Avaliação Laboratorial da Hemostasia. Silmara Montalvão Farmacêutica Bioquímica Laboratório de Hemostasia - Hemocentro Unicamp
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1 Avaliação Laboratorial da Hemostasia Silmara Montalvão Farmacêutica Bioquímica Laboratório de Hemostasia - Hemocentro Unicamp
2 Sumário Integridade da amostra e variabilidade pré-analítica Principais exames na investigação laboratorial e sua interpretação: - Limitações e considerações dos testes clássicos da avaliação laboratorial da hemostasia Laboratório de hemostasia x Hemofilia
3 Introdução Modelos para o entendimento da Hemostasia Cedido por De Paula, 2012
4 Integridade da amostra e variabilidade pré-analítica Fontes de erros mais comuns: 1. Não utilizar citrato de sódio como anticoagulante 2. Tubos utilizado em sistema a vácuo incompletos 3. Inadequada homogeneização 4. Estocagem de sangue total em gelo ou ambiente refrigerado Amostra ideal para teste de hemostasia 1. Coleta não traumática com mínimo tempo de torniquete 2. Tubos com correta proporção de anticoagulante ( > 90%) 3. Transporte em temperatura ambiente 4. Tempo máximo de uma hora entre coleta e processamento da amostra Causas de rejeição de amostra 1. Amostra não coletada com citrato de sódio como anticoagulante 2. Amostras que contenham coágulo 3. Amostras que não apresentam a proporção de 9:1 (sangue/anticoagulante) 4. Amostras com hematócrito > 55% 5. Amostras hemolizadas Steve K, Quality in laboratory Hemostasis 2009
5 Principais exames na investigação laboratorial e sua interpretação
6 História Clínica Grupo I Grupo II Avaliação do paciente com história de sangramento Avaliação do paciente com história de trombose Avaliação do paciente assintomático pré procedimentos (triagem) Avaliação do paciente assintomático após alteração dos exames de triagem
7 Modelo Clássico da Investigação Laboratorial Hillarp, IHTC- Basic in vivo Coagulation
8 Modelo Clássico da Investigação Laboratorial Hemostasia Primária TS e PFA Teste de função plaquetária Quantidade e função do FVW Hemostasia Secundária Testes de triagem: TP, TTPA, TT Fatores da Coagulação Fibinólise Dímero D Lise de euglobulina Tromboelato metria
9 Testes de triagem TP TTPA Hillarp, IHTC- Basic in vivo Coagulation
10 Testes de triagem Cedido por De Paula, 2012
11 Teste de triagem TTPa normal e TP prolongado Repetir com mistura 50:50 Sem correção com mistura Inibidor de FVII (raro) Correção com mistura Deficiência isolada de fator VII hereditária Deficiência de múltiplos fatores: hepatopatia, uso de Varfarina, deficiência de vitamina K (Fator VII tem a meia-vida mais curta)
12 Teste de triagem TP normal e TTPa prolongado Correção do TTPa Repetir com mistura 50:50 Sem correção do TTPa Pesquisar inibidores: Inespecíficos (ac. Lúpico) Específicos (FVIII, FIX, FV) Deficiência de fatores da via intrínseca FVIII, FIX, FXII, FXI, PK, HMWK Deficiência de fator de von Willebrand Pesquisa de inibidor especifico para FVIII
13 Coagulopatia adquiridas Considerações: TTPA incubado a 37ºC/ 2h em pacientes com inibidor adquirido KICHEN S, WFH 2010
14 Teste de triagem TP e TTPa normais Contagem de plaquetas normal Paciente com sangramento Deficiência de F XIII Hiperfibrinólise Trombopatia
15 Ferramentas disponíveis para a investigação? Hemostasia Primária TS e PFA Teste de função plaquetária Quantidade e função do FVW Hemostasia Secundária Testes de triagem: TP, TTPA, TT Fatores da Coagulação Fibinólise Dímero D Lise de euglobulina Tromboelato metria
16 Doença de von Willebrand Procedimentos Laboratoriais para o diagnóstico da DvW Testes de triagem Tempo de sangramento (TS) ou PFA-100 *Dade Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) Contagem de plaqueta Testes confirmatórios Atividade de fator VIII (F VIII) Antígeno de fator de von Willebrand (FvW:Ag) Atividade de co-fator de Ristocetina (FvW: Rco) Capacidade de ligação do FvW ao colágeno (FvW:CB) Testes especiais Aglutinação plaquetária induzida pela ristocetina ( RIPA) Padrão Multimérico do FvW Capacidade de ligação ao FVIII (FvW: FVIIIB)
17 Avaliação dos distúrbios do FvW Atividade Proteína Teste para avaliação da atividade de FVW X Variabilidade de técnicas atualmente disponíveis: Utilizar ou não a ristocetina? Muitos trabalhos mostram alta correlação entre os resultados entre FVW:Ag por técnica de ELISA e Imunotubidimertria, bem como alta concordância clínica. KITCHEN. S, Quality in Laboratory Hemostasis and thrombosis, 2009.
18 U /d L Avaliação dos distúrbios do FvW F V W :A g p = E L IS A G r ifo ls IL M é d ia /D P Montalvão SAL, Hemo 2012
19 Ferramentas disponíveis para a investigação? Hemostasia Primária TS e PFA Teste de função plaquetária Quantidade e função do FVW Hemostasia Secundária Testes de triagem: TP, TTPA, TT Fatores da Coagulação Fibinólise Dímero D Lise de euglobulina Tromboelato metria
20 Avaliação dos distúrbios da fibrinólise Há poucas evidências associado alterações da fibrinólise com quadros hemorrágicos ou trombóticos. CIVD grave Coagulopatia pós-transplante hepático leucemia promielocítica D dímero Tromboelastometria (tpa) Teste de euglobulina (baixa sensibilidade)
21 Avaliação Convencional x Global Método tradicional da hemostasia compartimentaliza um processo que na prática ocorre simultaneamente, dependendo de plaquetas, endotélio, fatores da coagulação e até mesmo de outros elementos como hemácias e leucócitos Medem a Cinética da formação do coágulo e podem prover a exatidão do estado hemostático in vivo: São mais efetivos para : Avaliar a geração de trombina Capacidade hemostática individual Polimerização da fibrina em sangue total Estrutura e estabilidade do coágulo MEERA CHITLUR, Thrombosis Research. 2012
22
23 Questões laboratoriais da Hemofilia
24 3 questões laboratoriais que interferem no diagnóstico e tratamento das hemofilias 1. Diagnóstico 2. Quantificação de inibidor 3. Avaliação da Farmacocinética
25 1. Diagnóstico - Condição pré-analítica Amostras para o teste de FVIII e FvW em tubo fechado e conservado entre 18º e 24º devem ser centrifugados e processados em 4 horas. Estocagem de 2º a 4º pode resultar em baixa atividade de FVIII e FvW. FVIII:C Favaloro Ej, Soltani S.McDonald J. Potencial Laboratory Misdiagnosis of Hemophilia and von Willebrand Disorder Owing to Cold Activation of Blood Samples for Testing. Am J Clin Pathol 2004; 122:
26 1. Diagnóstico - Reagentes
27 1. Diagnóstico Método Montalvão SAL, Hemo 2011
28 1. Diagnóstico Método Montalvão SAL, Hemo 2011
29 1. Diagnóstico Método 1/3 pacientes com HA leve causado por mutação missense tem discrepância de resultados entre o ensaio cromogênico e o de coagulação de uma etapa Normalmente a atividade do ensaio crormogênico é menor em relação ao de uma etapa 17 mutações até agora foram descritas com esta informação de discrepância A discrepância pode ser parcialmente explicada pelo aumento da instabilidade da molécula que sofreu mutação A diferença significativa entre os métodos é que o tempo de incubação necessário para o teste cromogênico é maior
30 2. Quantificação de inibidor Bethesda Teste Padrão-Ouro: Bethesta Clássico (Kasper.C 1975) e Bethesda Modificado (Verbruggen 1995)-ISTH (2001) Resultados do método Bethesda modificado apresenta menor CV% quando comparado ao Bethesda Clássico, sendo mais fidedignos em resultados de baixo título de inibidor ( 0 a 3 UB-mL)
31 2. Quantificação de inibidor A presença de FVIII na amostra do paciente viola o princípio do teste de Bethesda, onde a amostra do paciente e o controle devem ser equivalentes antes da incubação da amostra. Montalvão SA, dado não publicado, 2013
32 3. A importância da utilização da farmacocinética do FVIII e FIX na prática clínica Parâmetros farmacocinéticos (PK) pode ser útil para: (1) Profilaxia: calcular a dose mínima necessária para manter o pacientes > 1 UI/dL de fator (2) Protocolo de ITI: critério de avaliação de sucesso
33 3. A importância da utilização da farmacocinética do FVIII e FIX na prática clínica (1) Profilaxia: Dose mínima x Farmacocinética Profilaxia: o aumento do nível mínimo de fator VIII e IX > 1 UI/dL, com o objetivo de transformar um paciente com hemofilia A ou B grave para moderado, melhorando a condição clínica do paciente Dose escalonada x Uso de parâmetros farmacocinéticos: Vantagens da utilização de PK Considera o padrão de sangramento individual do paciente, ou seja, o uso racional do concentrado de fator Com a dose ajustada corretamente o paciente apresenta menor risco de sangramento Desvantagens da utilização de PK Disponibilidade da apresentação dos frascos Quantidade de amostras requeridas (pediátricos)
34 3. A importância da utilização da farmacocinética do FVIII na prática clínica (2) Avaliação do sucesso de ITI: Farmacocinética O sucesso da ITI é considerado levando-se em conta quatro parâmetros Título de inibidor negativo (< 0,6 UB/mL) Teste normal de recuperação in vivo (IVR) de FVIII:C (> 66%) Vida-média de FVIII normal (> 6 horas após 72h com ausência de fator exógeno) Ausência de resposta anamnésica em futura reexposição do fator DI MICHELE et. al, Haemophilia2007
35 Amostras necessárias para avaliação da farmacocinética Parâmetros da farmacocinética Método convencional ISTH (2001) Método utilizado no Brasil MS (2011) Método em avaliação ISTH (2012) Amostragem Teste de recuperação in vivo 15 minutos 15 minutos 15 minutos 30 minutos 30 minutos 30 minutos 3 horas 1 hora 4 horas Teste de vida - média 6 horas 3 horas 24 horas 9 horas 6 horas 48 horas 24 horas 24 horas 28 horas 32 horas
36 Modelo convencional: Cálculo do Teste de recuperação do FVIII in vivo
37 Cálculo da vida-média de Fator VIII (T1/2) Modelo convencional
38 Conclusão A condição pré-analítica deve ser observada no momento da análise, pois 70% dos casos de erros no laboratório de hemostasia acontecem nesta etapa Embora os principais testes que avaliam a hemostasia no modelo convencional esteja bem padronizados. Deve-se considerar as suas limitações para uma adequada interpretação dos resultados A utilização dos parâmetros da farmacocinética do FVIII e FIX na pratica clinica são relevantes, sobreduto para o seguimento da profilaxia e na avaliação de sucesso do protocolo de ITI
39 Referências 1. FAVALORO, E.J. Diagnosis and classification of von Willebrand disease: a review of the differential utility of various functional von Willebrand factor assays. Blood Coagul. Fibrinolysis, London, v. 22, n. 7, p , HAY, C. R. et al. The diagnosis and management of factor VIII and IX inhibitors: a guideline from the UK Haemophilia Centre Doctors' Organization. Br. j. haematol., Oxford, v. 111, n. 1, p , KITCHEN, S. ; MCCRAW, A.; ECHENAGUCIA, M. Diagnosis of hemophilia and other bleeding disorders: a laboratory manual. 2. ed. Montreal: WFH, BRASIL. Ministerio da Saude. Manual de diagnóstico e tratamento da doença de von Willebrand. Brasilia, Ministerio da Saude, BRASIL. Ministerio da Saude. Hemofilia congênita e inibidor, manual de diagnóstico e tratamento de eventos hemorrágicos. Brasilia: Ministerio da Saude, VERBRUGGEN, B. et al. The Nijmegen modification of the Bethesda assay for factor VIII:C inhibitors: improved specificity and reliability. Thrombosis and haemostasis, Sttutgart, v. 73, n. 2, p , 1995
40 Obrigada!
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