Projeto: Avaliação de efeitos bioquímicos e histopatológicos da exposição à microcistina-lr (cianotoxina) pela via inalatória em camundongos Suíços

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1 Projeto: Avaliação de efeitos bioquímicos e histopatológicos da exposição à microcistina-lr (cianotoxina) pela via inalatória em camundongos Suíços Financiador: CNPq Modalidade: Universal 14/ Faixa A Participantes: Raquel Moraes Soares IBCCF-Xerem/UFRJ Coordenadora Lorena dos Santos Santiago IBCCF-Xerem/UFRJ Aluna de IC Resumo: Cianobactérias, também chamadas de cianofíceas, algas azuis ou cianoprocariotos, são microrganismos procariotes e fotossintetizantes, de estrutura semelhante às bactérias, podendo ser unicelulares, coloniais ou filamentosas. O processo de eutrofização artificial, intensificado pela ação antrópica a partir dos últimos 50 anos, e que significa um aporte excessivo de nutrientes (principalmente N e P) nos ambientes aquáticos, favorece florações destes organismos. Este fenômeno é freqüente em países como Canadá, E.U.A., Portugal, Inglaterra, Alemanha, África do Sul, China, Brasil, Austrália, entre outros. Atualmente a preocupação mais séria em relação às florações, é o fato de que as cianobactérias são potencialmente produtoras de toxinas que podem causar sérios danos a mamíferos e também a biota aquática. Estas moléculas são endotoxinas classificadas em três classes: dermatotoxinas, neurotoxinas e hepatotoxinas. Dentre as últimas, a mais comum, é a Microcistina (MCYST), isolada dos gêneros Microcystis, Anabaena, Oscillatoria (Planktothirix), Nostoc e Anabaenopsis. nos animais vertebrados doses letais de microcistinas levam rapidamente a morte devido aos efeitos extensos e danosos ao fígado. No entanto, estudos com doses sub-letais dessas toxinas mostraram que as mesmas provocam efeitos também em outros órgãos. Já

2 serão observados alterações de atividades enzimáticas (sucrase, fosfatase ácida e succinato desidrogenase) e aumento da peroxidação lipídica na mucosa intestinal de ratos, assim como apoptose em quase todo o trato gastrointestinal de camundongos injetados intraperitonealmente com microcistinas. Em trabalhos recentes de nosso grupo, será possível observar que tanto MCYST-LR pura quanto o extrato de M. aeruginosa produtora de microcistinas produziram no pulmão de camundongos estresse oxidativo, resposta inflamatória e colapso alveolar (com efeitos sobre a mecânica respiratória) em níveis praticamente iguais. Isto indica que no extrato de Microcystis os principais agentes realmente serão as microcistinas. Esta é uma constatação importante, uma vez que, em condições reais, seres humanos ou animais se intoxicam com células de cianobactérias ou seus metabólitos (dissolvidos na água) como um todo. No entanto, ainda existe uma carência de estudos sobre a biodistribuição desta toxina em mamíferos. Soares (2005), através do uso de ELISA pôde detectar a microcistina-lr no soro de ratos Wistar por até 60 dias após uma única injeção intraperitoneal desta toxina. Este dado importante indica que microcistinas podem permanecer no organismo por um longo tempo. Tudo indica que esta recirculação parte do fígado, onde as mesmas se acumulam inicialmente e são liberadas à medida que as proteínas fosfatases com as quais estão conjugadas vão sendo catabolizadas. Estes dados devem ser melhor investigados analisando-se efeitos sobre o fígado, o pulmão, os rins e outros órgãos de animais. No mesmo trabalho citado acima, a autora também identificou uma recuperação da atividade de proteínas fosfatases 1 e 2A no fígado de camundongos injetados com uma dose sub-letal de 40 g/kg de peso corpóreo no período de 24hs pós injeção i.p. da toxina. Andrinolo et al. (2008) também observaram evidências citológicas e fisiológicas de recuperação da função hepática até 2 meses após exposição a uma dose subletal a microcistina-lr. Isto leva à hipótese de que o fígado possa aumentar a expressão destas enzimas como resposta a uma intoxicação sub-

3 letal. Mas não se sabe se uma exposição crônica permitiria o mesmo tipo de resposta celular. Após o incidente de Caruaru em 1996, onde mais de 100 pacientes de hemodiálise faleceram após tratamento com água contaminada com microcistinas, aumentou consideravelmente a preocupação mundial quanto aos riscos impostos pela ocorrência de cianobactérias em corpos d água utilizados para o abastecimento público. Isto se reflete na criação de legislação específica para o aperfeiçoamento do controle da qualidade da água, incluindo o monitoramento de cianotoxinas. O Brasil será o primeiro país a estabelecer tal medida, através da portaria 518 do Ministério da Saúde. Portanto, os estudos toxicológicos experimentais são uma importante ferramenta na avaliação dos riscos dessas toxinas para a população humana. No entanto, a grande maioria dos dados sobre cianotoxinas ainda é obtida em estudos de intoxicação aguda, mas a intoxicação crônica e sub-letal certamente é mais freqüente e também representa sérios riscos à população. Atualmente, a preocupação com os riscos relacionados à exposição às cianotoxinas através da recreação em ambientes aquáticos contaminados também tem crescido em todo o mundo. Na cidade do Rio de Janeiro, por exemplo, é comum a prática de esportes aquáticos no Complexo Lagunar de Jacarepaguá, o qual apresenta constantes florações de cianobactérias tóxicas. No entanto, são bastante reduzidos os estudos de avaliação dos efeitos da exposição a essas toxinas pela via inalatória, a qual é a mais importante via de intoxicação para grupos da população de dependem da água para seu sustento, tais como pescadores e atletas profissionais. O presente trabalho tem como objetivo geral contribuir para o conhecimento dos efeitos das microcistina-lr sobre aspectos bioquímicos e histológicos de pulmão e fígado de animais expostos por inalação à aerossóis contaminados com essa toxina. Este projeto será executado no Laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactérias, Coordenado pela Profa. Sandra M.F.O. Azevedo, do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF) da Universidade Federal do Rio de Janeiro em colaboração com o Laboratório de Fisiologia da Respiração (IBCCF-UFRJ) coordenado pelo Prof. Walter Zin.

4 Como objetivos específicos, utilizando-se camundongos machos adultos Suíços expostos cronicamente à microcistina-lr por inalação pretende-se: 1) Avaliar a presença e acúmulo da microcistina-lr no soro, fígado e pulmão; 2) Avaliar a atividade enzimática proteínas fosfatases 1 e 2A no fígado e pulmão; 3) Avaliar atividade de enzimas indicadoras de estresse oxidativo e detoxificação no fígado e pulmão de camundongos Suíços; 4) Avaliar efeitos histopatológicos de microcistina-lr em fígado e pulmão; 5) Avaliar dano a função hepática através de enzimas marcadoras no soro. Como procedimento para alcançar os objetivos, será realizado um experimento de exposição às microcistinas por inalação em um cubo de acrílico com 1m 3 de volume. O cubo foi construído de forma a permitir a medida de pressão de entrada e saída de ar, através de um fluxômetro, e será devidamente acoplado a um nebullizador e um coletor de partículas atmosféricas. Diariamente, serão acondicionados camundongos Suíços machos (n=20) de 6 semanas de idade, pesando inicialmente 25 g, mantidos no Biotério do Laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactérias - IBCCF. Estes animais ficarão expostos por 3h a uma atmosfera saturada por aerossóis produzidos com uma solução aquosa de extrato de Microcystis aeruginosa contendo microcistinas em uma concentração de 100 g/ L (equivalente a concentração presente em uma floração em estado de degradação de 10 6 cels/ml). O experimento terá uma duração total de 3 meses, sendo 10 animais amostrados no final dos primeiros 45 dias e 10 animais amostrados no final do terceiro mês. Em cada um destes dois momentos serão amostrados também 10 animais controle mantidos no biotério. Por este experimento simular uma exposição a uma dose subletal pela via aérea, serão analisados apenas pulmão e fígado (por ser este o órgão alvo) dos animais, em colaboração o Laboratório de Fisiologia da Respiração IBCCF- UFRJ. No fígado e pulmão serão realizadas análises bioquímicas para avaliação do acúmulo de microcistina nesses órgãos. Além disso, será investigado o estresse oxidativo através da avaliação de peroxidação lipídica, atividade enzimática de catalase, superóxido desmutase e glutationa

5 peroxidase. Também será avaliada a atividade da principal ezima detoxificadora de microcistinas: a glutationa S-transferase. Igualmente, a atividade das enzimas-alvo das microcistinas, as proteínas fostatases 1 e 2A será avaliada nos tecidos citados. Posteriormente, a parte dos tecidos do pulmão e do fígado separadas para análise histológica, será avaliada para a verificação de alterações teciduais. Finalmente, a função do principal órgão afetado pelas microcistinas, o fígado, será avaliada através da determinação de marcadores de função hepática no soro dos animais. Para a avaliação estatística dos dados será aplicada one-way ANOVA, seguida do teste de Tukey para comparações múltiplas, quando necessário. Em caso negativo, o teste não-paramétrico Kruskal Wallis ANOVA on Ranks será empregado. As análises histológicas do parênquima pulmonar e hepático serão realizadas em colaboração com o Laboratório de Fisiologia da Respiração- IBCCF-UFRJ. O restante das análises será realizado no Laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactérias (LETC)-IBCCF-UFRJ (ao qual a proponente está vinculada) com a colaboração de sua coordenadora, Profa. Sandra M.F.O. Azevedo. Este trabalho será realizado com a participação dos alunos de graduação, Lorena Santiago e Cesar Macedo, ambos do curso de Ciências Biológicas Biofísica da UFRJ (Pólo de Xerém e Campus do Fundão, respectivamente). Este trabalho fará parte de seus trabalhos de conclusão de curso. Ao final do período de desenvolvimento do projeto, pretende ter resultados que esclareçam como a microcistina-lr afeta órgãos principais de camundongos, tais como fígado e pulmão, através da exposição, por inalação, à aerossóis contaminados. Com tais dados um passo importante para a avaliação de risco de nossas águas recreacionais terá sido dado. Pretende-se também que a realização desse projeto resulte na elaboração de duas monografias de conclusão de curso dos alunos envolvidos (citados acima), além de manuscritos a serem publicados em revistas científicas internacionais.