Opresente estudo visa definir as melhores condições para esta

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1 Revista da Fapese, v.4, n. 2, p , jul./dez Estabelecimento de Colônia de Aedes aegypti por Meio de Amostra Proveniente do Bairro Porto Dantas - Aracaju - Sergipe Daniela Passos Vieira Bispo * Roseli La Corte dos Santos ** Resumo Opresente estudo visa definir as melhores condições para esta belecimento de colônia de A. aegypti, no insetário do Labora tório de Parasitologia/UFS. O material para realização dos ensaios foi obtido em residências situadas no bairro Porto Dantas, Aracaju/SE. As variáveis analisadas foram: mortalidade larvária, mortalidade total, sincronia, taxa de emergência do adulto, média de ovos por fêmea e envergadura da asa de machos e fêmeas. Foram avaliadas: três densidades larvárias, três esquemas de alimentação descritos na literatura e três tipos de alimentos. Obtidos os parâmetros foi elaborado procedimento operacional padrão (POP) provisório para criação da cepa Rockefeller, referência de suscetibilidade, até a terceira geração e após a avaliação da estabilidade da colônia nas condições selecionadas foi elaborado POP final. Os fatores ambientais como temperatura e umidade parecem ter afetado a maioria dos ensaios. As densidades testadas não apresentassem diferença significativa, porém, por apresentar menor mortalidade e ser mais prática a densidade de 300 larvas foi utilizada. Houve contraste de médias entre o esquema três e os demais, aquele não foi satisfatório e foi escolhido o esquema dois, que alimentava as larvas por cinco dias. Como tipo de ração utilizouse a de gato por apresentar diferença para envergadura da asa do macho, baixas mortalidades e uma alta sincronia e taxa de emergência. Utilizando essas condições na montagem da colônia Rockefeller esta aparentemente se apresentou estável ao longo das gerações podendo ser finalizado o POP que será utilizado pelo insetário na criação de A. aegypti de forma padronizada no campus da UFS. PALAVRAS-CHAVE: Colônia, Aedes aegypti, Porto Dantas. * Graduanda em Farmácia. Bolsista do PIBIC/UFS/CNPq. danifarmaufs@hotmail.com ** Professora Doutora do Departamento de Morfologia da Universidade Federal de Sergipe. rlacorte@ufs.br

2 98 Daniela Passos Vieira Bispo; Roseli La Corte dos Santos 1. Introdução A família Culicidae (latim culex = mosquitos) apresenta grande interesse em parasitologia médica, por ser nela que encontramos os mais importantes insetos hematófagos entre todos os Arthropoda. As numerosas espécies de culicídeos apresentam grande adaptabilidade biológica, variabilidade genética e ampla valência ecológica (Eiras, 2005). São conhecidos pela população como mosquitos, pernilongos, muriçocas, mossorongos, entre outros. Eles são holometábolos, isto é, passam pelas fases de ovo, larva (quatro estádios = L1, L2, L3 e L4), pupa e adulto (figura 1). A preocupação particular em se estudar o Aedes aegypti, deve-se ao fato deste ser vetor da dengue e da forma urbana da febre amarela (Eiras, 2005). No início de 2008 a população brasileira se assustou com a ocorrência do aumento no número de casos fatais de febre amarela, no entanto até o início do mês de junho, a situação epidemiológica é de setenta e cinco notificações de casos suspeitos de febre amarela silvestre, forma que não é transmitida pelo A. aegypti. Destes, quarenta e cinco casos foram confirmados, dos quais vinte e cinco evoluíram para óbito (Brasil, 2008c). A dengue é doença febril aguda, seu agente etiológico também é vírus da família Flaviviridae e são conhecidos atualmente quatro sorotipos, antigenicamente distintos: DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4. Clinicamente, as manifestações podem variar desde síndrome viral, inespecífica e benigna, até quadro grave e fatal de doença hemorrágica com choque (Tauil, 2001). No Brasil, o primeiro registro de casos de dengue ocorreu na década de Durante os 61 anos seguintes, não foram relatados casos no país e o A. aegypti foi erradicado do Brasil (Claro et al., 2004). A reinfestação do país pelo vetor ocasionou em 1981 um surto com circulação dos sorotipos 1 e 4, que foi rapidamente contido em Roraima (Braga e Valle, 2007a). A partir de 1986, com a reentrada do sorotipo 1 a dengue adquiriu importância epidemiológica, quando ocasionou epidemia no Estado do Rio de Janeiro e que logo alcançou a Região Nordeste (Braga e Valle, 2007a). Figura 1- estágios evolutivos do Aedes aegypti. Fonte: Dengue, A febre amarela tem como agente etiológico um Flavivírus. Clinicamente, pode se apresentar assintomática, oligossintomática, moderada, grave e maligna. Existe na forma urbana, erradicada do Brasil desde 1942, e na forma silvestre sendo que a diferença entre as formas se dá devido ao tipo de transmissor e de hospedeiro vertebrado. Há vários anos existe vacina para essa doença (Vasconcelos, 2003). Em 1990 e 1991, houve nova epidemia com a inclusão do sorotipo 2 e ao final do ano 2000, foi isolado, no Rio de Janeiro, o sorotipo 3 do vírus da dengue, considerado o mais agressivo entre os três primeiros (Claro et al., 2004). Em decorrência da entrada deste último, no ano de 2001 o Rio de Janeiro foi atingido por mais uma grande epidemia, que atingiu níveis de incidência assustadores no verão de 2002 (Brasil, 2007a). Em 2007 foram registrados casos de dengue clássica no Brasil, sendo em Sergipe e, de febre hemorrágica da dengue com 158 óbitos, sen-

3 Estabelecimento de colônia de Aedes aegypti por meio de amostra proveniente do Bairro Porto Dantas - Aracaju - Sergipe 99 do quatro casos confirmados em Sergipe sem nenhum óbito. Nesse ano, 79% dos casos suspeitos de dengue foram notificados nos cinco primeiros meses do ano e foram isolados os três sorotipos virais. Em Sergipe apenas o sorotipo três foi isolado, todavia o número de amostras analisadas foi irrisório, apenas 14 amostras, sendo três positivas (Brasil, 2008a). A dengue é endêmica em Sergipe desde 1996 quando foram registrados os primeiros casos da doença no estado, sendo que nos três anos seguintes houve epidemia (Brasil, 2008b). Porém foi constatado no ano de 2007 que o índice de infestação na cidade de Aracaju estava em estado de alerta, sendo que 40% do município se encontrava em risco de surto (Brasil, 2007b). Apesar do alerta de epidemia iminente, infelizmente no ano de 2008 o estado de Sergipe figurou entre os estados brasileiros com maiores taxas de incidência de dengue sendo notificados entre janeiro e início de julho deste ano casos, desses foram confirmados. Foram 348 casos de dengue hemorrágica, 681 casos de dengue com complicação e 33 óbitos (Sergipe, 2008). Atualmente não se dispõe de tratamento nem vacina para uso preventivo contra a dengue, assim enquanto não se puder contar com esta medida de controle, o único elo vulnerável da cadeia epidemiológica é o vetor A. aegypti (Tauil, 2001). Há dois tipos de inseticidas em uso: os larvicidas e os adulticidas. Dentre os larvicidas temos o organofosforado temefós, utilizado atualmente no combate, e o larvicida biológico Bacillus turinghiensis israelensis (FUNASA, 2001) ambos aprovados pela Organização Mundial de Saúde (OMS) para uso em água potável (Braga e Valle, 2007b). Os adulticidas atualmente empregados pertencem ao grupo dos piretróides, como a cipermetrina e a deltametrina, sendo o último o atualmente utilizado. Eles pertencem a quarta geração de piretróides que são efetivos em baixas doses e são fotoestáveis (Braga e Valle, 2007b) O uso dos inseticidas químicos vem se tornando cada vez mais difícil, já que mesmo havendo a morte dos mosquitos suscetíveis às dosagens aplicadas, os que sobrevivem sendo mais resistentes, transferem essa capacidade a seus descendentes e populações cada vez mais tolerantes são selecionadas. Acresce ainda o uso indiscriminado dos inseticidas, o que torna o estabelecimento da resistência mais rápido (Donalísio e Glasser, 2002). Tendo em vista esses aspectos faz-se necessário o monitoramento da suscetibilidade das populações de mosquitos aos inseticidas utilizados rotineiramente e o desenvolvimento de novos produtos, preferencialmente produtos menos tóxicos às pessoas e que agridam menos o meio ambiente. O combate ao vetor é feito de duas maneiras, a primeira é preventiva através dos agentes de saúde em visitas bimensais aos imóveis. Eles têm a função de descobrir focos, destruir e evitar a formação de criadouros, impedir a reprodução de focos e orientar a comunidade com ações educativas (FUNASA, 2001). A segunda é o controle do A. aegypti realizado utilizando inseticidas que só é, ou ao menos deveria ser, aplicado após manejo ambiental, educação em saúde e eliminação física de criadouros, quando essas medidas não surtem efeito (FUNASA, 2001). A primeira etapa no teste de suscetibilidade do mosquito ou de um novo produto larvicida ou adulticida consiste em testar a nova droga frente à determinada população de A. aegypti. Para esse estudo se faz necessário estabelecer colônia em laboratório para obter uniformidade no tamanho e vitalidade dos insetos, pois isto interfere na resposta da espécie, sendo também importante para o estudo da biologia, ecologia e comportamento, bem como para poder elaborar e testar métodos viáveis para o controle, seja físicos, químicos ou biológicos (Gama, 2005). O estabelecimento de uma colônia com as condições ideais de criação é condição fundamental para que durante o teste biológico proposto haja o menor

4 100 Daniela Passos Vieira Bispo; Roseli La Corte dos Santos número de variáveis possíveis que possam interferir ou confundir os resultados. Afinal não saberemos se os mosquitos foram a óbito por alguma deficiência no desenvolvimento durante a criação ou pela ação dos inseticidas. Para estabelecer uma colônia é necessário conhecer as condições ambientais necessárias para o desenvolvimento homogêneo da espécie que será usada com fim investigativo de comportamento, resistência ou testando novas drogas (Pérez et al., 2004). Estabelecidas as condições pode-se dar início à formação da colônia utilizando a cepa Rockefeller, esta cepa é mantida e utilizada nos diversos laboratórios de entomologia pois é referência de suscetibilidade, podendo ser empregada em ensaios biológicos para comparação de resistência com determinada população local (FIOCRUZ, 2007). verificaram a resistência da população de larvas de A. aegypti de Sergipe ao temefós e, no entanto esse inseticida continua sendo utilizado, podendo levar ao insucesso das atividades desenvolvidas pela secretaria municipal de saúde (SMS) para o controle do mosquito. Não é incomum ao consultar a literatura científica especializada sobre A. aegypti encontrar menção ao uso de espécies obtidas de colônia que é mantida no laboratório da referida instituição que está desenvolvendo a pesquisa. Ao estudar a suscetibilidade de A. aegypti, Macoris et al. (1999) relatam que testaram exemplares da geração F1 de laboratório, referentes a colônias obtidas a partir de coleta de larvas ou ovos. Num estudo com as mesmas características do anterior, Campos e Andrade (2003) citam o uso de larvas da referida espécie, provenientes da colônia com quatro anos e meio. No campus da UFS vem sendo desenvolvidos, pelo Departamento de Fisiologia, em colaboração dos Departamentos de Química, Agronomia e Morfologia, estudos com produtos naturais para verificação de atividade inseticida. Recentemente foi verificado potencial efeito larvicida do óleo essencial de Lippia gracilis contra A. aegypti (Silva et al., 2008). Porém não há colônia em condições ideais no campus da UFS para evolução e execução de experimentos de verificação da atividade larvicida e adulticida de compostos, devido à inexistência da mesma este trabalho se mostrou necessário. Esta ausência dificulta a continuidade das pesquisas por esses departamentos, já que esta linha de pesquisa é de vital importância no desenvolvimento de novas estratégias de controle da referida espécie. Outro fator importante é a avaliação da suscetibilidade aos inseticidas em uso, visto que esse é um dos principais problemas no combate ao A. aegypti e a resistência já foi verificada em vários estados brasileiros (Braga et al., 2004; Carvalho et al., 2004; Lima et al., 2006). Além disso, desde 2001, Braga et al. (2004) No estudo de Braga et al. (2004) sobre a resistência do mosquito ao temefós (larvicida utilizado pelo programa de combate a dengue do ministério da saúde) em alguns estados brasileiros, eles fazem referência ao uso da cepa Rockefeller continuamente mantida pelo laboratório por muitos anos. E ainda num recente estudo de resistência Lima et al. (2006) descrevem no início da metodologia que as amostras de ovos provenientes da coleta em campo foram levadas ao laboratório e identificadas para o estabelecimento de colônias. Provavelmente nenhum desses importantes estudos teria se tornado realidade se no início não houvesse se estabelecido colônia da espécie de interesse. Para estabelecer uma colônia existem algumas variáveis importantes que devem ser levadas em consideração para se conseguir colônia estável, entre elas: temperatura, umidade relativa do ar, fotoperíodo, densidade populacional, tipo de água, tipo de ração e esquema de alimentação. A temperatura ideal para o desenvolvimento, utilizada nos insetários está na faixa dos 24 a 28ºC com pequenas variações. A maioria dos laboratórios fixa a tempera-

5 Estabelecimento de colônia de Aedes aegypti por meio de amostra proveniente do Bairro Porto Dantas - Aracaju - Sergipe 101 tura em 26ºC ± 2ºC (Pérez et al., 2004; Beserra et al., 2006, 2007; FIOCRUZ, 2007). Temperatura um pouco menor é utilizada por Gama et al. (2005), 25ºC ± 2 C. Com relação à umidade relativa do ar ideal, entre 70 e 80% tem sido utilizada por Pérez et al. (2004) e FIOCRUZ (2007), 70 a 85% por Gama et al. (2005) e 70 ± 5% por Gomes et al. (2006), variando, portanto, no intervalo de 65% a 85%. Fotoperíodo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão é o mais utilizado (Gama et al., 2005; Gomes et al., 2006; Beserra et al., 2006, 2007), porém também é utilizado 10 horas de luz e 14 de escuridão (Pérez et al., 2004). É importante ressaltar ainda a influência da densidade populacional sobre o desenvolvimento do mosquito, Gama et al. (2005) observou relação inversamente proporcional entre densidade larval e tamanho de adultos. Um aspecto que não pode ser deixado de lado diz respeito à água onde as larvas são criadas. Já que das quatro fases de desenvolvimento dos culicídeos três se passam na água. Usualmente é utilizada água desclorada. (Pérez et al., 2004; Gama et al., 2005; Gomes et al., 2006; FIOCRUZ, 2007). Com relação à alimentação há vários tipos de rações em utilização: para peixe (Gama et al., 2005; Beserra et al., 2006,2007), para cachorro (Pérez et al., 2004), para camundongo (Gomes et al., 2006) e para gato (FIOCRUZ, 2007). Esquemas de alimentação são os mais diversos desde 100mg de ração a cada três dias (Gama et al., 2005) o que corresponde a aproximadamente 300 mg no total já que a fase de larva dura em média nove dias (Salas, 1999). Alimentação diária de quantidades variáveis (Pérez et al., 2004; Gomes et al., 2006), por exemplo, 0,3 mg/ larva no primeiro dia, 0,4 mg/larva no segundo e 0,6 mg/larva do terceiro ao sétimo. Se tivermos criando 100 larvas estas receberão um total de 370 mg. E ainda alimentação somente no primeiro dia (Beserra et al., 2006, 2007; FIOCRUZ, 2007), por exemplo, 1000 mg para 1000 larvas, num total de 100 mg de alimentação considerando 100 larvas. Sendo assim, fica evidente as variações nas técnicas de criação, as quais devem ser adaptadas à realidade local, considerando as condições disponíveis para a manutenção da colônia, inclusive recursos humanos e o conforto ambiental das larvas. O objetivo desse trabalho é estabelecer os parâmetros para colonização de Aedes aegypti no laboratório de Parasitologia da UFS, definindo a densidade larvária ideal para o conforto ambiental das larvas, o tipo e o esquema de alimentação. Estabelecer colônia com a cepa Rockefeller, verificando a sua estabilidade ao esquema proposto e elaborar Procedimento operacional padrão (POP) de criação de larvas e adultos. 2. Metodologia 2.1. Coleta de imaturos de A. aegypti e obtenção da geração F1 O material para realização dos ensaios foi obtido por meio de larvas de A. aegypti coletadas em residências situadas no bairro Porto Dantas na cidade de Aracaju/SE. Estas foram criadas em laboratório até obtenção de pupas que foram transferidas diariamente para gaiolas de 30x30x30 cm 3 (figura 2) até obtenção das formas adultas. Após a emergência, os adultos foram alimentados com água açucarada, contida em erlenmeyer com bola de gaze e algodão (figura 3), e sangue. A alimentação sanguínea é feita por meio de rato anestesiado com 0,1 ml de cloridrato de xilazina a 2% e 0,3 ml de cloridrato de S(+) cetamina via intramuscular, o qual é colocado com o ventre sobre a gaiola por aproximadamente 30 minutos. Esse procedimento é autorizado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Animais (CEPA) da UFS segundo o protocolo CEPA 12/07. Assim puderam dar origem aos ovos (geração F1), os quais foram armazenados, classificados pela data da postura, e utilizados nos ensaios de conforto ambiental.

6 102 Daniela Passos Vieira Bispo; Roseli La Corte dos Santos Figura 2 Gaiola utilizada para criação das formas adultas de culicídeos. Figura 3 Alimentador dos mosquitos contendo água açucarada 2.2. Ensaios de conforto ambiental Em todos os experimentos, papel de filtro contendo ovos de A. aegypti da geração F1 foi colocado em recipientes retangulares de polietileno de cor branca, com dimensões de 28 x 20 x 6cm 3, contendo um litro de água desclorada e água de criação 1 para eclosão das larvas (figura 4a). As larvas de 1 o estádio, com menos de 24h de eclosão, foram transferidas para recipientes de polietileno contendo um litro e meio de água desclorada (figura 4b). Os recipientes foram mantidos em insetário, a temperatura da água mantida entre 24 e 28ºC, assim como a temperatura do ambiente, e a umidade relativa do ar entre 70 e 80% (PÉREZ et al., 2004), registros diários foram realizados às 9:00h±:30. Todos os ensaios foram realizados em triplicata e os resultados apresentados como média dos três experimentos AVALIAÇÃO DA DENSIDADE LARVÁRIA Nesse experimento foi testada a quantidade ideal de larvas por bandeja de criação. Em cada recipiente foram colocadas 300, 400 e 500 larvas em 1º estádio, as quais receberam, diariamente, ração para animais de laboratório (Labina; PURINA ) triturada, tamizada (1mm) e colocada em estufa a 100 C por 1 hora. Figura 4 Bandejas de criação: a-apenas com ovos e b-apenas com larvas. 1 Água retirada de recipientes contendo larvas criadas em laboratório que é utilizada como estímulo à eclosão dos ovos. Esta deve ser coada para evitar passagem de larvas do outro recipiente.

7 Estabelecimento de colônia de Aedes aegypti por meio de amostra proveniente do Bairro Porto Dantas - Aracaju - Sergipe 103 No primeiro dia (D1) 0,3 mg/larva, no segundo dia (D2) 0,4 mg/larva e do terceiro ao sétimo dia (D3 a D7) 0,6 mg/larva (Pérez, et al. 2004). Diariamente as larvas que mudavam para o estágio de pupa foram contadas e transferidas para gaiolas de 30 x 30x 30 cm 3 até a emergência das formas adultas. As variáveis observadas nesse experimento foram: c) Esquema três, utilizado pela Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ, 2007). O esquema utilizado na Fiocruz é mg para larvas, utilizando essa proporção (1:1), foi adicionada a quantidade de ração para o número ideal de larvas obtido no esquema anterior. As variáveis observadas nesse experimento foram: a) Mortalidade larvária = número de larvas mortas x 100 número de larvas no recipiente b) Mortalidade total = número de larvas e de pupas mortas x 100 número de larvas no recipiente c) Sincronia = número de dias decorridos entre o surgimento da 1ª e da última pupa. d) Taxa de emergência do adulto = número de exúvias 2 de pupas x 100 número de pupas transferidas a) Mortalidade larvária; b) Mortalidade total; c) Sincronia; d) Taxa de emergência do adulto AVALIAÇÃO DO TIPO DE ALIMENTO Utilizando o número de larvas obtido no primeiro experimento e o esquema de alimentação obtido no segundo, foram avaliados três tipos de ração: para peixes (Primus para engorda), para animais de laboratório (Labina; PURINA ) e para gatos (Gatsy: peixe, frango e carne; PURINA ). As variáveis observadas nesse experimento foram: AVALIAÇÃO DO ESQUEMA DE ALIMENTAÇÃO Utilizando o número de larvas ideal, obtido no experimento anterior, foram testados três esquemas de alimentação usando ainda ração para animais de laboratório (Labina; PURINA ): a) Mortalidade larvária; b) Mortalidade total; c) Sincronia; d) Taxa de emergência do adulto; e) Média de ovos por fêmea = número de ovos número de fêmeas a) Esquema um, recomendado por Pérez, et al. (2004): - Primeiro dia (D1) 0,3 mg/larva - Segundo dia (D2) 0,4 mg/larva - Terceiro ao sétimo dia (D3 a D7) 0,6 mg/larva f) Envergadura da asa: foram selecionados ao acaso 25 mosquitos para cada sexo, a medição das asas foi feita a partir da álula até a extremidade da asa (figura 5), não considerando a franja (Gama et al., 2005). b) Esquema dois, também recomendado por Pérez, et al. (2004): - D1 100 mg por larvas - D2 não alimentar - D3 ao D5 100 mg por dia para a mesma quantidade de larvas. Figura 5 - Asa de culicídeo. Fonte: Forattini, Revestimento deixado pela forma imatura durante a mudança de estágio.

8 104 Daniela Passos Vieira Bispo; Roseli La Corte dos Santos 2.3. Elaboração de procedimento operacional padrão (POP) provisório Utilizando as informações obtidas nos experimentos anteriores foi elaborado procedimento operacional padrão de criação para estabelecer colônia da cepa Rockefeller Estabelecimento da colônia Rockefeller e finalização do POP Utilizando as informações do POP foi estabelecida a colônia de A. aegypti (cepa Rockefeller), a qual foi avaliada até a terceira geração, para verificação da sua estabilidade e para finalização do POP. As variáveis observadas foram: a) Mortalidade larvária; b) Mortalidade total; c) Sincronia; d) Taxa de emergência do adulto; e) Média de ovos por fêmea Análise dos dados Foi montado banco de dados utilizando o Microsoft office excel e as análises estatísticas foram realizadas com o programa Statistica 6.0., com nível de confiança de 95%, utilizando ANOVA, e quando verificavase no teste anterior p< 0,05 Tukey. 3. Resultados e discussão 3.1. Avaliação da densidade larvária Tabela 1 - Variação de temperatura e umidade durante os ensaios de densidade larvária. Ensaio Temperatura Temperatura Umidade da água do ambiente Relativa do ar 1 22,3-26,5ºC 24,0-27,7 C 41-76% 2 22,4-27,9ºC 26,0-29,3ºC 40-80% 3 22,2 e 27,3ºC 22,2 e 27,3ºC 41 e 83% durante a realização dos experimentos devido ao atraso na aquisição do umidificador de ar para o insetário, fato que não permitiu o controle da umidade, mas apenas o monitoramento. Todavia, como esta fase do trabalho está restrita às formas aquáticas, essa variável não foi de relevância para os resultados. Ainda com relação aos aspectos ambientais, entre os ensaios, observamos diferença significativa (ANOVA) para temperatura do ambiente (p<0,05), temperatura da água (p<0,05) e umidade relativa do ar (p<0,05) com contraste de médias (Tukey) entre os ensaios 1 e 3. Essa interferência, pode ter reduzido a sincronia e elevado as taxas de mortalidade no ensaio 3 com relação ao ensaio 1 (tabela 2). Para as variáveis mortalidade larvária (p=0,49), mortalidade total (p=0,53), sincronia (p=0,82) e taxa de emergência (p=0,26) não houve diferença significativa (ANOVA) entre as densidades testadas. Portanto, aparentemente qualquer destas densidades pode ser utilizada no estabelecimento da colônia. Embora trabalhos apresentem que a densidade é fator relevante (Gama, et al., 2005) esse ensaio demonstrou o contrário, provavelmente por utilizar densidades próximas, abaixo daquela que afetaria o desenvolvimento das larvas. Os ensaios foram realizados no período de 1º de outubro a 23 de novembro de Durante esse período as temperaturas e umidade variaram de acordo com a tabela 1. A umidade relativa do ar esteve abaixo da desejada É importante ressaltar um ponto discrepante do segundo ensaio, a mortalidade larvária, que se apresentou elevada para a densidade de 400 larvas (tabela 2). Nessa, assim como nas demais densidades, todos os procedimentos citados na metodologia estavam padronizados, levando a hipótese de contaminação da bandeja usada para essa densidade.

9 Estabelecimento de colônia de Aedes aegypti por meio de amostra proveniente do Bairro Porto Dantas - Aracaju - Sergipe 105 Tabela 2 Resultados dos ensaios de avaliação da densidade larvária. Variável Densidade larvária 300 larvas 400 larvas 500 larvas Primeiro ensaio Mortalidade larvária 0,0% 0,0% 1,4% Mortalidade total 0,0% 0,0% 3,6% Sincronia 4 dias 4 dias 4 dias Taxa de emergência 100,0% 100,0% 97,8% Segundo ensaio Mortalidade larvária 0,7% 34,3% 2,0% Mortalidade total 2,0% 34,8% 5,2% Sincronia > 18 dias 10 dias > 18 dias Taxa de emergência 98,6% 99,2% 96,7% Terceiro ensaio Mortalidade larvária 0,0% 0,0% 4,2% Mortalidade total 0,0% 0,2% 4,2% Sincronia 8 dias 9 dias 10 dias Taxa de emergência 100,0% 99,8% 100,0% Outro ponto importante diz respeito à sincronia que no primeiro ensaio se apresentou alta, ou seja, em quatro dias todas as larvas de 4 estádio viraram pupa, o que é satisfatório, visto que para realização de ensaios de verificação de resistência necessita-se de muitas larvas no mesmo estádio evolutivo e mosquitos com no máximo três dias de vida (LAFICAVE, 2007a; 2007b). Essa elevada sincronia com relação aos demais ensaios pode ser devido ao fato de que as larvas foram alimentadas por mais um dia além do previsto no esquema de alimentação e que a superfície da água foi limpa, no segundo teste isso não aconteceu e no terceiro procedeu-se apenas a limpeza da superfície da água Avaliação do esquema de alimentação Nesse ensaio foi utilizada a densidade de 300 larvas por recipiente devido a apresentar uma menor mortalidade em relação às outras e por questões de praticidade, já que conforme o item anterior observou-se não haver diferença entre as densidades. Os ensaios foram realizados no período de 27 de novembro de 2007 e 27 de janeiro de Durante esse período as temperaturas e umidade variaram de acordo com a tabela 3. Tabela 3 - Variação de temperatura e umidade durante os ensaios de esquema de alimentação. Ensaio Temperatura Temperatura Umidade da água do ambiente Relativa do ar 1 22,2-27,1ºC 24,5-28,8 C 40-84% 2 22,6-26,0ºC 24,5-27,3 C 48-79% 3 22,4-27,9ºC 26,0-29,3 C 40-80% Acerca dos fatores ambientais, apenas a temperatura atual e máxima do ambiente variaram significativamente durante a realização dos ensaios (p<0,05), porém essa possível interferência pode não ser relevante já que os três esquemas testados sofreram essa influência ao mesmo tempo. Acresce ainda que segundo Beserra et al. (2006), em estudo de exigências térmicas para A. aegypti, a temperatura da água ideal varia entre 21 e 29 C e nos ensaios a temperatura variou dentro dessa faixa.

10 106 Daniela Passos Vieira Bispo; Roseli La Corte dos Santos Os resultados obtidos nesse ensaio com relação as variáveis são mostrados na tabela 4. Foi observada diferença significativa (ANOVA) entre os esquemas testados para mortalidade larvária (p=0,01) e mortalidade total (p=0,01). Houve contraste de médias (Tukey) entre o esquema três e os demais, infere-se com isso que o esquema três não é satisfatório, visto que os outros esquemas apresentaram baixos índices de mortalidade (tabela 4). Assim podemos escolher entre o esquema um ou dois. Comparando quantidades de ração utilizadas para a densidade de 300 larvas obtemos 1110 mg gastos empregando o esquema um e 800 mg usando o esquema dois, apesar de pequena essa diferença aliada à necessidade de alimentar as larvas por menos dias nos leva a escolher o esquema dois. Já que podemos obter a mesma ou parecida qualidade na criação de larvas com um esquema mais prático e menos dispendioso. O terceiro ensaio apresentou, de modo geral, elevada mortalidade larvária com relação aos demais, mais uma vez pode ter acontecido contaminação das bandejas de criação ou da água utilizada, visto que os procedimentos estavam padronizados. O responsável pela criação deve, então, ter o máximo cuidado na limpeza e armazenamento das bandejas quando não estiverem em uso. A água é outro fator que necessita de cuidado, os tanques utilizados para descloração permanecem expostos do lado externo do laboratório o que pode permitir a contaminação da água por agentes diversos Avaliação do tipo de alimento Nesse ensaio foi utilizada a densidade de 300 larvas por recipiente e o esquema de alimentação dois. Os ensaios foram realizados no período de 11 de fevereiro a 11 de abril de Durante esse período as temperaturas e umidade variaram de acordo com a tabela 5. Tabela 4 Ensaios de avaliação do esquema de alimentação das larvas. Variável Esquema de alimentação Primeiro ensaio Mortalidade larvária 0,0% 3,3% 28,3% Mortalidade total 0,7% 5,0% 28,3% Sincronia 10 dias > 18 dias > 18 dias Taxa de emergência 99,3% 98,3% 100,0% Segundo ensaio Mortalidade larvária 0,3% 0,0% 50,0% Mortalidade total 0,7% 0,0% 50,0% Sincronia 12 dias 10 dias > 18 dias Taxa de emergência 99,7% 100,0% 100,0% Terceiro ensaio Mortalidade larvária 16,7% 16,7% 33,3% Mortalidade total 16,7% 17,0% 33,3% Sincronia > 18 dias > 18 dias > 18 dias Taxa de emergência 100,0% 99,6% 100,0% 1. fornece alimentação durante sete dias initerruptos. 2. fornece alimentação durante quatro dias com intervalo de um dia entre o primeiro e segundo dia de alimentação. 3.fornece alimentação em um só dia

11 Estabelecimento de colônia de Aedes aegypti por meio de amostra proveniente do Bairro Porto Dantas - Aracaju - Sergipe 107 Tabela 5 - Variação de temperatura e umidade durante os ensaios do tipo de alimentação. Ensaio Temperatura Temperatura Umidade da água do ambiente Relativa do ar 1 25,1-27,3ºC 22,9-28,5 C 42-81% 2 19,8-27,2ºC 23,0-28,5 C 42-79% 3 19,7-27,5ºC 22,9-28,8 C 43-89% fêmea (p= 0,17). Convém no entanto ressaltar, que a média de ovos é nitidamente superior quando se utiliza ração para gatos, o que é relevante do ponto de vista prático na rotina de criação pois a obtenção de larvas para posteriores colônias ou ensaios diversos será mais rápida. No entanto tivemos só dois valores para essa característica, o que pode ter levado a indiferença estatística. No que diz respeito aos aspectos ambientais, entre os ensaios, observamos diferença significativa (ANOVA) para temperatura do ambiente (p<0,05), temperatura da água (p<0,05) e umidade relativa do ar (p<0,05) com contraste de médias (Tukey) entre os ensaios 1 e 3 e, 2 e 3. Essa influência, pode ter diminuído a sincronia no ensaio 3 com relação ao ensaio 1 e 2 (tabela 6). Para as variáveis mortalidade larvária (p=0,60), mortalidade total (p=0,57), sincronia (p=0,94) e taxa de emergência (p=0,51) não houve diferença significativa (ANOVA), também não existiu diferença para média da asa de fêmeas (p=0,09) e média de ovos por A envergadura média da asa de machos apresentou diferença (p=0,01) entre os testes com variação da ração de gato (Tukey) com relação às demais. Portanto, como esta ração apresentou também menores mortalidades e a melhor sincronia em relação aos outros tipos, este tipo de ração será escolhido para estabelecer a colônia Rockefeller. A ausência de dados para média de ovos e medida das asas no ensaio três se deve a ocorrência de um incidente no qual formigas, os principais predadores dos mosquitos (Pérez et al., 2004), destruíram os exemplares de ovos e mosquitos. Mais um cuidado a ser adotado pelo mantenedor da colônia, impedir o acesso de formigas. Tabela 6 - Avaliação do tipo de alimentação com relação as variáveis. Tipo de alimentação Variável Ração de peixe Ração de gato Ração de animal de laboratório Primeiro ensaio Mortalidade larvária 23,0% 0,0% 0,0% Mortalidade total 23,3% 0,0% 0,3% Sincronia > 18 dias 7 dias 9 dias Taxa de emergência 99,5% 100,0% 99,7% Média de ovos por fêmea 6,08 18,59 9,58 Média da asa: macho 2,51 mm 2,63 mm 2,44 mm Média da asa: fêmea 3,17 mm 3,21 mm 2,98 mm Segundo ensaio Mortalidade larvária 0,0% 0,0% 0,0% Mortalidade total 0,7% 0,7% 2,0% Sincronia > 18 dias 7 dias > 18 dias Taxa de emergência 99,3% 99,3% 98% Média de ovos por fêmea 12,87 30,71 16,13 Média da asa: macho 2,49 mm 2,59 mm 2,48 mm Média da asa: fêmea 3,00 mm 3,25 mm 3,00 mm Terceiro ensaio Mortalidade larvária 0,0% 0,0% 35,0% Mortalidade total 1,6% 1,3% 36,3% Sincronia > 18 dias 10 > 18 dias Taxa de emergência 98,4% 98,7% 97,9%

12 108 Daniela Passos Vieira Bispo; Roseli La Corte dos Santos 3.4. Estabelecimento da colônia Rockefeller e finalização do POP Com os parâmetros obtidos nos ensaios anteriores foi estabelecido o POP provisório. Nesse ensaio foram utilizadas larvas com densidade de 300 e 350 larvas por recipiente, esquema de alimentação utilizando 100mg a cada 150 larvas, sendo alimentadas no D1 e do D3 ao D6, e ração de gato (Gatsy: peixe, frango e carne; PURINA ). Os ensaios foram realizados no período de 30 de abril a 20 de junho de Durante esse período as temperaturas e umidade variaram de acordo com a tabela 7. Tabela 7 - Variação de temperatura e umidade durante o estabelecimento da colônia Rockefeller. Ensaio Temperatura Temperatura Umidade da água do ambiente Relativa do ar 1 18,8-28,7ºC 20,9-28,5 C 51-90% 2 23,7 28,0ºC 24,9-26,6 C 64-86% 3 23,0-26,8ºC 24,1 28,0 C % Acerca dos aspectos ambientais, entre os ensaios, observamos diferença significativa (ANOVA) para temperatura do ambiente (p<0,05), temperatura da água (p<0,05) e umidade relativa do ar (p<0,05) com contraste de médias (Tukey) entre os ensaios 1 e 2 e, 1 e 3. Essa influência, pode ter levado a maior mortalidade larvária e total e menor média de ovos por fêmea com relação aos outros ensaios (figura 6). É importante frizar que nesse ensaio alimentamos as larvas por mais um dia além do proposto pelo esquema, isso por ter observado que na avaliação da densidade larvária observamos uma alta sincronia ao alimentarmos em um ensaio as larvas por mais um dia (último parágrafo do item 5.1). Realmente parece haver relação entre sincronia e número de dias em que se alimenta as larvas. Ainda é relevante observar que, o uso de larvas divididas em três recipientes foi necessário de- Figura 6 Avaliação dos indicadores de estabilidade da colônia Rockefeller. vido à formação de crosta gordurosa na superfície da água, que ocasionava morte generalizada das larvas quando se tentou criar o número de larvas citado, por duas vezes, numa mesma bandeja com dimensões maiores. Provavelmente a quantidade de ração que foi aumentada proporcionalmente deve ter saturado a água ocasionando o fenômeno. De uma maneira geral à medida que passavam as gerações as variáveis praticamente não se alteravam inclusive com queda de algumas (figura 6). Ao observar a mortalidade larvária e total percebemos essa queda, era de se esperar que a passagem de geração diminuísse a resistência dos ovos levando a larvas mais frágeis, mas aparentemente isso não aconteceu. A média de ovos por fêmea aumentou em relação à primeira geração o que pode indicar que a fertilidade das fêmeas não foi reduzida com as sucessivas gerações. A sincronia foi alta e ficou praticamente estável ao longo das gerações com cinco dias na primeira e terceira geração e seis dias na segunda. Por fim a taxa de emergência apresentou uma pequena queda, provavelmente devido aos próprios mecanismos de seleção natural da espécie visto que as demais variáveis apresentaram bons resultados ao longo das gerações. Com esses dados foi possível então finalizar o POP (Apêndice A). No entanto essa aparente estabilidade da colônia deve ser observada com cuidado, visto que o número de gerações acompanhadas foi pequeno.

13 Estabelecimento de colônia de Aedes aegypti por meio de amostra proveniente do Bairro Porto Dantas - Aracaju - Sergipe Considerações finais Tendo em vista a metodologia apresentada e os resultados obtidos até o momento, podemos perceber que as densidades larvárias testadas não diferiram significativamente quanto ao desenvolvimento do A. aegypti, no entanto não conseguimos estabelecer a colônia Rockefeller com densidade de 1000 larvas, contudo utilizando 300 larvas obtivemos bons resultados, portanto não pôde ser definida uma densidade ideal para criação, mas a densidade de 300 larvas é recomendada, verificada outras variáveis como tamanho da bandeja de criação e quantidade de água e ração. uma vez que, por exemplo, se iniciarmos a alimentação numa segunda-feira, com esquema um finalizaremos a alimentação no domingo e com o esquema dois na sexta, assim devido à dificuldade de acesso a universidade aos finais de semana o esquema dois se mostra como a melhor escolha, além de utilizar menos ração. Quanto ao tipo de alimentação não foi observada diferença significativa para a maioria das variáveis, entretanto por apresentar diferença para envergadura da asa do macho, baixas mortalidades e uma alta sincronia, média de ovos por fêmea e taxa de emergência, escolhemos a ração de gato (Gatsy: peixe, frango e carne; PURINA ), que foi definida para uso. Com relação aos esquemas de alimentação observamos diferença significativa entre o esquema três e os demais. A escolha entre o esquema um que fornece a ração em sete dias e o esquema dois que fornece em cinco visa uma de questão de praticidade e logística, A colônia Rockefeller que demonstrou ser estável ao esquema proposto, após três gerações permitiu finalizar o POP que será utilizado pelo insetário na criação de A. aegypti de forma padronizada no campus da UFS possibilitando, assim, o fornecimento de ovos para os laboratórios que fazem pesquisa com a referida espécie.

14 110 Daniela Passos Vieira Bispo; Roseli La Corte dos Santos REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BESERRA, E. B.; CASTRO JÚNIOR, F. P.; SANTOS, J. W.; SANTOS, T. S.; FERNANDES, C. R. M. Biologia e Exigências Térmicas de Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae) Provenientes de Quatro Regiões Bioclimáticas da Paraíba. Neotropical Entomology, Londrina, v. 35, n. 6, p , BRASIL. Ministério da saúde: Secretaria de Vigilância em Saúde. Taxa de incidência de dengue: Brasil e Grandes Regiões, Brasília, Disponível em: < Acesso em: 29 Fev 2008b. BRAGA, I. A.; LIMA, J. B. P.; SOARES, S. da S.; VALLE, D.. Aedes aegypti resistance to Temephos during 2001 in several municipalities in the states of Rio de Janeiro, Sergipe and Alagoas, Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 99, n. 2, p , mar, BRASIL. Ministério da saúde: Secretaria de Vigilância em Saúde. Situação da Febre Amarela Silvestre no Brasil, 2007 e Brasília, Disponível em: < /portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/ boletim_svs_febre_amarela_11_06.pdf>. Acesso em: 11 Jul 2008c. BRAGA, I. A.; VALLE, D. Aedes aegypti: histórico do controle no Brasil. Epidemiol. Serv. Saúde, Brasília, v. 16, n. 2, p , 2007a. BRAGA, I. A.; VALLE, D. Aedes aegypti: inseticidas, mecanismos de ação e resistência. Epidemiol. Serv. Saúde, Brasília, v. 16, n. 4, p , 2007b. BRASIL. Ministério da saúde: Secretaria de Vigilância em Saúde. Balanço dengue Janeiro a Julho de Brasília, Disponível em: < portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/ balanco_dengue_jan_jul_2007.pdf>. Acesso em: 22 Dez 2007a. BRASIL. Ministério da saúde: Secretaria de Vigilância em Saúde. Resultados do Levantamento Rápido de Infestação por Aedes aegypti LIRAa Brasília, Disponível em: < portal/arquivos/pdf/lira_nacional.pdf>. Acesso em: 17 Dez 2007b. BRASIL. Ministério da saúde: Secretaria de Vigilância em Saúde. Informe Epidemiológico da Dengue, Janeiro a Dezembro de Brasília, Disponível em: < boletim_dengue_ pdf>. Acesso em: 7 Fev 2008a. CAMPOS, J.; ANDRADE, C. F. S. Susceptibilidade larval de populações de Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus a inseticidas químicos. Rev. Saúde Pública, São Paulo, v. 37, n. 4, p , 2003 CARVALHO, M. do S. L.; CALDAS, E. D.; DEGALLIER, N.; VILARINHOS, P. de T. R.; SOU- ZA, L. C. K. R. de; YOSHIZAWA, M. A. C.; KNOX, M. B.; OLIVEIRA, C. de. Suscetibilidade de larvas de Aedes aegypti ao inseticida temefós no Distrito Federal. Rev. Saúde Pública, São Paulo, v. 38, n. 5, p , CLARO, L. B. L.; TOMASSINI, H. C. B.; ROSA, M. L. G. Dengue prevention and control: a review of 1457, nov-dec, DENGUE Fever and It s Management. Disponível em: studies on knowledge, beliefs, and practices. Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, v. 20, n. 6, p < Acesso em 11 Jul DONALISIO, M. R.; GLASSER, C. M. Entomological surveillance and control of dengue fever vectors. Rev. Bras. Epidemiol., São Paulo, v. 5, n. 3, p , 2002.

15 Estabelecimento de colônia de Aedes aegypti por meio de amostra proveniente do Bairro Porto Dantas - Aracaju - Sergipe 111 EIRAS, Á. E. Culicidae. In: NEVES, D. P. (Coord.). Parasitologia humana. 11. ed. Rio de janeiro: Atheneu, cap. 43, p FIOCRUZ. Laboratório de fisiologia e controle de artrópodes vetores. Manutenção de Aedes aegypti em laboratório. Rio de Janeiro, FORATTINI, O. P. Culicidologia Médica. São Paulo: Editora da Universidade de São Paulo, FUNASA.Vigilância epidemiológica. Dengue instruções para pessoal de combate ao vetor: manual de normas técnicas. 3 ed. Brasília: Ministério da Saúde, Trop., Uberaba, v. 39, n. 3, p , may-jun, MACORIS, M. de L. G.; ANDRIGHETTI, M. T. M.; TAKAKU, L.; GLASSER, C. M.; GARBELOTO, V. C.; CIRINO, V. C. B. Alteração de resposta de suscetibilidade de Aedes aegypti a inseticidas organofosforados em municípios do estado de São Paulo, Brasil. Rev. Saúde Pública, São Paulo, v. 33, n. 5, p , PÉREZ, O.; RODRÍGUEZ, J.; BISSET, J. A.; LEYVA, M.; DÍAZ, M.; FUENTES, O.; RAMOS F. ; GONZÁLEZ, R.; GARCÍA, I. Manual de indicaciones técnicas para insectarios. Ciudad de la Habana: Ciências médicas, p. GAMA, R. A.; ALVES, K. de C.; MARTINS, R. F.; EIRAS, Á. E.; RESENDE, M. C. de. Effect of larvae density on adult size of Aedes aegypti reared under laboratory condictions. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., Uberaba, v. 38, n. 1, p , jan-feb, GOMES, A. S.; SCIAVICO, C. J. S.; EIRAS, Á. E. Periodicity of oviposition of females of Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicidae) in laboratory and field. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., Uberaba, v. 39, n. 4, LAFICAVE. Procedimento Operacional Padrão: Bioensaio dose resposta de temefós sobre larvas de Aedes aegypti. Revisão 00, abr. 2007a. LAFICAVE. Procedimento Operacional Padrão: Bioensaio com garrafas impregnadas com inseticida para avaliação da resistência de Aedes aegypti adultos. Revisão 00, abr. 2007b. SALAS, I. F. Biologia y control de Aedes aegypti: manual de operaciones. 1 ed. Monterrey: Universidad Autônoma de Nuevo León, SERGIPE. Secretaria de Estado da Saúde: Coordenação de vigilância epidemiológica. Boletim semanal do programa estadual de controle do dengue dados de 1 de janeiro de 2008 a 7 de julho de Sergipe, Disponível em: < boletim_dengue_7_de_julho.pdf>. Acesso em: 11 Jul SILVA, W.J.,; DÓRIA, G.A.A.; MAIA, R.T.; NUNES, R.S.; CARVALHO, G.A.; BLANK, A.F.; ALVES, P.B.; MARÇAL, R.M.; CAVALCANTI, S.C.H. Effects of essential oils on Aedes aegypti larvae: Alternatives to environmentally safe insecticides. Bioresource Technology, v. 99, p , TAUIL, P. L. Urbanization and dengue ecology. Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, v. 17, p , LIMA, E. P.; OLIVEIRA FILHO, A. M. de; LIMA, J. W. de O.; RAMOS JÚNIOR, A. N.; CAVALCANTI, L. P. de G.; PONTES, R. J. S. Aedes aegypti resistance to temefos in counties of Ceará State. Rev. Soc. Brás. Méd. VASCONCELOS, P. F. da C. Yellow fever. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., Uberaba, v. 36, n. 2, p , mar-apr, 2003.

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