IDENTIFICAÇÃO DE CUPINS NA REGIÃO DE CANANÉIA, LITORAL SUL DO ESTADO DE SÃO PAULO

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1 IDENTIFICAÇÃO DE CUPINS NA REGIÃO DE CANANÉIA, LITORAL SUL DO ESTADO DE SÃO PAULO Fernando Salgado Camorani Faculdade de Ciências Biológicas Centro de Ciências da Vida Edmilson Ricardo Gonçalves Grupo de Pesquisa: Ecologia, Biologia Molecular e Filogenia de cupins e formigas Centro de Ciências da vida erg@puc-campinas.edu.br Resumo: O número de espécies em uma ilha é decorrente das taxas de migração e extinção locais, tornando este ambiente muito particular quanto as espécies que nele ocorrem. No Brasil, pouco se sabe sobre as espécies de Isoptera que ocorrem em ambientes insulares, quando comparados às regiões costeiras. Assim, o objetivo desse trabalho foi identificar, por taxonomia clássica e molecular, as espécies de cupins que ocorrem na Ilha Comprida, litoral sul do estado de São Paulo. Nossa hipótese é de que poucos dados moleculares estão disponibilizados no GenBank referentes as espécies de cupins de ecosssitemas brasileiros. Para tanto, foram realizadas duas coletas e amostrados 29 ninhos. Primeiramente, as espécies foram identificadas com uso de chaves taxonômicas e por comparação com aquelas depositadas no Museu de Zoologia da USP. O DNA dos cupins foi extraído e a região do gene coi foi amplificada por PCR. Os produtos do PCR foram sequenciados e comparados aos do GenBank (NCBI). Todas os cupins coletados foram identificados como pertencentes à Familia Termitidae, representada por três gêneros: Nasutitermes, Diversitermes e Microcerotermes. O código de barra de DNA permitiu a identificação até gênero, visto que é a primeira vez que essas espécies têm seus genes coi sequenciados. Não foram encontradas, até o momento, sequencias similares depositadas no GenBank, comprovando nossa hipótese. Para os representantes do gênero Microcerotemes não foi definida a espécie, tanto por taxonomia clássica quanto por molecular, sugerindo uma provável nova espécie. Palavras-chave: térmita; taxonomia molecular; cupim Área do Conhecimento: Ciências Biológicas Biologia Molecular 1. INTRODUÇÃO Ilha Comprida apresenta uma extensão de 72 km que se separa do continente sul americano devido à presença de canais lagunares. É uma região que apresenta uma planície resultante de transgressões e regressões durante períodos anteriores e ações geológicas dinâmicas que afetam ainda esta região [1]. Apresenta um solo arenoso recoberto com serrapilheira e abriga um conjunto de flora, praias e dunas muito importantes. A Ilha Comprida apresenta uma função direta no complexo estuarino-lagunar de Cananéia, pois é incumbida de formar as condições ambientais nesta laguna [2]. Essa ilha apresenta um ecossistema bem complexo, incluindo vegetação de dunas, mangues, restinga, praias e mata atlântica, além de abrigar alguns exemplares da fauna ameaçados de extinção [3]. Um estudo realizado com anuros mostrou que a região costeira de Cananéia atualmente é resultado de cinco eventos geológicos: o primeiro teve como característica a transgressão (Pleistoceno), onde o nível do mar ergueu-se cerca de 8 m acima do nível atual, levando a um isolamento das ilhas do complexo Lagamar. Seguido a isso, uma fase de regressão aconteceu, ainda no Pleistoceno e cerca de anos atrás o nível do mar chegou a 110 m abaixo do atual. No quarto estágio, outro quadro de transgressão, isolando as ilhas e no quinto estágio o nível do mar se estabilizou ao nível atual [4]. Os cupins apresentam grande importância na manutenção do meio ambiente, participando em processos de fluxo de nutrientes bem como decomposição. Além disso, os cupins são importantes para o fluxo de minerais e aumento da porosidade do solo [5]. Segundo Constantino, a região neotropical contempla cinco famílias de cupins (Kalotermitidae, Rhinotermitidae, Serritermitidae, Stolotermitidae e Termitidae). A família Termitidae se divide em oito sub-

2 famílias, porém na região neotropical encontram-se somente Apicotermitinae, Nasutitermitinae, Syntermitinae e Termitinae. Levando isto em conta, o Brasil apresenta cerca de 92 gêneros e 559 espécies. Até 1999 foram descritas cerca de espécies de cupins nas regiões tropicais do planeta, sendo que no Nordeste brasileiro somente 28 espécies de cupins foram registradas [6]. O estudo de cupins na região brasileira é muito escasso e poucas sequências de DNA relativo ao gene citocromo oxidase se encontram depositadas no banco de dados GenBank (NCBI). Atualmente, somente 14 espécies apresentam sequências depositada no GenBank (NCBI.nlm.nih.gov) relativo ao gene citocromo oxidase subunidade I, II e II (COI, COII e COIII), alguns com sequência de COI e COII, outros somente com COI, o gene escolhido para os projetos de identificação molecular da biodiversidade no planeta [7]. 2. Material e Métodos Figura 1. Georreferenciamento dos ninhos referentes à segunda coleta em Ilha comprida, São Paulo, com o número do ninho em destaque (Foto: Google Maps). 2.1 Coleta das amostras de cupim As coletas foram realizadas em diversos pontos na região de Ilha Comprida, abrangendo um total de 28 ninhos (Quadro 1 e Quadro 2). Para isso, foram necessárias duas idas ao local, uma em Agosto de 2014 e outra em Janeiro de As áreas de coleta estão indicados na figura 1. Os ninhos foram georreferenciados e fotografados. Em seguida, um fragmento de cada ninho foi retirado com auxílio de uma picareta e colocado em um saco plástico com as devidas informações (nº do ninho, local e data) e posteriormente levado ao laboratório da Pontifícia Universidade Católica de Campinas Triagem do material e acondicionamento das amostras. Como primeira etapa no processo de triagem, os cupins foram colocados em uma placa de petri com o auxílio de um pincel para, em seguida, serem armazenados em frascos entomológicos contendo álcool 80%. Nesta etapa não foram separados pelas castas e sim pelo ninho. Na segunda etapa da triagem, o material foi separado, uma parte para análise de DNA e outra para análise taxonômica tradicional. Após o processo de triagem o material foi armazenado em frascos contendo álcool 80% a - 20ºC até o momento da extração de DNA Extração e purificação de DNA Para a extração de DNA de cupins, foi utilizada cabeça e abdômen macerados em 30 microlitros de tampão PBS (Phosphate Buffered Saline) em tubo de microcentrifuga utilizando o kit illustra tissue & cells genomic Prep Mini Spin de acordo com o protocolo de extração descrito pelo fabricante (GE) Amplificação e sequenciamento de DNA Para o sequenciamento de DNA, foram realizadas algumas etapas prévias: a amplificação do gene desejado pelo método de Polymerase Chain Reaction (PCR), desenvolvido por Kary Mullis nos anos 80 e por fim o sequenciamento em questão. O gene mitocondrial utilizado para as análises foi o coi (citocromo oxidase, subunidade I). O Quadro I indica as sequências dos primers para a amplificação desse gene mitocondrial. As condições de amplificação por PCR foram as seguintes: O volume final foi de 25µL contendo 2,5 µl de tampão 10X, 17,4 µl de água, 0,5 mm de magnésio, 150 ng de DNA, 0,2 mm de dntp, 5 pmoles de cada primer (direto e reverso) e 2,5 Unidades de enzima Taq DNA polimerase (Thermo Scientific), utilizando os seguintes ciclos de

3 amplificação: 1 ciclo de 94 0 C por 1 minuto (desnaturação inicial); 35 ciclos de 94 0 C por 1 minuto (desnaturação), 45 0 C por 1 minuto (anelamento) e 72 0 C por 2 minutos (extensão); 1 ciclo de 72 0 C por 3 minutos (extensão final). Quadro I Sequência dos primers para amplificação por PCR dos genes mitocondriais coi (Citocromo Oxidase subunidade I). Gene Primer Sequências Fonte COI HCO 5' ATA CCT CGA CGW TAT TCA [8] GA 3' COI LCO 5' GGT CAA CAA ATC ATA AAG [8] ATA TTG G 3' COI CO1R 5 ACT TSA GGG TGY CCR AAG 3 [9] COI CO1L 5 ACW AAY CAY AAR GAY ATT GG [9] 3 COI LepF 5 ATT CAA CCA ATC ATA AAG [10] ATA TTG G 3 COI LepR 5 TAA ACT TCT GGA TGT CCA [10] AAA AAT CA 3 Sendo: W = T ou A; Y = T ou C; S = C ou G; R = G ou A Os produtos das amplificações de PCR foram visualizados em gel de agarose 1% em TAE (Tris-HCL, Ácido acético e EDTA) utilizando corante BlueGreen de acordo com as especificações do fabricante (LGC Biotecnologia). O resultado pode ser observado na Figura 2. Em resultados onde ocorreu o aparecimento de mais de uma banda de amplificação, a banda de tamanho correto foi extraída diretamente do gel com o auxílio de um bisturi esterilizado, transferida para um tubo de microcentrífuga e purificado com o kit Illustra GFX PCR DNA and Band Purification Kit (fabricante GE). Os produtos de PCR foram submetidos ao sequenciamento no Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética da UNICAMP, utilizando-se BigDye Terminator Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems). análise de qualidade do sequenciamento (Sequence Scanner, V1.0, Life Technologies Corporation), edição e comparação das sequências (Geneious 6.0 (Biomatters Limited Kearse et al., 2012). Com esse último programa foi possível excluir da sequência as regiões de baixa qualidade e primers e gerar a sequência consenso (Anexo 5.1) a partir de duas ou mais sequências (obtidas com primers direto e reverso, por exemplo), melhorando a qualidade da sequência final para que pudesse ser comparada no banco de dados através da ferramenta BLASTn do site NCBI ( 3. Resultados 3.1.Extração de DNA e amplificação por PCR As extrações realizadas com as amostras referentes às duas coletas forneceram DNA suficiente para as análises posteriores. As extrações foram realizadas com o auxílio de um kit para extração de DNA (illustra tissue & cells genomic Prep Mini Spin Kit) e armazenadas no freezer. Na etapa seguinte, de amplificação por PCR, cinco amostras geraram produtos de amplificação, e o tamanho do produto de PCR amplificado foi do tamanho esperado (~650 pb). A relação do resultado de produtos de PCR gerados por amostra é indicado no Quadro II Sequenciamento de DNA e comparação com o banco de dados. Os produtos de PCR obtidos foram enviados para o sequenciamento e os dados retornados foram analisados com auxílio de programas específicos. As sequências de DNA analisadas para as cinco amostras resultaram em três gêneros diferentes: Nasutitermes sp., Microcerotermes sp. e Diversitermes sp., representados abaixo na Figura Análise das sequencias de DNA Os dados do sequenciamento foram analisados através de programas específicos para Figura 2. Gêneros de cupins encontrados em Ilha Comprida, região de Cananéia: A) Microcerotermes

4 sp., B) Nasutitermes sp., C) Nasutitermes sp. e D) Diversitermes sp. Os resultados de sequenciamento do gene mitocondrial coi foram submetidos para comparação com sequencias de genes de diferentes espécies depositadas no banco de dados GenBank. A submissão das sequências neste banco nos trouxe resultados apenas de gêneros, pois o grau de similaridade com as sequências do banco foram inferiores a 98% em todos os casos, como indicado no Quadro III. Quadro III Resultado da comparação no Gen- Bank das amostras obtidas pelo sequenciamento e seus respectivos graus de similaridade. Amostra 4. Discussão Espécie mais próxima de acordo com o GenBank Grau de Similaridade 1 Nasutitermes corniger 92% 2 Microcerotermes parvus 92% 3 Neocapritermes araquaia 92% 4 Nasutitermes araquaia 94% 5 Microcerotermes parvus 92% A utilização do gene citocromo oxidase subunidade I vem sendo amplamente usado para identificar espécies [11]. Os resultados de amplificação do gene mitocondrial coi de cupins obtidos no presente trabalho foram similares àqueles descritos por Melo e colaboradores para outras espécies, ou seja, um produto de amplificação com cerca de 650 pb. O insucesso na amplificação do gene mitocondrial coi de diversos cupins (Quadro II) muito provavelmente se deve ao fato de serem espécies distantes filogeneticamente das espécies usadas para a elaboração dos primers de PCR [8, 11]. Essa distância genética implica em diferenças nas sequencias gênicas, explicando o insucesso na amplificação. Para contornar tal problema, teríamos a necessidade de desenvolver outros primers mais adequados para essas espécies coletadas, ou mesmo tentarmos novas condições de amplificações. Com relação à identificação taxonômica dos cupins por comparação com o Genbank (NCBI), só pudemos identificar até o nível de gênero. Isso se deve ao fato da limitação de informações das espécies brasileiras nesse banco de sequências gênicas mundiais. Uma vez que a identificação é realizada por comparação, se o banco não está bem representado, não permite a identificação. A fauna térmita não só do Brasil, mas como da região Neotropical é pouco conhecida e especificamente na Mata Atlântica, foram feitas pesquisas em poucas áreas [13]. Tais resultados só nos apontam a necessidade de mais pesquisas com a termitofauna brasileira, permitindo melhor conhecimento das espécies, seus papeis biológicos e, em casos necessários, possíveis manejos. A presença do gênero Nasutitermes como resultado de duas das cinco amostras pode ser compreendida devido a ser um gênero muito encontrado na região do sudeste brasileiro [14]. Dentre as espécies de Nasutitermes encontradas neste presente trabalho, uma delas pode ser classificada através da taxonomia clássica como Nasutitermes corniger, que segundo Constantino, citado por Reis e Cancello, é considerada uma das mais importantes espécies-praga da região sul americana. As amostras de Microcerotermes encontradas também não puderam ser identificadas até espécie, tanto por taxonomia clássica quanto molecular, sendo que os dados moleculares apresentaram 92% de similaridade com Microcerotermes parvus quando comparados no banco de dados. Esta porcentagem indica que as amostras coletadas para este trabalho e a amostra depositada no banco são do mesmo gênero, porém de espécies diferentes, pois de acordo com Hebert e colaboradores, quando duas espécies apresentam moléculas de DNA com divergência entre 5,8% até 9,1% são do mesmo gênero, porém de espécies distintas. Tanto os resultados de taxonomia molecular, quanto os de taxonomia clássica sugerem que as amostras de Microcerotermes pertencem a uma espécie nova, nunca descrita na literatura cientifica. Os resultados aqui encontrados apontam para a necessidade de novas coletas na região e da continuidade dos estudos para a conhecimento da termitofauna na região de Cananéia e a descrição dessa espécie nova do gênero Microcerotermes. 5. REFERÊNCIAS

5 [1] Gandolfo, O. C. B.; Souza, L. A. P.; Tessler, M. G.; Rodrigues, M. Estratigrafia rasa da Ilha Comprida (SP): um exemplo de aplicação do GPR. Revista Brasileira de Geofísica. Vol. 19(3), pp , [2] Campos, W. W. Análise e mapeamento da estrutura da paisagem da Ilha Comprida, no litoral sul de São Paulo f. Dissertação (Mestrado em Geografia Física) Programa de Pós-Graduação de Geografia Física, Universidade de São Paulo, Brasil, [3] Barbieri, E.; Mendonça, J. T.; Xavier, S. C. Distribuição da Batuíra-de bando (Charadrius semipalmatus) ao longo do ano de 1999 na praia da ilha comprida. Notas Téc. FACIMAR. Vol. 4, pp , [4] Zina, J.; Prado, C. P. A.; Brasileiro, C. A.; Haddad, C. F. B. Anurans of the Sandy coastal plains of the Lagamar paulista, state of São Paulo, Brazil. Biota Neotrop. Vol. 12, n.1, pp , [5] VASCONCELLO, A.; MÉLO, A. C. S.; SEGUNDO, E. M. V.; BANDEIRA, A. G. Cupins de duas florestas de restinga do nordeste brasileiro. Sér. Zool. Vol (95(2), pp , Disponível em: < Acesso: 02 Jun [6] BANDEIRA, A. G.; VASCONCELLOS, A. Estado atual do conhecimento sistemático e ecológico sobre os cupins (Insecta, Isoptera) do nordeste brasileiro. Revista Nordestina de Biologia. Vol. 13(1/2), pp 37-45, Disponível em: < icle/viewfile/12075/7027>. Acesso? 02 Jun [7] Vernooy, R., Haribabu, E., Muller, M. R., Vogel, J. H., Hebert, P. D. N., Schindel, D. E., Singer, G. a C. (2010). Barcoding life to conserve biological diversity: beyond the taxonomic imperative. PLoS biology, 8(7), e [11] MELO, B. F.; BENINE, R. C.; MARIGUELA, T. C.; OLIVEIRA, C. A new species of Tetragonopterus Cuvier, 1816 (Characiformes: Characidae: Tetragonopterinae) from the rio Jari, Amapá, northern Brazil. Neotrop. Ichthyol. Vol. 9, n. 1, [12] Booth, W., Brent, C. S., Calleri, D. V., Rosengaus, R. B., Traniello, J. F. a., & Vargo, E. L. (2011). Population genetic structure and colony breeding system in dampwood termites (Zootermopsis angusticollis and Z. nevadensis nuttingi). Insectes Sociaux, 59(1), [13] REIS, Y. T.; CANCELLO, E. M. Riqueza de cupins (Insecta, Isoptera) em áreas de Mata Atlântica primária e secundária do sudeste da Bahia. Sér. Zool. Vol. 97(3), pp , Disponível em:< Acesso em: 22 jun [14] OLIVEIRA, L. C. M. Diversidade de térmitas (Insecta: Isoptera) em um grande latitudinal de Mata Atlânica do sul e sudeste brasileiro f. Tese (Doutorado em Biodiversidade e Ecologia de Insetos) Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Ecologia de Insetos, Universidade de São Paulo, Brasil, [8] Folmer, O., Black, M., Hoeh, W., Lutz, R., & Vrijenhoek, R. (1994). DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Molecular marine biology and biotechnology, 3(5), [10] HAJIBABAEI, M.; JANZEN, D. H.; BURNS, J. M.; HALLWACHS, W.; HEBERT, P. D. N. DNA barcodes distinguish species of tropical Lepidoptera. Proc Natl Acad Sci U S A. Vol. 103(4), 2006.

6 Quadro II Resultado das amplificações realizadas com primers HCO/LCO, CO1L/CO1R e LF/LepR. Coleta Ninho Amostra Taxonomia Clássica 1ª 2ª Resultado da Amplificação com HCO/LCO Resultado da Amplifi- cação com CO1R/CO1L Resultado da Amplifi- cação com LepF1/LepR1 2 1 Nasutitermes sp Microcerotermes sp Diversitermes sp Nasutitermes sp Microcerotermes sp. + + NT 1 6 Microcerotermes sp Nasutitermes jaraguae Nasutitermes ehrhardti Nasutitermes ehrhardti Não classificado Nasutitermes sp Nasutitermes sp Nasutitermes ehrhardti Nasutitermes ehrhardti Nasutitermes jaraguae - +* Nasutitermes sp. - +* Nasutitermes jaraguae Nasutitermes aquilinus Microcerotermes sp Microcerotermes sp Microcerotermes sp Nasutitermes ehrhardti +* Microcerotermes sp. +* Microcerotermes sp. +* Sem soldado NT NT NT Nasutitermes aquilinus Microcerotermes sp