ANÁLISE MICROBIOLÓGICA REALIZADA EM CARNE BOVINA in natura PROVENIENTES DE FEIRAS LIVRES NO MUNICÍPIO DE PETROLINA PE.

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1 Evolvere Scientia, V. 3, N. 1, 2014 ARTIGO Evolvere Scientia UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO ANÁLISE MICROBIOLÓGICA REALIZADA EM CARNE BOVINA in natura PROVENIENTES DE FEIRAS LIVRES NO MUNICÍPIO DE PETROLINA PE. Tatiane Vitor da silva 1*, Nataly Conceição Rodrigues 1, Dielson da silva Vieira 1, e Mateus Matiuzzi da Costa 1, 1 Universidade Federal do Vale do São Francisco, , Campus de Ciências Agrárias, Petrolina, PE, Brasil. * ta_ty_vitor@hotmail.com Resumo: O Clostridium botulinum é um bacilo Gram positivo, esporulado, anaeróbio estrito, mesofilo e formador de toxinas. Este micro-organismo está bastante envolvido em casos de intoxicações, tanto em humanos como em animais. Diante a elevada taxa de cães com suspeita de botulismo na cidade de Petrolina, e a correlação entre a possível presença do agente e a prática de oferecimento de carnes in natura a esses animais, desenvolveu-se o presente trabalho cujo objetivo foi isolar o C. botulinum e detectar a presença de Salmonella spp., Staphylococcus spp. e E. coli. O isolamento do C. botulinum foi realizado em meio (CMM) por 48 horas a uma temperatura de 37 0 C, em seguida realizou-se a técnica de coloração de Gram. Para o isolamento de Salmonella spp. 25 g das amostras foram homogeneizadas em de Água Peptonada Tamponada, e incubou a 37 0 C/ 24 horas. Transferiu-se alíquotas para o Caldo Rappaport e incubados a 41 0 C/24 horas, e outras alíquotas foram transferidas para o Caldo Tetrationato sendo estes incubados a 37 0 C/24 horas. De cada tubo com RVS e Tetrationato estriou-se uma alçada em placas de Petri com Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD), Ágar Hektoen Enteric (HE) e Bismuth (BE). Em seguida as placas foram incubadas a 37 0 C/24h. A determinação dos coliformes fecais e totais foi feita através de diluição seriada utilizando o método do número mais provável. O isolamento do Staphylococcus spp. foi feito através de diluição em placas contendo ágar Baird Parker. No presente trabalho verificou-se a presença de E.coli patogênica e elevada contagem de Staphylococcus spp. Não foi detectado C. botulinum e Salmonella spp. em nenhuma das amostras. Palavras-chave: Coliformes, Salmonella spp., Staphylococcus spp., Clostridium botulinum. 211

2 Abstract: Clostridium botulinum is a Gram positive bacillus, sporulated, strict anaerobes, mesophyll and toxins forming bacteria. This microorganism is heavily involved in cases of poisoning in both humans and animals. Given the high rate of dogs with botulism suspecteion in the city of Petrolina, and the possible correlation between the presence of the agent and the practice of offering crude meat to these animals, the present work aimed to isolate the C. botulinum and detecting the presence of Salmonella spp., E. coli and Staphylococcus spp. Isolation of C. botulinum was performed in medium (CMM) for 48 hours at a temperature of 370C, and then held the Gram staining technique. For the isolation of Salmonella spp. samples of 25 g were homogenised in buffered peptone water and incubated at 370C / 24 hours. Aliquots were transferred to broth (RVS) and incubated at 41 0 C/24 hours and other aliquots were transferred to Tetrathionate Broth and these were incubated at 37 0 C/24 hours. Both Rappaport and Tetrationate cultive were streaked in Petri dishes with Xylose lysine deoxycholate (XLD), Hektoen Enteric (HE) e Bismuth (BE) Agar. Then the plates were incubated at 37 0 C/24h. The determination of fecal and total coliforms were made by serial dilution using the most probable number method. The isolation of Staphylococcus sp was done by dilution plate in agar Baird Parker. This study verify the presence of pathogenic E.coli and high count of Staphyllococcus spp. C. botulinum and Salmonella spp. has not been detected in any sample. Keywords: Coliform, Salmonella spp., Staphylococcus spp., Clostridium botulinum. INTRODUÇÃO No século X foi decretada pelo imperador de Bizâncio na Grécia antiga, a proibição da fabricação de salsicha recheada com sangue. Entretanto no final do século 18 ocorreram alguns surtos de intoxicação pela toxina botulínica, devido a ingestão de salsicha no sul da Alemanha. E em 1896 o patógeno Bacillus botulinus foi isolado de um presunto. A bactéria foi assim chamada por causa da sua associação com salsichas (do latim a palavra salsicha = botulus) (MENDES, 2008). Mas de acordo com Figueredo; Dias e Lucena, (2006) do latim botulus significa embutido, o nome botulismo deve-se ao fato de no século VIII esta doença ter sido associada ao consumo de embutidos. Apesar de ainda ser considerada, pelo senso comum, como uma doença causada pelo consumo de embutidos ou enlatados, o botulismo pode acontecer, também, por contaminação de outros tipos de alimentos e por outras formas de contaminação. Moura et al. (2009) relataram seis casos de botulismo em cães ocorridos na cidade de Petrolina, nos casos 1, 2 e 6 os cães tiveram acesso à carcaças de animais oriundas das feiras livres próximas à sua residência. Nos casos 3, 4 e 5 os animais residiam em zona urbana e tiveram contato com carcaças presentes nessas propriedades. 212

3 Segundo Franco e Landgraf (1996) micro-organismos indicadores são grupos de bactérias que estando presente nos alimentos, podem fornecer informações sobre a origem da contaminação, além de indicar também condições sanitárias insatisfatórias durante o processamento e armazenamento. Os micro-organismos indicadores de contaminação alimentar são representados por bactéria do gênero Staphylococcus spp, coliformes fecais e termotolerantes. No grupo dos coliformes totais estão as bactérias com formato de bastonete gram-negativas, não formadoras de esporos, aeróbias ou aeróbias facultativas, com capacidade de fermentar a lactose e produzir gás em 24 a 48 h a 35 0 C. E o grupo dos coliformes fecais que inclui as bactérias capazes de fermentar a lactose e produzir gás em 24 h a 44,5 0-45,5 0 C. Os Staphylococcus spp. são bactérias grampositivas em forma de cocos, anaeróbicas facultativas e catalase positiva (QUINN et al.,1994). Salmonella spp. é uma bactéria pertencente a família Enterobacteriaceae e é definida como bacilo gram negativo, não formadora de esporos e anaeróbica facultativa, cujos principais reservatórios são as aves domésticas, animais de criação e répteis (BARRETTO e SILVA, 2006) Segundo Lundgren et al. (2009) a ausência de Salmonella spp. não é parâmetro suficiente para assegurar a salubridade de alimentos uma vez que foram encontrados outros micro-organismos patogênicos como Staphylococcus coagulase positiva e E.coli nas suas análises. Souza et al. (2006) verificaram uma contagem elevada de coliformes totais e fecais bem como de Staphylococcus aureus nas amostras de carne do sol adquiridas das feiras livres. Para a amostra adquirida de supermercado observou-se a presença de coliformes totais e ausência de coliformes fecais e Staphylococcus aureus. Devido a elevada taxa de cães mortos com suspeita de botulismo na cidade de Petrolina, e a correlação entre a possível presença do agente e a prática de oferecimento de carnes in natura a esses animais foi delineado o seguinte trabalho cujo objetivo foi isolar o Clostridium botulinum e detectar a presença de Salmonella, Staphylococcus spp e E. coli. MATERIAL E MÉTODOS Local de execução O trabalho foi realizado na cidade de Petrolina, Pernambuco. Localizada a Sul, Oeste, a uma altitude de 380 m e com uma área de 4.561, 872 Km 2. Amostras utilizadas Foram coletadas 21 amostras de carne de sol com aproximadamente 200g, sendo que desse total 20 foram adquiridas nas feiras livres da cidade de Petrolina e 1 em supermercado da mesma cidade. As amostras foram devidamente acondicionadas em caixas de isopor com gelo reciclável e conduzidas ao laboratório de microbiologia da Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF) onde foram analisadas. 213

4 Isolamento de Clostridium botulinum: Para o isolamento dessa bactéria uma porção das amostras de carne foi inoculada em meio de cultura meio de carne cozida (CMM) por um período de 48 horas a temperatura de 37 0 C. Após esse período realizou-se a técnica do esfregaço corado pelo método de gram para detectar a presença da bactéria. Isolamento de Salmonella spp O isolamento de Salmonella foi realizado de acordo com a metodologia estabelecida por Silva et al. (1997). Pesou-se assepticamente 25 g da amostra, a homogeneizou em 225ml de Água Peptonada Tamponada (BPW), e incubou a 37 0 C por 24 horas. Alíquotas de 0,1ml dessa cultura préenrequecida foram transferidas para tubos contendo 10ml de Caldo Rappaport Vassilidis Soja (RVS) e incubados a 41 0 C por 24 horas, e outras alíquotas de 1ml foram transferidas para tubos contendo 10ml de Caldo Tetrationato sendo estes incubados a 37 0 C por 24 horas. De cada tubo com RVS foi estriada uma alçada em placas de Petri com Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD), Ágar Hektoen Enteric (HE) e Bismuth (BE), o mesmo foi feito com os tubos de Tetrationato. Em seguida as placas foram incubadas a 37 0 C por 24h. Determinação de coliformes totais e fecais: Para as análises de coliformes totais e fecais, pesou-se assepticamente 25g das amostras e diluiu-as em 225 ml de água peptonada que corresponde a diluição de 10-1, a partir da qual obtiveram-se as demais diluições decimais 10-2 e No teste presuntivo três alíquotas das três diluições foram inoculadas em uma série de tubos contendo Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST). Esses tubos foram incubados a 37 0 C por 24 horas. Os tubos positivos (com produção de gás) foram submetidos ao teste confirmatório em Caldo Verde Brilhante (VB) que confirma a presença de coliformes totais, e Caldo E.coli (EC) que confirma a presença de coliformes fecais. De cada tubo positivo, transferiu-se uma alçada para tubos contendo VB os quais foram incubados a 37 0 C por horas. E transferiu-se outra alçada para o caldo EC, porém este foi incubado a uma temperatura de 45 0 C por 24 horas. Para a contagem de coliformes totais foi anotada a quantidade de tubos de VB com produção de gás e comparouse o resultado obtido à tabela que determina o Número Mais Provável (NMP)/ g ou ml. Também foram anotados os números de tubos de EC positivos para determinar a quantidade dos coliformes fecais, mediante comparação à tabela do NMP/g ou ml. Os tubos de EC positivos sugerem a presença de E.coli, e para confirmar a presença dessa bactéria tomou-se um tubo positivo de cada diluição e uma alçada foi estriada em placas de Petri com o meio Macconkei, na sequência essas placas foram incubadas a 37 0 C/ 24h. As colônias típicas de E.coli obtidas nesse meio de cultura são de cor rósea brilhante. Foi feito o repique de uma 214

5 dessas colônias para meio TSB que foi incubado a uma temperatura de 37 0 C/ 24h. Em seguida foram realizados os testes bioquímicos, nessa etapa os meios de cultura utilizados foram GOF(oxidação-fermentação da glicose) SIM, TSI (tríplice açúcar ferro) e (ágar citrato de Simmons) CITRATO. As colônias de E.coli confirmadas nos testes bioquímicos foram submetidas a reação em cadeia da polimerase (PCR) para identificar a qual grupo filogenético elas pertenciam. As análises filogenéticas demonstram que cepas dessa bactéria podem ser classificadas em quatro grupos, sendo estes A, B1, B2 e D. As cepas comensais pertencem aos grupos A e B1, enquanto as cepas virulentas estão dentro dos grupo B2 e D. (CLERMONT et al., 2000). Análises moleculares para Ca racterização filogenética de E.coli Extração do DNA bacteriano. As colônias de E.coli confirmadas nos testes bioquímicos foram submetidas a PCR. Para isso, primeiramente procedeu-se com a extração do DNA por meio da termo-extração. Uma alçada das bactérias (E.coli) foram transferidas para 500µL de água ultra-pura em microtubos, estes foram submetidos a C/ 11 minutos e em seguida foram mantidos em gelo por 4 minutos. Após esse período foi realizada a centrifugação a RPM por 2 minutos. O sobrenadante contendo o material genético foi transferido para novos microtubos e mantidos refrigerados até o momento de sua utilização (SÁ et al., 2013). Amplificação por PCR. A confirmação molecular para filogenia de E. coli se deu pela amplificação do gene chua e yjaa por PCR. Na amplificação foram utilizados os seguintes iniciadores: chua 5- GACGAACCAACGGTCAGGAT-3 e 5 - TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3 e yjaa 5 -TGAAGTGTCAGGAGCGCTG-3 e 5 - ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC-3 (CLERMONT et al., 2000). Como molde foi utilizado o DNA termo-extraído dos isolados bacterianos em água ultra-pura, sendo que 3µl desta suspensão foram adicionados em 21µl de um mix contendo, 0,4pmol dos primers, 0,4 mm dos desoxirribonucleotídeos, Tampão de Taq 1x, 1U de Taq, 2 mm de MgCl2 (para chua) e 1,5 de MgCl2 (para yjaa). Este mix foi levado ao termociclador e submetido a uma etapa inicial de desnaturação a 94 C por 5 minutos seguida de 30 ciclos constituídos de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 55 ºC e 30 segundos a 72 ºC. Um passo de extensão final a 72 C por 7 minutos foi adicionado após o término dos ciclos. O resultado do PCR foi verificado em gel de agarose a 1,5%, corado com brometo de etídio e documentado através de um fotodocumentador. Pesquisa de Staphylococcus sp. A pesquisa de Staphylococcus spp. foi realizada segundo a metodologia de Silva et al (1997) pesando-se 25g das amostras e 215

6 diluindo-as em 225ml de água peptonada tamponada que corresponde a diluição 10-1, a partir dessa obtiveram as diluições 10-2 e Da primeira diluição foram retiradas quatro alíquotas, três alíquotas de 0,3ml e uma de 0,1 ml e das diluições 10-2 e 10-3 foram retidas alíquotas de 0,1 ml. Na sequência foi feita a semeadura utilizando o método spread-plate em placas contendo ágar Baird-Parker, onde com o auxilio da alça de Drigalsky flambada espalhou-se o inóculo por toda a superfície do meio até a completa absorção. Depois as placas foram incubadas a 37 0 C/ 48h. Após esse período, foi realizada a contagem das colônias. As colônias típicas foram repicadas para o meio TSB e incubadas a 37 0 C/ 24 h, a partir daí foram realizados os testes de catalase e coloração de Gram. RESULTADO E DISCUSSÃO Os resultados das análises microbiológicas realizadas para detectar coliformes fecais, totais, Staphyllococcus spp. e Salmonella spp. estão representados na Tabela 1. Amostra Coliforme total NMP/g Coliforme fecal NMP/g ,8x >1,100 >1.100 Inc Inc ,3x10 3 Staphyllococcus UFC/g ,7x ,68x Inc 08 <3,6 <3,6 Inc 09 <3,6 <3,6 Inc 10 3,6 23 Inc 11 <3,0 <3,6 Inc Inc Inc ,43x >1.100 > ,52x ,98x Inc Inc Inc Inc Inc= incontável, Salmonella spp. e C. botulinum: ausente em todas as amostras Tabela 1- resultados das análises microbiológicas realizadas em carne bovina vendida nas feiras livres de Petrolina-PE. Em todas as amostras analisadas não foi detectada a presença de Salmonella spp. Resultado semelhante foi encontrado por LUNDGREN et al (2009) e SOUSA et al (2006). Estando essas amostras dentro dos padrões microbiológicos estabelecidos pela resolução RDC n 0 12/2001 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária que exige a ausência desse microrganismo para carne in natura. Os coliformes totais foram encontrados em 20 amostras o que equivale a 100% do total. Fazem parte desse grupo bactérias não entéricas do gênero Enterobacter, Klebsiella e Citrobacter, bactérias oriundas do trato gastrointestinal de humanos e animais de sangue quente. Já os coliformes fecais foram encontrados em 100% das amostras, nesse outro grupo busca-se a presença de coliformes de origem gastrointestinal, (E.coli), no entanto, 216

7 cepas de Enterobacter, Klebsiella e Citrobacter também são encontradas. (Silva et al 1997). Foram isoladas quatro amostras (15, 18, 19 e 20) de E.coli e foi feito PCR de filogenia para classificá-las em grupos com base na presença/ausência dos genes chua e yjaa. As quatro amostras foram positivas para o chua podendo as mesmas pertencerem ao grupos B2 ou D, em seguida testou-se o yjaa e, todos os quatro isolados deram resultado negativo para este gene, pertencendo assim ao grupo D o que caracteriza esses isolados como patogênicos. Cepas de E.coli quando isoladas de alimentos representam indícios de contaminação fecal transmitida diretamente das mãos dos manipuladores ou indiretamente através de água contaminada. LUNDGREN et al. (2009) em seu trabalho encontraram coliformes fecais e totais em todas as amostras, com valor médio de 1,8x10 3 NMP/g para coliformes fecais, valor médio de 1,5x10 3 NMP/g para coliformes totais e detectaram E.coli em 6 amostras. A contagem de Staphyllococcus spp. foi elevada, sendo impossível a determinação da quantidade de colônias na maioria das amostras. Além da contagem, também foram realizados para essa bactéria os testes de catalase e coloração de gram para determinação do gênero, sendo todos catalase positiva, observou-se na coloração cocos gram positivos aglomerados de forma semelhante a cachos de uva. A presença dessa bactéria indica manipulação excessiva do alimento por parte dos comerciantes, precárias condições higiênicas das bancadas onde é exposta a carne e os maus habito de higiene dos manipuladores. CONCLUSÃO A ausência de bactérias do gênero Salmonella em 25g de amostra indica que a carne analisada estaria própria ao consumo segundo a resolução RDC n 0 12/2001 da ANVISA. Porém verificou-se a presença de E.coli patogênica e elevada contagem de Staphyllococcus spp.. A detecção de E.coli ainda é o melhor indicador de contaminação fecal, apesar de ser possível a introdução desse micro-organismo nos alimentos através fontes não fecais. A elevada contagem de Staphyllococcus spp. aponta manipulação excessiva do alimento por parte dos comerciantes, e indica também precárias condições higiênicas das bancadas onde é exposta a carne bem como os maus hábitos de higiene dos manipuladores. Isso requer uma maior atuação dos órgãos de vigilância sanitária nas feiras livres. Não foi detectado C. botulinum em nenhuma das amostras, dessa forma a elevada taxa de cães mortos com suspeita de botulismo pode estar relacionada a presença desse micro-organismo REFERÊNCIAS FIGUEREDO, M. A. A et al.: Considerações acerca de dois casos de botulismo ocorridos no Estado da Bahia. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 39 n. 3,

8 MENDES, R.: Botulismo no mel- Revisão de literatura. Monografia. Universidade Castelo Branco. 96f., MOURA, J. B et al.: Botulismo em cães no município de Petrolina- Pernambuco: Relato de seis casos. V Jornada de iniciação Científica da UNIVASF. Juazeiro BA, FRANCO, B.D.G,M.; LANDGRAF, M. Microbiologia de alimentos. São Paulo: Editora Atheneu, 182p, BARRETO, J. R; SILVA, L. R. Intoxicações alimentares. Cap BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC n.12, de 02 de janeiro de LUNDGREN, U. P et al.: Perfil da qualidade higiênico-sanitária da carne bovina comercializada em feiras livres e mercados públicos de João Pessoa/ PB Brasil.Revista Alimentação e Nutrição, v. 20, n. 1, p , Clermont, O et al.: Rapid and Simple Determination of the Escherichia coli Phylogenetic Group. Appl Environ Microbiol v.66, p , SÁ, M. C. A et al.: Distribution of PLD and FagA, B, C and D genes in Corynebacterium pseudotuberculosis isolates from sheep and goats with caseus lymphadenitis. Genetics and Molecular Biology, v. 36, n. 2, p , 2013 SOUZA, A. M et al.: Esporos e toxina de Clostridium botulinum dos tipos C e D em cacimbas no Vale do Araguaia, Goiás, 2006 SILVA, N. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. - São Paulo: Livraria Varela, p31,