PROCEDIMENTOS OPERACIONAIS PADRÃO SETOR DE IMUNOHEMATOLOGIA

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1 PROCEDIMENTOS OPERACIONAIS PADRÃO NO SETOR DE IMUNOHEMATOLOGIA Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 1 de 21

2 Elaborado: Hildenete Monteiro Fortes Assinatura: Data da Elaboração: Aprovado e liberado por: Hildenete Monteiro Fortes Data da implantação: Data da Revisão: 10/11/11 Periodicidade da Revisão: anual REVISADO: Hildenete Monteiro Fores Tempo de arquivo: 05 anos Setor: Setor de Imunohematologia Código do documento: Imunohem 07 Número da versão atual: 05 Número total de Páginas: 21 Número de cópias - distribuição: 02 Original para a direção arquivo Setor de Imunohematologia da Agência Transfusional ESTE É UM DOCUMENTO CONTROLADO Não deve ser copiado ou distribuído sem a autorização da chefia da agência transfusional do HUJM. Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 2 de 21

3 1. OBJETIVO E APLICAÇÃO: O objetivo da padronização é o melhor aproveitamento técnico dos reagentes, mais agilidade e confiabilidade nos exames realizados no setor de imunohematologia da agência transfusional do HUJM, obedecendo a (Portaria N o 1353 de 13 de Junho de 2011). 2. OBJETIVOS GERAIS: Identificar o Grupo Sangüíneo, realizar Coombs dirteo e pesquisar anticorpos irregulares dos pacientes do HUJM. 3. OBJETIVO ESPECÍFICO: Apoio técnico nas investigações imunohematológicas para pacientes do HUJM. 4. PRINCÍPIO: Determinar o Grupo ABO: A tipagem sangüínea direta pesquisa a presença de antígenos ABO nas hemácias teste e a reversa seus anticorpos correspondentes utilizando hemácias conhecidas A1 e B. Caso haja necessidade será feita a pesquisa de subgrupos de A e AB. Determinar o Fator Rh: Na determinação do tipo Rho (D), é obrigatório o uso do soro anti-d e do controle Rh da mesmo fabricante e marca do soro Anti-D em uso, este último pela possibilidade da presença de auto-anticorpos e /ou proteínas séricas anormais. Pesquisar Anticorpos Irregulares: Visa detectar anticorpos irregulares clinicamente significantes no soro/plasma dos recém nascidos ou de suas mães, bem como de pacientes do HUJM, consiste em testar o soro teste com hemácias conhecidas (TRIACEL). Nos casos positivos deverão ser identificados os anticorpos através do uso de painel. 5. TIPAGEM SANGÜÍNEA ABO/ Fator Rh/Subgrupos AMOSTRAS: Hemácias / soro ou plasma do doador O técnico do serviço de Hemoterapia - SETOR DE COLETA deverá colher às amostras Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 3 de 21

4 Identificação dos tubos de hemólise da amostra do doador será feita na triagem clínica com etiqueta de código de barra, constando iniciais, número do doador e data coleta. Colher em tubo de hemólise 120x100 mm com EDTA - de 04 ml de sangue (ABO, Rh, CRh) Colher em tubo de hemólise seco 150x100 mm - 10 ml de sangue sem anticoagulante para realização de PAI. As amostras hemolisadas ou lipêmicas devem ser desprezadas. MATERIAIS: Equipamentos / Outros: Centrífuga sorológica de mesa Estante porta tubos Banho Maria 37ºC Micropipetas: 50 µl, 100 µl e 1000 ul. Tubos de hemólise 120x100 mm e 150x100 mm. Negatoscópio ou aglutinoscópio REAGENTES: Soro mono ou policlonais anti-a, anti-b, anti-a,b. Caso seja utilizado anti-soros MONOCLONAIS, a utilização do soro anti-a,b não é necessária. Soro anti-d albuminoso (Rh), mono ou policlonais Soro anti-d salino Soro anti gama globulina = Coombs = Monoespecífico. Soro poliespecífico = Anti Humano. Controle de Rh, da mesma procedência do soro anti-d. Hemácias conhecidas de grupo A 1 e B em suspensão salina 3 5%. Hemácias comerciais para triagem de anticorpos. Controle de Coombs Lecitinas anti-a 1 e anti-h. PROCEDIMENTOS: Antes de iniciar o trabalho de o dia fazer o controle interno de todos os reagentes que serão utilizados na rotina para testes em tubo modelo anexo. Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 4 de 21

5 MÉTODO EM TUBO PREPARAR SUSPENSÃO HEMÁCIAS: Identificar um tubo de hemólise 120x100 mm com número do Doador Hemácias suspensa em SALINA 3 a 5% Identificar 01 tubo de hemólise 120x100 número do doador Colocar µl Salina soro fisiológico Colocar - 75 µl Hemácias do Doador no tubo identificado SEPARAÇÃO DO SORO Centrifugar o tubo sem anticoagulante 3 min / 3400 rpm. Separar o soro do doador em um tubo de hemólise já identificado. CLASSIFICAÇÃO SANGUÍNEA ABO/Rh O sistema ABO primeiro sistema de grupo sangüíneo descoberto, é o único onde anticorpos estarão certamente presentes no soro de indivíduos que não possuam o(s) antígeno(s) correspondente(s). É o sistema mais importante para a prática transfusional. A classificação direta pesquisa a presença dos antígenos ABO nas hemácias testes, usando anti-soros, enquanto a reversa pesquisa seus anticorpos correspondentes no soro, utilizando hemácias comerciais. Identificar os tubos 120 x 100 mm com caneta de retro projetor A B AB Rh CR h HA HB DIRETA REVERSA 1. Colocar Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 5 de 21

6 50 ul Soro Anti A no tubo A 50 ul Soro Anti B no tubo B 50 ul Soro Anti A,B no tubo AB 50 ul Soro Anti Rh (D) no tubo Rh 50 ul Controle Rh no tubo CRh - Controle de Rh 100 ul Soro teste (doador) nos tubos de HA e HB 2. Colocar 50 ul hemácias A1 no tubo HA 50 ul hemácias B no tubo HB 50 ul Suspensão Hemácias do doador nos tubos de A a CRh 3. Homogeneizar bem os tubos 4. Colocar para centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos ou 1000 rpm por 1 minuto 5. Ressuspender o botão de hemácias formado agitando levemente 6. Ler para aglutinação e hemólise, usando auxiliar ótico. 7. Anotar os resultados em cruzes ou escore de acordo com a graduação apropriada INTERPRETAÇÃO: Reagentes / Grupo ABO Soro Anti-A DIRETA Soro Anti-B Soro Anti-AB Hemácias A 1 REVERSA Hemácias B A B AB O A presença de aglutinação nos tubos de hemácias teste e presença de hemólise nos tubos de soro teste indicam reações positivas. Hemácias suspensas, após leitura do botão de hemácias, correspondem a resultado negativo. Discrepâncias entre a classificação direta e reversa devem ser resolvidas antes da interpretação do grupo sanguíneo da amostra teste. Não deverão ser liberados antes da realização de testes adicionais necessários, incluindo-se testes com lecitinas anti- A 1 e anti-h. Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 6 de 21

7 Qualquer discrepância entre a tipagem DIRETA e REVERSA deverá ser resolvida pelo responsável técnico do serviço que será informado imediatamente. Rh Positivo e Rh Negativo O termo Rh positivo e Rh negativo, refere-se a presença (Rh positivo) ou ausência (Rh negativo) na membrana da hemácia do antígeno D, que é, após os antígenos A e B, o mais importante em transfusão de sangue. O anticorpo anti-d não esta normalmente presente no soro/plasma dos pacientes Rh negativos. Seu desenvolvimento depende de uma exposição prévia ao antígeno, 80 % das pessoas Rh negativo que recebem pelo menos uma transfusão Rh positivo, poderá desenvolver o anticorpo anti-d. O antígeno é muito imunogênico determinando que grandes partes das pessoas expostas ao antígeno desenvolvam o anticorpo. Os mecanismos comuns de imunização é gestação e/ou transfusão anterior. Outros antígenos do sistema Rh tem também importância clínica, entre eles C (grande) e c (pequeno), E (grande) e e (pequeno). A combinação dos 05 principais antígenos do sistema Rh, avaliando-se a partir da nomenclatura de Fisher e Race oferece ferramentas para a resolução de problemas diários. INTERPRETAÇÃO para tipagem Rh e Pesquisa de D-fraco: Quando a tipagem para D ou D-fraco resultar positivo o sangue será rotulado como Rh POSITIVO. Quando a tipagem para ambos resultar negativo o sangue será rotulado como Rh NEGATIVO. Para que a tipagem do fator Rh possa ser considerado como válido o resultado do controle de Rh é sempre NEGATIVO. Caso o controle de Rh (tubo CRh) seja POSITIVO não considerar o seu Rh e proceder da seguinte maneira: Considerar INVÁLIDA a tipagem Rh. Chamar o responsável para resolver o caso. Nestes casos deverá ser utilizado o soro anti-d salino Todos os resultados Rh Negativo fazer a pesquisa de D-fraco Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 7 de 21

8 PESQUISA de D-fraco: Pegar os 02 tubos de hemólise identificados Rh e CRh que deram negativos Incubar os 02 tubos - Rh e CRh em Banho Maria a 37ºC durante 15 minutos Retirar os tubos do BM e centrifuga-los a 3400 rpm por 15 segundos Fazer a leitura para presença ou ausência de aglutinação Quando negativo realizar a lavagem 3 x com soro fisiológico Desprezar o sobrenadante e secar bem os tubos Adicionar soro de Coombs (Anti IgG) 100 ul, homogeneizar bem os tubos Centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos Fazer a leitura Se houver ausência de aglutinação nos 02 tubos: Pingar Controle de Coombs 50 ul cada tubo Homogeneizar, centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos e fazer a leitura. Para que o teste seja validado os tubos devem dar positivos, caso contrário reiniciar todos os procedimentos. D fraco A característica de reagir de modo atípico com anti-d apresentada por algumas células foi descrita por Stratton, em 1946, como sendo tais células portadoras do fenótipo D-fracas. De acordo com a descrição original, esse fenótipo não reagia ao método de aglutinação direta, mas podiam ser expressos com o uso da técnica de AGH indireto (Coombs Indireto). Atualmente sabemos que a diferença entre D Positivo e D-fraco é quantitativa, não qualitativa. A maioria dos soros monoclonais utilizados regularmente nas rotinas é capaz de detectar a maioria das amostras que foram até então classificadas como D-fraco. D Parcial As hemácias que ao ser testado com antisoros monoclonais apresentarem resultados negativos para o antígeno D, ou seja, Rh negativo deverão ser testadas novamente utilizando-se reagentes de origem humana, policlonais para determinação da possibilidade de tratar-se de um D categoria. Sabe-se que a presença de epitopos de um antígeno D parcial é capaz de determinar a formação de um anticorpo correspondente. Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 8 de 21

9 Os D parciais, fenótipos raros de antígeno D positivos, foram divididos em categorias numeradas de I a VII. As categorias III, IV e V, em face de algumas outras evidencias sorológicas foram subdivididas. RECOMENDAÇÕES: 1. Utilizar um antissoro monoclonal que detecta o antígeno D parcial categoria VI (DVI- ou IgG) e um antissoro que não detecta o antígeno D parcial categoria VI (DVI- ou Ig M), quando houver discrepância nos resultados entre os dois antissoros utilizados deve-se investigar a presença de D fraco e D parcial na amostra. 2. Em pacientes RhD-negativo recomenda-se a pesquisa de antígeno C e E 6. PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES PRINCÍPIO: Anticorpos ditos irregulares são aqueles formados por imunização devido a transfusões, gestação ou ingestão constante de material imunogênico, sendo de classe IgG ou IgM. É um teste de triagem onde em casos de pesquisa positiva, deve-se identificar a classe e especificidade do anticorpo. O teste emprega um KIT contendo no mínimo duas suspensões de hemácias O (hemácias de triagem), as quais possuem a maioria dos antígenos estudados em rotina de banco de sangue. Havendo presença de anticorpos irregulares no soro a ser testado, estes reagiram com os antígenos correspondentes, presentes nas hemácias de triagem. Anticorpos da classe IgM são normalmente detectados em meio salino e temperatura ambiente, enquanto que anticorpos da classe IgG são detectados através da utilização do soro antiglobulina humana após a incubação a 37ºC. Quanto às enzimas proteolíticas, sabe-se que modificam os antígenos presentes na membrana eritrocitária, podendo retirá-los ou torná-los aglutináveis em suspensões salinas. Os antígenos sensíveis à ação enzimática são os dos sistemas MNS Duffy Xg a. Os anticorpos cuja reatividade é aumentada pela ação de enzimas são os dos sistemas Rh, Kidd, Lewis e P. A ação enzimática inclui ainda modificações nas propriedades físicas da suspensão de hemácias, podendo causar auto-aglutinação sem presença de processos auto-imunes. As técnicas enzimáticas podem ser associadas ao soro anti-gama globulina humana (soro anti IgG) e podem ser utilizadas em técnicas de 1 ou 2 estágios. Na primeira adiciona-se a enzima diretamente à mistura soro + hemácias, sendo mais bem indicada Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 9 de 21

10 para testes de triagem enquanto que no segundo procedimento as hemácias são previamente tratadas com enzimas e depois misturadas ao soro teste, sendo mais bem indicado para identificação de anticorpos. As principais enzimas utilizadas em testes imunohematológicos são: BROMELINA (abacaxi), PAPAINA (mamão), TRIPSINA (estômago de porco) e FICINA (ficus). As alíquotas de solução enzimáticas devem ser mantidas em freezer, devendo-se desprezá-las após o descongelamento e utilização. PESQUISA de ANTICORPOS: SALINA / ALBUMINA / A.G.H. Identificar 2 Tubos I II Soro desconhecido Pingar 100 ul cada tubo Hemácias Triacel I Pingar 50 ul no tubo I Hemácias Triacel II Pingar 50 ul no tubo II Centrifugar 3400 rpm por 15 segundos ou 1000 rpm por 1 minuto Ressuspender o botão de hemácias formado agitando levemente Ler para aglutinação e hemólise, usando um auxiliar ótico. Interpretar Anotar os resultados em cruzes ou escore de acordo com a graduação apropriad CASO os tubos I e II seja: I II A. Negativo Albumina Bovina 22% acrescentar 100 ul cada tubo Incubar em Banho-maria à 37ºC por período variando entre 15 minutos e 1 hora de acordo com a orientação do fabricante. Centrifugar 3400 rmp por 15 segundos, ler e anotar os resultados. Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 10 de 21

11 Lavar 03 vezes com soro fisiológico, desprezar o sobrenadante e secar os tubos. Soro Anti Humano (Poli específico) acrescentar 100 ul em cada tubo Homogeneizar e centrifugar 3400 rpm por 15 segundos, ler e anotar os resultados. POSITIVO = presença de anticorpos irregulares encaminharem amostra ao MT HEMOCENTRO para identificação de anticorpos e comunicar ao responsável pelo Serviço. NEGATIVO = Ausência de anticorpos irregulares neste caso: Acrescentar Controle Coombs 1 gota em cada tubo, Homogeneizar e centrifugar os tubos a 3400 rpm por 15 segundos e ler, o resultado deverá ser POSITIVO com intensidade de 3 / 4+. Esta última etapa permite avaliar: Se as hemácias testes foram corretamente lavadas, caso contrário haverá neutralização dos anticorpos do reagente AGH pelas globulinas residuais presentes no soro do paciente, que não foram totalmente retiradas com a lavagem das hemácias, apresentando resultado falso-negativo, devendo-se assim repetir a pesquisa. Se o soro AGH que está sendo utilizado esta funcionando. Repetir a pesquisa caso não se observe aglutinação, utilizando um frasco novo de soro AGH. B. Positivo: Fazer a identificação de anticorpos 7. IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IRREGULARES: OBJETIVO: Identificar e caracterizar o anticorpo, para fins de pesquisa de reações transfusionais e doença Hemolítica Peri-Natal. Seleção de sangue compatível antígeno negativo. PRINCÍPIO: Anticorpos ditos irregulares são aqueles formados por imunização devido a transfusões, gestações ou ingestão constante de material imunogênico, sendo de classe IgM ou IgG, Em testes pré-transfusionais, além da determinação ABO e Rh e prova de compatibilidade, é obrigatória também a realização da pesquisa de anticorpos irregulares em receptores de hemocomponentes (RDC N o 153 de 14/06/04). Quando observada positividade no teste de triagem, deve-se identificar a classe e especificidade do anticorpo responsável e selecionar sangue compatível, antígeno Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 11 de 21

12 negativo para a transfusão. A identificação de anticorpos emprega um kit contendo no mínimo 10 suspensões de hemácias de adulto O e 01 suspensão de hemácia de cordão O. A determinação da especificidade se dá por comparação do resultado obtido com o soro teste e um diagrama listando os fenótipos das 11 hemácias, as quais possuem a maioria dos antígenos estudados em rotinas de banco de sangue. Anticorpos de classe IgM são normalmente detectados em meio salino e temperatura ambiente, enquanto que anticorpos IgG são detectados através da utilização do soro anti-humano (POLIESPECIFICO) após incubação a 37ºC. AMOSTRAS: 10 ml de sangue sem anticoagulante. Encaminhada ao MT- HEMOCENTRO, não fazemos identificação de anticorpos. REAGENTES: Estojo contendo no mínimo 10 hemácias de adultos em pool de hemácias de cordão de grupo O, contendo a maior combinação de 3/5%, obtidas comercialmente ou preparadas diariamente no laboratório a partir de uma população de doadores locais (não aconselhável). Solução fisiológica. Soro anti-humano (poli específico). Reagente comercial de hemácias controle, recobertas por anticorpos IgG Albumina bovina a 22% (opcional). MATERIAIS: Centrífuga sorológica de mesa. Estante de metal, porta tubos. Pipeta automática 50 µl e 100 µl e 1000 µl. Tubos de ensaio 10 x 75 mm. Negatoscópio para leitura. PROCEDIMENTO: 1. Identificação de Anticorpos Irregulares (método tubo) 2. Identificar 11 tubos de 10x75 mm, dispensar 50 ul das hemácias de painel correspondente. Incluir também 01 tubo de autocontrole, dispensando 1 gota das hemácias testes, em suspensão de 3-5%. Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 12 de 21

13 3. Adicionar 100 ul do soro a ser testados aos tubos. 4. Incubar por 20 minutos em temperatura ambiente. 5. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. 6. Realizar leitura e anotar os resultados. 7. Não observando positividade, incubar os tubos a 37ºC por 60 minutos ou adicionar 2 gotas de albumina bovina a 22%, reduzindo o período de incubação para 20 minutos. Em caso de presença de positividade nesta fase, resfriar os tubos a temperatura de 16ºC também por 60 minutos (não utilizar albumina bovina aqui, evitando-se resultados falsos positivos). 8. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. 9. Realizar leitura e anotar os resultados. 10. Lavar 03 vezes o conteúdo dos tubos com salina, decantando e secando bem as bordas destes na ultima lavada. 11. Adicionar 100 ul de soro anti-humano (poli específico). 12. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M Realizar leitura, anotar e interpretar os resultados. 14. Adicionar 50 ul de hemácias controle comercial (controcel), aos tubos onde se observou reação negativa. 15. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M Realizar leitura o resultado deverá ser positivo com intensidade de 3+/4+. Esta última etapa permite avaliar: Se as hemácias testes foram corretamente lavadas, caso contrário haverá neutralização dos anticorpos do reagente AGH pelas globulinas residuais presentes no soro do paciente, que não foram totalmente retiradas com a lavagem das hemácias, apresentando resultado falso-negativo, devendo-se assim repetir a pesquisa. Se o soro AGH que está sendo utilizada esta funcionando. Repetir a pesquisa caso não se observe aglutinação, utilizando um frasco novo de soro AGH. INTERPRETAÇÃO: Ausência de aglutinação em todas as etapas do teste indica ausência de anticorpos irregulares contra os antígenos presentes nas hemácias de triagem. Presença de aglutinação em incubação em temperatura ambiente indica presença de anticorpos de classe IgM. Presença de aglutinação em incubação a 37ºC indica presença de anticorpo de classe IgM reativo e/ou anticorpo classe IgG. Anticorpos de classe IgM são considerados de Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 13 de 21

14 importância clinica quando são reativos a partir de temperaturas de 30ºC, devendo-se nesses casos selecionar sangue antígeno negativo para transfusão. Presença de aglutinação em fase de anti-gamaglobulina humana indica presença de anticorpos de classe IgG, os quais possuem importância transfusional, devendo-se sempre selecionar sangue antígeno negativo para transfusão. Casos inconclusivos ou com presença de múltiplos anticorpos deverão ser testados em outras técnicas descritas neste manual (P.E.G., D.T.T. enzimas), comparando-se os resultados da(s) técnica(s) apropriada(s) com o primeiro teste de identificação de anticorpos realizados. 8. SELEÇÃO DE DOADORES DO GRUPO O COM BAIXO TÍTULO DE AGLUTININAS O PERIGOSO OBJETIVO: Seleção de sangue total ou plasma do tipo O em transfusões heterologa. Este procedimento está sendo realizado no MT-HEMOCENTRO. PRINCÍPIO: O sangue total de grupo O pode ser usado em pacientes com outros grupos sangüíneos, em uma quantidade que não exceda um litro e nas emergências. Nestes casos devem ser testados em salina e ter um título de aglutininas anti-a e anti- B menor que 100. AMOSTRAS: 05 ml de sangue sem anticoagulante. MATERIAIS: Centrífuga sorológica de mesa. Estante de metal, porta tubos. Pipeta automática 50 µl e 100 µl e 1000 µl. Tubos de ensaio 10 x 75 mm. Negatoscópio para leitura. REAGENTES: Solução fisiológica. Suspensão de hemácias A 1 e B, a 3-5%. PROCEDIMENTO: 1. Em tubo de ensaio 10x75 mm, limpo preparar uma diluição do soro a ser testado a 1/100 (diluição em solução fisiológica). Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 14 de 21

15 2. Transferir 100 µl da diluição para dois tubos de ensaio 10x75mm, previamente identificados como, A 1 e B. 3. Adicionar aos tubos 50 ul das hemácias A 1 e B, em seus respectivos tubos. 4. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. 5. Realizar leitura e interpretar os resultados. INTERPRETAÇÃO: Aglutinação em um dos dois tubos, A 1 e B indica presença de aglutininas salinas a um título maior que 1/100. Os soros que não aglutinarem é considerado de baixo titulo e este sangue pode ser usado para transfusão heteróloga. Os soros que aglutinarem para uma ou ambas as hemácias, deverão ser consideradas de alto título e não devem ser usados em transfusão Heteróloga. 9. TITULAÇÃO DE ISOHEMAGLUTININAS OBJETIVO: Exame imunohematológico de auxilio no diagnóstico de incompatibilidade ABO materno-fetal. Este procedimento está sendo realizado no MT- HEMOCENTRO. PRINCÍPIO: A titulação de isohemaglutininas anti-a e anti-b é realizada a fim de se obter a quantidade relativa de anticorpos presentes no soro ou plasma a ser testado. O titulo de um anticorpo é dado pela realização de diluições seriadas do soro contra hemácias contendo o antígeno correspondente. O resultado é obtido considerando-se a maior diluição do soro onde é observada a aglutinação. AMOSTRAS: 04 ml de sangue sem anticoagulante. MATERIAIS: Centrífuga sorológica de mesa. Estante de metal, porta tubos. Pipeta automática 50 µl e 100 µl e 1000 µl. Tubos de ensaio 10 x 75 mm. Negatoscópio para leitura. REAGENTES: Solução fisiológica. Hemácias de grupo A 1 e B em suspensão de 2 a 5%, as quais podem ser obtidas comercialmente ou preparadas diariamente no laboratório. Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 15 de 21

16 PROCEDIMENTO: 1. Preparar uma bateria de tubo 10x75 mm identificando-os como: 1/1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, 1/512, 1/1024, 1/2048 e 1/4096, para uma titulação seriada. 2. Com exceção do tubo 1/1, adicionar 100 µl de salina em todos. 3. Adicionar 100 µl do soro a ser testado aos tubos 1/1 e 1/2. 4. A partir do tubo 1/2 transferir 100 µl da mistura para o tubo seguinte sucessivamente. 5. Reservar a ponteira no tubo 1/4096, caso seja necessário continuar as diluições. 6. Com exceção do tubo 1/4096, adicionar 50 ul da suspensão de hemácias contendo o antígeno correspondente a tipagem reserva do soro teste. 7. Incubar em temperatura ambiente por 20 minutos. 8. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. 9. Realizar leitura e anotar os resultados. INTERPRETAÇÃO: Considerar como titulo a maior diluição do soro onde se observa aglutinação fidedigna. Em caso de soro teste O, efetuar uma bateria para Anti-A e outra para Anti-B. Soros de grupo AB, não terão titulo de isohemaglutininas. 10. DIFERENCIAÇÃO ENTRE AGLUTINAÇÃO E FÊNOMENO DE ROLEAUX OBJETIVO: Descartar uma reação de falsa aglutinação PRINCÍPIO: O fenômeno de Roleaux, confundido com o de aglutinação, pode ser identificado microscopicamente e caracterizam-se por aderência das hemácias umas as outras se assemelhando uma pilha de moedas. É importante também conhecer o diagnóstico do paciente e o meio diluente dos reagentes usados (protéico ou salino). Pois, sabe-se que as globulinas normalmente estão aumentadas quando a proporção 2:1 de albumina: globulina está invertida. MATERIAIS: Centrífuga sorológica de mesa. Estante de metal, porta tubos. Pipeta automática 50 µl e 100 µl e 1000 µl. Tubos de ensaio 10 x 75 mm e Negatoscópio para leitura. REAGENTES: Solução fisiológica. Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 16 de 21

17 PROCEDIMENTO (método tubo) 1. Realizada a leitura do teste e detectado o fenômeno de Roleaux 2. Recentrifugar o conteúdo do tubo por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. 3. Remover o soro do tubo teste e adicionar a mesma quantidade de salina (100 µl) homogeneizar. 4. Centrifugar novamente por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. 5. Ressuspender o botão formado, realizando leitura. INTERPRETAÇÃO: Adicionando-se a salina o fenômeno de roleaux desaparece e havendo realmente aglutinação, esta permanecerá visível. Em caso de dúvida, observar em microscópio. 11. TESTE DA ANTIGLOBULINA DIRETA (T.A.D.) OBJETIVO: Pesquisar sensibilização in vivo através de transfusão e gestação PRINCÍPIO: É utilizado para demonstrar-se a presença de hemácias recobertas por anticorpos in vivo, principalmente IgG e C3d. AMOSTRAS: 05 ml de sangue com anticoagulante. MATERIAIS: Centrífuga sorológica de mesa. Estante de metal, porta tubos. Pipeta automática 50 µl e 100 µl e 1000 µl. Tubos de ensaio 10 x 75 mm. Negatoscópio para leitura. REAGENTES: Soro anti-gama globulina humana poli específico (soro anti-humano). Soro anti-gama globulina humana mono específico (soro anti-igg). O uso deste reagente é importante na diferenciação do tipo de globulinas presentes na superfície das hemácias a serem testadas Hemácias a serem testadas lavadas por no mínimo 03 vezes com solução fisiológica e preparadas em suspensão de 3-5%. Reagente comercial de hemácias controle, recobertas por anticorpos IgG. Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 17 de 21

18 PROCEDIMENTO (método tubo) 1. Identificar 2 tubos de 10x75 mm um TESTE e um P POSITIVO ), 2. Pingar 1 gota das suspensão de hemácias (já lavada anteriormente) de 3-5% a ser testada T e o controle (controcel) no tubo P 3. Pingar 2 gotas do soro de Coombs ou AGH em cada tubo 4. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M ou 1 minuto a 1000 R.P.M, a fim de observar-se reação por anticorpos classe IgG e C3d (AGH). 5. Realizar leitura e anotar os resultados. 6. Observando-se ausência de aglutinação. 7. Adicionar 1 gota de hemácias controle comerciais (controcel) no tubo T caso se observou reação negativa. 8. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M ou 1 minuto a 1000 R.P.M. 9. Realizar leitura, o resultado deverá ser positivo com intensidade de 3+/4+. Esta última etapa permite avaliar: Se as hemácias testes foram corretamente lavadas, caso contrário haverá neutralização dos anticorpos do reagente AGH pelas globulinas residuais presentes no soro do paciente, que não foram totalmente retiradas com a lavagem das hemácias, apresentando resultado falso-negativo, devendo-se assim repetir a pesquisa. Se o soro AGH que está sendo utilizada esta funcionando. Repetir a pesquisa caso não se observe aglutinação, utilizando um frasco novo de AGH. Interpretação Hemácias testes sem aglutinação e o controle com aglutinação indicam resultado negativo. Caso não seja observada aglutinação no tubo de hemácias controle devem-se desconsiderar os resultados do T.A.D. e realizar-se um novo procedimento. Em amostras com T.A.D. positivo, deverão ser realizados testes adicionais, incluindo-se eluição e pesquisa de frações de complementos e IgA. Não deverão ser liberados resultados antes da conclusão de toda a pesquisa. Reação Positiva: Presença de anticorpos. Presença de alo-anticorpos em casos de Doença Hemolítica do Recém-Nascido (D.H.R.N.) ou Reações Hemolíticas Pós- Transfusionais. 12. RESPONSABILIDADES: Dos colaboradores que executam as atividades neste setor. Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 18 de 21

19 Bioquímico Técnico de laboratório. Auxiliar de analises clinica. 13. COMENTÁRIOS: Este manual foi elaborado e implantado para ser seguido por todos os profissionais envolvidos, padronizando todas as atividades desenvolvidas neste setor. 14. NORMAS DE SEGURANÇA Os profissionais da área de saúde que manipulam materiais biológicos devem obedecer aos procedimentos básicos de biossegurança também deverão estar fazendo a segurança do meio ambiente. GERAIS: 1. Descartar as lancetas, algodão e capilar dentro do descarpack. 2. Nunca recapar as lancetas. 3. Não abrir a centrífuga de microhematócrito antes da sua parada completa. 4. Não jogar material biológico na pia. 5. Fazer desinfecção concorrente no término de cada período e desinfecção terminal mensalmente. 6. Lixo comum acondicionar em sacos escuros 7. Lixo infectante acondicionar em sacos brancos leitoso 8. Em caso de derramamento de material biológico, despeje hipoclorito de sódio 1% e deixe agir por 20 minutos, limpar com papel toalha e descartá-lo em recipiente apropriado. 9. Todo material cortante, perfurante ou perfuro-cortante tais como ampolas, lâminas cortantes, agulhas e seringas, devem ser lacrados e enviados ao expurgo. Não despreze estes materiais em outros cestos de lixo. 10. Caso ocorra algum ferimento durante seu trabalho, procure imediatamente o serviço médico dos funcionários para comunicar a ocorrência e receber orientação. 11. Todo material cortante, perfurante ou perfuro-cortante tais como ampolas, lâminas cortantes, agulhas e seringas, devem ser lacrados e enviados ao expurgo. Não despreze estes materiais em outros cestos de lixo. 12. As bolsas de hemocomponentes não devem ser colocadas diretamente nas latas ou depósitos de lixo; Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 19 de 21

20 13. Toda bolsa de sangue e hemocomponentes a ser descartada deve ser submetida a algum método que elimine a infectividade de patógenos eventualmente presentes; 14. Depois de inativados as bolsas devem ser acondicionadas em sacos plásticos destinados a resíduos biológicos; 15. É permitido o transporte de bolsas para serem incineradas em outros locais desde que, sejam transportados em recipientes rígidos, lacrados, identificados e em veículos apropriados; 16. Os demais materiais que deverão ser desprezados tais como frascos de soros, seringas e equipos que não contenham sangue devem ser colocados em outro cesto de lixo. INDIVIDUAIS: 1. Lavar as mãos antes e após qualquer procedimento. 2. O papel utilizado para enxugar as mãos após a lavagem pode ser usado para fechar a torneira, evitando uma eventual "recontaminação". 3. Troque as luvas imediatamente caso elas se contaminem com material biológico ou apresentem sinais de perfuração ou rompimento; 4. Ao remover as luvas inverta-as completamente, evitando, que sua porção exterior entre em contato com qualquer superfície; 5. Quando estiver utilizando luvas evitar tocar superfícies limpas, tais como telefones, mesas ou maçanetas de portas; 6. Ao manipular o paciente utilize uma nova luva desprezando a anterior em local adequado. 7. Utilizar os equipamentos de proteção individual. 8. Trajar vestimentas totalmente brancas ou aventais longos brancos de mangas compridas, caso estejam trajando roupas que não sejam brancas; 9. Troque o avental sempre que estiver sujo e/ou contaminado. 10. Evitar sentar nas macas ou nas camas dos pacientes, sentar no chão, sentar nas mesas ou nos balcões existentes no ambulatório; 11. É proibido comer, beber, fumar, cortar as unhas, passar cosmético ou colocar lentes de contato no setor; 12. Cabelos longos devem ser presos; 15. TREINAMENTO - Objetivo é o aprimoramento contínuo Será dado treinamento a todos os colaboradores da AGÊNCIA TRANSFUSIONAL, antes da implantação deste manual de procedimentos, são responsabilidades dos colaboradores participarem dos treinamentos e implantá-los na Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 20 de 21

21 prática. A reciclagem será feita anualmente ou quando novos colaboradores sejam admitidos. 16. FORMULÁRIOS/DOCUMENTOS RELACIONADOS Mapa para controle diário dos reagentes utilizados. 17. CONTROLE DE REGISTRO: Deve-se ter registrado todos os exames realizados no setor e arquivados por 20 anos. 18. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Issitt, Peter D. & Issitt, Charla H. Applied Blood Group Serology. Second Edition Second Repriting, jully Editora Spectra Biologicals (Division of Becton, Dickinson and Company B-D). 2. Biotest S/A Industria E Comércio. Triacel Reagente de Glóbulos Vermelhos Humanos (bula). Médico Resp. Drº Jacob Rosenblit CRM Manual De Procedimentos Operacionais Padrão. Fundação Pró-Sangue, São Paulo SP. 4. Padronização Laboratório de Compatibilidade UNICAMP 5. Unidade de Pesquisa lmunohematológica HEMOAM 6. Biotest s/a industria e comércio. triacel reagente de glóbulos vermelhos humanos (bula). médico resp. Drº Jacob Rosenblit CRM Manual de procedimentos operacionais padrão. Fundação Pró-Sangue, São Paulo SP. 8. Marcelli. a. et alli. Techniques en Imuno-hèmatologie. mèdecine-sciences. flamarion Lima, Callado Santos. Curso de imunohematologia. Faculdade de Medicina de Botucatu. UNESP Technical Manual, American Association of Blood Banks 12 th edition, Conselho Federal de Enfermagem - Resolução COFEN Nº 200 de 15 de Abril de ABO Revista de MEDICINA Transfusional, Número 12 Dezembro de Ministério de Estado da Saúde Portaria N o 1353 de 13 de Junho de Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 21 de 21