AVALIAÇÃO DE METODOLOGIAS PARA DETECÇÃO DE OVOS DE HELMINTOS NO LODO E DETERMINAÇÃO DO PERCENTUAL DE RECUPERAÇÃO

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1 AVALIAÇÃO DE METODOLOGIAS PARA DETECÇÃO DE OVOS DE HELMINTOS NO LODO E DETERMINAÇÃO DO PERCENTUAL DE RECUPERAÇÃO Wilma Maria Coelho* Saneamento de Goiás S/A - Bióloga/Biomédica mestre em Parasitologia Eraldo Henriques de Carvalho Escola de Engenharia da Universidade Federal de Goiás José Luis de Barros Araújo Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás End. Saneamento de Goiás S/A Av. Santos Dumont, Bairro Negrão de Lima, nº 1957 Goiânia Goiás Brasil - Tel/fax. 0055(62) (62) / conagua@netgo.com.br RESUMO O presente trabalho consistiu em modificar algumas etapas do método de Yanko (1987) apud SOCCOL et al (1998), para aumentar a sua eficiência de recuperação de ovos de helmintos. Foram efetuadas adaptações importantes no método de Yanko tradicional consorciando etapas do método de Bailenger (AYRES et al., 1996) e Leeds I (AYRES et al., 1991). Estas adaptações permitiram encontrar ovos de Taenia sp cuja densidade é de 1,30 o que não ocorria no método de Yanko tradicional utilizando solução de ressuspensão de ovos com densidade de 1,18. A taxa de recuperação do método aumentou consideravelmente quando observou-se além da parte líquida (sobrenadante), conforme descrito no método tradicional de Yanko (1987), também a parte do sedimento (resíduo) da amostra conforme ensaios deste trabalho. Em teste com amostra de água limpa isenta de sólidos, ou seja, apresentando 0,0 ml/l/h de sólidos sedimentáveis a recuperação foi de 62,62%, assim distribuída: 42,48% obtido na parte líquida e 20,14% no resíduo da amostra. Em experimento com amostra de lodo apresentando 100 ml/l/h de sólidos sedimentáveis, o percentual de recuperação foi de 43,15% (29,27% parte líquida e 13,88% parte do resíduo). Palavras Chave: metodologia; ovos de helmintos; lodo. INTRODUÇÃO Os trabalhos caracterizando a condição parasitológica das águas superficiais e efluentes de estações de tratamento de esgotos são muitos e há pouco tempo as pesquisas têm avançado com estudos de caracterização parasitológica do lodo. A densidade de patógenos presente no lodo de esgoto de uma determinada localidade é bastante variável e depende das condições sócio-econômicas da população, da região geográfica e do tipo de tratamento a que o esgoto e o lodo foram submetidos. O conhecimento dos agentes patogênicos, da sua viabilidade e de sua sobrevivência no lodo, permite avaliar o potencial de risco de infecção a que o homem e outros animais da localidade estão expostos. É portanto, conveniente, conhecer o percentual de recuperação do método como forma de expressar a real qualidade parasitológica do lodo e assim, evidenciar o seu grau de patogenicidade. As metodologias para determinação de ovos de helmintos no lodo têm sido bastante estudadas e consideradas de baixa eficiência na detecção destes organismos. Nem todos os ovos de helmintos ressuspendem com o mesmo tipo de solução (sugerido pelos métodos tradicionais) como é o caso de ovos de Taenia sp cuja densidade é maior que 1,30. Portanto, uma metodologia efetiva na detecção e quantificação de ovos de parasitos é um importante 1

2 instrumento para indicar o destino que deverá ser dado ao lodo se na agricultura, ou em usos menos restritivos como o reflorestamento. OBJETIVOS Definir um método que seja eficiente na determinação de ovos de helmintos, especialmente Taenia sp, no lodo à partir dos métodos consagrados como os de Yanko (1987), de Bailenger modificado (AYRES et al.,1996) e Leeds I (AYRES et al., 1991). MATERIAIS E MÉTODOS Os ensaios foram realizados no Laboratório de Análises de Água e Esgoto da Companhia de Saneamento de Goiás em amostras de lodo líquido e sólido provenientes dos sistemas de tratamento de esgoto (Cruzeiro do Sul e Parque Ateneu). As amostras foram coletadas em sacos plásticos de aproximadamente 3 kg e em frascos de ml para lodo seco e pastoso respectivamente e imediatamente transportadas ao laboratório para análise, onde ficaram sob refrigeração até o momento da análise e analisadas por três métodos, sendo dois métodos específicos para amostras de resíduos líquidos - Bailenger Modificado (AYRES et al., 1996) e Método de Leeds I (AYRES et al., 1991) - e um aplicado para amostras sólidas - Método de YANKO (1987). Método Bailenger Modificado (AYRES et al., 1996) método da centrífugo-flutuação consiste em lavar o sedimento contendo os ovos de helmintos em solução tampão aceto-acética ph 4,5 e éter, separando em fases distintas e finalmente ressuspender o sedimento em solução de sulfato de zinco a 30%. Observa o sobrenadante em câmara de McMaster. A recuperação do método foi definida por CRISPIM et al. (1994) concluindo ser inversamente proporcional a quantidade de sólidos presentes. Método de Leeds I (AYRES et al., 1991): Consiste no tratamento do sedimento com solução de sulfato de magnésio saturado de densidade 1,30 em que há ressuspensão de ovos mais densos seguindo da contagem destes, entre lâmina e lamínula num período de no máximo 30 minutos a fim de evitar a cristalização da amostra pela solução salina. O método tem percentual de recuperação de 24%. Método de YANKO (1987) método de sedimentação consiste em ressuspender, inicialmente, o sedimento com solução de sulfato de zinco 33% (densidade 1,18) e solução álcool ácida e posterior sedimentação com solução de ácido sulfúrico 0,1 N. Observa-se o sedimento em câmara de Sedgewick Rafter. ATIVIDADES OU ETAPAS As amostras foram contaminadas com um pool de ovos de Ascaris suum recolhidos diretamente do útero do parasito. Numa primeira etapa (período pré-experimental) foram aplicados os métodos de Yanko (1987), de Bailenger (AYRES et al., 1996) e de Leeds I (AYRES et al., 1991) observando o comportamento de cada um deles na determinação de ovos em lodo. Na segunda etapa do experimento trabalhou-se apenas com as modificações adotadas no método de Yanko consorciadas com etapas dos métodos de Bailenger e Leeds I. Foram escolhidas etapas importantes com o propósito de aumentar a eficiência do método de Yanko (1987) e garantir o encontro das mais diversificadas classes do filo dos helmintos, especialmente os cestodas que tem a Taenia sp como principal representante de interesse para a agricultura e pecuária, no Estado de Goiás. Para aumentar a eficiência do Método de Yanko (1987) foram adotadas etapas importantes dos métodos de Bailenger e Leeds I fundamentadas em princípios de separação dos ovos do sedimento através do balanço Hidrofílico-lipofílico e da densidade relativa. Segundo AYRES et al. (1989) o encontro de ovos de helmintos não só é um resultado da sedimentação e flutuação baseada na gravidade específica mas que o balanço hidrofílico-lipofílico dos ovos dos parasitos em relação ao meio de extração é também um fator importante. Pelo controle do ph, o balanço hidrofílico-lipofílico pode ser modificado para otimizar a concentração de ovos de helmintos. CRISPIM (1993) registrou que os ovos têm potenciais eletrolíticos diferentes nas suas camadas. O uso da solução tampão de 2

3 ph 4,5 adotado por Bailenger favorece a separação dos ovos da camada de detritos e gorduras. O éter, por sua vez, elimina as gorduras persistentes. As amostras de lodo ao serem analisadas passam pelas etapas de sedimentação e flutuação com o auxílio de soluções de densidades que variam de 1,18 a 1,30. Os ovos que possuem densidade relativa menor que 1,18 são separados do sedimento e flutuam. Conforme a Tabela 01 os ovos de Taenia saginata apresentam densidade mais elevada que os demais (1,30), portanto para separá-los do sedimento a densidade da solução deve ser no mínimo de 1,13. Tabela 01 Tamanho, Densidade e Velocidade de Sedimentação de Algumas Espécies de Ovos de Helmintos Espécie Tamanho (µm) Densidade Velocidade de sedimentação (m/h) Ascaris suum 65x45 1,13 0,95 Ascaris lumbricoides 55x40 1,11 0,43 Schistosoma mansoni 50x150 1,18 5,23 Trichuris trichiura 22x50 1,15 0,48 Taenia saginata 40x35 1,30 0,83 Ancilostomídeos 60x40 1,06 0,26 Fonte: ZERBINI & CHERNICHARO (2001) apud DUNN (1991) Os ovos de helmintos encontrados nas amostras de lodo foram identificados segundo o tamanho e as características morfológicas específicas dos ovos encontrados, tais como: forma, conteúdo do ovo, espessura da membrana externa. Os ovos foram observados com o auxílio de microscópio óptico marca Olympus utilizando aumentos de 100 e 200 vezes, segundo a Forma - podem ser esféricos ou ovais; Membrana Externa; Conteúdo interno; Estruturas. RESULTADOS Teste Experimental Método de Bailenger Modificado (AYRES et al., 1996) o resíduo sólido gerado no final do teste não permitiu a observação de ovos de helmintos na câmara de McMaster. Método de Leeds I (AYRES et al., 1991) é um método semi-quantitativo, por ser contado entre lâmina e lamínula. No entanto bastante eficiente na ressuspensão de ovos. A grande quantidade de resíduo gerado não impediu a observação de ovos de helmintos. Método de YANKO (1987) por não observar a parte sólida da amostra, foram computados apenas os ovos de helmintos encontrados na parte líquida. A enumeração de ovos de helmintos foi exaustivamente realizada em câmara de Sedgewick-Rafter e apenas ovos de baixa densidade separam-se na etapa de ressuspensão. Método de YANKO Modificado por observar a parte líquida e sólida da amostra, foram computados os ovos de helmintos encontrados nas duas etapas, o que contribuiu para aumentar a eficiência do método. A contagem foi confortavelmente realizada em câmara de Sedgewick-Rafter ou McMaster. Na etapa de ressuspensão foi possível separar ovos de densidade até 1,30. A comparação dos resultados obtidos na aplicação dos métodos encontra-se na Tabela 02. 3

4 Tabela 02 Encontro de ovos segundo o método utilizado MÉTODO Bailenger Modificado (1996) Leeds I (1991) YANKO (1987) YANKO modificado Ancilostomídeos Hymenolepis diminuta Ascaris lumbricoides Trichuris trichiura Taenia sp Observação por câmara: + 1 ovo ++ até 5 ovos +++ mais de 5 ovos Definição de Metodologia As amostras foram analisadas conforme recomendações do método descrito por Yanko (1987) e modificadas segundo princípios dos métodos de Bailenger e Leeds I suportados pelas etapas demonstradas na Fig. 1. Pesar amostras de lodo bruto, calado ou compostado Diluição da amostra em água Filtragem e sedimentação por 12 horas Transporte do sedimento final para cálice de sedimentação Ressuspensão do sedimento em sulfato de sulfato de magnésio 1,30 Separação da parte líquida e sólida Fase Líquida Diluição à metade da concentração com água Sedimentação por 3 horas Centrifugação do sedimento a 1400 rpm por 3 minutos Fase Sólida Mistura com solução acetoacética ph 4,5 e éter Homogeneização em vortex por 1 minuto Centrifugação a 1800 rpm por 15 minutos Ressuspensão com sulfato de magnésio 1,30 e determinação do número de ovos de helmintos em câmara de Sedgewick-Rafter ou McMaster Figura 01 - Determinação do número de ovos de helmintos pelo método de Yanko Modificado 4

5 Os instrumentos e recursos definidos para aumentar a eficiência de recuperação de ovos e transformar o método de Yanko tradicional em um método mais confortável na observação da amostra estão apontados na Tabela 03. Tabela 03 Recursos utilizados no método tradicional de Yanko (1987) e no método modificado Método YANKO (1987) YANKO MODIFICADO Princípio do método Flutuação / Sedimentação Flutuação Densidade da solução 1,18 1,30 Soluções utilizadas Triton X-100; água fosfatada; álcoolácido; ácido sulfúrico 0,1N; sulfato de zinco; éter etílico. Triton X-100; aceto-acética; sulfato de magnésio ou sulfato de zinco; éter etílico. Câmara de observação Sedgewick-Rafter Sedgewick-Rafter / McMaster Fração da amostra observada Líquida Sólida e Líquida Tempo médio aproximado para enumeração de ovos em 1 ml de amostra para um observador experiente 20 minutos 7 minutos - Sedgewick-Rafter 4 minutos - McMaster Equipamentos Centrífuga Centrifuga e Aparelho Vortex Eficiência de recuperação dos Métodos Yanko Tradicional e Modificado Em amostras contaminadas com 500 ovos de Ascaris suum foi possível encontrar apenas uma eficiência de 19%, com valores de sólidos sedimentáveis variando de 20 a 50 m/l/h. Uma amostra isenta de sólidos (ou seja, igual a 0,0 ml/l/h) foi contaminada com 685 ovos. Após as modificações sugeridas que consideram observações da parte líquida e sólida geradas no procedimento analítico foram recuperados 291 ovos na parte líquida, resultando 42,48% de recuperação nesta etapa e 138 ovos na parte sólida (resíduo) perfazendo 20,14% de recuperação, que somadas atribui ao método 62,62% de eficiência de remoção. Os restantes 27,38% que não foram recuperados, atribuídos como perda devem-se às etapas de transferência, adesão de ovos dos parasitos à detritos e descartes sucessivos durante o processamento da amostra. Em testes com amostras de lodo apresentando 100 ml/l/h de sólidos sedimentáveis foi possível recuperar 29,27% de ovos na parte líquida e 13,88% na parte sólida, atribuindo ao método, nesta condição uma eficiência de 42,45%. CONCLUSÃO. O experimento gerou um método baseado em princípios de centrífugo-flutuação utilizando uma solução de maior densidade (1,30) do que a sugerida pelo método tradicional (1,18), permitindo o encontro de ovos de helmintos de maiores e menores densidades, inclusive ovos de Taenia sp. Por ser baseado na ressuspensão de ovos de helmintos possibilitou a observação de um volume maior de amostra tornando-o mais seguro e confiável. A flutuação dos ovos de helmintos em câmaras, tanto de Sedgewick-Rafter quanto de Mc Master, amenizaram o trabalho de observação uma vez que os elementos procurados se separaram totalmente do resíduo do lodo gerado no final do teste.. Foi definido o percentual de recuperação de ovos de helmintos:. Método de Yanko (1997) igual a 19%. Método de Yanko modificado igual a 43,15% (29,27% parte líquida e 13,88% parte do resíduo). REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AYRES, R.; LEE, D.; MARA, D. D. (1989). The enumeration of human intestinal nematod eggs in raw and treated wastewaters. Tropical Public Health Engineering. March. Leeds. U.K. AYRES, R. STOTT, R; LEE, D.L.; MARA D. D.; SILVA, S. A. (1991). Comparison of techniques for the enumeration of human parasitic helmint eggs in treated wastewater. Environmental Technology, vol. 12 pp Leeds. U.K. 5

6 AYRES, R.; LEE, D.; MARA, D. (1996). Analysis of wastewater for use in agriculture A laboratory manual of parasitological and bacteriological techniques. Dept of Civil Engineering University of Leeds. England. 31 p. Leeds. U.K. CRISPIM, W. M. C. (1993). Selecção de metodologias para pesquisa de ovos de helmintos em águas residuais. Relatório 242/93. LNEC/NHS. Lisboa. 47 p. CRISPIM, W. M. C., BARBOSA, D. M. C. (1994). Avaliação do sistema de lagoas de estabilização de esgotos na remoção de ovos de helmintos - Proposta para recuperação do método da OMS. In: 3 RD IAWQ International Specialist Conference and Workshop. Waste Stabilization Ponds Tecnology and Applications. João Pessoa - Paraíba. SOCCOL, V. T.; PAULINO, R. C.; CASTRO, E. A (1998). Metodologia de análise parasitológica em lodo de esgoto e esgoto. In: Manual de Métodos para Análises Microbiológivcas e parasitológicas em Reciclagem de lodo de Esgoto. P SANEPAR/PROSAB. Paraná. ZERBINI, A. M.; CHERNICHARO, C. A. (2001). Metodologias para quantificação, identificação e análise de viabilidade de ovos de helmintos em esgotos brutos e tratados. In: Pós-tratamento de Efluentes de Reatores Anaeróbios. PROSAB 2. p Belo Horizonte MG. 6