CITOLOGIA E FISIOLOGIA DA CÉLULA BACTERIANA. Prof a. Dr a. Vânia Lúcia da Silva

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1 CITOLOGIA E FISIOLOGIA DA CÉLULA BACTERIANA Prof a. Dr a. Vânia Lúcia da Silva

2 A primeira pessoa a relatar a observação de estruturas com um microscópio foi o inglês Robert Hooke em microscópio rudimentar - estruturas celulares de plantas e fungos. Início da teoria celular. Apesar disso, pode-se dizer que a Microbiologia teve seu início com as observações feitas por Antonie van Leewenhoek - lentes que atingiam a resolução de 300 a 500 vezes, permitiram-lhe a descoberta de um mundo desconhecido ao permitir a observação de algas, protozoários, leveduras e bactérias maiores publicação da primeira representação de uma bactéria. Leeuwenhoek surpreendeu o mundo científico declarando que os microrganismos que observava eram vivos por apresentarem movimento ativo e intenso Leeuwenhoek observou que o fermento consistia de partículas globulares diminutas, as leveduras, e ainda descobriu e descreveu o parasita intestinal Giardia lamblia que isolou de suas próprias fezes em um episódio de diarréia.

3 O progresso da Microbiologia ficou vinculado ao desenvolvimento de instrumentos e técnicas pertinentes ao seu estudo, tais como microscópios com maior poder de resolução e técnicas de cultivo e coloração de estruturas celulares. A Microbiologia como Ciência começa a ter um verdadeiro avanço a partir de meados do século XIX, com o desenvolvimento de microscópios de alta qualidade juntamente com o aperfeiçoamento de técnicas de esterilização, cultivo de microrganismos e técnicas citológicas.

4 Nessa época, o químico francês Louis Pasteur e o médico alemão Robert Koch desenvolveram estudos que estabeleceram as bases da Microbiologia como ciência experimental estruturada e especializada. A Microbiologia deixa de ser uma ciência meramente descritiva para centrar-se no estudo da complexidade estrutural, fisiológica, genética e ecológica dos microrganismos, bem como das inúmeras atividades por eles desempenhadas. Estes avanços determinaram o desdobramento da Microbiologia em disciplinas especializadas, como a Bacteriologia, a Micologia, a Parasitologia, a Virologia e a Imunologia

5 Em 1857 Pasteurização Pasteur descobriu microrganismos que contaminavam e deterioravam o vinho destinado às tripulações dos navios da Marinha francesa, tornando-o impróprio para consumo. Deduziu que, se o vinho fosse aquecido até uma temperatura que não afetasse seu sabor e que, ao mesmo tempo, matasse os microrganismos contaminantes, este não mais se deterioraria. Pasteur também descobriu que as leveduras presentes no vinho eram as responsáveis pela produção do conteúdo alcoólico da bebida. A descoberta permitiu que a indústria monitorasse a qualidade do vinho controlando as leveduras que fermentavam o suco de uvas. Ao investigar a cólera aviária, Pasteur inoculou galinhas com uma cultura velha do patógeno e as aves não morreram - as bactérias da cultura velha não eram mais patogênicas. Posteriormente inoculou as mesmas galinhas com doses letais de uma cultura fresca do patógeno e, novamente, as aves não morreram. As culturas velhas tinham imunizado as galinhas e as bactérias mantidas sob condições adversas perderam a capacidade de causar doença mas retinham a capacidade de imunizar um hospedeiro. Produção de vacinas contra doenças como o carbúnculo e a raiva.

6 No final da década de 1870, Koch interessou-se pelo carbúnculo. Analisando sangue de vítimas do carbúnculo ao microscópio, observou a presença de uma bactéria de grandes dimensões. Desenvolvendo técnicas microbiológicas, Koch conseguiu isolar a bactéria. Animais sadios inoculados com a bactéria purificada apresentavam os sintomas clássicos do carbúnculo. A partir do sangue destes animais, Koch re-isolou mesma bactéria. Ele repetiu o experimento, sempre re-isolando a bactéria dos animais experimentalmente infectados até que tivesse certeza que tinha encontrado o agente da doença. Koch também descobriu os agentes etiológicos da cólera e da tuberculose, as bactérias Vibrio cholerae e Mycobacterium tuberculosis, respectivamente. A bactéria M. tuberculosis é ainda hoje denominada bacilo de Koch. Seus estudos, combinados com os de Pasteur, estabeleceram a Teoria do Germe da Doença.

7 Em 1877, Koch formulou um conjunto de postulados os quais afirmava deveriam ser adotados para que se aceitasse uma relação entre um microrganismo em particular e uma doença. Postulados de Koch: 1. O mesmo patógeno deve estar presente em todos os casos da doença; 2. O patógeno deve ser isolado do hospedeiro doente e crescer em cultura pura; 3. O patógeno deve causar a doença quando inoculado em animal saudável; 4. O patógeno deve ser isolado do animal inoculado e deve ser o organismo original.

8 SISTEMAS DE CLASSIFICAÇÃO DOS ORGANISMOS

9 Linnaeus Primeiro sistema de classificação de microrganismos 1753 (Carollus Linnaeus) Domínio (Reino) - Divisão (filo) Classe Ordem Família Gênero Espécie Domínio Animália (animais e protozoários) Constituído por seres não-fotossintéticos, móveis e sem parede celular Plantae (plantas, algas, bactérias e fungos) Constituído por organismos fotossintéticos, imóveis e com parede celular

10 Haeckel Tentativa de acomodar melhor os microrganismos 1866 (Ernest Haeckel) Organismos unicelulares de organização simples terceiro reino => PROTISTA Animália (animais) Plantae (plantas e algas multicelulares) Protista (algas unicelulares, bactérias protozoários e fungos)

11 Whittaker Desenvolvimento da microscopia e técnicas bioquímicas 1969 (Robert H. Whittaker) Cinco reinos relacionados com estrutura celular e forma de obtenção de nutrientes Animália (animais) Plantae (plantas) Protista (algas e protozoários) Fungi (fungos) Monera (procariotas)

12 ÁRVORE FILOGENÉTICA DA VIDA Classificação dos seres vivos, de acordo com Whittaker (1969)

13 Woese Sistema de classificação fundamentado no argumento de que a divisão dos microrganismos em procariotos e eucariotos era insuficiente 1991 (Carl R. Woese) Divisão dos procariotos em Archae e Bacteria - seqüência do RNAr 16S e 18S Archaea (procariotas) Bacteria (procariotas) Eukarya (eucariotas: fungos, algas, protozoários, plantas e animais) As archaea são procariotas porque não possuem núcleo envolvido por membrana, mas possuem lipídios e ácidos nucléicos ribossomais diferentes das bactérias e dos eucariotos

14 ÁRVORE FILOGENÉTICA DA VIDA Classificação dos seres vivos, de acordo com Woese (1991)

15 PRINCIPAIS GRUPOS DE PROCARIOTOS Domínio Bacteria Grande variedade fisiológica e morfológica. Diferentes tipos nutricionais quanto a fonte de carbono, energia e fatores ambientais (oxigênio, ph, temperatura e pressão osmótica) são encontrados. Os principais grupos filogenéticos estão agrupados em 16 filos ou divisões Domínio Archaea Bactérias com características altamente especializadas capazes de resistir a altas temperaturas, concentrações de sal e valores extremos de ph. Metabolizadores incomuns como redutoras de sulfato e metanogênicas. Os principais grupos filogenéticos estão agrupados em 2 filos. Mais 2 filos foram descobertos e compõe formas de vida primitivas e as menores já descobertas

16 Proteobactérias Espiroquetas Deinococos Bactérias hipertermófilas Flavobactérias Cianobactérias e Proclorófitas DOMÍNIO EUBACTERIA Cytophaga Chlamydia Planctomyces Nitrospira e Deferribacter Bactérias Gram positivas Verrucomicrobios Bactérias verdes sulfurosas Bactérias verdes não-sulfurosas

17 Halófitas Euryarchaeota Termófilas Metanogênicas DOMÍNIO ARCHAE Crenarchaeota

18 MORFOLOGIA BACTERIANA BACTÉRIAS - células procariontes, constituindo os menores seres vivos e os mais simples estruturalmente, embora complexos e diversificados do ponto de vista bioquímico e metabólico - ADAPTAÇÃO Características básicas dos procariontes: Ausência de compartimentos dentro da célula - metabólitos dispersos no citoplasma; Ausência de núcleo verdadeiro - cromossomo bacteriano disperso no citoplasma Morfologia Bacteriana: As células bacterianas são caracterizadas morfologicamente pelo seu tamanho, forma e arranjo. Tamanho: 0,3 /0,8 µm até 10/25 µm. As espécies de interesse médico variam entre 0,5 a 1,0 µm por 2 a 5 µm. Forma e arranjo: - Cocos (formas esféricas): grupo homogêneo em relação a tamanho, sendo células menores (0,8 a 1,0 µm).

19 Diplococos: cocos agrupados aos pares. Ex.: Neisseria (meningococo) Tétrades: agrupamentos de quatro cocos Sarcinas: agrupamento de oito cocos em forma cúbica. Ex.: Sarcina Estreptococos: cocos agrupados em cadeias. Ex.: Streptococcus Estafilococos: cocos em grupos irregulares, lembrando cachos de uvas. Ex.: Staphylococcus

20 Bacilos ou bastonetes: cilíndricos, forma de bastão, podendo ser longos ou delgados, pequenos e grossos, extremidade reta, afilada, convexa ou arredondada. Diplobacilos: bastonetes agrupados aos pares. Estreptobacilos: bastonetes agrupados em cadeias. Paliçada: bastonetes agrupados lado a lado como palitos de fósforos.

21 Formas helicoidais ou espiraladas: células de forma espiral. Espirilos: possuem corpo rígido e se movem às custas de flagelos externos, dando uma ou mais voltas espirais em torno do próprio eixo. Espiroquetas: são flexíveis e locomovem-se às custas de filamentos axiais (flagelos periplasmáticos), podendo das várias voltas completas em torno do próprio eixo. Ex.: Gênero Treponema Formas de transição Bacilos muito curtos: cocobacilos. Ex.: Prevotella Espirilos muito curtos, assumindo formas de vírgula: vibriões. Ex.: Vibrio cholerae

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23 CITOLOGIA BACTERIANA A observação interna das estruturas celulares dá-nos uma idéia de como a bactéria funciona no ambiente. A figura a seguir representa as diversas estruturas bacterianas:

24 ESTRUTURAS CELULARES EXTERNAS Flagelos Estruturas especiais de locomoção, constituídas pela proteína flagelina, que formam longos filamentos que partem do corpo da bactéria e se estendem externamente à parede celular. O flagelo propulsiona a bactéria por movimento rotatório => dependente de energia fornecida pela diferença de potencial de membrana (fluxo de íons H). Distribuição dos flagelos: atríquias (sem flagelo) a) monotríquio b) anfitríquio c) lofotríquio b) peritríquio

25 Fímbrias Estruturas filamentosas mais curtas e delicadas que os flagelos, semelhantes a pêlos, que se originam da membrana plasmática, e são usados para fixação, e não para motilidade. São constituídas por uma proteína denominada pilina. Estão relacionadas com a aderência às superfícies mucosas (fímbrias comuns) => colonização. Pili F => relacionado com a transferência de material genético durante a conjugação bacteriana (fímbrias ou pili sexual codificadas pelo plasmídeo F).

26 Fímbria comum Fímbria sexual

27 Cápsula Camada que circunda a célula bacteriana externamente a parede celular, de consistência viscosa e de natureza polissacarídica (polissacarídeo extracelular) ou polipeptídica. Pode ser evidenciada por métodos especiais de coloração (tinta nanquim). Funções: proteção da célula bacteriana contra desidratação, permitir a fixação da bactéria em várias superfícies, evitar a adsorção de bacteriófagos na célula bacteriana. Relacionada à virulência da bactéria, pois confere resistência à fagocitose pelas células de defesa do corpo em uma mesma espécie, amostras encapsuladas são mais virulentas que as não-encapsuladas AUMENTA A CHANCE DE INFECÇÃO.

28 Parede Celular Estrutura rígida que recobre a membrana citoplasmática e dá forma às células, além de proteção, mantendo a pressão osmótica intrabacteriana e prevenindo expansão e eventual rompimento da célula. Composição: peptidioglicano (mucopeptídeo ou mureína) estrutura rígida da parede: N-acetilglicosamina (NAG) ácido N-acetilmurâmico (NAM) tetrapeptídeo (4 aminoácidos) Devido as propriedades da parede celular, as bactérias podem ser divididas em dois grandes grupos: GRAM POSITIVAS e GRAM NEGATIVAS, de acordo com a sua resposta à coloração de GRAM.

29 Composição do tetrapeptídeo Contém L e D aminoácidos, sempre ligado ao NAM. Ligações cruzadas entre o COOH terminal do aminoácido de um tetrapeptídeo e o grupo NH 2 do aminoácido do tetrapeptídeo vizinho. L-alanina D-ácido glutâmico L-lisina D-alanina L-alanina D-ácido glutâmico L-lisina D-alanina Ligação cruzada

30 PAREDE DAS GRAM POSITIVAS Possuem maior quantidade de peptidioglicano, o que torna a parede dessas bactérias mais espessa e rígida. Composta por peptidioglicano e ácidos teicóicos (cadeias de polifosfato com resíduos de ribitol e glicerol) ou ácidos lipoteicócicos. Ácidos teicóicos Peptideoglicano Membrana citoplasmática Citoplasma Os ácidos teicóicos/lipoteicóicos estão ligados ao peptidioglicano APENAS nas bactérias Gram positivas, nunca nas Gram negativas.

31 PAREDE DAS GRAM NEGATIVAS Mais complexa - a quantidade de peptidioglicano é menor, e possui uma membrana externa envolvendo a fina camada de peptidioglicano, que se situa no espaço periplasmático. MEMBRANA EXTERNA: Serve como barreira seletiva que controla a passagem de algumas substâncias. Estrutura: bicamada assimétrica, contendo fosfolipídios, semelhante à MP. Internamente => camada de fosfolipídeos e lipoproteína, que está ancorada ao peptidioglicano. Externamente => camada impermeável de lipopolissacarídeo (LPS) molécula anfipática.

32 A membrana externa das bactérias Gram negativas contém proteínas (OMP), que formam canais por onde penetram diversas substâncias. Lipopolissacarideo Membrana externa Espaço periplasmático e lipoproteínas Peptideoglicano Espaço periplasmático Membrana citoplasmática Citoplasma Essas proteínas presentes na membrana externa das Gram negativas constituem aprox. 50% da membrana, não relacionadas com as proteínas da MP, e possuem diversas funções.

33 LPS 3 segmentos ligados covalentemente: lipídio A, cerne do polissacarídeo e antígenos O. A porção lipídica do LPS é também chamada de ENDOTOXINA. O LPS pode ser tóxico, causando febre, diarréia, destruição de hemácias e um choque potencialmente fatal. Efeito protetor nas bactérias Gram negativas intestinais (resistência à solubilização pelas enzimas intestinais e bile).

34 Implicação da estrutura da parede celular bacteriana - COLORAÇÃO DE GRAM Baseado nas propriedades da parede celular (substâncias lipídicas na camada externa) 1884 Hans Christian Joachim Gram Experimentos com pneumococos corantes seletivos para bactérias Desenvolvimento de um protocolo de coloração de esfregaços bacterianos Permitiu a divisão destes organismos em 2 grandes grupos - visualização por microscopia óptica Revolução no diagnóstico das doenças infecciosas.

35 PAREDE CELULAR DAS MICOBACTÉRIAS Bacilos aeróbios, imóveis, não-formadores de esporos, de parede celular complexa rica em lipídios e ceras, especialmente ácidos micólicos que são ligados covalentemente a lipidios acil (ácidos arabnogalactamicos). Causadores da tuberculose e da lepra. Estrutura da parece celular: A parede celular das micobactérias é responsável por muitas características das bactérias (por exemplo, ácido resistência, crescimento lento, resistência aos detergentes, resistência aos antibióticos comuns). Nutrientes solúveis em água entram nas células através de porinas.

36 Os diferentes lipídios da parede celular das micobactérias formam uma bicamada assimétrica com cadeias curtas de glicerol-fosfolipídios que atuam como barreira a substâncias aquosas tornando a superfície celular hidrofóbica e resistente a numerosos desinfetantes, álcoois e ácidos.

37 Membrana Citoplasmática Aproximadamente 10 nm e separa a parede celular do citoplasma. É constituída de fosfolipídeos e proteínas. Desempenha importante papel na permeabilidade seletiva da célula funciona como barreira osmótica. Difere da membrana citoplasmática dos eucariotos por: - não apresentar esteróis (colesterol) em sua composição; - ser sede de numerosas enzimas do metabolismo respiratório => (MESOSSOMO); - controlar a divisão bacteriana através do mesossomo.

38 ESTRUTURAS CELULARES INTERNAS Área citoplasmática Citoplasma: 80 % de água, ácidos nucléicos, proteínas, carboidratos, compostos de baixo peso molecular, lipídios, íons inorgânicos. Sítio de reações químicas. Ribossomos: ligados a uma molécula de mrna, são chamados de poliribossomos. Presentes em grande número nas células bacterianas. São menores ribossomos 70S Grânulos de reserva (inclusões): os procariotos podem acumular no citoplasma substâncias sob a forma de grânulos, constituídos de polímeros insolúveis (ex.: grânulos de glicogênio, amido, lipídios, polifosfato, enxofre e óxido de ferro).

39 Área citoplasmática Ribossomos: ligados a uma molécula de mrna, são chamados de poliribossomos. Presentes em grande número nas células bacterianas. São menores ribossomos 70S Tipo de rrna em procariotos Número aproximado de nucleotídeos Localização da subunidade 16s s 5s s 23s s

40 Área nuclear Nucleóide: cromossomo bacteriano, constituído por uma única molécula dupla fita circular de DNA não delimitado por membrana nuclear e sem a presença de histonas. Contém as informações necessárias à sobrevivência da célula e é capaz de replicação. Elementos extracromossomais Plasmídeos:, moléculas menores de DNA, dupla fita, circulares, cujos genes não codificam características essenciais, mas podem conferir vantagens seletivas para as bactérias que os possuem (ex.: genes de resistência a antibióticos, metais tóxicos, produção de toxinas, etc). Auto-duplicação independente do cromossomo bacteriano, e podem existir várias cópias dentro da célula. Transposons e integrons

41 Esporos Também chamados de endósporos (porque se formam dentro da célula). Esporos contém pouca água no citoplasma, possuem parede celular muito espessa, são altamente resistentes a agentes físicos e químicos, devido a sua capa impermeável de proteína tipo queratina (associado ao cálcio) e presença de ácido dipicolínico. Função: proteção da célula vegetativa das adversidades do meio ambiente (limitação de nutrientes, temperatura, e dessecação). Sua formação leva em torno de 6 horas. Têm pouca atividade metabólica, pode permanecer latente por longos períodos - forma de sobrevivência, e não de reprodução. Ex. Bacillus e Clostridium.

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