INNO-LiPA HBV Genotyping

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1 INNO-LiPA HBV Genotyping Instruções de Uso USO PRETENDIDO O INNO-LiPA HBV Genotyping é um ensaio de sondas em linha concebido para identificar os genótipos do vírus da hepatite B (HBV) de A a H através da detecção de sequências específicas do tipo nos domínios B a C do gene da polimerase do HBV. O HBV Genotype Assay (LiPA) não deve ser utilizado como teste de triagem do HBV ou teste de diagnóstico para confirmar a presença do HBV. PRINCÍPIO DO TESTE O vírus da hepatite B (HBV) é um vírus de DNA de cadeia parcialmente dupla que se reproduz através de um RNA intermediário. O primeiro passo é o isolamento do DNA viral da amostra. O DNA purificado é amplificado em dois ciclos de PCR com iniciadores para PCR biotinilados. Os iniciadores exteriores (para a primeira etapa do PCR) utilizados neste teste amplificam parte (domínios B e C) do gene da polimerase do HBV. As duas cadeias da hélice de DNA são separadas (desnaturação) através de um processo de aquecimento para expor o alvo aos iniciadores exteriores. Estes iniciadores oligonucleotídicos são complementares às regiões conservadas que flanqueiam a região alvo. Por isso, após arrefecimento para uma determinada temperatura, estes iniciadores ligam-se à sequência alvo (emparelhamento a 45 C). A uma temperatura elevada, na presença de dntp, a polimerase de DNA termostável estende os iniciadores emparelhados ao longo do molde alvo (extensão). Produz-se uma cópia exata da sequência do molde após um ciclo de desnaturação, emparelhamento e extensão. O processo é repetido durante 40 ciclos, produzindo uma sequência alvo amplificada múltiplas vezes com 409 bp. Como a quantidade de produto de amplificação não é geralmente suficiente, é necessária PCR aninhada (segunda etapa). O princípio desta amplificação é idêntico ao primeiro com exceção que o DNA é substituído pelo produto amplificado do PCR do primeiro ciclo e que os iniciadores exteriores são substituídos pelos iniciadores aninhados biotinilados. O processo de desnaturação, anelamento e extensão é repetido durante 35 ciclos, produzindo uma sequência amplificada de 342 bp. Recomendamos que verifique em gel se o produto de amplificação do PCR aninhado ou exterior deve ser utilizado. Depois da amplificação, o material de DNA biotinilado gerado a partir da estrutura de leitura aberta do gene do HBsAg é hibridizado com as sondas oligonucleotídicas específicas imobilizadas como linhas paralelas em tiras baseadas em membranas. Depois da hibridização, o DNA não hibridizado é lavado da tira, é adicionada estreptavidina com fosfatase alcalina que se liga a quaisquer híbridos biotinilados formados anteriormente. A incubação com o cromógeno BCIP/NBT produz um precipitado púrpura/castanho. A tira INNO-LiPA HBV Genotyping contém uma linha de marcação vermelha, 2 linhas de controle e 14 linhas de sondas paralelas. A linha de controle do conjugado é um controle da reação da revelação de cor e a linha de controle de amplificação contém as sondas HBV universais para verificar a presença de material genômico de HBV amplificado. 1

2 REAGENTES Descrição, preparo para utilização e condições recomendadas de conservação OBSERVAÇÃO: Os reagentes AMP e LiPA devem ser armazenados imediatamente após a chegada: Os reagentes AMP na área de pré-amplificação e os reagentes LiPA na área de pósamplificação. - Se armazenados entre 2-8 C, os reagentes permanecem estáveis até à data limite de validade. Não utilize os reagentes além da data de validade. - Para evitar a contaminação, recomendamos que divida os reagentes de amplificação em alíquotas após a primeira utilização. - Não deve guardar reagentes junto de qualquer fonte de contaminação do DNA, em especial, de produtos amplificados. Deve utilizar tubos e pontas (de preferência com filtros de algodão) descartáveis. - Todos reagentes devem ficar em temperatura ambiente (20-25 C) aproximadamente 30 minutos antes da utilização e ser colocados no refrigerador imediatamente após a utilização. Agite brevemente em vórtex e centrifugue brevemente os reagentes descongelados antes de abrir as suas embalagens. Feche os frascos imediatamente após a utilização. - Alterações na aparência física dos reagentes do kit podem indicar instabilidade ou deterioração. - Recomendamos que guarde o tubo horizontalmente para minimizar a possibilidade de enrolamento das tiras antes da utilização. REAGENTES FORNECIDOS COMPONENTE QUANTIDADE DESCRIÇÃO Reagentes AMP: Mistura de iniciadores exteriores Mistura de iniciadores aninhados Reagentes LiPA: 1 x 0,08 ml 1 x 0,08 ml Tiras 1 x 20 Solução de desnaturação Solução de hibridização Solução para lavagem rigorosa Conjugado 100x 1 x 1 ml 1 x 80 ml 1 x 200 ml 1 x 0,8 ml Contém iniciadores biotinilados e 0,05% de NaN3 como conservante. Contém iniciadores biotinilados e 0,05% de NaN3 como conservante. 1 tubo de plástico com tiras INNO-LiPA HBV Genotyping com uma linha de marcação vermelha. Solução alcalina com EDTA. CUIDADO: Feche o frasco com a solução de desnaturação imediatamente após a utilização; a exposição prolongada da solução ao ar leva a uma rápida deterioração. Contém tampão SSC com detergentes e conservantes. Pré-aqueça a solução de hibridização até pelo menos atingir os 37 C, não podendo a temperatura exceder os 49 C (Todos os cristais devem ser dissolvidos antes da sua utilização). Contém tampão SSC com detergentes e conservantes. Pré-aqueça a solução de lavagem rigorosa até atingir pelo menos os 37 C, não podendo a temperatura exceder os 49 C (Todos os cristais devem ser dissolvidos antes da sua utilização). Estreptavidina com fosfatase alcalina em tampão Tris com estabilizadores proteicos e0,01% MIT/0,098% CAA como 2

3 Diluente de conjugado Substrato BCIP/NBT100x Tampão de substrato Solução de lavagem 5x 1 x 80 ml 1 x 0,8 ml 1 x 180 ml 1 x 80 ml conservantes, a diluir a 1/100 em diluente conjugado antes de utilizar. Prepare 2 ml de solução de conjugado de trabalho para cada cavidade teste + 2 ml em excesso. Para o Auto-LiPA, prepare mais 10 ml. A solução de conjugado de trabalho permanece estável durante 24 horas quando for armazenada em um local escuro e à temperatura ambiente (20-25 C). Tampão fosfato com NaCl, Triton, estabilizadores proteicos e 0,01% MIT/0,1% CAA como conservantes. 5-bromo-4-cloro-3-indolifosfato e 4-nitro azul de tetrazólio em dimetilformamida, a diluir a 1/100 em tampão de substrato antes de utilizar. Prepare 2 ml de solução de substrato de trabalho para cada cavidade teste + 2 ml em excesso. Para o Auto-LiPA, prepare mais 10 ml. A solução de substrato de trabalho permanece estável durante 24 horas quando for armazenada em um local escuro e à temperatura ambiente (20-25 C). Tampão Tris com NaCl, MgCl2 e 0,01% MIT/0,1% CAA como conservantes. Tampão fosfato com NaCl, Triton e 0,01% MIT/0,1% CAA como conservantes, a diluir a 1/5 (1 parte + 4 partes) em água destilada ou desionizada antes de utilizar. Prepare 8 ml de solução de lavagem de trabalho para cada cavidade teste + 10 ml em excesso. Para Auto-LiPA, prepare 12 ml de Solução de lavagem de trabalho por teste a realizar, mais 20 ml em excesso. A solução de lavagem de trabalho permanece estável durante 2 semanas a uma temperatura de 2-8 C. Placa de incubação 3 Com 8 cavidades cada. Cartão de leitura 1 Para a identificação de sondas positivas. Folha de relatório de dados 2 Para guardar tiras processadas. MATERIAL NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO - Luvas descartáveis. - Pontas de pipetas estéreis descartáveis (de preferência com filtro). - Microtubos estéreis. - Suportes para microtubos. - Centrífugas de microtubos. - Pipetas ajustáveis para dispensar 1-20 µl, µl e µl. - Água destilada e esterilizada em autoclave. Especificamente para amplificação Recomendamos a utilização da polimerase de DNA Taq e do tampão de amplificação Taq fornecidos pela Stratagene para a amplificação. - Equipamento e termociclador de DNA. - dntp (25 mm). - Tampão Taq 10x (com 100 mm de Tris-HCl ph 8,8; 500 mm de KCl; 15 mm MgCl2, 0,01% (s/v) de gelatina e estabilizadores, Stratagene). - Polimerase de DNA Taq (Polimerase de ADN Taq, Stratagene). 3

4 Especificamente para LiPA - Aspirador. - Termômetro calibrado. - Pinças. - Provetas graduadas (10, 25, 50 e 100 ml). - Cronômetro (2 horas ± 1 minuto). - Agitador Vortex ou equivalente. - Banho-maria com plataforma agitadora (80 rpm; tampa inclinada, temperatura ajustável para um mínimo de 49 C ± 0,5 C). - Agitador orbital (160 rpm) ou oscilador (50 rpm). Materiais opcionais - Multipipeta de dispensação (Multipipetas, Eppendorf ou equivalente). - Equipamento para automação de passos de processamento de tiras. Para mais informações, contate o distribuidor. SEGURANÇA E AMBIENTE Tóxico! R61-20/21-36, S /37/ Contém N,N dimetilformamida: SUBS BCIP/NBT 100x. Irritante! R43, S Contém 2-cloroacetamida: STRIN WASH SOLN, HYBRIDIZ SOLN, RINSE SOLN, SUBS BUF e CONJ DIL. Corrosiva! (C) R34, S /37/ Contém hidróxido de sódio: DENAT SOLN. R20/21 Nocivo por inalação e em contato com a pele. R34 Provoca queimaduras. R36 Irritante para os olhos. R43 Pode causar sensibilização em contato com a pele. R61 Risco durante a gravidez com efeitos adversos na descendência. S9 Manter o recipiente em um local bem ventilado. S20 Não comer nem beber durante a utilização. S23 Não inalar vapor/aerosol. S24 Evitar o contato com a pele. S26 Em caso de contato com os olhos, lavar imediata e abundantemente com água e consultar um especialista. S36/37/39 Usar vestuário de proteção, luvas e equipamento protetor para os olhos/face adequados. S37 Usar luvas adequadas. S45 Em caso de acidente ou de indisposição, consultar imediatamente o médico (se possível mostrar-lhe o rótulo). S53 Evitar a exposição obter instruções específicas antes da utilização. S60 Este produto e o seu recipiente devem ser eliminados como resíduos perigosos. 4

5 - As amostras devem ser sempre manipuladas como potencialmente infecciosas. Todos os componentes sanguíneos e materiais biológicos devem ser considerados como sendo potencialmente infecciosos e devem ser manipulados em conformidade. Este teste só deve ser efetuado por técnicos com formação adequada. - Todos os componentes sanguíneos e materiais biológicos devem ser eliminados em conformidade com os procedimentos de segurança estabelecidos. Autoclavagem durante 15 minutos a 121 C no mínimo. Incinere o material descartável. Misture os resíduos líquidos com hipoclorito de sódio para que a concentração final seja de ± 1% de hipoclorito de sódio. Deixar repousar durante a noite antes de eliminar os resíduos. CUIDADO: Neutralize o líquido residual que contenha ácido antes de adicionar o hipoclorito de sódio. - Use equipamento de proteção pessoal: luvas e óculos de segurança quando manipular agentes perigosos ou infecciosos. - Os resíduos devem ser manipulados de acordo com as diretivas de eliminação de resíduos da instituição. Deve cumprir todos os regulamentos ambientais, federais, locais e nacionais. COLETA E MANIPULAÇÃO DE AMOSTRAS Utilize o DNA extraído de amostras positivas para HBV isolado imediatamente após a coleta das amostras ou de amostras congeladas a uma temperatura igual ou inferior a -20 C e preferencialmente nunca descongeladas. Pode gerar material amplificado do gene pol do HBV dos domínios B e C. Utilize 10 µl de produto amplificado do HBV para o processo LiPA. OBSERVAÇÕES E PRECAUÇÕES - Apenas para utilização profissional. - Esterilize em autoclave todas as ponteiras de pipetas e tubos. Recomendamos a utilização de ponteiras de pipetas com filtro de algodão. Utilize apenas materiais de laboratório descartáveis. - Utilize uma ponteira de pipeta nova por cada amostra dividida em alíquotas. - Não misture reagentes de kits diferentes, exceto os componentes com números de lote idênticos. - Para evitar a contaminação da PCR, maximize a separação das etapas pré e pósamplificação. Não coloque as amostras, o equipamento ou os reagentes na área onde executou a etapa anterior. Se for necessário voltar a uma área de trabalho anterior, realize as etapas de descontaminação adequadas. - Utilize pinças para manipular as tiras. Não toque nas tiras com as mãos porque a oleosidade das mãos pode interferir com a hibridização e a revelação da cor. - Utilize apenas lápis para escrever nas tiras. Os reagentes do ensaio podem remover a tinta das tiras. - Para obter resultados precisos, utilize um banho-maria para os passos de lavagem e hibridização, e verifique se a temperatura é 49 C ± 0,5 C. Não utilize um agitador de ar quente. Utilize um termômetro calibrado para fazer um controle de temperatura rigoroso. Feche sempre a tampa do banho-maria para manter a temperatura. Se a 5

6 temperatura for muito baixa, o ensaio pode produzir resultados falsos positivos; se a temperatura for muito elevada, pode produzir sinais fracos ou resultados falsos negativos. Utilize um banho-maria com agitação e a tampa inclinada para um controle de temperatura ótimo. - A agitação gerada pelo banho-maria durante a hibridização e a lavagem rigorosa, e pelo agitador orbital ou oscilador durante a revelação da cor é crítica. Ajuste a velocidade destes instrumentos cuidadosamente para maximizar o movimento dos reagentes na tira sem respingar as soluções entre as cavidades do trabalho. - Evite respingar a placa com o banho-maria. Ajuste o nível de água no banho-maria para que fique entre um terço e metade da altura da placa. Evite o deslizamento da placa, imobilizando-a com pesos. - Não deixe que as tiras sequem entre passos. - Deixe ficar cada tira na mesma cavidade durante o procedimento. - Aspire o líquido de uma cavidade com uma pipeta que pode ser instalada em um aspirador de vácuo. PROCEDIMENTO DO TESTE PARA AMPLIFICAÇÃO Protocolo de extração de DNA: Kit de preparação do molde PCR de elevada pureza (Roche Diagnostics). Consulte o protocolo do kit mencionado. Pode utilizar outros procedimentos de extração de DNA. Protocolo de amplificação Os protocolos seguintes (Amplificação aninhada e exterior) foram concebidos para amplificação ótima com: - Polimerase Taq (5U/µL, Stratagene), - Tampão Taq 10x (com 100 mm de Tris-HCl ph 8.8; 500 mm de KCl; 15 mm MgCl2, 0,01% (w/v) de gelatina, estabilizadores, Stratagene). - Tubos PCR MicroAmp (Tubos finos de 0,2 ml) e - Termocicladores PE-2400 ou PE-9600 (Perkin Elmer Cetus). Este protocolo pode ser utilizado para a maioria dos tipos de termocicladores comerciais, mas pode requerer modificações fornecidas pelo fabricante do termociclador. Tome as precauções necessárias para evitar uma amplificação não específica, que pode afetar os resultados: - Descongele os componentes enumerados, em seguida e coloque-os em gelo. - Efetue todos os passos de pipetagem em gelo de uma forma rápida. 6

7 Amplificação exterior 1. Determine o número de tubos a preparar (N) com a fórmula seguinte: N = Número de amostras + 1 Controle negativo + 1 Controle positivo Utilize pontas de pipetas com filtro para preparar a mistura principal em um tubo de microcentrífuga livre de nucleases, esterilizado por autoclavagem: 3. Prepare a mistura principal 1 com: (N x 32,4 µl) Água destilada esterilizada em autoclavagem + (N x 5.0 µl) Tampão de amplificação Taq 10x (Stratagene) + (N x 0,4 µl) Mistura dntp (25 mm) + (N x 2,0 µl) Mistura de iniciadores exteriores + (N x 0,2 µl) Polimerase de DNA 5U/µL (Stratagene) Centrifugue brevemente e divida esta mistura principal em alíquotas de 40 µl desta mistura principal 1 para tubos de amplificação esterilizados em autoclavagem (N-1). 4. Coloque 10 µl de DNA purificado ou 10 µl de água destilada com uma pipeta (Sem DNA no Controle negativo). OBSERVAÇÃO: Misture e centrifugue brevemente a mistura para recolher o líquido no fundo do tubo. 5. Coloque as amostras no bloco térmico calibrado (consulte as instruções fornecidas pelo fabricante do termociclador). Inicie o programa de amplificação concebido para a amplificação exterior INNO-LiPA HPV Genotyping. Perfil da amplificação exterior INNO-LiPA HBV Genotyping para um termociclador PE-2400 ou PE-9600: Passo Temperatura Tempo Obs. 1 Desnaturação 94 C 4 min. 2 Desnaturação 94 C 30 seg. 3 Emparelhar Repetir ciclo 45 C 30 seg. iniciadores passos 2-4, 4 Estender 40 vezes 72 C 30 seg. iniciadores 6 Alongar 72 C 10 min. 7 Resfriar para 4 C 6. Depois deste processo, utilize as amostras imediatamente para a amplificação aninhada ou guarde-as a uma temperatura de -15/-25 C. NOTA: Não armazene os produtos de amplificação de DNA junto de reagentes de amplificação ou do DNA extraído. Amplificação aninhada 1. Determine o número de tubos a preparar (N) com a fórmula seguinte: N = Número de amostras amplificadas exteriores + Controle negativo amplificado exterior + 7

8 1 Controle negativo + 1 Controle positivo + 1. Utilize uma ponteira com filtro para preparar a mistura principal 2 em um tubo esterilizado em autoclavagem: (N x 40,4µL) Água destilada esterilizada em autoclavagem + (N x 0,4 µl) Mistura dntp (25 mm) + (N x 5,0 µl) Tampão de amplificação Taq 10x (Stratagene) + (N x 2,0 µl) Mistura de iniciadores aninhados + (N x 0,2 µl) Polimerase de DNA Taq 5U/µL (Stratagene) Misture por vórtex brevemente e divida esta mistura principal em alíquotas de 48 µl para (N- 1) tubos de amplificação esterilizados por autoclavagem. 2. Coloque 2 µl de produtos amplificados exteriores ou 2 µl de água destilada com uma pipeta (Sem DNA no Controle negativo). OBSERVAÇÃO: Misture por vórtex e centrifugue brevemente a mistura para recolher o líquido no fundo do tubo. 3. Coloque as amostras no bloco térmico calibrado (consulte as instruções fornecidas pelo fabricante do termociclador). Inicie o programa de amplificação concebido para a amplificação aninhada INNO-LiPA HPV Genotyping. Perfil da amplificação aninhada INNO-LiPA HBV Genotyping para um termociclador PE-2400 ou PE-9600: Passo Temperatura Tempo Obs. 1 Desnaturação 94 C 4 min. 2 Desnaturação 94 C 30 seg. 3 Emparelhar iniciadores 45 C 30 seg. 4 Estender iniciadores 72 C 30 seg. 6 Alongar 72 C 10 min. 7 Resfriar para 4 C Repetir ciclo passos 2-4, 35 vezes 4. Depois deste processo, analise 5 µl de produto amplificado aninhado e exterior em gel de agarose de 2% ou guarde-o a uma temperatura de -15/-25 C. Recomendamos, com base nas observações internas, que se o produto amplificado exterior fornecer uma banda de 409 bp, o ensaio LiPA deve fornecer um resultado interpretável. Se não for visível nenhuma banda para o produto amplificado exterior, utilize o produto amplificado aninhado com o INNO-LiPA HBV Genotyping. NOTA: Não armazene os produtos de amplificação de DNA junto de reagentes de amplificação ou de DNA extraído. 8

9 RESULTADOS DA AMPLIFICAÇÃO Visualização - A presença de produtos amplificados pode ser verificada com um gel de agarose de 2%. - Coloque 5 µl de produto amplificado em cada ranhura. - O produto amplificado aninhado deve aparecer como uma banda com um comprimento de 342 bp. - O produto amplificado exterior deve aparecer como uma banda com um comprimento de 409 bp. Controle de qualidade - Inclua pelo menos um branco para extração. - Inclua pelo menos um controle positivo e um controle negativo para cada amplificação. Tal como sucede com qualquer outro novo procedimento de laboratório, até se ter alcançado um grau de confiança mais elevado quanto à execução correta do procedimento deve ser considerada a inclusão de controles positivos e negativos adicionais. - Se for desejável a inclusão de um controle positivo adicional, utilize uma amostra conhecida como positiva. - Se obtiver uma banda positiva no gel para o controle negativo, deve rejeitar a série de ensaio inteira e repetir o procedimento do início. PROCEDIMENTO DO TESTE PARA O LiPA Desnaturação das amostras CUIDADO: Utilize um termômetro calibrado para verificar se a temperatura do banho-maria agitado é 49 C ± 0,5 C, e ajuste a temperatura, se for necessário, antes de adicionar uma placa de amostras. 1. Equilibre um banho-maria agitado a 49 C ± 0.5 C. 2. Coloque a solução de hibridização e a solução de lavagem rigorosa em um banho-maria com uma temperatura entre 37 e 49 C para dissolver todos os cristais. Certifique-se de que o banho-maria não excede 49 C. Agite a garrafa para misturar antes de utilizar. 3. Remova uma tira de cada amostra com as pinças. Escreva um número de identificação com um lápis por cima da linha de marcação vermelha da tira. Inclua sempre uma tira para o controle negativo (produto amplificado de uma amostra negativa do HBV). NOTA: Não coloque a tira na cavidade até ao passo 2 da Hibridização das amostras. 4. Coloque uma cavidade para cada amostra/tira na placa. 5. Adicione 10 µl de solução de desnaturação no canto superior de cada cavidade. 9

10 NOTA: Feche imediatamente o frasco com a solução de desnaturação depois de cada utilização. A exposição prolongada ao ar provoca a deterioração da solução. 6. Adicione 10 µl de controle negativo ou amostra à solução de desnaturação em cada cavidade. Misture cuidadosamente com a pipeta. 7. Deixe ficar a desnaturação durante 5 minutos à temperatura ambiente. Hibridização das amostras 1. Adicione cuidadosamente 2 ml de solução de hibridização em cada cavidade, tendo cuidado para não contaminar as outras cavidades. Agite a cavidade para misturar os reagentes. 2. Coloque imediatamente uma tira com a linha de marcação virada para cima em uma cavidade. NOTA: Use luvas descartáveis e pinças quando manusear as tiras. 3. Certifique-se de que a tira está completamente submergida na solução. Não cubra as cavidades com selantes de microplacas para evitar a contaminação cruzada. 4. Coloque a placa no banho-maria agitado a 49 C ± 0.5 C e imobilize a placa entre dois pesos pesados. Defina o banho-maria para cerca de 80 rpm, feche a tampa e incube a placa durante 60 minutos. Certifique-se de que cada tira permanece completamente submersa e flutua livremente. 5. Quando a incubação da hibridização terminar, remova a placa do banho-maria. Lavagem das tiras CUIDADO: Segure a placa em um ângulo baixo para que o líquido se acumule em uma extremidade de uma cavidade, por cima da linha de marcação da tira, para fácil remoção. Não danifique a superfície da tira. Evite salpicar ou transferir soluções entre cavidades. 1. Aspire a solução da cavidade com uma pipeta, de preferência ligada a aspirador de vácuo. 2. Adicione 2 ml de solução de lavagem rigorosa em cada cavidade e agite a placa durante 1 minuto a C para lavar a tira. Aspire a solução de cada cavidade. NOTA: Uma multipipeta é útil para distribuir a solução de lavagem rigorosa. 3. Repita a lavagem através da adição de 2 ml de solução de lavagem rigorosa em cada cavidade e da agitação da placa durante 1 minuto a C para lavar a tira. Aspire a solução de cada cavidade. 4. Adicione 2 ml de solução de lavagem rigorosa em cada cavidade, coloque a placa no banho-maria agitado a 49 C ± 0.5 C e imobilize a placa entre dois pesos pesados. Defina o banho-maria para cerca de 80 rpm, feche a tampa e incube a placa durante 30 ± 1 minutos. 10

11 5. Prepare a solução de lavagem de trabalho e a solução de conjugado de trabalho (Ver Reagentes). Revelação da cor CUIDADO: Segure a placa em um ângulo baixo para que o líquido se acumule em uma extremidade de uma cavidade, por cima da linha de marcação da tira, para fácil remoção. Não danifique a superfície da tira. Evite respingar ou transferir soluções entre cavidades. 1. Aspire a solução da cavidade com uma pipeta. 2. Adicione 2 ml de solução de lavagem de trabalho em cada cavidade e agite a placa durante 1 minuto à temperatura ambiente para lavar a tira. Aspire a solução de cada cavidade. Repita este passo uma vez. 3. Adicione 2 ml de solução de conjugado de trabalho em cada cavidade, coloque a placa em um agitador (orbital a 160 rpm ou oscilador a 50 rpm) a C e incube durante 30 ± 1 minutos. NOTA: Prepare a solução de substrato de trabalho cerca de 10 minutos antes do fim da incubação do conjugado (Ver Reagentes). 4. Quando a incubação terminar, remova a placa do agitador e aspire a solução de cada cavidade com uma pipeta. 5. Adicione 2 ml de solução de lavagem de trabalho em cada cavidade e agite a placa durante 1 minuto a C para lavar a tira. Aspire a solução de cada cavidade. Repita este passo uma vez. 6. Adicione 2 ml de tampão de substrato em cada cavidade e agite a placa durante 1 minuto a C para lavar a tira. Aspire a solução de cada cavidade. 7. Adicione 2 ml de solução de substrato de trabalho em cada cavidade, coloque no agitador a C e incube durante 30 ± 1 minutos. 8. Quando a incubação terminar, pare a revelação da cor através da lavagem das tiras: remova o a placa do agitador, aspire a solução de cada cavidade e, em seguida, adicione 2 ml de água destilada em cada cavidade e coloque a placa no agitador durante 3 minutos. Repita este passo uma vez. 9. Remova cada tira da cavidade e coloque a tira com a linha de marcação virada para cima em papel absorvente com as pinças. 10. Seque as tiras completamente antes de ler os resultados. Armazene em lugar escuro as tiras secas e processadas. PROCEDIMENTO DE TESTE AUTOMATIZADO: Auto-LiPA e Auto-LiPA 48 Os equipamentos Auto-LiPA e Auto-LiPA 48 foram concebidos para realizar totalmente as etapas da hibridização, da lavagem rigorosa e da revelação da cor de forma automatizada. O 11

12 Auto-LiPA e o Auto-LiPA 48 são concebidos como equipamentos autônomos com aquecimento, refrigeração, aspiração e pipetagem automatizados. Para mais informações e protocolos específicos para o Auto-LiPA e o Auto-LiPA 48, entre em contato com a Biometrix. RESULTADOS DO LiPA Leitura A figura 1 mostra a posição das diferentes sondas de oligonucleotídeos na tira INNO-LiPA HBV Genotyping. Uma linha é considerada positiva quando aparecer uma faixa de cor púrpura/castanho claro no final do teste. Fig. 1: Localização da linha de marcação vermelha, linha de controle de Conjugado (controlo de Conjugado), linha de controle de Amplificação (controle de Amplificação) e 14 linhas de sondas na tira INNO-LiPA HBV Genotyping. Controle de qualidade - A linha superior vermelha é a linha de marcação. Esta linha permite orientar corretamente a tira. - A primeira linha positiva deve estar alinhada com a linha "controle Conj." no cartão de leitura de plástico. Esta linha controla a adição da solução de conjugado e substrato reativa durante o procedimento de detecção. Esta linha deve estar sempre positiva e ter aproximadamente a mesma intensidade em todas as tiras utilizadas durante a mesma série de testes. - A segunda linha positiva ("controle de Amplificação" no cartão de leitura) controla a adição de material amplificado para hibridização. Se o HBV estiver presente na amostra e ocorreu a amplificação e o processamento de amostras corretos, a amplificação alvo hibridiza para esta Linha de controle de Amplificação". - A tira de controle negativo deve estar em branco, exceto para a linha de controle de conjugado. Isto demonstra que não há contaminação durante a execução do ensaio. Interpretação dos resultados Utilize sempre a tabela de interpretação para correta interpretação do genótipo HBV. NOTA: - O isolamento de diferentes genótipos pode fazer uma reação cruzada na mesma linha de sonda. - Verifique cuidadosamente os padrões da linha da sonda aplicáveis a cada genótipo individual na tabela de interpretação. 12

13 OBSERVAÇÃO: (padrões não presentes na tabela de interpretação): - Interpretação de infecções mistas: A existência de infecções de genótipos mistos em portadores crónicos de HBV foi documentada. Quando detectar várias infecções de genótipos com o ensaio INNO-LiPA HBV Genotyping, deve interpretar os resultados da seguinte forma: Se várias linhas específicas de genótipos mostrarem diferentes genótipos, deve indicar um genótipo misto. Por exemplo, as linhas 6-7 positivas juntamente com as linhas 8-9 positivas são indicadas como uma amostra co-infectada B/C. O genótipo HBV G está co-infectado com o genótipo HBV A na maioria dos casos. Por exemplo, um padrão de reação em que a linha específica 16 do genótipo G está presente juntamente com pelo menos 2 linhas positivas do genótipo A devem ser indicadas como uma amostra co-infectada A/G. Se aparecerem várias linhas específicas dos genótipos para um genótipo juntamente com uma linha positiva única para um segundo genótipo, este deve ser comunicado como um genótipo único. O genótipo indicado deve ser o genótipo com as várias linhas positivas. Não se esqueça de que uma linha única 16 é indicativa da presença de um genótipo G. - Resultados indeterminados: Os resultados indeterminados (IND) devem ser indicados nos seguintes casos: Linhas de reação única para mais de um genótipo juntamente com uma linha de controle de amplificação positiva (linha 2). Não se esqueça de que a reação da linha única 11 e da linha única 15 deve ser interpretada como o genótipo H. Ausência de linhas específicas do genótipo positivo juntamente com uma linha de controle de amplificação positiva (linha 2). Todas as linhas positivas. Para obter suporte para a interpretação, contate a Biometrix. IDENTIFICAÇÃO DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagnóstica Ltda. Estrada da Graciosa, Curitiba PR - CEP: Tel.: (41) Fax: (41) DDG: biometrix@biometrix.com.br Website: CNPJ: / INFORMAÇÕES DO FABRICANTE INNOGENETICS N.V. Technologiepark Gent - Belgium Tel.:

14 REGISTRO ANVISA RESPONSÁVEL TÉCNICA Edna Cristina Kurokawa Guimarães Ferreira CRQ/PR:

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