PROTOCOLO PARA DETERMINAÇÃO DE FOSFATO INORGÂNICO DISSOLVIDO (PID) NA ÁGUA DO MAR

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1 PROTOCOLO PARA DETERMINAÇÃO DE FOSFATO INORGÂNICO DISSOLVIDO (PID) NA ÁGUA DO MAR Objetivo Avaliar a concentração de fósforo inorgânico dissolvido na água do mar, na forma de íons HPO4-2 e PO4-3, por técnica colorimétrica, utilizando-se espectrofotômetro. A concentração de fósforo inorgânico na água do mar varia de 0,0 a 3,2 μm, o valor máximo é observado em ambiente eutrofizado. Princípio do método Baseia-se na formação do ácido molibdofosfórico e sua subsequente redução com ácido ascórbico, resultando no complexo de fosfomolibdênio de cor azul. Primeiro é formado o complexo ácido de cor amarela. Com a adição do ácido ascórbico, ocorre a redução. Normalmente esta redução é lenta, porém a adição de um catalisador, o antimonil tartarato de potássio, faz com que esta reação ocorra rapidamente. A quantidade do complexo azul de fosfomolibdênio formado é proporcional à concentração de fósforo presente como fosfato inorgânico na amostra de água. Portanto, o fósforo pode ser quantificado por espectrofotometria. Interferentes e precisão do método Os principais interferentes são os silicatos e arsenatos que também formam complexos azuis com o molibdato, entretanto, a velocidade de reação é mais lenta e a concentração destes íons não interfere na água do mar (até 200 μm para silicatos e 0,03 μm para arsenatos). Assim, os problemas de interferentes podem ser eliminados se as amostras forem lidas após 5 minutos de reação. A precisão do método está em torno de 5 a 15%. 1. Materiais necessários 1.1. Equipamentos a serem utilizados Espectrofotômetro HITACHI 2900 Balança analítica Estufa Capela exaustora Dessecador com sílica gel 1.2. Vidraria e materiais diversos a serem utilizados Balões volumétricos de 100 (4) (com tampa esmerilhada) Béqueres de 10, 100, 200 e 500 ml (descarte) Provetas de 50, 100, 250 ml e 500 ml (plástico) Pipeta automática volumétrica (várias ponteiras) Tubos de ensaio para análise em microvolume (triplicata) Bastão de vidro Seringa de 15 ml Espátula de inox

2 1.3. Preparo dos reagentes necessários: a. Solução padrão de fosfato 0,01 M = 10 µm (solução mãe) Por ser a etapa mais demorada, deve-se começar preparando esta solução a fim de otimizar o tempo. - Ligar a estufa a 110 C para aquecê-la; - Ligar a balança analítica para estabilizar por uns 30 minutos antes da pesagem. Ver procedimento de uso no protocolo específico. A balança deverá estar limpa. Caso haja resíduos na parte interna, utilize um pincel de cerdas macias para limpála (o mesmo encontra-se ao lado da balança). - Pesar aproximadamente 200 mg (ou 0,2 g) de fosfato diácido de potássio anidro (KH 2PO 4) na balança, com auxílio de espátula de inox e béquer de ml: a. Tara-se o béquer vazio, colocando-o dentro da balança, fechando a porta lateral e esperando a mesma estabilizar. Então tecla-se T e zera-se o valor. b. Abre-se a embalagem do sal com cuidado e, com auxílio de espátula de inox coloca-se aproximadamente 200 mg (0,2g) do sal no béquer. c. Levar o sal para a estufa para secar a 110 C por 3 (três) horas. Anota-se o horário inicial. Terminando o tempo de três horas, baixar a temperatura para 60 C e esperar esfriar um pouco, retirar com cuidado o béquer da estufa, pois o mesmo estará quente (pode-se usar folhas de papel toalha dobrados para segurá-lo). Colocá-lo rapidamente no dessecador para resfriar, até que atinja temperatura ambiente. d. Pesar exatamente 136,1 mg em béquer, tampar com papel alumínio e reservar. Caso não consiga pesar exatamente este valor, deve-se anotar o valor final com precisão de 01 (uma) casa decimal. Este valor será utilizado para calcular a nova concentração da solução, a qual será aproximadamente de 0,01 M. - Dissolver o sal no béquer em água destilada, a qual foi adicionada 1 ml de ácido sulfúrico 9,0 N. Completar com água o balão de 100ml seguindo cuidado analítico. - Homogeneizar a solução. Certificar-se de fechar bem a tampa do balão. Agitar, invertendo o balão 10X a fim de homogeneizar a solução por completo. - Acondicionar a solução em frasco de vidro âmbar identificado e manter refrigerado. Ambientar 1X o frasco de acondicionamento com a solução recémpreparada. Use volumes mínimos para ambientar, evitando desperdício. Esta solução é estável por vários meses. b. Solução de molibdato de amônio 0,08 M - Pesar em béquer (conforme descrito acima) 9,5 g de (NH 4) 6MO 7O 244H Diluir em becker com aproximadamente 60 ml de água destilada e mexer com bastão de vidro até dissolver o sal por completo (não se esquecer de lavar o bastão com água destilada dentro do béquer para evitar perda do sal). - Transferir solução para balão volumétrico de 100 ml, tomando cuidado para não desperdiçar nada da solução. Ajustar o volume da solução até o menisco com auxílio de seringa com água destilada. - Homogeneizar a solução, certificar-se de fechar bem a tampa do balão. Agitar, invertendo o balão 10X a fim de homogeneizar a solução por completo. Reservar. Esta solução é estável por vários meses.

3 c. Solução de ácido sulfúrico 9,0 N Trabalhar dentro da capela com equipamentos de segurança! COM CUIDADO!! Solução altamente exotérmica e corrosiva!! - Adicionar 250 ml de água destilada em uma proveta de 500 ml. - Abrir com cuidado a embalagem do ácido PA e medir 125 ml de H 2SO 4 concentrado (P.A.) na proveta pequena. - Secar parede externa do frasco de ácido, caso tenha escorrido durante esta preparação. - Gotejar o ácido na proveta de 500 ml com água destilada, a reação é altamente exotérmica!! Fazer isto aos poucos para evitar super aquecimento da solução. Esperar esfriar e diluir para 500 ml com água destilada. Reservar. d. Solução de antimonil tartarato de potássio 0,1 M - Pesar (conforme procedimentos descritos anteriormente) 3,25 g de K(SbO)C 4H 4O 6 - Diluir em becker com aproximadamente 60 ml de água destilada e mexer com bastão de vidro até dissolver o sal por completo (não se esquecer de lavar o bastão com água destilada dentro do béquer para evitar perda do sal). - Transferir solução para balão volumétrico de 100 ml com auxílio de funil de vidro, tomando cuidado para não desperdiçar nada da solução, e ajustar o volume da solução até o menisco com auxílio de seringa com água destilada até 100 ml. O reagente pode ser usado enquanto permanecer claro. e. Solução de mistura (R1) - Homogeneizar as soluções preparadas nos item b, c e d; - Em um béquer de 250 ml: inserir 200 ml da solução de ácido sulfúrico 9N e adicionar, aos poucos, 45 ml da solução de molibdato de amônio, misturar com bastão de vidro. Em seguida, adicione 5 ml da solução de antimonil tartarato de potássio. Misturar com bastão de vidro. - Ambientar o frasco de acondicionamento da solução, frasco de vidro âmbar, com um pouco da solução, descartado em seguida. Guardar o volume restante da mistura no frasco já ambientado e acondicionar na geladeira com identificação (ver padrão da etiqueta no protocolo específico). Esta mistura é estável por vários meses. f. Solução de ácido ascórbico 0,4 M (R2) Dissolver 7,0 g de C 6H 8O 6 em 100 ml de água destilada, conforme descrito nas metodologias anteriores. Guardar em frasco de vidro âmbar (ambientado) sob refrigeração com identificação. Refazer esta solução sempre no dia da análise. Teste: Fazer o teste de reagentes para certificar que está funcionando. Este teste é grosseiro, somente a calibração irá indicar se está no padrão de qualidade exigido. - Em um Becker de 10 ml, misturar um pouco da solução padrão com gotas do reagente R1, homogeneizar. Adicionar gotas do R2 deve ser produzida solução de cor azul escura. Se ficou amarela ou verde é porque a temperatura dos reagentes não está bom ou os reagentes não estão funcionando. O primeiro reagente que deve ser refeito em situação de erro é o R2, devido a sua instabilidade.

4 2. Preparando Padrões para calibração - Para as análises os reagentes devem estar em temperatura ambiente, por isso devem ser retirados antecipadamente da geladeira. - Jamais pipetar nos frasco de estocagem: a. Retirar uma alíquota de 5 ml da solução padrão mãe e acondicionar em Becker de 10 ml específico de PID. Cobrir com papel toalha ou alumínio para evitar poeira e contaminação durante a aclimatação; Reserve o volume que utilizou p ambientar o frasco para utilizar posteriormente no teste de reagente. d. retirar o volume de R1 e R2 necessário para as análises que fará no dia, considere o volume necessário para calibrar as pipetas, frascos e fazer o teste de reagente; - Jamais devolver o reagente ou a solução mãe que sobrou nas vidrarias de trabalho para os frascos de estocagem. Por isto economize e organize o volume que irá usar no dia Solução intermediária de fosfato (100 µm) - Ambientar a ponteira da pipeta automática 3X com solução padrão, descartando; - Pipetar 1 ml da solução padrão de fosfato (0.1 M) no balão volumétrico e diluir para 100 ml com água destilada, ajustando o menisco com auxílio de seringa. - Homogeneizar a solução por 10X, invertendo e agitando o balão Soluções diluídas - Acondicionar a solução intermediária em um béquer de 10 ml já ambientado; - Trocar a ponteira da pipeta e ambientar 3X com a solução intermediária; - Preparar 3 balões volumétricos de 100 ml, cada um deve estar identificado com a concentração final das soluções que serão preparadas: 0.5 um, 1uM e 2 um; - Ambientar 3 X com água destilada, completar até a metade com água destilada. - Fazer as seguintes diluições no momento do uso, usando o restante dos balões de 100 ml: - Além destas soluções, deve ser preparado o branco, utilizando-se apenas água destilada. OBS: Estas soluções permitirá calibrar toda a análise e testar a qualidade dos reagentes. 3. Análise - Quando a análise apresentar uma boa calibração e valores de referência roda-se as amostras. - Separar os tubos de ensaio (três por amostra) em ordem crescente de numeração; - Organizar as amostras em ordem crescente de numeração, manter sempre a ordem para facilitar no planilhamento dos dados; - Descongelar as amostras até temperatura ambiente e homogeneizá-las calmamente por 10 X (pode-se utilizar ventilador para acelerar o processo de descongelamento);

5 - Transferir 3 ml das soluções e amostras (previamente homogeneizadas) para os tubos de ensaio identificados, com auxílio de pipeta volumétrica, a ponteira deve ser ambientada previamente, - Rodar uma amostra (triplicata) da solução de concentração conhecida Merck, que servirá também para se ter certeza de que o método está bem calibrado. Seguindo a descrição abaixo: A solução original certificada é de 1000 mg.l, isto é, 32,6 mm. Para certificar as amostras é necessário diluir 0,5 ml da solução original em 100 ml de água destilada em balão volumétrico, formando uma solução intermediária e diluir 0,5 ml da solução intermediária em 100 ml de água destilada em balão volumétrico, fixar 3 ml da amostra final com os devidos reagentes e ler no espectrofotômetro, o valor da [] tem que ser aproximadamente 0,8 µm. - Anotar em caderno o número do tubo de ensaio em que a amostra foi acondicionada. - Lembrar-se de sempre passar água destilada na ponteira por 3 x entre uma amostra e outra, além da ambientação com a amostra! - Após preparar todas as amostras nos tubos de ensaio, preparar para a reação de análise: a. Ambientar a pipeta com reagentes, lembrando-se de usar ponteiras diferentes para cada reagente; b. Adicionar 100 µl para 3 ml de amostra da mistura de reagentes R1, tampar e agitar para misturar soluções; c. Adicionar 100 µl para 3 ml de amostra do ácido ascórbico R2, tampar e agitar invertendo (3X)para misturar soluções; - Anotar a hora que colocar o primeiro reagente. Após 5 minutos, ler a absorbância a 880 nm em espectrofotômetro; - Salvar os dados. Referências Bibliográficas (Metodologia) Methods of seawater analysis / ed. by Klaus GraRhoff... With contributions by Leif Anderson; Constant van den Berg. - 3., completely rev. and extended ed. - Weinheim; New York; Chiester; Brisbane; Singapore; Toronto: Wiley-VCH, Avaliação ambiental de estuários brasileiros: diretrizes metodológicas/organizadores. Paulo da Cunha Lana... [et al.]. Rio de Janeiro : Museu Nacional, p., 28 cm (Série Livros, 22). Projeto RECOS Uso e Apropriação de Recursos Costeiros, Grupo Temático Biodiversidade e Qualidade Ambiental.

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