Adesão de células mesenquimais da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de ratos a diferentes superfícies de titânio:

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1 A UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PERIODONTIA E PRÓTESE DENTÁRIA Adesão de células mesenquimais da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de ratos a diferentes superfícies de titânio: Estudo comparativo in vitro Luciana Bastos Alves Natal/ RN 2008

2 Luciana Bastos Alves Adesão de células mesenquimais da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de ratos a diferentes superfícies de titânio: Estudo comparativo in vitro Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Odontologia, com área de concentração em Periodontia e Prótese Dentária, da Faculdade de Odontologia da UFRN, como requisito parcial para obtenção do grau de mestre. Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza Natal 2008

3 Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia Biblioteca Setorial de Odontologia Profº Alberto Moreira Campos. Alves, Luciana Bastos. Adesão de células mesenquimais da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de ratos a diferentes superfícies de titânio: estudo comparativo in vitro / Luciana Bastos Alves. Natal, RN, p. : il. Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza. Dissertação (Mestrado) Departamento de Odontologia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. 1. Ligamento periodontal - Dissertação. 2. Medula óssea Dissertação. 3. Titânio Dissertação. I. Barboza, Carlos Augusto Galvão. II. Título. RN/UF/BSO Black D64

4 Dedico este trabalho A Deus, pelo seu amor e sua presença em minha vida que me faz mais forte e segura. Aos meus pais Edmar e Lúcia, que sempre me apoiaram, incentivaram e se esforçaram para a concretização de mais uma etapa da minha vida. Sem vocês eu nada seria. Muito obrigada!

5 AGRADECIMENTOS Ao meu orientador, Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza, pela confiança depositada em meu trabalho, pela sua disponibilidade irrestrita, pelos ensinamentos compartilhados, pelo incentivo e estímulo na área de cultivo celular que me abriram as portas para a próxima etapa, pelo apoio nos momentos difíceis e pelo carinho e amizade. À aluna de iniciação científica do curso de Biomedicina da UFRN, Fernanda Ginani, pelos primeiros passos na área de cultivo de células, pela sua disponibilidade e amizade que construímos e cultivamos junto com este trabalho. Ao colega e Prof. José Sandro Pereira da Silva, pelas amostras de titânio e completa contribuição na caracterização de superfícies, pelas orientações nesta área, pelo apoio, atenção e disponibilidade na elaboração deste trabalho. Ao LabPlasma (Departamento de Física da UFRN), na pessoa do Prof. Dr. Clodomiro Alves Júnior, pelo espaço e estrutura cedidos para o tratamento das amostras. Ao laboratório de cultura de células do Departamento de Bioquímica do Centro de Biociências da UFRN, na pessoa do Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha, pelo espaço e estrutura cedidos para o cultivo celular. Ao Departamento de Energia Nuclear da UFPE, na pessoa da Prof. Dra. Helen Jamil Khoury, pela irradiação das amostras. Ao Laboratório de Cronobiologia do Departamento de Morfologia da UFRN, pela concessão dos animais utilizados neste trabalho.

6 A Faculdade de Odontologia da UFRN, na pessoa do chefe do departamento Prof. Dr. Antônio Ricardo Calazans Duarte, Aos Professores Dra. Ruthnéia Diógenes Alves Uchoa e Dr. Adriano Rocha Germano, pela participação na banca da qualificação, o que contribuiu para qualidade desta dissertação. Aos Professores Dra. Adriana da Fonte Porto Carreiro, Dr. Antônio Ricardo Calazans Duarte, Dr. Gustavo Augusto Seabra Barbosa, pelos ensinamentos em Prótese Dentária, e em especial ao Prof. Dr. Eduardo Gomes Seabra pelos ensinamentos em Periodontia. Aos Professores do Programa de Pós-graduação em Odontologia da UFRN, Dra. Maria Ângela Ferreira, Dr. Kênio Costa Lima, Dr. Ângelo Giuseppe Roncalli, Dra. Elizabethe Cristina Fagundes de Souza, Dra. Maria do Socorro Costa Feitosa Alves, Dra. Íris do Céu Clara costa, e Dra. Maria Celeste Nunes de Melo, pelas orientações e ensinamentos partilhados. A todos os funcionários da Faculdade que contribuíram de alguma forma para a concretização deste trabalho, em especial a Sandra, Ocian e Cecília. Aos meus colegas de turma, Luana, Eudivar Alessandra, Lidiane, Miguel, Pedro Henrique, Ana Rafaela e Arcelino, pela convivência amiga e alegre durante todo o curso. Ao aluno de iniciação científica do curso de Odontologia da UFRN, Marcel Cortês Bonifácio Varela Cavalcanti, pelo seu apoio no cultivo de células. Ao aluno do curso de Odontologia da Universidade Potiguar, Almir Nery, pela contribuição no tratamento de superfícies das amostras.

7 Ao meu irmão Rafael Bastos Alves, que mesmo distante se fez presente através do amor, amizade e cumplicidade, o que me deu forças para realização desta etapa. As minhas amigas Alinne Alice e Renata Filgueira, pelo carinho, apoio e amizade durante os momentos de convivência alegre fora da faculdade. A Tony, pelo incentivo, compreensão, carinho e boas energias transmitidas durante a realização deste trabalho. As minhas primas de sangue, irmãs de coração e colegas de profissão Nathália Bastos e Ludmila Alves, pelo carinho e apoio nos momentos difíceis. A minha grande família : tios, primos, sobrinhos e especial aos meus amados avós Geraldo e Lysia, que estiveram sempre na torcida por mim. A todos que de acreditaram em mim e de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.

8 Se as coisas são inatingíveis... ora! Não é motivo para não querê-las... Que tristes os caminhos, se não fora a mágica presença das estrelas! (DAS UTOPIAS Mário Quintana)

9 RESUMO O presente trabalho utilizou a cultura celular para analisar a capacidade de adesão de células mesenquimais da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de ratos a diferentes superfícies de titânio. Para tanto, foram utilizados discos de titânio grau II ASTM F86 nas dimensões de 15mm de diâmetro por 1,5mm de espessura, os quais receberam diferentes tratamentos de superfície em 2 grupos distintos (polido e nitretação a plasma por gaiola catódica). As células foram isoladas da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de ratos e cultivadas em meio de cultura meio básico α-mem contendo antibióticos e suplementado com 10% de FBS, por 72 horas, em atmosfera úmida com 5% de CO 2 a 37ºC. No subcultivo as células foram cultivadas em 1 placa de 24 poços, na densidade de 1 x 10 4 células por poço, onde os discos de titânio foram distribuídos de acordo com os grupos, incluindo-se controles positivos sem os discos de titânio. Após 24 horas de cultivo, as células foram submetidas a contagem em câmara de Neubauer. Os resultados analisados mostraram que tanto as células mesenquimais da medula óssea de camundongos como as células do ligamento periodontal de ratos tiveram melhor adesão à superfície controle. O número de células da medula óssea aderidas a superfície de Ti polido não foi estatisticamente significante quando comparado ao mesmo tipo celular aderido à superfície de Ti tratada por plasma na configuração de gaiola catódica, entretanto diferença significante foi encontrada entre o grupo controle e o grupo Ti polido. Com relação à adesão das células do ligamento periodontal, diferença significativa foi encontrada apenas entre as superfícies controle e as superfícies de Ti tratadas por plasma. No que diz respeito às comparações entre superfícies iguais com células diferentes, não foi observada nenhuma diferença estatisticamente significante. Portanto, conclui-se que o titânio é um bom biomaterial para a adesão de células mesenquimais e que as diferentes formas de tratamento de superfície dada ao material podem influenciar neste processo. Palavras-chave: Células mesenquimais; medula óssea; ligamento periodontal; titânio.

10 ABSTRACT The present experiment used cell culture to analyze the adhesion capacity of mouse mesenchymal bone marrow cells and rat periodontal ligament to different titanium surfaces. Grade II ASTM F86 titanium discs 15mm in diameter and 1.5mm thick were used and received 2 distinct surface treatments (polished and cathodic cage plasma nitriding). The cells were isolated from the mouse bone marrow and rat periodontal ligament and cultured in α- MEM basic culture medium containing antibiotics and supplemented with 10% FBS and 5% CO 2, for 72 hours at 37ºC in a humidified atmosphere. Subculture cells were cultured in a 24- well plate with a density of 1 x 10 4 cells per well. The titanium discs were distributed in accordance with the groups, including positive controls without titanium discs. After a 24- hour culture, the cells were counted in a Neubauer chamber. The results show that both the mouse mesenchymal bone marrow cells and rat periodontal ligament cells had better adhesion to the control surface. The number of bone marrow cells adhered to the polished Ti surface was not statistically significant when compared to the same type of cell adhered to the Ti surface treated by cathodic cage plasma nitriding. However a significant difference was found between the control and polished Ti groups. In relation to periodontal ligament cell adhesion, a significant difference was only found between the control and plasma-treated Ti surfaces. When comparing equal surfaces with different cells, no statistically significant difference was observed. We can therefore conclude that titanium is a good material for mesenchymal cell adhesion and that different material surface treatments can influence this process. Key words: Mesenchymal cells; bone marrow; periodontal ligament; titanium.

11 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Esquema básico de um equipamento para nitretação iônica (ALVES Jr, 1995). Figura 2. Equipamento para nitretação iônica. Figura 3. Esquema do equipamento para nitretação iônica em gaiola catódica (SOUSA, et al.2008). Figura 4. Corte das epífises ósseas. Figura 5. Extração da medula óssea. Figura 6. Rato Wistar. Figura 7. Incisivos no meio básico alfa-mem. Figura 8. Remoção do ligamento periodontal. Figura 9. Fragmentos de ligamento periodontal cultivados em tripsina. Figura 10. Suspensão centrifugada. Figura 11. Placa de cultura contendo meiobásico alfa-mem supletmentado com 10% de SFB. Figura 12. Suspensão centrifugada. Figura 13. Placa de cultura com discos e células. Figura 14. Esquema dos discos de titânio na placa de cultura de 24 poços. Figura 15. Adesão de células às diferentes superfícies de titânio. Figura 16. Adesão de células da medula óssea às diferentes superfícies de titânio. Figura 17. Adesão de células do ligamento periodontal às diferentes superfícies de titânio. Figura 18. Adesão de células às superfícies controle. Figura 19. Adesão de células à superfície Ti Polido. Figura 20. Adesão de células à superfície Ti Gaiola.

12 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Parâmetros de tratamento com plasma de nitrogênio. Tabela 2. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às diferentes superfícies. Tabela 3. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às superfícies Controle e Ti Polido. Tabela 4. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às superfícies Controle e Ti Gaiola. Tabela 5. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às superfícies Ti Polido e Ti Gaiola. Tabela 6. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às diferentes superfícies. Tabela 7. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às superfícies Controle e Ti Polido. Tabela 8. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às superfícies Controle e Ti Gaiola. Tabela 9. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às superfícies Ti Polido e Ti Gaiola. Tabela 10. Análise da adesão dos dois tipos celulares sobre a superfície controle. Tabela 11. Análise da adesão dos dois tipos celulares sobre a superfície controle Ti Polido. Tabela 12. Análise da adesão dos dois tipos celulares sobre a superfície Ti Gaiola. Tabela 13. Valores de rugosidade média (Ra) obtidas por profilômetro. Tabela 14. Valores da média e desvio padrão de molhabilidade.

13 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ABCG-2 - Marcador de células-tronco mesenquimais ALP- Fosfatase alcalina AOs - Osteoblastos alveolares α -MEM Meio essencial mínimo tipo alfa α-sma Actina de músculo liso tipo alfa ASTM Sociedade Americana de Análise e Padronização de Materiais β-fgf- Fator de crescimento fibroblástico beta BSP- Sialoproteína óssea β-tcp - Fosfato tricálcio beta ºC - Grau Celsus Cbfa-1 - Subunidade alfa 1 do fator de ligação ao core CD - Marcador de superfície celular CFU-F Unidades formadoras de colônias de fibroblastos c-kit - Marcador de células-tronco mesenquimais. cm 2 - Centímetro quadrado CO 2 - Gás carbônico Col I - Colágeno tipo I Col XII - Colágeno tipo XII CTM - Célula-tronco mesenquimal EDTA- Ácido etilenodiamino tetra-acético EGF- Fator de crescimento epidérmico FBS - Soro fetal bovino g - Grama GFAP Proteína glial ácida fibrilar GFs - Fibroblastos gengivais

14 H - Hidrogênio hescs - Células-tronco embrionárias humanas HNK1 - Marcador para células de cristas neurais indiferenciadas H 2 O 2 - Peróxido de hidrogênio hpdlf - Fibroblastos do ligamento periodontal humano I-11 - Interleucina-11 kgy - KiloGray L1 - Grupo de células do ligamento periodontal sobre superfície controle L2 - Grupo de células do ligamento periodontal sobre superfície de titânio polido L3 - Grupo de células do ligamento periodontal sobre superfície de titânio tratado M1 - Grupo de células da medula óssea sobre superfície controle M2 - Grupo de células da medula óssea sobre superfície de titânio polido M3 - Grupo de células da medula óssea sobre superfície de titânio nitretado ma - Miliampére Mbar - Milésimo de bar (pressão) MC3T3-E1 Linhagem de células osteoblásticas da calvária de embrião de camundongos MEV - Microscopia eletrônica de varredura MG-63 Linhagem de células osteoblásticas mg/l - Miligramas por litro ml- Mililitro mm - Milímetro mm - Milimolar mrna - Ácido ribonucleico mensageiro MUC18 - Marcador de células-tronco mesenquimais µl - Microlitro N - Nitrogênio

15 NFM - Neurofilamento M Oct-4 - Fator crítico transcripicional para manutenção da pluripotencialidade OCNE - Marcador de células-tronco mesenquimais OCN - Osteocalcina OP-CHEM - Tipo de pano de polimento OPG - osteoprotegerina OPN - Osteopontina OSC Osteocalcina Osteo-1- Linhagem celular p75 Proteína associada a células das cristas neurais indiferenciadas PBS - Tampão fosfato-salino PCNA Antígeno nuclear de proliferação celular PDL - Ligamento periodontal PDLFs - Fibroblastos do ligamento peridontal ph - Potencial hidrogeniônico Ra Parâmetro de rugosidade média RANKL Ligante do receptor ativador do fator nuclear Kappa rpm Rotação por minuto RTG - Regeneração tecidual uuiada RUNX-2 Fator de transcrição associado ao Runt sccm - Centímetro cúbico padrão por minuto (medida de fluxo de gás) SiC- Carbeto de silício Slug - Fator de transcrição associado à crista neural STRO-1 - Marcador de superfície de células-tronco mesenquimais Sox2 - Fator de transcrição Sox9 - Fator de transcrição

16 Ti - Titânio Ti6A14V - Liga de Titânio Twist - Fator de transcrição U-2 OS Linhagem de células osteoblásticas de ostessarcoma V -Voltz Vol. - Volume

17 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Células mesenquimais da medula óssea Regeneração periodontal Células mesenquimais do ligamento periodontal Osseointegração Titânio (Ti) Características superficiais e respostas celulares Tratamento de superfície Nitretação iônica OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos METODOLOGIA Preparo das amostras Protocolo de nitretação Caracterização das amostras Composição da camada Textura superficial Rugosidade Molhabilidade Esterelização das amostras Cultura de células Obtenção das células da medula óssea de camundongos Cultivo das células da medula óssea...43

18 4.4.3 Obtenção das células do ligamento periodontal de ratos Cultivo das células do ligamento periodontal Cultivo nos discos de Titânio Viabilidade e adesão celular Análise estatística RESULTADOS Resultados da análise de superfície Resultados de adesão celular Adesão das células da medula óssea de camundongos às diferentes superfícies Adesão das células do ligamento periodontal de ratos às diferentes superfícies Adesão de células da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de ratos à mesma superfície DISCUSSÃO CONCLUSÕES...58 REFERÊNCIAS...59 APÊNDICE...67 ANEXOS...69

19 1 INTRODUÇÃO As células mesenquimais indiferenciadas, ou células-tronco como são conhecidas, são células com grande capacidade de auto-renovação e de produzir pelo menos um tipo celular altamente especializado. Existem duas categorias de células-tronco: as células-tronco embriononárias pluripotentes que são procedentes do embrioblasto durante a fase de blástula do embrião e que são capazes de dar origem a todas as linhagens celulares do corpo; e a categoria de células unipotentes ou multipotentes, denominadas células-tronco adultas, que têm capacidade de dar origem a tipos celulares específicos (SOUZA et al., 2003). A maior vantagem do uso de células-tronco embrionárias é a sua capacidade de proliferação e de diferenciação em diversos tipos celulares. Contudo, existem desvantagens, como a sua instabilidade genética, a obrigatoriedade de sua transplantação para hospedeiros imunocomprometidos e o risco de formação de teratocarcinomas, além da questão ética. Já as células-tronco adultas apresentam a vantagem de serem autogênicas, não incorrendo em limitações morais, e responsivas aos fatores de crescimento inerentes ao hospedeiro. No entanto, também apresentam desvantagens, como o fato de não serem pluripotentes, a dificuldade de obtêlas, purificá-las e cultivá-las in vitro, além de sua presença em menor quantidade nos tecidos (SONG et al., 2004; SOARES, 2007). A principal fonte de células-tronco adultas é a medula óssea. Constituem uma pequena população celular, contudo, podem ser expandidas com alta eficiência e induzidas a se diferenciarem em múltiplas linhagens em condições de cultura definidas. Estas células têm a capacidade de se diferenciarem em células dos tecidos ósseo, adiposo, cartilaginoso e muscular, o que demonstra sua alta plasticidade. O interesse neste tipo celular cresceu vertiginosamente nos últimos anos devido ao seu grande potencial de uso na regeneração de tecidos e órgãos lesados (PITTENGER et al., 1999; ROSADA et al., 2003;, SHORT et al., 2003; BARRY, MURPHY, 2004). Inúmeros estudos também têm isolado células mesenquimais indiferenciadas derivadas dos tecidos orais, tais como polpa dentária (GRONTHOS, MANKANI, BRAHIM, 2000; GRONTHOS et al, 2002; MIURA et al., 2003; SHI, ROBEY, GRONTHOS, 2001; SHI, GRONTHOS, 2003; SLOAN, SMITH, 2007) e ligamento periodontal (SEO et al, 2004; CHEN et al., 2006; AKIZUKI et al. 2005; NAGATOMO et al., 2006; GRONTHOS et al, 2006). A identificação desta população celular nos tecidos dentais tem estimulado o interesse

20 no potencial regenerativo destas células e na sua aplicabilidade na engenharia tecidual, ou bioengenharia. A bioengenharia é usada para construção ou para regeneração dos tecidos injuriados ou perdidos, decorrentes de doenças degenerativas, trauma, câncer ou doença periodontal, tais como o tecido ósseo. Baseia-se na terapia celular envolvendo células mesenquimais associadas ou não aos biomateriais (SILVÉRIO et al., 2008). Dentre os biomateriais, diversos estudos têm mostrado que o titânio atualmente é considerado o biomaterial de escolha para a confecção de implantes osseointegrados em implantodontia e ortopedia, devido à característica osteocondutora e às propriedades mecânicas, estabilidade química e biocompatibilidade, que varia de acordo com o tratamento dado a esse metal. (AMARANTE, LIMA, 2001). Portanto, a natureza da superfície determina a resposta biológica ao redor do biomaterial e, como conseqüência, o sucesso da interação célula-superfície. A interação das células ao biomaterial pode ser dividida em três fases. Na primeira fase as células em contato com a superfície primeiramente se ligam, aderem e se espalham. Esta fase é a mais importante, pois a qualidade desta adesão influenciará na morfologia e na capacidade para proliferação e diferenciação das células. Durante a segunda fase, as células se proliferam e se diferenciam. Finalmente, durante a terceira fase, ocorre a deposição da matriz extracelular mineralizada. (KASEMO, 2002; ANSELME, 2000). Na busca por superfícies que melhoram a essa interação e supram à necessidade de obter uma boa adesão, e conseqüentemente uma maior proliferação e formação óssea, contribuindo para a osseointegração, vários métodos de tratamento de superfície têm sido utilizados, tais como: a aspersão com plasma de titânio, jateamento com óxido de titânio, deposição a laser de carbeto de titânio, condicionamento ácido, e outros (XUANYONG, 2004). Dentre os diferentes métodos, pode-se citar a nitretação iônica ou nitretação a plasma, um processo de introdução do elemento nitrogênio na superfície dos metais com o objetivo de alterar as propriedades superficiais desse material (COOPER, MASUDA,WHITSON, 1999; BRAMA, 2007). Devido ao importante papel das células mesenquimais nos processos de regeneração óssea e fixação dos implantes, o presente estudo busca avaliar a capacidade de adesão das

21 células mesenquimais da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de ratos às superfícies de titânio lisas e nitretadas por plasma na configuração de gaiola catódica.

22 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Células mesenquimais da medula óssea A medula óssea não é apenas o local onde ocorre a hematopoese na vida pós-natal, mas também é um reservatório de células-tronco adultas (CANCEDDA, BIANCHI, DERUBEIS, 2003) Um tipo específico de célula-tronco adulta é a célula-tronco mesenquimal (CTM) (PITTENGER et al., 1999; HU et al., 2002) também denominada de célula-tronco estromal da medula (BIANCO et al., 2001) ou apenas célula estromal da medula (PROCKOP, 1997). As células-tronco mesenquimais (CTM) foram isoladas pela primeira vez por Friedenstein e colaboradores no início da década 70, a partir de uma suspensão celular da medula óssea, e caracterizadas como células aderentes, fibroblastóide e clonogênica, sendo inicialmente denominadas de células formadoras de colônia fibroblastóides (CFU-F = colony forming units fibroblastic) (FRIEDENSTEIN et al., 1966) ou células mesenquimais estromais multipotentes, de acordo com a nova nomeclatura proposta pela Sociedade Internacional para Terapia Celular, em 2005 (HOROWITZ et al., 2005). Essas células mostraram ser multipotenciais e não apenas participam como estroma de mielosuporte, como também se diferenciam em linhagens mesodérmicas quando implantadas in vivo (OWEN, 1988). Atualmente, muitos estudos têm isolado as CTM e têm controlado, in vitro, a sua diferenciação em tecido cartilaginoso e ósseo, utilizando fatores de crescimento específico, com o objetivo de usar esta nova tecnologia no reparo de tecidos lesados de origem mesenquimal (PITTENGER et al., 1999; MARTIN et al., 2002; MEIRELES, NARDI, 2003). Além disso, células estromais da medula óssea também têm sido bastante utilizadas no reparo de grandes defeitos ósseos, através da associação com biomateriais e injeção sistêmica de células osteogênicas para o tratamento de doenças ósseas genéticas, como a osteogênese imperfeita (CANCEDDA, BIANCHI, DERUBEIS, 2003; SHANTI et al., 2007). As células-tronco mesenquimais podem se diferenciar em osteoblastos e promover mineralização quando cultivadas na presença de ácido ascórbico, betaglicerol fosfato e dexametasona (MAEDA et al. 2007). As células adquirem morfologia de osteoblastos, após 14 a 21 dias (KIM et al., 2004) com aumento da atividade da fosfatase alcalina, deposição de

23 uma matriz extracelular rica em cálcio (BARRY, MURPHY, 2004) e formação de cristais de hidroxiapatita (BARRY, 2003). Pesquisas recentes sinalizam para a possibilidade de implantação de tecido ósseo desenvolvido a partir de cultura de células-tronco do próprio paciente, diferenciadas em osteoblasto. A regeneração óssea guiada utiliza a implantação de células-tronco no local afetado, sem a necessidade de enxertos ósseos, usando um biomaterial como veiculo (BORDJI, 1996). A associação dos implantes de titânio com o tecido ósseo em cultura poderá contribuir para a engenharia tecidual e o sucesso na regeneração periodontal e osseointegração (FRAZOLIN et al. 2008). 2.2 Regeneração periodontal O reparo do aparato de inserção e sustentação do periodonto, destruído como resultado da progressão da doença periodontal, tem sido a meta principal da terapia periodontal. A regeneração periodontal busca a formação de novo cemento e novo osso alveolar além da nova inserção e reinserção das fibras do ligamento periodontal ao novo cemento e superfície radicular (BARTOLD et al., 2000). Desde a década de 70, inúmeras técnicas têm sido utilizadas a fim de interromper a progressão da doença e obter a reconstituição da arquitetura e função das estruturas de suporte perdidas. A terapia periodontal inclui raspagem e alisamento radicular, cirurgias para descontaminação e biomodificação da superfície radicular, enxertos, substitutos ósseos, biomateriais, fatores de crescimento e regeneração tecidual guiada (RTG) (POLIMENI, XIROPAIDIS, WIKESJO, 2006). Melcher, em 1976, sugeriu que o tipo de células que repovoam a superfície radicular após o tratamento cirúrgico periodontal determina a natureza da inserção que formará. A superfície radicular tratada pode ser repovoada por células epiteliais, células do tecido conjuntivo, células ósseas e células do ligamento periodontal. Foi sugerido também que a regeneração do periodonto envolve células progenitoras presentes no ligamento periodontal, capazes de se diferenciarem em fibroblastos, cementoblastos e osteoblastos. Baseada nestas hipóteses, a técnica de RTG tem como princípio biológico a exclusão celular seletiva através da utilização de uma barreira física interposta entre o retalho periodontal e a superfície radicular tratada. Seu objetivo é excluir o tecido conjuntivo, além

24 de desviar a proliferação epitelial da superfície radicular, criando um espaço protegido que poderá ser repovoado por células derivadas do ligamento periodontal, conduzindo assim a regeneração do periodonto (GOTTLOW, 1984; CAFESSE et al., 1988). Entretanto estas terapias são limitadas pela severidade da doença periodontal, tipo de defeito e por fatores locais e sistêmicos, dentre outros. Desta forma, busca-se uma nova terapia de reconstrução do periodonto destruído pela doença periodontal. Recentes técnicas de engenharia tecidual baseadas na biologia de células-tronco têm sido propostas para desenvolver tal terapia (NEEDLEMAN et al., 2006; HASEGAWA et al., 2005; GRONTHOS et al, 2006; FUJII et al., 2008). Desta maneira, o ligamento periodontal tem sido de fundamental importância no processo de reparo e regeneração do periodonto, uma vez que apresentam células como cementoblastos, osteoblastos, mifibroblastos, células endoteliais, células epiteliais e células nervosas, além de células progenitoras ou células mesenquimais indiferenciadas (célulastronco) que têm sido identificadas através de vários estudos (IVANOVSKI et al., 2006). 2.3 Células mesenquimais do ligamento periodontal O ligamento periodontal é um tecido conjuntivo frouxo interposto entre as superfícies radiculares dos dentes e a parede interna do osso alveolar. Suas fibras formam uma malha que se estende entre o cemento e osso e está firmemente ancorada pelas fibras de Sharpey. O ligamento periodontal une o dente ao osso alveolar propriamente dito, promovendo suporte, proteção, sensitividade, nutrição, homeostase e reparo (BEERTSENC, MCCULLOC, SODEK, 1997). O conceito de que células mesenquimais indiferenciadas podem estar presentes no ligamento periodontal foi inicialmente proposto por Melcher em 1976, o qual observou que estas células presentes no ligamento periodontal eram capazes de formarem fibroblastos, cementoblastos e osteoblastos A partir de então, a capacidade regeneradora das células do ligamento periodontal tem sido pesquisada através de vários estudos (BARTOLD, SHI, GRONTHOS, 2006). Seo et al. (2004) levantaram a hipótese de que o ligamento periodontal pode conter células indiferenciadas multipotentes que podem ser usadas para regenerar cemento e ligamento periodontal in vivo. Os autores isolaram células do ligamento periodontal de

25 terceiros molares extraídos de humanos, e analisaram através da imunohistoquímica para identificar marcadores de células-tronco. Quando transplantadas em ratos imunocomprometidos, as mesmas mostraram a capacidade de formar estruturas como cemento e ligamento e contribuir para o reparo tecidual periodontal. Os resultados da pesquisa mostraram que células do ligamento periodontal expressaram os marcadores de células-tronco mesenquimais: STRO-1 e CD146/MUC18. Em condições de cultura, células do ligamento periodontal diferenciaram-se em cementoblastos, adipócitos e fibroblastos. Vários antígenos de superfície celular têm sido usados como marcadores para célulastronco e são importantes para isolar essas células de outros tecidos. Chen et al. (2006) realizaram um estudo com o objetivo de identificar e localizar células indiferenciadas no ligamento periodontal humano sadio e doente usando marcadores de superfície celular para células mesenquimais (STRO-1, CD146 e CD44). Dentes afetados pela doença periodontal e sadios foram coletados, fixados em formal a 10%, descalcificados e embebidos em parafina para análise imunohistoquímica. Anticorpos contra STRO-1, CD146 e CD44 foram usados para identificar células-tronco no ligamento periodontal. Os resultados mostraram que células mesenquimais indiferenciadas foram identificadas tanto no ligamento de periodonto sadio quanto em doente. Akizuki et al. (2005) em um estudo piloto isolaram e cultivaram células do ligamento periodontal de pré-molares extraídos de cães e aplicaram essas células juntamente com condutor de ácido hialurônico em cinco defeitos ósseos criados cirurgicamente nas superfícies mesiais das raízes dos primeiros molares mandibulares de uma hemi-arcada de cada cão. A outra hemi-arcada foi usada como grupo controle, onde foram criados os mesmos defeitos e neles aplicados apenas condutor de ácido hialurônico. Após oito semanas, os animais foram sacrificados e os espécimes preparados a fim de avaliar histologicamente e histometricamente a cicatrização dos defeitos periodontais. Os resultados mostraram ausência de inflamação clínica ou recessão gengival em ambos os lados. No grupo experimental foi observada a cicatrização periodontal com formação de osso, ligamento periodontal e cemento em três dos cinco defeitos, e no grupo controle não foi constatada a formação de tecido periodontal, exceto em um defeito. A análise histométrica revelou que a formação de novo cemento no grupo experimental foi altamente significante quando comparada ao grupo controle. Deste modo, os autores concluíram que as células do ligamento periodontal têm o potencial de promover regeneração tecidual, sendo de grande importância para a terapia regenerativa.

26 Nagatomo et al. (2006) isolaram células do ligamento periodontal de pré-molares e terceiros molares extraídos de humanos a fim de verificar as propriedades de renovação, multiplicação e expressão de marcadores dessas células. Análise de fluorescência ativada revelou que essas células expressaram marcadores de células-tronco CD105, CD166, e STRO-1. Esses resultados sugerem que as células do ligamento periodontal incluem célulastronco mesenquimais juntamente com outras células progenitoras. Gronthos, Mankani e Brahim (2000) demonstraram que as células mesenquimais da polpa dentária expressavam a molécula de adesão celular CD106 (VCAM-1). Em 2003, Gronthos, Zannettino e Hay observaram que esta mesma molécula CD106 (VCAM-1) era expressa nas células-tronco da medula óssea. Em 2006, usaram uma estratégia de imunoseleção para purificar as células mesenquimais clonogênicas do ligamento periodontal de ovinos baseada na reatividade ao anticorpo que identifica o CD106. A positividade para este antígeno CD106 das células do ligamento periodontal de ovinos demonstrou a capacidade de formarem um agregado de células semelhantes a fibroblastos quando manipuladas em baixa densidade in vitro. A expanção ex-vivo dessas células exibiu alto grau de proliferação in vitro e expressaram um fenótipo (CD44+, CD166+, CBFA-1+, colágeno-i+, sialoproteína óssea+) consistente com células mesenquimais do ligamento periodontal de humanos, além da capacidade de regenerarem, tanto tecido mineralizado semelhante ao cemento, quanto ligamento periodontal, quando transplantadas em ratos imunocomprometidos. Kawanabe, Murakami e Yamamoto (2006) observaram que as células mesenquimais do ligamento periodontal exibiam um perfil funcional de células-tronco e expressavam ABCG-2 (um marcador usual de células-tronco) e Oct-4 (um fator crítico transcripicional para manutenção da pluripotencialidade), entretanto somente 3,9% das células do ligamento periodontal cultivadas exibiam tais características. Gay, Chen e Macdougall (2007) realizaram um estudo onde células do ligamento periodontal de humanos foram isoladas, marcadas para STRO-1 e separadas em meio de cultura com o objetivo de analisar sua capacidade de diferenciação em osso, cartilagem e tecido adiposo. Células da medula óssea foram usadas como controle nas mesmas condições de cultivo e indução. Os autores concluíram que as células do ligamento periodontal contêm células mesenquimais que têm o potencial de se diferenciarem em osteoblastos, condrócitos e adipócitos, semelhantes às células-tronco da medula óssea. Fujii et al. (2008) isolaram e cultivaram três linhagens celulares (linhas 1-4, 1-11 e 1-24) que expressam os marcadores celulares RUNX-2, Col I, ALP, OPN, OCN, RANKL,

27 OPG, escreráxe, periostina, Col XII, e α-sma mrna. A análise histoquímica demonstrou que o marcador celular CD146 foi expresso nas células das linhagens 1-4 e 1-11 e o STRO-1 foi expresso nas linhagens 1-11 e As células das linhagens 1-4 e 1-11 se diferenciaram em células osteoblásticas e adipócitos quando cultivadas em meio de diferenciação de linhagem específica. Quatro semanas depois das células da linhagem 1-11 serem transplantadas em ratos imunodeficientes com fosfato β-tricálcio (β-tcp), o transplante produziu tecidos semelhantes a cemento e osso ao redor do β-tcp. Oito semanas depois, as células 1-11 transplantadas formaram estruturas semelhantes ao ligamento periodontal na superfície do β-tcp. Estes resultados sugerem que as células da linhagem 1-11 eram derivadas das células progenitoras/ células mesenquimais do ligamento periodontal e pode ser bastante útil para estudar a biologia e regeneração do periodonto humano. Coura (2008) buscando verificar a possibilidade de o ligamento periodontal conter células mesenquimais cresto neurais, isolou e cultivou células do ligamento em dois grupos distintos (um com células do ligamento de 10 dentes de 7 indivíduos diferentes e outro grupo com células do ligamento de 4 dentes de um mesmo indivíduo). Após serem cultivadas em um meio indutivo específico e as analisadas através de imunohistoquímica, observou-se a presença de um marcador de células-tronco neurais e também marcadores para células cresto neurais indiferenciadas (HNK1, p75). Os resultados foram similares nos dois grupos, sugerindo evidências de que o ligamento periodontal humano em adição a derivados mesodermas, produzem células semelhantes às células cresto neurais. Lin et al. (2008) realizaram um estudo a fim de identificar e localizar células mesenquimais indiferenciadas em biópsias em bloco e em cultura de expansão celular dos tecidos periodontais humanos regenerados. Para tal, foi utilizada a técnica de regeneração tecidual guiada com membranas em defeitos de furca e superfície dentária dos terceiros molares de humanos voluntários. Após o período de cicatrização de 6 semanas, os dentes e os tecidos ao seu redor (tecidos regenerados e osso alveolar) foram removidos cirurgicamente para o preparo das amostras em bloco as quais foram processadas para análise imunohistoquímica, e para obtenção de células para cultura. Os marcadores de células-tronco mesenquimais STRO-1, CD146 e CD44 foram utilizados para identificar as células. Culturas celulares obtidas dos tecidos regenerados foram analisadas pela citometria fluida, e os resultados revelaram positividade para tais marcadores. Mineralização, concentração de cálcio e potencial adipogênico das células dos tecidos regenerados foram acessados e comparados com as células mesenquimais do ligamento periodontal, células-tronco da medula óssea e

28 fibroblastos gengivais. Os resultados mostraram a capacidade desses tecidos formarem depósitos minerais e adipócitos. Entretanto, o nível de mineralização das células do tecido regenerado foi mais baixo que o de células mesenquimais do ligamento periodontal e de células-tronco da medula óssea. Considerando que as células do ligamento periodontal são muito importantes para o processo de regeneração dos tecidos periodontais devido a sua localização e suas propriedades de células indiferenciadas, e que a interleucina-11 (I-11) é uma citocina multifuncional que participa ativamente do metabolismo ósseo, Leon et al. (2006) realizaram um estudo para examinar o efeito da I-11 na diferenciação osteoblástica das células do ligamento periodontal de humanos. As células do ligamento periodontal cultivadas foram estimuladas com I-11 e/ou ácido ascórbico, com ou sem inibidores para o colágeno tipo 1. A diferenciação osteoblástica foi analisada pela atividade de fosfatase alcalina e expressão gênica do marcador RUNX2, ostocalcina e sialoproteína óssea utilizando a cadeia de reação da polimerase transcripção reversa. O colágeno tipo 1 e o tecido inibidor da produção da metaloproteinase-1 foram medidos usando imunoensaios ligados à enzimas. Os resultados mostraram que a I-11 aumentou a atividade da fosfatase alcanina e do marcador RUNX2, e que na presença de ácido ascórbico, aumentaram a osteocalcina e expressão gênica da sialoproteína óssea. A I-11 induziu a produção de células do ligamento periodontal pelo colágeno tipo 1 e o tecido inbidor da metaloproteinase-1. Os autores concluíram que a interleucina-11 e/ou o ácido ascórbico induzem a diferenciação osteoblástica das células do ligamento periodontal através da produção de colágeno tipo 1. Os resultados também sugerem que a I-11 pode funcionar como uma citocina osteopromotora, estimulando a diferenciação osteoblástica das células do ligamento periodontal principalmente através da síntese de colágeno tipo 1 e possivelmente pela indução do tecido inibidor da metaloproteinase-1. Isaka et al. (2001) realizaram um estudo a fim de determinar se as células do ligamento periodontal tinham um papel importante no reparo ósseo durante o processo de regeneração periodontal. Para tal, foi investigada, in vitro, a expressão de fenótipo osteoblástico, tal como atividade da fosfatase alcalina, paratireóide hormônio-dependente 3`e acúmulo de adenosina monofosfato cíclica 5 utilizando células isoladas do ligamento periodontal e células isoladas da mandíbula de cães. As raízes de pré-molares extraídos de cães foram divididas em grupos: grupo PDL(+), no qual o ligamento periodontal foi preservado e grupo PDL(-), no qual o ligamento periodontal foi removido. Essas raízes foram respectivamente transplantadas em defeitos ósseos criados cirurgicamente e cobertas com

29 uma membrana biológica. Seis semanas após o transplante, os resultados mostraram o fenótipo osteoblático em ambas as culturas de células ósseas e do ligamento. Um nova inserção de tecido conjuntivo foi observada somente no grupo PDL(+), entretanto o osso alveolar foi quase completamente regenerado em ambos os grupos PDL(+) e PDL(-) e a quantidade de novo osso formado não foi estatisticamente diferente entre os grupos. Os autores concluíram que as células do ligamento periodontal de cães demonstravam a capacidade de se diferenciarem em linhagem de células osteobláticas e contribuírem para a regeneração periodontal. Inanç, Elçin e Elçin (2007) investigaram o potencial de diferenciação de células-tronco embrionárias (hescs) quando co-cultivadas com fibroblastos do ligamento periodontal (hpdlf). Após serem expandidas e caracterizadas morfologicamente e imunohistoquimicamente, hesc foram co-cultivadas com hpdlf por 28 dias. Dois grupos foram determinados: (i) grupo de indução osteogênica com ácido ascórbico, β-glicerofosfato e dexametazona contendo as hesc num meio de diferenciação; e (ii) grupo de diferenciação espontânea com as hesc também num meio de diferenciação. Mudanças morfológicas nas células foram analisadas em um microscópio invertido, e a himunohistoquímica foi realizada em espécimes fixados nos dias 1 e 28 usando anticorpos para fosfatase alcalina, osteonectina, osteopontina, sialoproteína óssea (BSP), e osteocalcina (OSC). A reação em cadeia da polimerase transcriptase reversa foi utilizada para a detecção da ligação octamérica da proteína 4, BSP, e o nível de expressão da OSC no mrna. A mineralização foi observada usando Alizarin Red, e as mudanças na superfície nas colônias foram demonstradas com microscopia eletrônica de varredura. Os resultados indicaram a viabilidade da diferenciação osteogênica das hescs em co-cultura com hpdlf, e sugeriram o papel dos fibroblastos do ligamento periodontal no modelo de diferenciação. Os autores concluíram que avanços neste campo podem permitir a aplicação das hescs na da engenharia tecidual periodontal, envolvendo regeneração óssea em áreas de destruição decorrente da doença periodontal. Ohta et al. (2008) criaram cavidades dentinárias nas raízes mesiais dos primeiros molares de ratos, os quais formam sacrificados 1, 3, 5, 7 e 14 dias após a cirurgia. Em cada um destes tempos de sacrifício, as secções foram marcadas histoquimicamente para CD44s, CD34, c-kit, OCNE, cbfa-1 e 5-bromo-deoxiuridina usando anticorpos primários. Para análise morfométrica, os níveis de Cbfa-1 e PCNA células positivas foram calculados de um número total de células positivas/ 10 4 µ 2 nas cavidades. Os resultados obtidos mostraram que células positivas para 5-bromo-2-deoxiuridina foram observadas no ligamento periodontal e

30 tinham migrado para áreas de cicatrização. Um pequeno número de células positivas para CD44s-, CD34- e c-kit- foram observadas na medula óssea, mas nada foi observado no ligamento periodontal. Células positivas para CD44s- foram observadas somente em cavidade do osso alveolar no 5 dia após a cirurgia. Células positivas para CD23- e c-kit- foram observadas somente na cavidade dentinária no 7 dia após a cirurgia. Os valores de Cbfa-1 e PCNA tenderam a mostrar um aumento no 7 dia após a cirurgia. Os autores puderam concluir que células-tronco mesenquimais e células-tronco hematopoiéticas na medula óssea não estão envolvidas na regeneração do periodonto. Células que migraram do ligamento periodontal residual regeneraram novo osso alveolar num estágio mais cedo, e a regeneração ao redor da dentina nas cavidades foi mais tardia que nas outras partes. Seo et al. (2005) utilizaram o ligamento periodontal de humanos para testar a hipótese que o ligamento periodontal criopreservado conteria células-tronco pós-natais recuperáveis. Estas células mesenquimais indiferenciadas do ligamento periodontal preservadas pelo frio mantiveram as características normais das células mesenquimais do ligamento periodontal, incluindo a expressão do marcador de superfície celular STRO-1, a formação de colônias celulares, o potencial de diferenciação, a formação de cemento e tecido de regeneração semelhante ao ligamento periodontal, além de um cariótipo diplóide normal. Este estudo demonstrou que as células-tronco pós-natal podem ser recuperadas a partir de células do ligamento periodontal criopreservadas. Promovendo, desta forma, uma acessível prática clínica para a utilização de tecidos congelados para isolamento de células-tronco e regeneração tecidual. Silvério et al.(2008) realizaram um estudo de revisão da literatura focando na caracterização in vitro e in vivo das células mesenquimais derivadas de tecidos dentais, e seu potencial para promover regeneração dos tecidos periodontais. Os primeiros resultados enfatizaram a necessidade de investigações adicionais para determinar a eficácia da expansão ex-vivo de células mesenquimais no reparo das estruturas dentais e tecidos periodontais. Mesmo com as limitações de cada estudo, as células mesenquimais indiferenciadas do ligamento periodontal mostraram uma habilidade de formarem estruturas semelhantes ao cemento radicular e ligamento periodontal. Contudo, como estas células são heterogêneas devido a sua capacidade de se proliferarem e se diferenciarem em células formadoras do tecido periodontal, mais estudos são necessários para investigar a função destas células no processo de regeneração. Além disto, células percursoras do folículo dental humano de terceiros molares podem ser no futuro, geneticamente modificada in vitro então elas estarão

31 hábeis para se diferenciarem em células do tecido periodontal antes de serem transplantadas in vivo. Apesar de novos estudos serem necessários para colocar em prática estas terapias alternativas, neste momento o melhor entendimento das células-tronco e seus possíveis papéis na regeneração tecidual podem ajudar a desenvolver novas abordagens para um tratamento mais previsível dos defeitos periodontais. Trubiani et al. (2008) utilizaram células mesenquimais indiferenciadas do ligamento periodontal de humanos que foram induzidas a osteogênese, semeadas em arcabouços tridimensionais biocompatíveis (esponja de fibrina, substitutos de derivados ósseos) e examinadas usando microscopia de luz e eletrônica de varredura e transmissão. Observações morfológicas mostraram crescimento extensivo da biomassa celular cobrindo parcialmente os arcabouços após 4 semanas de incubação no meio de mineralização. Estes resultados indicaram que o ligamento periodontal pode ser facilmente e eficientemente uma fonte autológa de células mesenquimais indiferenciadas com uma grande capacidade de expansão e habilidade de se diferenciarem em células osteogênicas que podem colonizar e crescerem conectadas ao arcabouço biocompatível. Células-tronco adultas multipotentes têm sido isoladas de vários tecidos não neurais. Techawattanawisal et al. (2007) relataram pela primeira vez o isolamento de células mesenquimais indiferenciadas derivadas do ligamento periodontal com características de células-tronco neurais primitivas. Células mesenquimais multipotentes do ligamento periodontal de ratos foram cultivadas utilizando sistema de cultura formadora de neurosferas. As células foram dissociadas enzimaticamente e cultivadas em meio básico livre de soro contendo EGFe β-fgf. Esferas livres expressando, GFAP e vimentina foram formadas em 7 dias de cultura. Em adição, as esferas expressaram RNAm de fatores de transcripção associados à crista neural: Twist, Slug, Sox2 e Sox9. As esferas derivadas do ligamento periodontal diferenciaram-se em miotubos multinucledos, células semelhantes a neurônios NFM-positivas, células semelhantes a astrócitos e a oligodentrócito Análise da formação de colônias de metilcelulose revelou que uma simples célula do ligamento periodontal poderia formar uma esfera numa freqüência e aproximadamente 0,01 % do total de células. Estes dados indicam que as esferas derivadas do ligamento periodontal contêm células-tronco adultas multipotentes capazes de se diferenciarem em ambas as linhagens neural e mesodermal, o que sugere que o ligamento periodontal pode ser uma nova fonte de célulastronco adultas multipotentes, e estas células possam ser usadas no tratamento de várias doenças tais como doenças neuronais degenerativas e distrofia muscular.

32 Zhou et al. (2008) investigaram a diferença dos marcadores de superfície celular em diferentes células periodontais, tais como osteoblastos alveolares (AOs), fibroblastos do ligamento peridontal (PDLFs) e fibroblastos gengivais (GFs), e seus potencias de diferenciação em fenótipos osteogênicos e adipogênicos. Estas células periodontais foram isoladas e a expressão padrão do antígeno de superfície foi analisada pela citometria fluida e as caracterizações moleculares e hitológicas das induções osteogênicas e adipogênicas foram monitoradas pela reação de cadeia da transcriptase reversa, Western blot e imunocitohistologia. Os resultados mostraram que os fenótipos celulares dos AOs foram verificados pela alta expressão de CD29 e CD49a, enquanto PDLFs mostraram distintivamente baixos níveis de CD63 e CD73. Em indução adipogênica, limitados AOs formaram células semelhantes a adipócitos de formato cúbico, enquanto PDLFs formaram células semelhantes a adipócitos fusiformes. Todos os três tipos celulares expressaram genes osteorelacionados a linha de base. Os AOs demonstraram maior habilidade osteogênica, seguidos dos PDLFs e GFs. Através deste estudo, pôde-se concluir que células no osso alveolar e ligamento periodontal possuem progenitoras osteogênicas e adipogênicas, indicando a possibilidade de sua aplicação para regeneração dos tecidos periodontais. Choi (2000), em um estudo piloto, cultivaram células do ligamento periodontal de cães e investigaram se essas células eram capazes de formar uma nova inserção do ligamento periodontal quando utilizadas sobre a superfície de implantes de titânio. Os implantes com as células cultivadas do ligamento periodontal foram colocados nas mandíbulas dos cães. Após 3 meses de cicatrização, o exame histológico revelou que em algumas superfícies do implante, uma camada com tecido semelhante ao cemento com inserção de fibras colágenas tinha sido alcançada.estes resultados demonstraram que células cultivadas do ligamento periodontal podem formar tecidos semelhantes a um verdadeiro ligamento periodontal ao redor do titânio, o qual têm sido o biomaterial mais utilizado atualmente em implantodontia através do processo de osseointegração.