USO DO FILTRO DE CELULOSE E PAPEL FILTRO PARA REDUÇÃO DO VOLUME DA SOLUÇÃO CRIOPROTETORA NA VITRIFICAÇÃO DE EMBRIÕES MURINOS RESUMO INTRODUÇÃO

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1 ARTIGO DE ORIGINAL ISSN USO DO FILTRO DE CELULOSE E PAPEL FILTRO PARA REDUÇÃO DO VOLUME DA SOLUÇÃO CRIOPROTETORA NA VITRIFICAÇÃO DE EMBRIÕES MURINOS Willian Daniel Pessoa 1, Fabiane Aparecida de Alvarenga Rosa Porto 1, Vera Lucia Langaro Amaral 1 1. Laboratório de Biotecnologia da Reprodução - Universidade do Vale do Itajaí UNIVALI Santa Catarina. DATA RECEBIMENTO: 02/05/2016 ACEITO PARA A PUBLICAÇÃO: 10/10/2016 AUTOR PARA CORRESPONDÊNCIA: Vera Lucia Langaro Amaral veralangaro@gmail.com Este estudo teve como objetivo avaliar a eficiência do filtro de celulose e papel filtro na diminuição do volume de crioprotetor na vitrificação de embriões murinos. Foram utilizadas 20 fêmeas de camundongos F1 (C57Bl/6 X BALBc), com 04 semanas de idade, e superovuladas por administração intraperitoneal de 10 IU ecg (Gonadotrofina Coriônica equina Novormon-SYntex ) e após 48h com 10 IU hcg (Gonadotrofina Coriônica humana Vetecor-HertapeCalier ). A vitrificação e aquecimento de todos os grupos seguiu o protocolo estabelecido pelo método Vitri-Ingá. Na última etapa da técnica, o excesso de meio crioprotetor foi aspirado com pipeta pasteur de vidro estirada (Grupo A), com tiras de papel filtro (Grupo B) e com tiras de celulose (Grupo C), sendo imediatamente imersos em nitrogênio líquido. A análise estatística foi realizada através do cálculo chi², avaliando as taxas de sobrevivência, clivagem, formação de blastocistos e eclosão. Percebeu-se que não houve diferença entre os grupos A e B quanto as taxas de sobrevivência, clivagem, blastocistos e eclosão. Houve diferença (p<0,05) nas taxas de blastocisto (80,8%, 60%) e eclosão (55,3%, 33,3%) entre o grupo A e o grupo C, respectivamente. Ao fim, concluiu-se que a utilização do papel filtro na vitrificação de embriões neste estudo foi satisfatória e promissora, confirmando a importância da velocidade de resfriamento para o sucesso da técnica e ainda buscou simplificar e melhorar a execução da metodologia. RESUMO Palavras-chave: Embriões. Papel filtro. Vitrificação. INTRODUÇÃO A criopreservação de gametas e embriões é uma técnica que tem despertado grande interesse para a reprodução assistida, humana e animal, nas últimas três décadas. A produção de embriões murinos é fundamental para o desenvolvimento de diversas áreas da ciência através do aprimoramento de técnicas e protocolos. A criobiologia é uma área de grande importância na pesquisa, pois possibilita a criopreservação de embriões e a formação de bancos, que estariam disponíveis para fins de estudos e preservação de linhagens de animais de laboratório de interesse biomédico. A vitrificação é um método de criopreservação através do qual ocorre a solidificação da solução que contém o embrião sem a formação de cristais de gelo intracelular, uma vez que a passagem pela zona crítica (-5 a -80 ºC) de resfriamento ocorre de maneira muito rápida. O estado vítreo refere-se à aparência macroscópica dessa solução, que se mostra clara e transparente. Para tanto, são necessárias elevadas taxas de resfriamento e aumento da concentração dos crioprotetores¹, ². RESBCAL, São Paulo, v.4 n.2, pg ,

2 USO DO FILTRO DE CELULOSE E PAPEL FILTRO PARA REDUÇÃO DO VOLUME DA SOLUÇÃO CRIOPROTETORA NA VITRIFICAÇÃO DE EMBRIÕES MURINOS O principal objetivo de um protocolo de criopreservação é atingir temperaturas criogênicas sem danos químicos e físicos, e sem formação gelo intracelular e isso pode ser idealmente alcançado pela vitrificação. Este fato se deve a utilização de crioprotetores intracelulares e extracelulares, ou com associação de mais crioprotetores.³ Segundo Schneider & Mazur 4, o embrião quando exposto a um crioprotetor intracelular, retrai devido à perda de água causada pela hiperosmolaridade inicial do meio extracelular, e também porque o embrião é mais permeável à saída de água do que à entrada do crioprotetor. O índice de entrada do crioprotetor depende do coeficiente de permeabilidade deste e da temperatura da solução. O equilíbrio é atingido quando o embrião retorna ao seu volume anterior em meio isotônico. As características fundamentais para um eficiente agente crioprotetor é o baixo peso molecular, a sua alta capacidade de atravessar a membrana celular e uma baixa toxicidade. Em geral, agentes com rápida capacidade de penetração são mais favoráveis, porque o tempo de exposição ao crioprotetor antes do rápido resfriamento é curto, prevenindo assim, as injúrias osmóticas. 5 A vitrificação pelo método de Cryotop 6 tem recebido especial atenção, principalmente pelos ótimos resultados em embriões humanos. Tal técnica consiste na utilização de uma haste de polipropileno na qual os embriões são alocados junto a volumes mínimos (microgotas) de crioprotetor. Esse sistema tem se mostrado promissor para vitrificação tanto de embriões, como de oócitos 7, 6, 8. A vitrificação com a técnica Vitri- Ingá 9, consiste na transferência do embrião ou oócito, também para uma haste de polipropileno diferenciada com um volume mínimo de solução crioprotetora. Embora haja inúmeros estudos sobre criopreservação de embriões, os resultados ainda são muito divergentes, provavelmente pelas inúmeras variáveis que se apresentam, como estágio embrionário, associação de crioprotetores, recipiente para o envase e ainda o volume de crioprotetor e protocolos utilizados no momento da vitrificação. Estes fatores ressaltam a importância e o desenvolvimento de novas metodologias na área da criobiologia. Principalmente as que facilitem a manipulação dos embriões no momento da criopreservação, já que o tempo de exposição ás soluções crioprotetoras deve ser mínimo e limitado. Este estudo utilizou o filtro de celulose e papel filtro no auxílio da redução do volume da solução crioprotetora e avaliou a viabilidade de utilizar este protocolo nas rotinas diárias de criopreservação. MATERIAIS E MÉTODOS Este projeto foi submetido a CEUA (Comissão de ética no uso de animais) UNIVALI e aprovado sob o o parecer n 040/13. Para este estudo foram utilizadas 20 camundongos fêmeas F1 (C57Bl/6 X BALBc) provenientes do Biotério Central da Universidade do Vale do Itajaí, com 04 semanas de idade. O ambiente teve condições controladas de temperatura (22 ± 2ºC) e fotoperíodo de 12 horas (claro/escuro), com água e ração à vontade. As fêmeas foram superovuladas por administração intraperitoneal de 10 IU ecg (Gonadotrofina Coriônica equina Novormon-SYntex ) e após 48h com 10 IU hcg (Gonadotrofina Coriônica humana Vetecor-HertapeCalier ). Após a aplicação de hcg, as fêmeas foram colocadas em caixas individuais com machos para o acasalamento. No dia seguinte, a cópula foi constatada através da observação de tampão seminal na vagina da fêmea. Após 36 horas as fêmeas foram mortas em câmara de CO2/O2 e as tubas uterinas retiradas e lavadas através de perfusão pelo infundíbulo com meio GV-Hepes (Ingaméd ) para retirada dos embriões de duas a quatro células. Os embriões (N=156) foram selecionados pela integridade morfológica, regularidade dos blastômeros e divididos em três grupos iguais (N=52): grupo Controle (A), papel filtro (B) e filtro de celulose (C). A vitrificação de todos os grupos do estudo seguiu o protocolo estabelecido pelo método Vitri- -Ingá 9. O kit Vitri-Ingá possui as soluções de vitrificação VI-1 e VI-2 e as soluções de aquecimento DV1, DV2, e DV3, além de uma haste fina 116 RESBCAL, São Paulo, v.4 n.2, pg , 2016

3 Willian Daniel Pessoa, Fabiane Aparecida de Alvarenga Rosa Porto, Vera Lucia Langaro Amaral de polipropileno (0,7 mm de espessura) com uma ponta arredondada. Após a coleta, os embriões selecionados (52 para cada grupo) foram alocados, sempre agrupados em 2, em 20 μl de solução de GV-Hepes (Ingaméd ), em seguida foi unida a uma gota de 20µL de solução de equilíbrio VI-1 por 3 minutos, na sequencia uma nova gota de 20µL de solução de equilíbrio VI-1 foi unida por mais 3 minutos. Os embriões então foram transferidos e mantidos por 10 minutos em uma nova gota 20µL de solução de equilíbrio VI-1. Em seguida os embriões foram transferidos para 3 gotas sequenciais de 20 μl de solução VI-2, permanecendo por 20 segundos em cada uma, e imediatamente alocados na haste. O excesso de meio crioprotetor foi aspirado com pipeta pasteur de vidro estirada (Grupo A), com tiras de papel filtro (Grupo B) e com tiras de celulose (Grupo C), sendo imediatamente imersos em nitrogênio líquido. O tempo total entre a exposição inicial ao VI-2 até sua imersão em nitrogênio líquido (NL2) não ultrapassou 80 segundos. O diferencial da técnica convencional para a técnica proposta está no uso do papel filtro (B) ou filtro de celulose (C) no formato de triângulo, com 0,5 cm de base e 1 cm nas laterais, fixado a uma pinça e colocada sobre a haste de forma a absorver o excesso de crioprotetor. Para o aquecimento, as hastes foram removidas do NL2, retirada da capa protetora, e imediatamente mergulhadas em 20 μl de solução de aquecimento DV - I (37ºC) durante 1 minuto. Os embriões recuperados foram transferidos para 100μL de solução DV - II durante 3 minutos à temperatura ambiente (20 ºC), e finalmente foi mantido durante 5 minutos em cada uma das duas últimas gotas contendo 100μL de solução DV III. Após este período, os embriões foram colocados em cultura em meio SSM (Single Step Mediun-Irvine ) suplementados com 10% de SSS (Substitute Serum Suplement-Irvine ), cobertos com óleo mineral, e mantidos em incubadora a 37 C em atmosfera de 6% de CO2 até a eclosão dos blastocistos. A análise estatística foi realizada através do cálculo chi², avaliando as taxas de sobrevivência, clivagem, formação de blastocistos e eclosão. RESULTADOS Os resultados demonstraram(tab.1) que houve diferença nas taxas de formação de blastocistos entre o grupo A e o grupo C (p<0,05). O mesmo pode ser observado, com relação às taxas de eclosão dos blastocistos (p<0,05). O grupo B não apresentou diferença estatística quando comparado aos demais grupos. DISCUSSÃO A vitrificação de embriões ainda é um desafio para pesquisadores da área de reprodução, o desenvolvimento de protocolos eficientes que utilizam soluções crioprotetoras de baixa toxici- Tabela 1: Taxas de sobrevivência embrionária, clivagem, formação de blastocisto e eclosão de embriões vitrificados no estágio de duas a quatro células, pelo método Vitri-Ingá, com redução de volume do crioprotetor realizada com: pipeta pasteur de vidro estirada - controle (A), papel filtro (B) e filtro de celulose (C). Número de Embriões Sobrevivência Clivagem Blastocisto Eclosão GRUPO (A) 52 47/52 (90,4%) 43/47 (91,4%) 38/47 (80,8%) ab 26/47 (55,3%) ab GRUPO (B) 52 49/52 (94,2%) 48/49 (97,9%) 33/49 (67,3%) a 21/49 (42,8%) a GRUPO (C) 52 45/52 (86,6%) 40/45 (88,8%) 27/45 (60%) ac 15/45 (33,3%) ac RESBCAL, São Paulo, v.4 n.2, pg ,

4 USO DO FILTRO DE CELULOSE E PAPEL FILTRO PARA REDUÇÃO DO VOLUME DA SOLUÇÃO CRIOPROTETORA NA VITRIFICAÇÃO DE EMBRIÕES MURINOS dade, associadas a técnicas confiáveis de envase, são fundamentais para proporcionarem maior sobrevivência embrionária e, consequentemente, maiores taxas de gestação. Este estudo avaliou a eficiência da vitrificação de embriões murinos em haste, utilizando filtro de celulose e papel filtro, em substituição a pipeta pasteur de vidro estirada na redução do volume da solução crioprotetora, buscando simplificar a metodologia. O uso da pipeta estirada nesta etapa, é fundamental para o sucesso da técnica de vitrificação. Na maioria dos protocolos que a literatura aborda, o envase e armazenamento dos embriões são feitos em dispositivos que tem como objetivo minimizar o volume de crioprotetor 10, 11, 12, uma vez que, quanto menor o volume da solução de vitrificação, maior a taxa de resfriamento e menor são as chances de formação de cristais de gelo, pois haverá uma passagem direta do estado líquido para o estado vítreo, sem passar pela cristalização 6, como consequência, as taxas de sobrevivência poderão aumentar 6. Nishikawa e cols 13, vitrificaram embriões de camundongos em estágio de 2-4 células, separados em 3 grupos com metodologias distintas: Cryotip, Cryotop e Vitri-Ingá, e avaliaram as taxas de blastocisto, que foram de 75%, 70% e 60%, respectivamente, verificando que não houve diferença significativa entre os grupos. Quando utilizaram a metodologia de haste Vitri-Inga obtiveram resultado igual ao presente estudo, ao se comparar com o grupo que utilizou o filtro de celulose (60%). Este trabalho apresentou resultados superiores, com a utilização de papel de filtro (67,3%), e utilizando a mesma metodologia com pipeta pasteur de vidro estirada (80,8%), sendo este o nosso grupo controle. Entretanto, em outro estudo, Neto e cols 14, utilizaram a mesma metodologia Vitri-Ingá, com redução de volume com pipeta pasteur de vidro estirada, e obtiveram uma taxa de formação de blastocistos murinos de 88%, semelhante aos nossos resultados. Zhang e cols 15, realizaram um estudo com embriões murinos no estágio de 2 células e observaram uma taxa de 96,7% de sobrevivência embrionária, 69,4% de formação de blastocistos e 52,6% de eclosão, utilizando as mesmas concentrações de crioprotetores (Etilenoglicol e Dimetilsulfoxido), as mesmas que utilizamos em nosso estudo, porém a redução do volume foi obtida pelo Cryotop, que consiste em uma haste de polipropileno, semelhante a utilizada em nosso estudo, em que os embriões são colocados em volumes mínimos de solução crioprotetora. Estes resultados corroboram com nosso trabalho quanto as taxas de sobrevivência e formação de blastocistos, porém os nossos resultados foram inferiores quanto a eclosão nos grupos em que utilizamos os artefatos para redução de volume. A probabilidade de sucesso na vitrificação está ligada a três fatores: viscosidade da amostra, taxas de refrigeração-aquecimento e volume da amostra. Estes fatores são independentes, e os dois primeiros estão relacionados direta e positivamente à probabilidade de vitrificação, isto é, quanto maior a viscosidade e a taxa de refrigeração, maior será a eficiência da vitrificação. No entanto, o volume da amostra tem relação inversa, e sua diminuição aumenta a probabilidade de sucesso 16. Cheuiche e cols 12 em seu experimento, utilizaram micropipetas de quartzo (QMC) de dois diferentes diâmetros internos (0,1mm e 0,2mm), e compararam a taxa de sobrevivência de blastocistos murinos obtidas na vitrificação dos embriões (54,8% e 58,5% respectivamente), concluindo que não houve diferença significativa nas taxa de eclosão entre os grupos experimentais. Osuna 11 em seu trabalho para determinar a taxa de sobrevivência de blastocistos murinos vitrificados em macro e microvolumes de crioprotetor (respectivamente, palhetas de 0,25mL e micropipetas de vidro - GMP), obtiveram uma taxa de eclosão de blastocistos de 4% (2/57) quando envasados em palhetas, e uma taxa de eclosão de blastocistos de 60% (52/86) quando envasados em micropipetas de vidro - GMP. Estes resultados comprovam que a redução do volume de vitrificação favorece a sobrevivência e aumenta a taxa de eclosão dos blastocistos. A técnica de vitrificação em micropipeta de vidro relatada por Cho e cols 17, teve como objetivo 118 RESBCAL, São Paulo, v.4 n.2, pg , 2016

5 Willian Daniel Pessoa, Fabiane Aparecida de Alvarenga Rosa Porto, Vera Lucia Langaro Amaral substituir a palheta de OPS por uma micropipeta que não flutuasse em nitrogênio líquido e com diâmetros interno e externo menores, que reduzem o volume de crioprotetor. As micropipetas de vidro GMP, foram produzidas a partir de capilares de vidro distendidos com o auxílio de um equipamento especifico, seu diâmetro na parte central diminuiu de 1,0 para 0,3mm, comportando um volume 19 vezes menor que a palheta de OPS que comporta um volume de 2,68mm³. Os autores realizaram a técnica com embriões bovinos. A taxa de re-expansão verificada foi significativamente maior para embriões vitrificados em GMP (90,4%) do que para embriões vitrificados em OPS (79,6%). Este é mais um estudo que comprova a importância na redução do volume de crioprotetor e consequentemente aumento na taxa de resfriamento. Assaf e cols 18 testaram diferentes volumes de solução de 9,0 M de etilenoglicol na vitrificação de embriões murinos. Os embriões foram envasados em fios de teflon (volume= 1 µl) ou tubos eppendorf (volume= 3 µl), sendo que as taxas de eclosão embrionária foram de 42,22% e 19,82% respectivamente. Estes dados demonstram que o volume afetou negativamente as taxas de eclosão. Da mesma forma que o volume pode ter afetado as taxas de formação blastocistos no presente estudo, quando utilizou-se o filtro de celulose, pois foi observado que sua absorção não foi tão eficiente quanto o uso de pipeta pasteur de vidro estirada e filtro de papel na redução do volume da solução crioprotetora. A alta taxa de resfriamento por minuto é essencial para o sucesso da criopreservação, pois é ela, juntamente com os crioprotetores, que evitam a formação de cristais de gelo e posteriores lesões celulares. As injúrias causadas pelo frio é o maior obstáculo para o sucesso da criopreservação, podendo ocasionar lesões nas membranas celulares, organelas, blastômeros e zona pelúcida 11. No grupo do filtro de celulose, pode ter havido danos celulares pelo excesso de volume da solução crioprotetora, que causa uma diminuição na taxa de resfriamento e como consequência, diminuição do metabolismo embrionário e com isso ocorrido a diminuição da quantidade celular interna do blastocisto, seguido por menor expansão e dificuldade na eclosão. Tal injúria celular pode ter sido responsável pela diminuição da taxa de blastocistos e de eclosão. Sem dúvida os dados deste estudo poderiam ter melhores taxas de formação de blastocistos e eclosão. Certamente a repetibilidade das técnicas tendem ao aperfeiçoamento. Esta metodologia pode ser considerada promissora se algumas modificações forem adaptadas, como por exemplo, na escolha do material para absorção do crioprotetor, visto que o filtro de celulose não foi eficaz quando comparada ao grupo controle. A modificação da técnica de criopreservação no momento do envase visa uma retirada mais precisa e rápida do excesso de volume da solução crioprotetora, diminuindo os riscos de toxicidade celular, garantindo uma maior eficiência e recuperação das células. Os resultados deste estudo foram satisfatórios, podendo ser esta, uma metodologia alternativa com o objetivo de alcançar resultados que possam suportar um protocolo que vise a diminuição do volume de vitrificação. Além, podendo contar ainda com a facilidade na execução da técnica. Esta proposta de uso de materiais que absorvam o volume de crioprotetor ainda não foi encontrada na literatura, o que reforça a importância deste estudo, que apresenta uma nova abordagem na redução do volume crioprotetor, ampliando a visão sobre as técnicas empregadas na vitrificação, uma vez que a ideia implantada abre extenso horizonte para inovações em relação a redução de volume. CONCLUSÃO A utilização do papel filtro na vitrificação de embriões neste estudo foi satisfatória e promissora, confirmando a importância da redução do volume da solução crioprotetora para o sucesso da metodologia, além de ter simplificada a execução da técnica. RESBCAL, São Paulo, v.4 n.2, pg ,

6 USO DO FILTRO DE CELULOSE E PAPEL FILTRO PARA REDUÇÃO DO VOLUME DA SOLUÇÃO CRIOPROTETORA NA VITRIFICAÇÃO DE EMBRIÕES MURINOS USE OF CELLULOSE FILTER AND PAPER FILTER TO REDUCE THE VOLUME OF CRYOPROTECTANT SOLUTION IN VITRIFICATION OF MOUSE EMBRYOS ABSTRACT The objective of this study was to evaluate the the efficiency of the cellulose filter on the reduction of the cryoprotectant during vitrification of mouse embryos. Twenty female mice, four week old, were used (C57BL / 6 X BalbC) and superovulated by intraperitoneal injection of 10 IU ecg (Equine Chorionic Gonadotropin - Novormon-SYntex ) followed 48h with 10 IU hcg (Chorionic Gonadotrophin human - Vetecor-HertapeCalier ). The protocol suggested by Vitri-Ingá was used for vitrification and heating. During the last step of the protocol, the excess of the cryoprotectant medium was aspirated with glass Pasteur pipette (Group A), with filter paper strips (Group B) and cellulose strips (Group C), and immediately mv immersed in liquid nitrogen. Statistical analysis was performed using the chi² calculation, evaluating survival rates, cleavage, blastocyst formation and hatching. There was no difference between groups A and B on survival rates, cleavage, blastocyst and hatching. However, there were differences (p <0.05) in blastocyst rates (80.8%, 60%) and hatching (55.3%, 33.3%) between group A and group C, respectively. It was concluded that the use of filter paper for the vitrification of embryos in the present study was satisfactory and promising, confirming the importance of the cooling rate for the success of the technique and it has also tried to simplify and improve the implementation of the methodology. Keywords: Embryos. Cellulose filter. Vitrification. REFERÊNCIAS 1. Vajta G, Holm P, Kuwayama M, Booth PJ. Open pulled straw (OPS) vitrification: a new way to reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos. Mol. Reprod. Dev Fev; 51 (1): doi: /(SICI) (199809)51:1<53::AID- MRD6>3.0.CO;2-V. 2. Vajta G. Vitrification of the oocytes and embryos of domestic animals. Animal Reproduction Science Jul; 60 (1): doi: / S (00)00097-X. 3. Green RE. Princípios e técnicas da vitrificação de embriões dos animais domésticos [dissertação na Internet]. Botucatu (Brasil): Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia; 2005 [citado 10 out. 2014]. 21 p. Disponível em: Renata.pdf. 4. Schneider V, Mazur P. Osmotic consequences of cryoprotectant permeability and its relation to the survival of frozen-thawed embryos. Theriogenology Jan; 21(1): doi: org/ / x(84) Kasai M. Simple and efficient methods for vitrification of mammalian embryos Anim. Reprod. Sci Abr; 42 (1): doi: / (96) Kuwayama M, Vajta G, Kato O, Leibo SP. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reprod. Biomed. Online Set; 11(3): doi: /j. theriogenology Papis K, Shimizu M, Izaike Y. Factors affecting the survivability of bovines oocytes vitrified in driplets. Theriogenology Set; 54 (5): doi: /S X(00) Spricigo JF, Morais KS, Yang BS, Dode MA. Effect of the exposure to methyl-beta-cyclodextrin prior to chilling or vitrification on the viability of bovine immature oocytes. Cryobiology Dez; 65 (3): doi: /j. cryobiol RESBCAL, São Paulo, v.4 n.2, pg , 2016

7 Willian Daniel Pessoa, Fabiane Aparecida de Alvarenga Rosa Porto, Vera Lucia Langaro Amaral 9. Fachini FC, Almodin CG, Câmara VCM, Moron AF, Nakano R, Shimabukuru L, et al. Vitri-Ingá: um novo Protocolo de Vitrificação. JBRA Assist. Reprod Fev; 12 (1): Martino A, Songsasen N, Leibo SP. Development into blastocysts of bovine oocytes cryopreserved by ultra-rapid cooling. Biol. Reprod Mai; 54 (5): Osuna AN. Sobrevivência in vitro de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificados em nacro e microvolume de crioprotetor. [dissertação na Internet]. Rio Grande do Sul (Brasil): Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Faculdade de Medicina Veterinária; 2008 [citado 05 mai. 2015]. 66 p. Disponível em: handle/10183/13372/ pdf?sequence= Cheuiche ZMG. Vitrificação de embriões Mus domesticus domesticus envasados em microcapilares de quartzo. [dissertação na Internet]. Rio Grande do Sul (Brasil): Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Faculdade de Medicina Veterinária; 2010 [citado 31 mai. 2015]. 55 p. Disponível em: handle/10183/36859/ pdf?sequence= Nishikawa LKS, Ceschin AP, Marcondes CO, Nakano R. Estudo comparativo de três métodos de vitrificação de embriões de camundongo baseado no seu desenvolvimento in-vitro. JBRA Assist. Reprod Jul; 14 (3): p Neto JAL, Almodin CG, Rosa VB, Frajblat M, Minguetti-Câmara VC. Viabilidade embrionária pós re-vitrificação pelo método Vitri-ingá. JBRA Assist. Reprod Jun; 15 (1): Zhang J, Cui J, Ling X, Li X, Peng Y, Guo X, Heng BC, Tong GQ. Vitrification of mouse embryos at 2-cell, 4-cell and 8-cell stages by cryotop method. Journal Assisted Reproduction and Genetics Nov; 26 (11): doi: / s Yavin S, Arav A. Measurement of essential physical properties of vitrification solutions. Theriogenology Jan; 67 (1): doi: /j. theriogenology Cho SK, Cho SG, Bae IH, Park CS, Kong IK. Improvement in postthaw viability of in vitro-produced bovine blastocysts vitrified by glass micropipette. Anim. Reprod. Sci Out; 73 (3): Assaf SS, Rodrigues JL. Vitrificação de embriões mus domesticus domesticus contidos em volumes diferentes de 9,0 m de etileno glicol. Ver. Bras. Ci. Vet Mai. 13 (2): doi: / rbcv REFERÊNCIAS RESBCAL, São Paulo, v.4 n.2, pg ,