Western Blot. 1. Introdução. 2. Extração e quantificação de proteínas. 3. Fracionamento de proteínas

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1 Western Blot 1. Introdução A técnica de western blotting (Towbin et al. 1979; Burnette 1981; Towbin and Gordon 1984) também pode ser denominada protein immunoblot e consiste na detecção de proteínas específicas em amostras de lisados celulares ou de tecidos. Os passos para a elaboração dessa técnica pode ser resumida em cinco etapas: (1) extração e quantificação das proteínas; (2) fracionamento das proteínas da amostra em um gel de poliacrilamida; (3) transferências dessas proteínas para uma membrana; (4) incubação da membrana com um anticorpo para detectar a proteína específica a ser analisada; e (5) revelação dessa membrana para análise dos dados. 2. Extração e quantificação de proteínas Para realização dos experimentos de western blotting é necessário, inicialmente, realizar a extração e a quantificação das proteínas. Diversos métodos espectroscópicos são utilizados para quantificar proteínas em uma solução. O ensaio de Bradford é o mais utilizado e apresenta diversas vantagens em relação aos demais, como rapidez, não exige aquecimento e alta sensibilidade para baixas concentrações de proteínas. O método de Bradford se baseia na mudança de cor do corante Coomassie Blue G-250 em solução ácida (cor avermelhada) para cor azulada na presença de proteínas. As interações hidrofóbicas e iônicas estabilizam o complexo proteína-corante. Para quantificar a concentração de proteínas na amostra deve-se fazer uma curva de padronização com concentrações conhecidas de uma proteína (comumente se utiliza soroalbumina bovina, BSA) versus absorbância em 595 nm (comprimento de onda que o complexo proteína-corante absorve). A partir dessa curva obtém-se a equação de ajuste linear na qual é possível substituir os valores médios de absorbâncias das amostras, obtendo-se assim os valores da concentração das proteínas. É importante ressaltar, que para uma maior confiabilidade dos resultados, o coeficiente de correlação linear deve ser maior que 0, Fracionamento de proteínas Para separar as proteínas de uma amostra homogênea, a técnica mais utilizada é a eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Inicialmente prepara-se o gel de SDS-poliacrilamida, que será uma matriz inerte através da qual as proteínas poderão migrar. O gel é preparado pela polimerização de monômeros de acrilamida e o tamanho dos poros do gel pode ser ajustado variando a concentração da acrilamida adicionada para retardar a migração da sua proteína de interesse. As proteínas podem possuir cargas positivas ou negativas, dependendo das cargas dos aminoácidos que as compõem. É utilizado, então, o SDS (sodium dodecyl sulfate), um poderoso detergente carregado negativamente, que se liga nas regiões hidrofóbicas das moléculas de proteínas mascarando a carga intrínseca, e permitindo que as proteínas migrem em direção ao polo

2 positivo em um campo elétrico. Além disso, o SDS quebra as ligações não covalentes das proteínas, fazendo com que elas voltem a sua estrutura primária, liberadas da associação com outros monômeros ou outras proteínas e moléculas de lipídeos. Além disso, usa-se, geralmente, um agente redutor tal como o β-mercaptoetanol, que quebra as ligações dissulfito (S-S) dos resíduos de cisteína que promovem a ligação de proteínas a outros monômeros, outras proteínas ou mesmo a estrutura terciária da mesma proteína, mantendo assim, as proteínas separadas e linearizadas (Figura 1a). A partir dessas condições, proteínas de um mesmo tamanho tendem a correr em um gel de poliacrilamida, na presença de um campo elétrico com as mesmas velocidades, uma vez que (1) suas estruturas nativas encontram-se completamente desnaturadas devido ao SDS e ao β- mercaptoetanol fazendo com que suas formas sejam as mesmas e, (2) elas se ligam na mesma quantidade de SDS e portanto tem a mesma quantidade de cargas negativas (Figura 1b, c). A técnica de SDS-PAGE é largamente utilizada, pois é capaz de separar todos os tipos de proteínas, mesmo aquelas que são normalmente insolúveis em água (como por exemplo muitas proteínas de membranas). Além disso, como as proteínas são separadas por tamanho, é possível estimar o peso molecular e a composição das subunidades da proteína. Essas proteínas podem ser visualizadas diretamente no SDS-PAGE por coloração direta do gel, por corantes como o Comassie-Blue ou por tratamentos com nitrato de prata. O nitrato de prata é um dos métodos mais sensíveis de detecção, que permite a visualização de proteínas de até 10ng, enquanto que a coloração por Coomassie-Blue

3 detecta proteínas de até 300ng. A Figura 2 representa proteínas coradas com Coomassie- Blue e com Nitrato de Prata. 4) Transferência para membrana Embora seja essencialmente uma técnica analítica, o SDS-PAGE somente não permite a análise de proteínas individuais e separadas. Para que isso seja possível é necessário utilizar anticorpos específicos para a proteína desejada, mas antes, é preciso que essas proteínas estejam em um suporte sólido, como membranas de nitrocelulose, PVDF ou de catiônicas de nylon. Essa transferência das proteínas do gel para a membrana inicialmente era feita por meio da capilaridade, mas atualmente usa-se a transferência eletroforética que é muito mais rápida e eficiente (Figura 3).

4 Existem três tipos de membranas usadas para western blotting: de nitrocelulose, nylon ou PVDF (polyvinylidene fluoride). Diferentes proteínas podem se ligar com eficiências diferentes nessas membranas, e particulares epítopos antigênicos podem ser melhor preservados em um tipo em relação a outro. Os detalhes de cada tipo de membrana podem ser visualizados na Tabela 2.

5 Depois de terminado o tempo de aplicação da corrente elétrica, usa-se um corante denominado Ponceau S para confirmar a transferência das proteínas para a membrana, e verificar se essa transferência ocorreu de maneira igual para todas as amostras. Em caso afirmativo, pode ser dada continuidade ao experimento de western blotting. 5) Detecção da proteína específica Para visualizar uma proteína de interesse é utilizado um anticorpo específico que vai reagir com um epítopo da proteína, formando um complexo anticorpo-antígeno. Esse anticorpo é denominado anticorpo primário, pode ser policlonal (reconhece mais de um epítopo) ou monoclonal (reconhece apenas um epítopo da proteína de interesse) e é produzido geralmente em camundongo ou em coelho. Além disso, esse anticorpo não possui nenhum tipo de radiomarcação, ou conjugação com alguma enzima. A incubação da membrana com o anticorpo primário geralmente ocorre overnight a 4ºC e, depois disso, a membrana é lavada intensamente com tampão de lavagem para retirar todo o anticorpo que não está especificamente ligado à proteína de interesse. Depois da lavagem, a membrana é incubada com um anticorpo secundário. Esse anticorpo é um anti-igg, ou seja, é um anticorpo que reconhece um anticorpo. Por exemplo, se foi utilizado um anticorpo primário anti uma proteína de interesse, produzido em camundongo, será utilizado um anticorpo secundário anti-igg de camundongo, que reconhecerá qualquer anticorpo produzido em camundongo. Esse anticorpo secundário possui alguma modificação que permitirá a visualização da proteína de interesse. As principais modificações utilizadas atualmente são (Figura 4): a) Conjugação do anticorpo com uma enzima: tais como peroxidade ou fosfatase alcalina. Neste caso, no momento da revelação da membrana, adiciona-se um substrato dessa enzima. Nos locais onde essa enzima está presente (apenas nos locais onde tem o anticorpo primário, ou seja, na proteína específica), ocorrerá a reação e a formação do produto dessa reação. É utilizado um filme, e aparecerá a marcação nas regiões em que ocorreu essa reação, permitindo localizar a proteína de interesse.

6 b) Associação do anticorpo com um fluoróforo: que será posteriormente excitado com um laser de comprimento de onda específico para esse fluoróforo, e então as regiões onde o anticorpo se ligou serão evidenciadas.

7 Metodologia 1. Extração e Quantificação de proteínas 1.1. Protocolo de extração de proteínas totais 1. Coletar células a g, 5 min, 37ºC; 2. Ressuspender pellet de células em tampão de lise composto por 20 mm HEPES ph 7.9, 20% glicerol, 200 mm KCl, 0.5 mm EDTA, 0.5% NP-40, 0.5 mm DTT, 1% coquetel de inibidor de protease; 3. Sonicar as células ressuspendidas 3 vezes no nível 3, com tempos de pulso de 10s, separados por 1 minuto de intervalo; 4. Centrifugar lisado a g, por 10 min, a 4ºC. Retirar o sobrenadante (extrato total de proteínas) Protocolo de quantificação de proteínas totais pelo método de Bradford. O ensaio de Bradford será realizado em placa de ELISA de 96 poços, consistindo num volume final de 200 ul para cada poço da placa. 1. Prepara solução estoque de BSA 10 mg/ml. Diluir 10 vezes a solução para efetuar as diluições para preparar a curva de calibração. 2. Preparar curva padrão com as seguintes concentrações de BSA: 0,125 ug/ml; 0,25 ug/ml; 0,5 ug/ml; 0,75 ug/ml; e 1,0 ug/ml. Diluir BSA em tampão de extração de proteínas. Aplicar 5ul de amostra de proteína na placa. 3. Após aplicar as amostras de proteína na placa, em triplicata, adicionar 195 ul de reagente Bradford. Lembrar-se de aplicar o branco, no caso o tampão de extração de proteínas (seguir mesma mistura que as proteínas: 5 ul de tampão ul de reagente Bradford). 4. Incubar as amostras, sob leve agitação, por 5 minutos. 5. Efetuar leitura da absorbância no comprimento de onda de 595 nm em espectrofotômetro. 6. Construir curva de padronização, com as concentrações de BSA na abscissa e as absorbâncias médias na ordenada. Plotar no Excel, obtendo equação de ajuste linear. 7. Medir a absorbância da amostra do extrato total de proteína (média das triplicatas) e estimar o valor da concentração de proteínas na amostra (variável x ) substituindo o valor da absorbância na equação linear resultante da curva padrão (variável y ).

8 2. GEL SDS-PAGE 2.1. Preparo dos géis - Vortexar o tubo contendo o gel, e depositar a solução até 5,5 cm. - Após depositar o gel de migração, adicionar isopropanol utilizando pipeta até completar altura de aproximadamente 0,5 cm acima da marcação. - Deixar polimerizar por aproximadamente 15 minutos - Eliminar o isopropanol lavando com água destilada e secar com papel Watmann. - Adicionar TEMED/PSA no gel de empilhamento e por em cima do gel de migração. - Colocar o pente referente ao tamanho do espaçador e polimerizar por 15 minutos. - Retirar o pente e transferir as placas para o suporte branco com a face da placa menor voltada para o interior do suporte. Marcar a base dos pocinhos com caneta. - Introduzir o cassete montado dentro do rack e em seguida fechar as abas. - Lavar os pocinhos com tampão de corrida (tampão de corrida 1X e SDS 1%) Preparo das Amostras - Pré-aquecer o Sample Buffer 5x em banho-maria 37 C - Tomar uma alíquota de 475 µl de tampão e adicionar 25 µl de 2-Mercaptoetanol. - Diluir o tampão com a amostra na proporção 1:4, e aquecer por 3-5 min a 95 C - Carregar as amostras e o marcador de peso molecular no gel Corrida - Colocar o cassete na cuba e preencher com o tampão de corrida. - Correr em 100 Volts até a amostra percorrer todo o gel de empilhamento

9 - Passar para 150 Volts para correr pelo gel de migração durante aproximadamente 60min (o tempo de migração é relativo podendo variar de acordo com a concentração do gel de migração e tamanho da banda de interesse). 3. Western 3.1. Montagem do Sandwich - Cortar a Membrana de Nitrocelulose nas dimensões do gel. Cortar 6 papéis Whatmann do mesmo tamanho (gerar a força de capilaridade). - Umedecer a superfície da plataforma inferior do Aparelho Transferidor com o Tampão de Transferência. - Encharcar 3 papéis Whatmann em Tampão de Transferência e acomodá-los sobre a superfície do Aparelho Transferidor. - Hidratar a membrana em Tampão de Transferência durante 2 minutos e colocá-la sobre os papéis Whatmann. Rolar levemente uma pipeta de vidro sobre o pré-sandwich para eliminar possíveis bolhas. - Desmontar a cuba de eletroforese e desacoplar as placas de vidro; com o auxílio de uma espátula, separar as duas placas de vidro para retirar o gel. Molhar as pontas dos dedos com o Tampão de Transferência e transferir o gel para o sandwich depositando-o sobre a membrana. Colocar os 3 papéis Whatmann umedecidos sobre o gel e eliminar as bolhas. - Umedecer a superfície da plataforma superior do Transferidor e fechar o aparelho Transferência - Aplicar uma corrente constante segundo as recomendações do equipamento usado. - Após esse tempo, remover os papéis Whatmann sem mover o gel e verificar se a transferência funcionou erguendo o canto do gel onde foi carregado o Marcador de Peso Molecular. - Caso as bandas do Marcador de Peso Molecular não tenham sido transferidas para a membrana, remontar o sandwich e continuar a transferência por um período maior. - Caso tenha transferido, as bandas do Marcador serão bem visualizadas na membrana. Transferir a membrana para um recipiente contendo água destilada. - Enxaguar o excesso de sal e adicionar a Solução Vermelha de Ponceau. Deixar agir durante 15 segundos e recuperar a solução. Enxaguar várias vezes com água destilada até que as amostras em cada canaleta sejam visualizadas.

10 - Enxaguar uma última vez com Tampão de Lavagem até que o Ponceau tenha desaparecido completamente Bloqueio - Descartar a solução do Tampão de Lavagem e adicionar um volume de Tampão de Bloqueio suficiente para deixar o gel imerso. - Deixar a membrana bloqueando sob leve agitação (orbital) durante 30 minutos a 1 hora. O tempo de bloqueio depende da especificidade de cada anticorpo primário. Em todos os casos, 1 hora pode ser o tempo inicial para testar anticorpos novos Incubação com o Anticorpo Primário - Descartar a solução do Tampão de Bloqueio e enxaguar rapidamente a membrana com água destilada para remover o excesso de leite. - Adicionar 10 ml da Solução do Anticorpo Primário. (200mg de BSA + 10mL de tampão de lavagem + Anticorpo). O Anticorpo primário deve ser diluído segundo as recomendações do fabricante, porém pode ser necessário padronizar esta diluição. - Vedar o recipiente com veda-filme e incubar a membrana overnight sob leve agitação orbital a 4oC. (Obs: pode incubar por um tempo menor, devendo ser ajustado conforme o anticorpo) Incubação com o Anticorpo Secundário - Recuperar a Solução do Anticorpo Primário e lavar a membrana com aproximadamente 30 ml de Tampão de Lavagem de acordo com os tempos: 2 X rápido, 2 X 15 min, 2 X 5 min. quim - Adicionar 10mL da Solução do Anticorpo Secundário. Se esse anticorpo for de de Tampão de Bloqueio. - Descartar a Solução do Anticorpo Secundário e lavar a membrana com aproximadamente 30 ml de Tampão de Lavagem de acordo com os tempos definidos abaixo: 2 X rápido, 2 X 15 min, 2 X 5 min. - Preparar a membrana para revelação Revelação - Scanear a membrana no aparelho Odyssey (Licor) no comprimento de onda que excitar o fluoróforo associado ao anticorpo secundário utilizado no experimento (700 ou 800nm).

11 Material Suplementar Proliferation Signaling Pathway Cell Cycle and Mitosis Mitosis and Cell Division What is Cancer? How Cells Divide and How Chemotherapy Works Aurora Kinases ABCAM Western Blot Video Protocol