação modificada. Tabela 1. Esquema de classificação antiga e atual das principais espécies do gênero Ehrlichia, Anaplasma e Neorickettsia com suas respectivas células alvos e hospedeiros. Classificação antiga Classificação atual Células Alvo Hospedeiros Principais Genogrupo I Ehrlichia canis Ehrlichia chaffeensis Ehrlichia ewingii Cowdria ruminatium Ehrlichia canis Ehrlichia chaffeensis Ehrlichia ewingii Ehrlichia ruminatium Mononucleares Mononucleares Granulócitos Endoteliais Caninos Humanos Caninos Ruminantes Genogrupo II Ehrlichia phagocytophila Ehrlichia equi Erliquiose Granulocítia Humana (EGH) Ehrlichia platys Anaplasma phagocytophila Anaplasma phagocytophila Anaplasma phagocytophila Anaplasma platys Granulócitos Granulócitos Granulócitos Plaquetas Ruminantes Equídeos Humanos Caninos Genogrupo III Ehrlichia sennetsu Ehrlichia risticii Neorickettia helminthoeca Neorickettsia sennetsu Neorickettsia risticii Neorickettia helminthoeca Mononucleares Mononucleares Mononucleares Humanos Equídeos Cães Fonte: Dagnone et al. (2001); Dumler et al. (2001); Almosny (2002); Quinn et al. (2005); Silva et al. (2009). 2.4 Epidemiologia As espécies de erlíquias, com exceção dos patógenos humanos Ehrlichia chaffensis e Ehrlichia sennetsu, são patógenos de animais domésticos e selvagens (QUINN et al, 2005). A erliquiose é relatada em grande parte das regiões tropicais e subtropicais de todo o mundo, sua distribuição está relacionada à presença do carrapato vetor, Rhipicephalus sanguíneus, o carrapato castanho do cão. Esta espécie é de grande importância por ser cosmopolita, tendo como hospedeiros vertebrados mais comuns os membros da família Canidae (cães, coiotes, raposa e chacal) (GROVES et al., 1975; DAGNONE et al., 2001; ETTINGER & FELDMAN, 2004). Cães de qualquer faixa etária podem ser infectados, porém algumas raças são mais susceptíveis à doença, incluindo aquelas que vivem em áreas endêmicas e as que são transportadas para estas regiões (NYINDO et al., 1980; RIKIHISA et al., 1994; DAGNONE et al., 2001; MYLONAKIS et al., 2004).

18 17 No Brasil, há relatos de várias espécies de carrapatos parasitando os cães, no entanto, a ocorrência dessas espécies é resultante das características epidemiológicas particulares de cada região e do ambiente em que são criados, pois a maioria dos carrapatos encontrados em cães urbanos pertence à espécie Rhipicephalus sanguíneus. Já os cães criados em áreas rurais ou suburbanas, podem ser infestados por várias espécies de carrapatos, pertencentes ao gênero Amblyoma (LABRUNA & PEREIRA, 2001). O gênero Ehrlichia atualmente compreende cinco espécies válidas: Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, Ehrlichia muris e Ehrlichia ruminantium (DUMLER et al., 2001). 2.5 Principais espécies que acometem o cão Três principais espécies estão envolvidas na ocorrência da erliquiose canina: a Ehrlichia ewingii agente etiológico da Erliquiose Granulocítica Canina (EGC), a Anaplasma platys causador da Erliquiose Trombocítica Canina (ETC), e a Ehrlichia canis determinante da Erliquiose Monocítica Canina (EMC) (HARVEY et al., 1978; FRENCH et al., 1983; ALMOSNY, 2002) Ehrlichia ewingii Infecta granulócitos (neutrófilos e eosinófilos) e é um dos dois agentes erliquiais conhecidos por causar infecção granulocítica em cães. É supostamente transmitida pelo carrapato Amblyomma americanus e certamente pelo Rhipicephalus sanguineus (GOLDMAN et al., 1998; DAGNONE et al., 2001; ALMOSNY, 2002). Foi relatada em 1985, como causadora da erliquiose granulocítica canina, após a observação da mórula em granulócitos de cães com poliartrite aguda (ALMOSNY, 2002). A EGC produz uma infecção subclínica causando febre, anormalidades hematológicas (trombocitopenia, neutropenia e linfocitose) entre 18 e 24 dias de infecção, além de causar claudicação e edema articular, podendo ser uma doença moderada a grave (STOCKHAM et al., 1990; EGENVALL et al, 1997; ALMOSNY, 2002). Através da análise da seqüência do gene 16S RNA ribossômico, a Ehrlichia ewingii apresenta grande semelhança genética com o Anaplasma phagocytophilum agente

19 18 da erliquiose granulocítica humana e com a Ehrlichia phagocytophila (ANDERSON et al., 1991; CHEN et al., 1994; CHAE et al., 2000). Testes laboratoriais revelaram a possibilidade de co-infecção de Ehrlichia ewingii, Ehrlichia equi e Ehrlichia canis ou ocorrência de reação cruzada entre elas em testes diagnósticos (STOCKHAM et al., 1990) Anaplasma platys O agente etiológico da erliquiose trombocítica canina é a Anaplasma platys (HARVEY et al., 1978; FRENCH et al., 1983). De acordo com Hoskins (1991) Anaplasma platys multiplica-se apenas em plaquetas de cães; no entanto Dagnone et al. (2001) informou que essa Rickettsia infecta as plaquetas do cão, podendo eventualmente infectar também os leucócitos. Suspeita-se que Anaplasma platys seja transmitida entre cães, principalmente pelo Rhipicephalus sanguineus, pois infecções concomitantes de Ehrlichia canis e Ehrlichia platys são comuns (HOSKINS, 1991; ALMOSNY, 2002; SANOGO et al., 2003). Os cães acometidos pela Anaplasma platys apresentam sinais clínicos após um período de incubação de 8 a 15 dias, apresentando sinais digestivos e distúrbios hemostáticos, (BEUAFILS, 1999 apud DAGNONE et al., 2001). A ETC, também é conhecida como trombocitopenia cíclica canina por apresentar trombocitopenia cíclica com parasitemia inicial, que tendem a ocorrer periodicamente em intervalos de uma a duas semanas (DAGNONE, et al., 2001). Nos dias em que ocorre plaquetopenia, as inclusões não são observadas; essa trombocitopenia tende a agravar com a evolução do quadro e o número de plaquetas parasitadas diminui durante o ciclo (HARVEY et al., 1978; HIBLLER et al., 1986; SWANGO et al., 1989; ALMOSNY, 2002) Ehrlichia canis (EMC) A Ehrlichia canis é o agente erliquial mais comum da erliquiose monocítica canina, e a espécie que causa a doença com maior severidade parasitando monócitos (ALMOSNY, 2002). O risco de transmissão de Ehrlichia canis numa área pode ser estimado pela prevalência de infecções ativas e passadas em cães (BOWMAN et al., 2009). A erliquiose tem transmissão focal e a distribuição global varia de acordo com a densidade da

20 19 população e a distribuição do carrapato vetor. A expansão das populações de carrapatos pode introduzir a doença em áreas antes livres ou de endemicidade muito baixa (NICHOLSON et al., 2010). A infeccção por Ehrlichia canis é prevalente em um grande número de países em todo o mundo, em especial nas regiões temperadas e tropicais, com índices de infecção entre cães variando de menos de 5% a quase 70% (STICH et al., 2008). Com exceção de Ehrlichia canis, cães não são considerados reservatórios primários para patógenos riquetsiais transmitidos por carrapatos. Ao contrário, cães e seres humanos são hospedeiros acidentais e podem ser infectados através da picada de um ixodídeo (NICHOLSON et al., 2010). A Ehrlichia canis é transmitida pelo carrapato no estágio adulto ou de ninfa, que por sua vez se infectou em estágios anteriores, em outro cão ou em algum animal silvestre. A transmissão transovariana garante a infecção das larvas, que é mantida ao longo das mudanças estadiais (COMER et al., 2001). 2.6 Transmissão, clínica e patogenia da infecção por Ehrlichia canis O parasitismo do carrapato Rhipicephalus sanguineus pela Ehrlichia canis é garantido por transmissão transestadial, podendo a doença ser transmitida pelos três estágios: larva, ninfa e adulto (GROVES et al., 1975; DAGNONE, 2001; BREMER et al., 2005). As larvas e ninfas se infectam através da ingestão de leucócitos infectados em um cão na fase aguda da doença (SMITH et al., 1976; LEWIS et al., 1977). No carrapato, as erlíquias se disseminam por hemócitos do intestino para a glândula salivar e durante a alimentação, os carrapatos inoculam a secreção salivar contaminada com erlíquias no interior do ambiente de alimentação no hospedeiro (SMITH et al., 1976). As erlíquias se replicam nos fagossomos das células mononucleares fagocíticas do hospedeiro, propagando-se para o baço, fígado e linfonodos (McDADE, 1990), evoluindo de corpúsculos elementares para corpúsculos iniciais até a formação de mórulas (NYINDO et al., 1971). As células infectadas são transportadas especialmente ao pulmão, rins e meninges, aderindo ao endotélio vascular e induzindo o aparecimento de vasculite e infecção do tecido subendotelial (SIMPSON, 1974). As manifestações mais comuns causadas por Ehrlichia canis são anemia, leucopenia, trombocitopenia, febre e emaciação (BICHARD & SHERDING, 1998). Os sinais clínicos variam com a severidade da infecção, a resposta imunológica do hospedeiro, os órgãos atingidos, a espécie de erlíquia envolvida e a presença de co-infecção com outras

21 20 erlíquias ou outros microorganismos transmitidos pelo mesmo vetor (DAGNONE et al., 2001). A infecção por Ehrlichia canis pode progredir às fases aguda, subclínica e crônica (QUINN et al, 2005). A fase aguda é iniciada com um processo de hipertermia, após incubação de 5 a 15 dias, variando entre os animais a intensidade do pico febril, assim como também a gravidade dos sinais (ALMOSNY, 2002). Nesta fase, os sinais clínicos são inespecíficos incluindo febre, secreção ocular e nasal, anorexia, depressão, perda de peso, linfadenopatia, vasculite, tremores musculares e poliartrite (BELLAH et al., 1986). O quadro agudo da doença dura de duas a quatro semanas; ocorre bacteremia e as principais alterações hematológicas são anemia, trombocitopenia e leucopenia observada em poucos animais nessa fase (GREENE & HARVEY, 1984; ANDEREG & PASSOS, 1999; ALMOSNY, 2002; NAKAGHI et al., 2008). A trombocitopenia que se desenvolve durante essa fase é devido o decréscimo da meia vida das plaquetas circulantes, que ocorre por alterações imunomediadas (ALMOSNY, 2002). Os cães infectados se recuperam espontaneamente, podendo entrar numa fase assintomática ou subclínica, permanecendo com o agente por longos períodos (HARRUS et al., 1997b). Na fase subclínica, são observados elevados títulos de anticorpos, com alterações hematológicas mais discretas (ANDEREG & PASSOS, 1999; NAKAGHI et al., 2008). Estudos relatam que cerca de 50% dos cães que desenvolvem a fase subclínica, a anemia regride e a contagem de plaquetas retorna ao valor normal (ALMOSNY, 2002). Algumas complicações podem ser encontradas nesta fase como depressão, hemorragias, edema de membros, perda de apetite, palidez de mucosas, uveíte e cegueira (WOODY & HOSKINS, 1991). Cães imunocompetentes podem eliminar o parasita ou, ocasionalmente, desenvolvem a fase crônica da doença, caracterizada por supressão medular, sangramentos por mucosas e conjuntivas e alta letalidade (HARRUS et al., 1997b). O sistema imune do hospedeiro não consegue debelar a infecção e apresenta alterações clínicas e laboratoriais mais severas (ANDEREG & PASSOS, 1999; NAKAGHI et al., 2008). Os sintomas mais comuns da doença crônica são depressão, apatia, perda de peso crônica e emaciação, mucosas pálidas, febre, edema periférico, equimoses e epistaxe, podendo ocorrer infecções secundárias como pneumonia, glomerulonefrite, insuficiência renal, artrite, polimiosite e ataxia (HARRUS et al., 1997a).

22 21 Os achados hematológicos na fase crônica são similares aos da fase aguda sendo observados monocitose, linfocitose e trombocitopenia persistente associados à anemia arregenerativa (ALMOSNY, 2002). A trombocitopenia é o achado mais freqüente em cães experimentalmente e naturalmente infectados (OLIVEIRA et al., 2000; NAKAGHI, et al. 2004), estando associada principalmente à fase crônica devido ao decréscimo da hematopoiese, que ocorre por carência de megacariócitos (ALMOSNY, 2002). A leucopenia está presente na fase crônica e a pancitopenia pode ocorrer em casos avançados desta fase, devido à hipoplasia de todas as células precursoras (MEINKOTH, 1989; HOSKINS, 1991; ALMOSNY, 2002). 2.7 Principais métodos de diagnósticos utilizados na detecção de Ehrlichia. A combinação de sinais clínicos e hematológicos é rotineiramente empregada para levantar a suspeita diagnóstica de erliquiose, porém os sinais apresentados pelos animais são confusos e variáveis, obrigando ao uso de exames laboratoriais para firmar um diagnóstico definitivo (WANER et al., 2001; COHN, 2003). Algumas técnicas têm sido utilizadas para um diagnóstico definitivo, como pesquisa de inclusões em esfregaços sanguíneos e papas de leucócitos, cultivo celular, sorologia pela imunofluorescência indireta (IFI), ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA), western blotting e, mais recentemente, técnicas moleculares como a reação em cadeia da polimerase (PCR) (IQBAL & RIKIHISA, 1994; TAKAHIRA et al., 2003; DAGNONE et al., 2003; MYLONAKIS et al., 2004; MORAIS et al., 2004). O método de rotina é feito normalmente pela demonstração microscópica direta de inclusões intracitoplasmáticas, mais conhecidas como mórulas, em células mononucleares sanguíneas, a partir de preparações coradas de esfregaço sanguíneo ou da papa leucocitária (WOODY & HOSKINS, 1991). As espécies de erlíquias são encontradas em granulócitos ou em plaquetas dos esfregaços sanguíneos de animais nos estágios iniciais da doença. Aquelas espécies que têm por alvo monócitos estão presentes com menor freqüência nos esfregaços sanguíneos (QUINN et al, 2005). A detecção de mórulas de Ehrlichia canis não é freqüente; exceto durante a fase aguda da infecção, dificilmente as mórulas são encontradas em esfregaços sanguíneos corados (HIBBLER et al., 1986; OLIVEIRA at al., 2000; OLICHESKI et al., 2002; LEITE & RIBEIRO, 2003; NAKAGHI et al., 2004; 2008; RAMOS et al., 2009). De fato, Mylonakis et al. (2003), comparando

23 22 diagnóstico direto para Ehrlichia canis a partir de diferentes tecidos como sangue periférico (SP) capa leucocitária (CL), aspirados de medula óssea (MO) e linfonodo (LN), concluíram que o diagnóstico a partir de SP é o que apresenta a menor sensibilidade (8%) quando comparado a CL (66%), MO (34%) e LN (60,9%), desencorajando a utilização dessa técnica para diagnóstico. A técnica não é eficaz devido também à constante flutuação da parasitemia durante o curso da enfermidade (ELIAS, 1992). Corpúsculos iniciais, mórulas e inclusões intraplaquetárias sugestivos para Ehrlichia canis e/ou Anaplasma platys podem ser vistos na Figura 1. Figura 1. Fotomicrografias de esfregaços de papa leucocitária de sangue de cães positivos na nested PCR para Ehrlichia canis e/ou PCR para Anaplasma platys. Foto A morfologia compatível com corpúsculos iniciais, B com mórulas de Ehrlichia canis, C com inclusões intraplaquetárias. Fonte: D agnone (2006). As técnicas sorológicas podem ser empregadas como testes confirmatórios de diagnóstico para infecções por rickettsias (EGENVALL et al., 1998; COHN, 2003); entretanto, apesar de apresentarem alta sensibilidade, esses testes podem levar a resultados falsos positivos, pois os anticorpos específicos podem permanecer por bastante tempo após o tratamento e cura (RIKIHISA et al., 1994; NAKAGHI et al., 2008; AQUINO, 2009). Existem reações cruzadas em exames sorológicos dentro do mesmo grupo, e potencialmente entre genogrupos, dificultando a determinação inequívoca do agente

24 23 etiológico. Os testes sorológicos também não são capazes de distinguir entre infecção aguda e exposição prévia (RIKIHISA et al., 1994; SUKASAWAT et al., 2000). Técnicas moleculares de diagnóstico reconhecidamente mais sensível, como a PCR e a nested PCR, têm sido empregadas para o diagnóstico de Ehrlichia canis (AGUIRRE et al, 2008; NAKAGHI et al. 2008; BANETH et al., 2009; KLEDMANEE et al., 2009; MYLONAKIS et al., 2009; RAMOS et al., 2009). A padronização da PCR é essencial para que esta possa ser usada como diagnóstico seguro (ROTONDANO, 2007), pois se trata de uma reação que multiplica um trecho específico do DNA utilizando primers que, por definição, são pequenos segmentos de nucleotídeos capazes de se ligar em áreas conservadas de DNA do organismo testado, amplificando uma região do mesmo e, dessa forma, permitindo sua identificação (COHN et al., 2003). A nested PCR é uma segunda reação que utiliza o produto da amplificação da primeira reação, obtendo assim, um produto menor que o da primeira amplificação. Uma análise comparativa entre a PCR (gene dsb) e a nested PCR (16S RNA ribossômico), realizada em amostras sangüíneas de cães infectados por Ehrlichia canis, demonstrou que as duas técnicas são adequadas ao diagnóstico da EMC; no entanto, a nested PCR é até agora a única capaz de diferenciar as espécies de Ehrlichia spp. (NAKAGHI et al., 2004). A presença de DNA de Ehrlichia canis em cães infectados foi inicialmente demonstrada pela PCR de sangue, medula óssea, baço, fígado, rim e linfonodos (IQBAL & RIKIHISA, 1994; HARRUS et al., 1998; 2004; MYLONAKIS et al., 2004). Infecções experimentais indicaram que o baço foi o local de maior probabilidade de encontrar Ehrlichia canis durante a fase subclínica da EMC, apoiando a hipótese de que os organismos são mais facilmente encontrados nos órgãos do que no sangue periférico. Entretanto, o estudo não avaliou cães na fase aguda nem no início da fase sub-clínica, fases estas em que se encontram em geral, os cães que recebem atendimento nos hospitais e clínicas veterinárias (HARRUS et al., 1998; NEITZ & TOMAS, 1938) No entanto, Gal et al. (2008) ressaltaram que informações comparativas sobre a propagação e a presença de Ehrlichia canis por PCR em diferentes órgãos são limitadas e que a comparação é difícil devido: a) diferenças na infecção natural e experimental, b) diferentes fases da doença, c) metodologia de amostragem, d) natureza dos tecidos avaliados.

25 24 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Local de Execução O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Biologia Molecular do Semiárido, da Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária no Centro de Saúde e Tecnologia Rural da Universidade Federal de Campina Grande, Campus Patos - PB. 4.2 Amostras de ehrlichias Foram coletadas 24 amostras, oriundas dos Hospitais Veterinários da Universidade Federal de Campina Grande (UFCG), na cidade de Patos - PB e da Universidade Rural de Pernambuco (UFRPE), na cidade do Recife PE, além do Centro Médico Veterinário Dr. Leonardo Torres CMVLT, Patos PB, a partir de cães com sintomatologia, parasitologia e/ou hematologia positiva ou sugestiva para erliquiose ou apenas com presença de carrapatos. As amostras de sangue foram coletadas da veia cefálica, obtendo de cada animal 4 ml utilizando citrato de sódio (4%) e 1 ml sem o anticoagulante ambos para extração do DNA. As frações obtidas foram sangue total (ST), papa leucocitária (PL), mononucleares (M), granulócitos (G), e coágulo de sangue (CS). Para obtenção do ST e da PL foi utilizado uma parte da amostra com citrato, sendo a PL centrifugada a rotações por 15 minutos; no restante da amostra com anticoagulante foi adicionado reagente para isolamento in vitro de linfócitos 1, segundo as recomendações do fabricante, para obtenção de mononucleares e granulócitos(figura 2). O coágulo sanguíneo foi obtido a partir da amostra sem citrato. 1 Sep Cell, LGC Biotecnologia

26 25 Figura 2 - Reagente para isolamento in vitro de linfócitos. Fonte: Sep Cell: LGC Biotecnologia. 4.3 Esfregaço Sanguíneo Os esfregaços sanguíneos foram obtidos de amostras de 22 animais, corados pelo Panótico rápido 2 e observados em microscópio (100X, objetiva de imersão em óleo) para visualização de estruturas compatíveis com mórulas. 4.4 Extração do DNA O DNA analisado foi extraído de amostras de ST (200µl), PL (50 µl), M (50 µl), G (100 µl) e CS (50 µl) utilizando-se um kit comercial 3, seguindo as instruções do fabricante. Foram realizadas extrações de DNA em 21 amostras de ST, 20 de PL, 19 de M, 19 de G e 17 de CS, que foram utilizadas na nested PCR para a amplificação do fragmento do gene 16S RNA ribossômico de Ehrlichia canis e Anaplasma platys. 2 LaborClin, Brasil 3 Invisorb Spin Blood kit Midi; INVITEK

27 Nested PCR A amplificação do DNA das amostras foi realizada no Laboratório de Diagnóstico Molecular, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, São Paulo, Brasil, utilizando a técnica de nested PCR. Para a primeira reação de PCR foi usado cerca de 0,5-1,0 µg do DNA genômico e os pares de primers sense e antisense EHO descristos na Tabela 2 (BULLA et al., 2004). Cada reação de PCR continha uma mistura de reação tampão 1X (50 µm KCl, 20 mm Tris-HCl (ph 8,4), 0,1% Triton X-100), 1,75 mm de MgCl2, 0,2 mm dntp's, 1 µm de primers PCR, 0,625 U Taq DNA polimerase e água ultrapura autoclavada para um volume final de 25 µl. O esquema de amplificação foi o seguinte: uma etapa inicial de desnaturação a 94 C por 10 minutos seguidos de 40 ciclos de desnaturação a 94 C por 60 segundos, anelamento a 60 C por 60 segundos e extensão a 72 C por 60 segundos, com uma etapa final a 72 C por 4 minutos antes de cair para 4 C. A segunda reação de PCR foi idêntica ao primeiro PCR com exceção do DNA molde e primers utilizados. O molde para a segunda reação de nested PCR foi uma alíquota de 1,0 µl de reação positiva inicial e os primers utilizados também descristos na Tabela 2 foram os seguintes: EHCA sense / EHCA antisense específicos para Ehrlichia canis (BULLA et al., 2004) e sense EHPL / EHPL antisense específico para Anaplasma platys (João Pessoa Araújo Jr., comunicação pessoal). Para cada lote de PCR, água ultra-pura autoclavada foi utilizada como molde e agiu como um controle negativo. Também dentro de cada execução da PCR, o DNA genômico de um caso confirmado de Ehrlichia canis e Anaplasma platys foi utilizado como controle positivo. Após a conclusão da segunda etapa da PCR, 10µl do produto da reação foi separado em gel de agarose a 1,5% com brometo de etídio adicionados em Tris-Borato EDTA (TBE), a 90 volts por aproximadamente 1 hora, para a visualização pela eletroforese.

28 27 Tabela 2. Sequencia de primers selecionados para a amplificação do fragmento do gene 16S RNAr de Ehrlichia pela nested PCR. Primer Agente etiológico Seqüência de Primer 5-3 EHO sense E. spp AGAACGAACGCTGGCGGCAAGCC* EHO antisense E. spp CGTATTACCGCGGCTGCTGGC* EHCA sense E. canis CAATTATTTATAGCCTCTGGCTATAGC* EHCA antisense Fonte: *Bula et al., 2004/**João Pessoa Araújo Jr., comunicação pessoal. Pares de base (pb) De-a (pb) 478 pb E. canis TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAT* 389 pb EHPL sense A. platys TTTTTGTCGTAGCTTGCTATGATA** EHPL antisense A. platys TGTGGGTACCGTCATTATCTTCCCCA** 384 pb Análise Estatística Os resultados do esfregaço sanguíneo e nested PCR utilizando papa leucocitária (PL), mononucleares (M), granulócitos (G) e coágulo sanguíneo (CS) foram comparados com os resultados da nested PCR utilizando sangue total (ST), que foi considerado o teste padrão-ouro. Foi calculado sensibilidade e indicador Kappa, utilizando o programa Dag Stat (MACKINNON, 2000). O teste de hipótese foi feito com o teste de McNemar, com um nível de significância de 5%. Os valores de referência do Kappa foram interpretados da senguinte forma: (<0) nenhuma concordância, (0-0.19) concordância pobre, ( ) concordância fraca, ( ) concordância moderada, ( ) concordância substancial, ( ) concordância quase perfeita (LANDIS & KOCK, 1977)

29 28 6 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados do esfregaço sanguíneo e da nested PCR das frações sanguíneas estão detalhados na Tabela 3 para as 24 amostras coletadas. Tabela 3. Resultados do esfregaço sanguíneo e da nested PCR das frações sanguíneas das amostras do ácido desoxirribonucleico (DNA) dos cães com sinais de Erliquiose. Nº de identicação do animal * não foi feito Esfregaço sanguíneo (E. spp.) PCR Sangue total (ST) PCR Granulócitos (G) PCR Mononucleares (M) PCR Papa de leucócitos (PL) PCR Coágulo sanguíneo (C) 01 Positivo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo * 02 Negativo Ehrlichiacanis Ehrlichia canis Ehrlichia canis Ehrlichia canis * 03 Negativo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo Negativo 04 Negativo Ehrlichia canis Ehrlichia canis Ehrlichia canis Ehrlichia canis * 05 Negativo Negativo * * Negativo Negativo 06 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo * 07 Negativo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo * 08 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 09 Positivo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo * 10 Negativo Ehrlichia canis Negativo Ehrlichia canis * Ehrlichia canis 11 Negativo Ehrlichia canis Ehrlichia canis Ehrlichia canis Ehrlichia canis * 12 Positivo Ehrlichia canis * * Ehrlichia canis/ Anaplasma Anaplasma platys platys 13 Positivo Ehrlichia canis Negativo Ehrlichia canis Ehrlichia canis Negativo 14 Negativo Anaplasma platys Negativo Negativo Negativo Anaplasma platys 15 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 16 Positivo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo Negativo 17 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 18 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 19 Positivo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo Negativo 20 Positivo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo Negativo 21 Negativo Ehrlichia canis Negativo Ehrlichia canis Ehrlichia canis Negativo 22 * * * * * Negativo 23 * * * * * Ehrlichia canis 24 Positivo * * * * Ehrlichiacanis Na pesquisa feita em esfregaços sanguíneos, das 22 amostras analisadas 8 (36,3%) apresentaram mórulas ou inclusões para Ehrlichia, sendo a positividade confirmada pela nested PCR de ST. Todos os animais positivos no esfregaço sanguíneo amplificaram DNA para Erlichia ou Anaplasma em pelo menos uma fração das amostras na nested PCR. Vários autores relatam a baixa sensibilidade do diagnóstico pelo esfregaço sanguíneo (NAKAGHI et al., 2008; RAMOS, 2009; UENO et al., 2009). Neste trabalho, a sensibilidade foi baixa (46,6%), porém maior do que a observada por Meneses et al. (2008)

30 29 em Salvador e região metropolitana (5,33% para Ehrlichia canis), por Ramos et al. (2009) em Recife-PE (9% e 21% para Ehrlichia canis e Anaplasma platys, respectivamente) e por Nakaghi et al. (2008), em Jaboticabal, SP (3,3%). A alta sensibilidade da PCR foi relatada por Mcbride et al. (1996) e Wen et al. (1997). Das 14 (63,6%) amostras negativas no esfregaço sanguíneo, 8 (57,15%) foram falso negativas, apresentando-se positivas na nested PCR de ST. Ramos et al. (2009) observou uma proporção maior de falso negativos no exame direto em relação à nested PCR para Ehrlichia canis e Anaplasma platys, concordando com os resultados encontrados no presente trabalho. O teste Kappa indicou concordância fraca entre a presença de mórulas em esfregaços sanguíneos e a nested PCR, mostrando uma diferença significativa (p = 0,0133) para o esfregaço sanguíneo como demonstrado na Tabela 4. Todas as amostras negativas na nested PCR de ST foram negativas no esfregaço sanguíneo, podendo ser justificados pela subjetividade do exame direto, devido a curta duração de parasitemia e da pouca sensibilidade da técnica como método de diagnóstico da infecção (MENESES, et al., 2008). Tabela 4. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e esfregaço sanguíneo na detecção de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica de hemoparasitoses. Esfregaço sanguíneo PCR (ST) Total Positivo Negativo Positivo Negativo Total Qui - quadrado de McNemar (p = 0, 0133) Kappa = 0, 3333 A amplificação do DNA de Ehrlichia e/ou Anaplasma pela nested PCR de ST foi confirmada em 15/21 (71,4%) amostras, apenas 6/21 (28,5%) foram negativas, como demonstradas na Figura 3. Dos 15 animais positivos, em 7 (46,4%) foi amplificado DNA de Ehrlichia canis e apenas 1 (6,6%) para Anaplasma platys. No estudo feito por Ramos et al. (2009), 32% (32/100) dos animais analisados pela nested PCR apresentavam-se infectados por Ehrlichia canis e Anaplasma platys. Esta última não é o principal agente etiológico de erliquiose no Brasil, ao contrário do observado no Chile, que tem como agente etiológico principal a Anaplasma platys (ABARCA et al., 2007).

31 30 PM AMOSTRAS CP CN CN 500 pb 400 pb 389 pb Figura 3. Eletroforese em gel de agarose (1,5%) apresentando os resultados da nested PCR para detecção do gene 16S RNA ribossômico de Ehrlichia canis. Caneleta 1: marcador de pares de base (pb) 100pb; canaleta 2 a 5: amostras de DNA extraído a partir de sangue total de animais com suspeita clínica de erliquiose; canaleta 6: controle positivo; caneleta 7: controle negativo da reação de PCR; caneleta 8: controle negativo da reação de nested. Fonte: Laboratório de Diagnóstico Molecular UNESP, campus de Botucatu. Em 7 (46,6%) amostras não houve amplificação na segunda reação de PCR, não sendo possível identificar a espécie. Isto pode ter ocorrido em função da infecção destes animais por outra espécie que não possa ser identificada com os primers utilizados para Ehrlichia canis e Anaplasma platys, como a Ehrlichia chaffeensis, já que em cinco desses animais havia mórulas no esfregaço de sangue. Foram positivas para Ehrlichia canis 3/19 (15,8%) amostras de G, 6/19 (31,6%) amostras de M, 6/20 (30%) amostras de PL e 3/17 (17,6%) amostras de CS. Anaplasma platys foi confirmado apenas em 2/17 (11,7%) amostras de CS. Um animal apresentou co-infecção de Ehrlichia canis e Anaplasma platys. Este resultado pode ser justificado pelo fato de que a Anaplasma platys infecta preferencialmente plaquetas, podendo sugerir que o CS é a melhor amostra para se identificar esta espécie. Onze animais foram submetidos à PCR de todas as frações (ST, G, M, PL, CS), em 7 (76,6%) a espécie identificada foi Ehrlichia Canis, com 2 (18,1%) animais positivos por